방법 논문

Podocyte 손상 조절 및 당뇨병성 신장 질환 치료 예측 및 검증(Predicting and Validating the Regulation of Podocyte Injury and Treatment of Diabetic Kidney Disease) 저자: Yinhuo Tang

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DOI:

10.3791/67939

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2025년 6월 20일

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 네트워크 약리학 및 실험적 검증을 사용하여 당뇨병성 신장 질환(DKD) 치료에서 Yinhuo Tang(YHT)의 작용 메커니즘과 YHT가 PI3K/AKT/NF-κB 신호 경로의 억제를 통해 DKD 마우스의 포도사이트 손상을 줄이는 방법을 밝힙니다.

초록

당뇨병성 신장 질환(DKD)은 다량의 단백뇨와 사구체 여과율 감소를 특징으로 하는 만성 신장 질환입니다. DKD의 주요 병리학적 특징은 신장 미세혈관병증이며, 당뇨병 환자의 ~40%가 DKD로 발전합니다. 포도사이트 관련 단백질인 CD2AP 및 WT-1은 포도세포의 정상적인 기능과 사구체 여과 장벽의 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 염증, 산화 스트레스 또는 기타 병리학적 손상으로 인해 podocyte 구조 또는 기능이 중단되면 슬릿 횡격막과 액틴 세포골격이 손상되어 사구체 여과 장벽의 투과성이 증가하고 단백뇨가 발생합니다. Yinhuo Tang (YHT)은 단백뇨를 줄이고 신장 기능의 악화를 지연시키는 기능이있는 전통 한약 처방전입니다. 그러나 DKD를 치료하는 YHT의 메커니즘은 명확하지 않습니다. 본 논문에서는 네트워크 약리학 및 동물 실험을 기반으로 혈당, 간 기능, 신장 기능, 혈중 지질, 신장 병리학, 포도세포 마커 단백질 CD2AP 및 WT-1의 발현 수준과 8주 동안 YHT 투여 후 db/db 마우스에서 PI3K/AKT/NF-κB 신호 경로를 조사했습니다. 본 연구의 결과는 YHT가 PI3K/AKT/NF-κB 신호전달 경로를 억제함으로써 염증 인자의 발현 수준을 감소시켜 포도사이트 손상을 감소시켜 DKD의 진행을 지연시키는 역할을 한다는 것을 보여줍니다.

서론

당뇨병성 신장 질환(DKD)은 당뇨병의 흔하고 심각한 합병증으로, 전 세계적으로 말기 신부전의 주요 원인으로 남아 있다1. 이 질환은 사구체 확대, 중간혈관 확장, 세뇨관 간질 섬유증, 세포 외 기질 성분의 과도한 축적과 같은 일련의 복잡한 병리학적 과정을 통해 진행됩니다 2,3. 당뇨병 관리의 개선에도 불구하고, 현재의 치료법은 주로 혈당 수치와 혈압을 조절하는 것을 목표로 하며, 이는 DKD의 근본적인 병리학적 변화를 되돌리기보다는 오히려 진행을 늦출 뿐입니다. 이는 보다 포괄적이고 효과적인 치료 옵션이 시급히 필요하다는 것을 강조한다 4,5.

중국 전통 의학(TCM)은 DKD 6,7,8과 같은 만성 질환 치료에서 유망한 대체 요법으로 부상했습니다. TCM은 DKD의 복잡하고 다중 표적 특성을 해결할 수 있는 전체론적 치료 접근 방식을 강조합니다. 다양한 한의학 제형 중에서 Yinhuo Tang(YHT)은 음(혈액량 보충), 신장 강화(신장 기능 향상), 열 제거(염증 억제), 양 억제(혈압 강하)9,10,11. 그러나 YHT가 DKD를 완화하는 메커니즘에 대한 포괄적인 이해는 아직 부족합니다.

podocyte 관련 단백질 CD2AP는 podocyte의 핵심 단백질로 여과 장벽의 무결성을 유지하는 데 중요한 반면, WT-1은 신장 발달 및 섬유증에 중요한 역할을 합니다 12,13,14,15,16. 따라서 이 두 단백질의 정상적인 기능은 정상적인 사구체 여과 기능에 필수적입니다. 기존 문헌에 따르면 이러한 표적이 DKD의 진행에 관여하며, 우리는 YHT의 활성 성분이 이러한 표적과 상호 작용하여 치료 효과를 발휘할 수 있다는 가설을 세웁니다. 이 연구는 이러한 상호 작용을 확인하고 YHT가 DKD의 질병 경로를 조절하는 방법에 대한 심층적인 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

이 연구에서는 DKD에서 YHT의 치료 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학과 동물 실험을 조합하여 사용합니다. 활성 화합물과 생물학적 표적 간의 복잡한 상호 작용을 분석하기 위해 생물 정보학 도구를 통합하는 네트워크 약리학을 통해 YHT의 작용 17,18,19의 다중 표적, 다중 경로 특성을 탐구 할 수 있습니다. 전통적인 신약 개발 방법은 종종 단일 표적 중재를 강조합니다. 이와는 대조적으로, 네트워크 약리학은 잠재적인 경로와 분자 표적을 식별하는 데 도움이 되는 예측 도구 역할을 하여 복잡한 치료법의 가능한 작용 메커니즘에 대한 예비 통찰력을 제공합니다. 네트워크 약리학은 약물 개발에 필요한 엄격한 실험 및 규제 단계를 대체하지는 않지만, 가설 생성을 안내하고 초기 단계 연구를 간소화할 수 있습니다20.

궁극적으로 이 연구는 전통 의학과 현대 의학의 격차를 해소하여 한의학을 DKD 치료에 통합하기 위한 과학적 증거를 제공하는 것을 목표로 합니다. 이 연구의 결과는 DKD에 대한 보다 효과적이고 안전한 치료 전략을 개발하는 데 도움이 될 수 있으며, 종종 부작용으로 인해 제한되는 표준 치료에 대한 대안을 제공할 수 있습니다. YHT의 분자 메커니즘을 규명하고 치료 가능성을 검증함으로써 DKD 치료에서 TCM의 광범위한 적용 가능성을 입증할 수 있기를 바랍니다.

프로토콜

본 연구를 위해 동일한 유전적 배경을 가진 6주 된 수컷 자발적 II형 당뇨병(C57BL/Ksj db/db) 마우스 30마리와 동일한 유전적 배경을 가진 수컷 비당뇨병 대조군 마우스(db/m) 6마리를 선정했습니다. 생쥐는 장춘 중국 전통 의학 대학의 동물 실험 센터(라이선스 번호: SYXK (JI) 2023-0014)의 멸균 SPF 등급 환경에서 2주 동안 보관되었습니다. 이 기간 동안 그들은 정기적인 유지 식단과 멸균 물을 제공받았습니다. 2주 기간의 시작과 끝에 db/db 마우스에서 공복 혈당을 측정했으며, 두 테스트 모두에서 결과가 11.1mmol/L을 초과하는 마우스만 실험에 포함시켰습니다. 이 연구는 장춘 중국 전통 의학 대학의 윤리 위원회(ID 번호: 2024147)의 승인을 받았습니다.

1. 약물 제제

  1. YHT의 제조 (표 1)
    1. Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g), Schisandra chinensis (6 g)를 선택하고 물로 헹구어 표면의 불순물과 먼지를 제거합니다. 그런 다음 생허브 71g과 증류수 710mL를 섞고 세라믹 냄비에 60분 동안 담가둡니다.
    2. 100°C에서 끓인 후 달인 온도를 80°C로 60분 동안 낮춘 다음 두 겹의 의료용 거즈를 통해 찌꺼기를 걸러냅니다. 액체는 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
    3. 위의 찌꺼기에 증류수 710mL를 넣고 1.1.1 단계와 1.1.2 단계에서 담그기를 한 번 반복하십시오. 액체는 4°C의 냉장고에 보관하십시오.
    4. 1.1.2 및 1.1.3 단계에서 위의 두 가지 약액을 혼합하여 진공 동결 건조기의 재료 트레이에 넣습니다. 진공 펌프를 시작하여 동결 건조 챔버에서 공기를 제거하고 온도를 -40°C로 설정하고 6시간 동안 유지하여 약물 용액의 물을 고체 상태로 동결합니다. 그런 다음 온도를 -20°C로 36시간 동안 조정하여 물을 얼음 결정으로 기체로 승화시킵니다. 마지막으로 온도를 40°C로 설정하고 24시간 동안 유지하여 약물 용액에 남아 있는 수분을 제거하고 가열 및 진공 펌프를 끄고 동결 건조 분말(YHT 분말)을 제거합니다.
    5. 동결 건조 된 YHT 분말 0.4615g, 0.923g 및 1.846g의 무게를 달고 식염수 1mL에 현탁하고 각각 0.4615g / mL, 0.923g / mL 및 1.846g / mL의 농도로 YHT의 현탁액을 만듭니다.
  2. 발사르탄의 준비
    1. 발사르탄(10.29mg)을 PEG300 50mL에 넣고 잘 흔들어 완전히 녹입니다.
    2. 1.2.1 단계의 용액에 식염수 50mL를 첨가하고 잘 흔들어 균질화하고 10.29 mg/mL 농도의 발사르탄 용액을 얻습니다.

2. 약물 치료

참고: 실험은 정상 대조군(CON), 모델 그룹(MOD), 발사르탄 양성 대조군(POS), YHT의 저용량 그룹(YH-L), YHT의 중간 용량 그룹(YH-M) 및 YHT의 고용량 그룹(YH-H)의 6개 그룹으로 나뉩니다. 성인은 하루에 71g의 YHT가 필요합니다. 실험용 마우스와 인간 약물 용량의 변환 공식에 따르면 마우스의 일일 복용량은 ~ 9.23 g / kg이었습니다.

마우스에 대한 등가 실험 선량(g/kg) = 인간 투여량(g)/체중(70kg) × 9.1

  1. 주로 사용하지 않는 손으로 마우스의 등을 단단히 잡고 머리, 목 및 몸통이 일직선이 되도록(몸부림치지 않기 위해) 1mL 위배지 바늘을 마우스의 식도의 생리적 곡률과 유사한 각도로 적절하게 배치합니다. 생쥐의 입 모서리를 통해 개비지 바늘을 밀어 넣고, 혀를 누르고, 입천장에 대고 누르고, 위 안쪽으로 부드럽게 밀어 넣습니다.
  2. 주로 사용하는 손의 검지 손가락을 사용하여 약물을 천천히 밀어 넣고 바늘을 수직으로 빼면 개비지 작업이 완료됩니다.
    참고: 약물의 용량은 총 4주 동안 10mL/kg이었습니다.
    1. 10ml∙kg-1∙day-1 식염수를 CON과 MOD 마우스에 위방향으로 투여합니다.
    2. POS 그룹 마우스에 10.29 mg∙kg-1∙day-1 발사르탄 현탁액을 위장으로 투여합니다.
    3. 이 그룹에 gavage에 의해 YHT의 다음 용량을 투여하십시오 : YH-L 그룹에 4.615 g∙kg-1∙day-1 ; 9.23 g∙kg-1∙day-1 을 YH-M 그룹에; 18.46 g∙kg-1∙day-1 YH-H 그룹에.

3. YHT 효능 평가

  1. 혈액 및 소변 생화학적 지수 검출
    1. 8주간의 지속적인 약물 투여 후 대사 케이지를 사용하여 마우스에서 24시간 소변을 채취하고 수집된 소변을 7,992× g 에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 요단백 테스트 키트를 사용하여 소변 단백질 수치를 측정합니다.
    2. 주로 사용하지 않는 손으로 마우스 뒷면을 잡고 마우스를 고정하고 사용하지 않는 동일한 손의 새끼 손가락과 약지를 사용하여 마우스 꼬리를 고정합니다. 요오드 증기 면봉으로 마우스의 꼬리 끝을 살균하십시오. 주로 사용하는 손으로 채혈 바늘을 잡고 마우스 꼬리 끝에 빠르게 구멍을 뚫고 마우스 꼬리 뿌리에서 꼬리 끝까지 짜낸 다음 혈당 검사지에 혈액을 떨어뜨립니다.
    3. 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 마우스의 꼬리를 잡고 엄지와 검지로 견갑골 영역을 고정하여 마우스의 복부가 위를 향하도록 합니다. 주로 사용하는 손으로 페노바르비탈 나트륨으로 채워진 1mL 주사기를 잡습니다. 바늘(3-5mm 깊이)을 30-45° 각도로 복강에 삽입하고 바늘은 머리를 향하도록 배꼽과 뒷다리 사이의 영역을 목표로 합니다. 주사기 플런저를 천천히 당겨 혈액을 확인하십시오. 혈액이 흡인되면 그에 따라 바늘의 위치를 변경하십시오..
    4. 천천히 투여 조차를 보장하기 위해 펜토바르비탈 나트륨 용액을 주입하고 주입이 완료된 후 주사기를 철회합니다. 10분 동안 기다린 다음 주로 사용하는 손에 집게를 잡고 마우스의 뒷다리 발가락을 부드럽게 꼬집어 반응을 확인합니다. 그래도 반응이 관찰되면 필요에 따라 소량의 추가 용량(10mg/kg)을 투여합니다.
      참고: 마우스의 무게가 60g이고 페노바르비탈 용액이 1% w/v라고 가정하면 0.06mL는 모든 반응의 경우 투여해야 하는 추가 용량입니다.
    5. 가위를 사용하여 쥐의 눈 주위의 수염과 털을 다듬고, 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 안구를 제거할 눈 주위의 피부를 눌러 안구가 돌출되도록 합니다. 안구 주위 피부를 에탄올로 살균하고, 핀셋을 사용하여 안구를 빠르게 꺼내 혈액이 마이크로 원심분리기 튜브(1.5-2mL)에 떨어지도록 한 다음, 실온에서 튜브를 10분 동안 배양한 후 7,992 × g에서 10분 동안 튜브를 원심분리한 후 상등액을 추출합니다.
    6. 키트의 지침에 따라 혈청 내 혈청 크레아티닌(Scr), 혈액 요소 질소(BUN), 알부민(ALB), 알라닌 아미노전이효소(ALT), 아스파르테이트 아미노전이효소(AST), 트리글리세리드(TG) 및 총 콜레스테롤(TC)의 발현 수준을 측정합니다.
  2. 신장 조직의 분리
    1. 채혈 후 수술판에 쥐를 누운 자세로 고정하고, 쥐의 흉부 전방부의 털을 자르고, 에탄올을 사용하여 흉부 앞쪽을 살균하고, 가위로 복부 피부를 자르고, 소장과 대장을 옆으로 밀어 신장을 노출시킵니다.
    2. 쥐의 신장 조직을 제거하고 지혈 겸자를 사용하여 골막을 뭉툭하게 분리한 다음 왼쪽 신장을 -80°C 냉동고에 넣어 보관하고 오른쪽 신장을 4% 파라포름알데히드 용액이 함유된 20mL 튜브에 넣어 신장을 고정합니다.
    3. 24 시간 후에 포름 알데히드에서 올바른 신장을 제거하고, 5 분 동안 증류수로 간단히 헹구고, 무수 에탄올 (100 % → 95 % → 85 % → 75 %, 각 5 분)의 구배를 사용하여 탈수하고, 그라디언트 자일렌 (2 x 10 분)을 사용하여 투명화하고, 파라핀 왁스에 삽입하고, 왁스 블록이 실온21에서 응고되도록합니다. 그런 다음 -20°C 냉동고에 하룻밤 동안 넣습니다.
    4. 왁스 블록을 제거하고 3μm 두께로 얇게 썰어 물에 넣어 펼친 다음 슬라이드로 낚아채고 40°C의 항온 오븐에 넣어 30분 동안 굽고 후속 분석을 위해 보관합니다.
  3. 신장 조직병리학적 분석
    1. 오른쪽 신장을 제거하고 위와 같이 그라디언트 자일렌 탈왁스 및 무수 에탄올 탈수를 수행하고(3.2.3단계) 증류수로 세척합니다.
    2. Hematoxylin 및 Eosin stain(H&E), Periodic Acid-Schiff stain(PAS) 및 Masson staining kit의 지침에 따라 염색을 수행합니다.
    3. 3.2.3단계에서와 같이 그래디언트 무수 에탄올 탈수 및 자일렌 투명도를 다시 수행합니다.
    4. 실온에서 건조시킨 후 중성 껌을 장착 매체로 사용하여 커버슬립으로 슬라이드의 조직 부분을 장착합니다. 슬라이드를 관찰하고 400x 배율의 광학 현미경으로 이미지화합니다.
  4. 신장 조직의 면역조직화학적 분석
    1. 3.2.3단계에서 설명한 대로 올바른 신장을 제거하고 왁스를 제거하고 탈수한 후 10mM 구연산나트륨 완충 용액(pH 6.0)에 넣고 항원 복구를 위해 125분(103°C, 103kPa)으로 가열합니다. 10분 후 단면을 제거하고 실온으로 식힌 후 3x PBS에서 5 x 1분씩 세탁합니다.
    2. 3% 과산화수소 용액에 절편을 10분 동안 넣어 내인성 과산화효소를 차단하고 PBS에서 3 x 5분씩 세척합니다.
    3. 10% 염소 세럼을 섹션에 덧바르고 염소 세럼이 전체 섹션을 고르게 덮도록 합니다. 절편을 젖은 상자에 넣고 37°C에서 30분 동안 배양한 다음 PBS로 3 x 5분 세척합니다.
    4. 1차 항체 COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200)를 적가하고( 재료 표 참조) 4°C의 젖은 상자에 넣어 냉장고에서 밤새 배양합니다.
    5. 단면을 제거하고 PBS 3 x 5 분으로 세척하고 2 차 항체 (1 : 3,000)를 적가하고 37 ° C에서 60 분 동안 배양하고 PBS로 3 x 5 분 동안 세척합니다.
    6. 3,3'-디아미노벤지딘(DAB) 발색액을 10분 동안 첨가하고 증류수로 발색 용액을 씻어내고 실온에서 100μL의 헤마톡실린으로 5분 동안 배양하고 증류수로 5분 동안 헹굽니다.
    7. 3.2.3단계에서 설명한 대로 탈수, 투명 및 밀봉하고 광학 현미경을 사용하여 이미지를 수집합니다.
  5. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qRT-PCR) 분석 분석
    1. 10mL 균질화 튜브에 ~100mg의 냉동 신장 조직을 넣고 명백한 조직 덩어리가 없을 때까지 유봉으로 철저히 분쇄한 다음 균질화를 위해 1mL의 RNA 추출 시약을 추가합니다.
    2. 클로로포름 250μL를 넣고 와류 믹서에서 10초 동안 흔든 다음 얼음에서 5분 동안 배양하고 4°C에서 10분 동안 15,984×g 으로 원심분리한 다음 상부 수성상을 새 튜브로 피펫으로 배출합니다.
    3. 수성상에 500μL의 이소프로판올을 첨가하고 와류 믹서를 사용하여 10초 동안 철저히 혼합한 다음 혼합물을 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 15,984 × g 에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 75% 에탄올 1mL로 세척합니다. 짧은 볼텍싱 후 15,984 × g에서 10분 동안 다시 원심분리합니다. 에탄올을 버리고 RNA 펠릿을 실온에서 자연 건조시킵니다.
    4. 30μL의 디에틸 피로탄산염수를 첨가하여 RNA를 용해시키고 분광 광도계를 사용하여 260nm 및 280nm에서 RNA 용액의 흡광도를 측정하여 RNA 농도를 계산합니다.
      참고: RNA 순도는 A260/A 280 비율로 평가됩니다. 이상적인 A260/A280 비율은 1.8에서 2.0 사이여야 하며, 이는 RNA 순도가 양호함을 나타냅니다. 비율이 1.8 미만인 경우 단백질 또는 페놀 오염이 있음을 나타낼 수 있으며 오염 물질을 제거하기 위해 추가 페놀-클로로포름 추출 또는 에탄올 침전을 수행하는 등의 추가 정제가 필요합니다.
    5. 총 RNA 3 μg, 4 gDNA 와이퍼 믹스 4 μL 및 RNase-free ddH2O를 최종 부피 16 μL까지 혼합하고 1,250 × g에서 10초 동안 원심분리한 다음 42 °C에서 2분 동안 배양합니다. 위 용액의 16 μL에 5x 역전사 효소 4 μL를 첨가하고 1,250 × g에서 10 초 동안 원심 분리합니다. 50°C(15분) → 85°C(5초) → 4°C(10분)에서 역전사 프로그램을 수행합니다. 합성된 cDNA를 -20°C에서 보관합니다.
    6. 냉동고에서 cDNA 용액을 제거하고 90°C(10분)에서 사전 변성을 수행한 다음 94°C(30초) → 60°C(30초) → 72°C(24초)의 40회 사이클을 수행하고 최종적으로 95°C(15초) → 60°C(60초) → 95°C(350초, 60°C는 0.1°C/s의 비율로 95°C로 점차적으로 증가)의 순서로 용해합니다.
    7. Gapdh를 내부 기준(internal reference)으로 하여 각 시료의 Ct 값(ΔΔCt = 타겟 유전자의 Ct 값 - 내부 참조 유전자의 Ct 값)을 기준으로 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB 및 IL-1β의 상대 발현을 계산합니다(표 2 참조).
  6. 웨스턴 블롯(WB) 분석
    1. 10mL 균질화 튜브에 ~100mg의 냉동 신장 조직을 넣은 다음 500μL의 용해 용액(프로테아제 억제제:인산가수분해효소 억제제:RIPA= 1:1:100)을 취하고 명백한 조직 덩어리가 없을 때까지 유봉으로 충분히 분쇄합니다.
    2. 얼음 위에서 튜브를 30분 동안 배양하고 15,984 ×g에서 10분 동안 원 심분리한 다음 상층액을 흡인합니다.
    3. BCA 분석을 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 측정합니다. 측정된 농도에 따라 각 그룹의 총 단백질(예: 30μg)과 동일한 양을 새 튜브에 넣고 PBS를 사용하여 최종 부피를 조정하여 일관성을 보장합니다. 다음으로, 5x 단백질 로딩 버퍼를 추가하고 100°C에서 10분 동안 끓인 다음 제거하고 실온으로 냉각합니다.
    4. 12.5% SDS-PAGE 젤 전기영동을 사용하여 단백질을 분리합니다. 첫째, 80V를 사용하여 샘플이 농도 젤을 천천히 통과한 다음 샘플이 분리 젤의 바닥으로 떨어질 때까지 전압을 120V로 조정하고 장치를 끕니다.
    5. 여과지를 멤브레인 전달 버퍼에 담그고 핀셋을 사용하여 PVDF 멤브레인의 모서리를 잡고 메탄올에 담궈 활성화합니다. 겔을 제거하고 플라스틱 플레이트를 사용하여 농축된 겔과 분리 겔의 바닥을 차단한 다음 여과지/겔/PVDF 멤브레인/여과지의 샌드위치 구조에 따라 멤브레인 전달 장치(겔을 음극으로, PVDF 멤브레인을 양극으로)를 설정하고 사전 냉각된 전달 버퍼로 채워진 멤브레인 전달 탱크에 설정을 배치합니다. 낮은 온도를 유지하기 위해 얼음 조각으로 둘러싸고 200mA의 정전류로 전송을 수행합니다.
      참고: 단백질의 분자량에 따라 전달 시간을 결정합니다(분자량이 클수록 전달 시간이 길어짐).
    6. PVDF 멤브레인을 차단 버퍼에 넣고 실온에서 90분 동안 차단 버퍼를 흔든 다음 TBST(50x TBS 50mL 및 TBST 0.5mL당 Tween-20)로 3 x 5분 동안 세척합니다.
    7. 1차 항체 희석제 희석 1차 항체: WT-1(1:1,000), CD2AP(1:1,000), P-PI3K(1:1,000), P-AKT(1:1,000), P-NF-κB(1:1,000) 및 IL-1β(1:1,000)를 사용하여 PVDF 멤브레인에 1차 항체를 추가하고 4°C 냉장고의 습식 상자에 넣어 하룻밤 동안 배양합니다( 재료 표 참조).
    8. 4°C 냉장고에서 PVDF 멤브레인을 제거하고 2차 항체 희석액 희석 2차 항체(1:10000)를 사용하여 2차 항체를 추가하고 실온에서 60분 동안 배양하고 TBST로 3 x 5분 동안 세척하고 PVDF 멤브레인을 화학발광 영상기에 넣고 ECL 발광 액체를 균일하게 적가(A: B = 1:1).

4. DKD 치료를 위한 YHT의 네트워크 약리학 분석

  1. YHT의 활성 성분 및 표적 스크리닝
    1. TCMSP 데이터베이스(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)를 사용하여 Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria 및 Schisandra Chinensis의 활성 성분을 확인하고 BATMAN-TCM 데이터베이스(http://bionet.ncpsb.org/batmantcm)에서 잎새버섯 의 활성 성분을 결정합니다. 활성 성분을 식별하기 위한 스크리닝 기준으로 경구용 생체이용률(OB)을 30% ≥ , 약물 유사성(DL) ≥ 0.18 로 설정합니다.
    2. TCMSP 데이터베이스(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)에서 위의 TCM에서 활성 성분의 작용 목표를 검색합니다.
    3. 위의 활성 성분의 표적을 강조하지 않고 추가 분석을 위해 목록에 통합합니다. Uniprot 단백질 데이터베이스(https://www.uniprot.org)를 사용하여 표적의 이름을 표준화합니다.
  2. YHT의 활성 성분의 대상 네트워크 구축
    1. 활성 성분 및 해당 대상을 소프트웨어로 가져오기: File | 가져오기 | 네트워크 및 관련 데이터 로드.
    2. Tools(도구) | 네트워크 분석 | 네트워크를 분석하여 약물, 활성 성분, 표적 및 질병 간의 관계를 시각화합니다. 네트워크 시각화에서 노드는 활성 성분을 나타내고 가장자리는 활성 성분과 대상 간의 상호 작용을 나타냅니다.
  3. DKD 관련 표적 스크리닝
    1. 당뇨병성 신장 질환을 검색어로 사용하고 종을 Human으로 설정하여 다음 데이터베이스에서 DKD 관련 표적을 스크리닝합니다: GeneCards 데이터베이스(https://www.genecards.org); OMIM 데이터베이스(http://www.omim.org); TTD 데이터베이스(https://www.ttd.cn); DrugBank 데이터베이스(http://www.drugbank.ca); DisGeNET 데이터베이스(http://www.disgenet.org).
    2. 5개의 데이터베이스에서 결과를 얻은 후 스프레드시트에 병합하고 데이터 메뉴의 중복 제거 기능을 사용하여 중복을 제거하여 DKD 관련 대상의 고유 이름만 유지되도록 합니다.
  4. PPI(단백질-단백질 상호작용)의 구축 및 핵심 표적 스크리닝
    1. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 한 열에 YHT 대상 목록을 입력하고 다른 열에 DKD 대상 목록을 입력하여 YHT 및 DKD의 교차 대상을 식별합니다. 조건부 서식을 적용하여 두 열의 공통 항목을 강조 표시하여 교차 대상을 식별합니다.
    2. String 데이터베이스 웹 사이트(https://cn.string-db.org/)를 열고 입력 | 붙여넣기/업로드 를 사용하여 데이터를 일괄 가져오고 임계값 Degree ≥ 1 로 설정하여 네트워크에서 사용 가능한 대상(상호 작용이 없는 대상)을 필터링합니다.
    3. 파일 | 가져오기 | 네트워크를 구축하고 필터링된 교차로를 소프트웨어로 가져와 최종 시각화를 생성합니다.
    4. Network Analysis(네트워크 분석) | 네트워크를 분석하고 학위 값을 기반으로 YHT-DKD의 핵심 대상을 필터링합니다.
  5. 유전자 온톨로지(GO) 기능 분석 및 유전자 및 게놈 교토 백과사전(KEGG) 경로 농축 분석
    1. http://metascape.org/gp/index.html 를 방문하여 Metascape 플랫폼을 열고, Start Analysis 를 선택하여 시작하고, YHT 및 DKD에 대한 표적 목록을 Custom Analysis 섹션의 입력 상자에 붙여넣고, 드롭다운 메뉴에서 종 을 Homo sapiens 로 설정하고, Custom Analysis를 선택하고, P-value 임계값 을 <0.01로 설정하고, Submit 을 클릭하여 분석을 실행합니다.
    2. Metascape에서 결과가 반환된 후 http://www.bioinformatics.com.cn/ 로 이동하여 Tools | enrichment GO term을 선택하고 결과에서 GO 용어를 붙여 넣은 다음 Submit(제출 )을 클릭하여 거품형 차트를 생성합니다. 상위 10개의 GO 항을 P-값을 기준으로 정렬하여 시각화합니다.
    3. Metascape 분석 결과의 P-값을 기준으로 KEGG 경로를 정렬합니다. 동일한 미생물학 웹사이트(http://www.bioinformatics.com.cn/)로 이동하여 go kegg pathway enrichment를 선택하고 선택한 상위 10개 KEGG 경로를 붙여넣은 다음 제출 을 클릭하여 KEGG 버블 다이어그램을 시각화합니다.

5. 통계 분석

  1. 데이터가 정규 분포를 따르고 분산이 동질인 경우 일원 분산 분석을 사용합니다. 분산이 동질적이지 않으면 Dunnett의 T3 검정 또는 독립 표본 t-검정을 사용합니다.
  2. 정규 분포를 따르지 않는 데이터의 경우 비모수 방법의 순위합 검정을 사용합니다.
  3. P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

결과

DKD 마우스의 혈당, 간 및 신장 기능, 지질 대사 장애 개선
투여 8주 후, YHT의 다른 용량은 무작위 혈당, 24시간 UTP, Scr 및 BUN의 수치를 현저하게 감소시켜 신장 기능을 개선했습니다(그림 1A-D). ALB 수준을 높였습니다. ALT 및 AST의 수준을 줄였습니다. 간 기능 향상(그림 1E-G); TC 및 TG의 수치를 감소시켰다. 지질 대사의 조절을 개선했습니다(그림 1H, I). 위의 결과는 YHT가 혈당, 간 및 신장 기능, 지질 조절에 대한 보호 효과가 있음을 나타냅니다.

DKD 마우스의 신장 조직병리학적 손상 개선
YHT가 DKD 마우스의 신장 손상을 개선할 수 있는지 여부를 테스트하기 위해 H&E, PAS, Masson 염색 및 IHC를 사용하여 신장 조직의 병리학적 손상 정도를 조사했습니다. H&E 및 PAS 염색 결과 사구체 위축, 튜니카 알부기니아 영역의 확장, 세뇨관 상피 세포의 팽창 및 박리, 간질성 염증 세포 침투, MOD 그룹에서 명백한 사구체 글리코겐 침착이 나타났습니다(그림 2A, B). Masson 염색은 CON 그룹에 비해 MOD 그룹의 신장에서 파란색 콜라겐 섬유가 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 2C, D). IHC는 COI-I 및 α-SMA에 양성인 영역의 비율이 CON 그룹보다 MOD 그룹에서 유의하게 높았다는 것을 보여주었습니다(그림 2E-G). 대조적으로, YHT 및 POS 사용 후 사구체 위축, 테더 영역의 확장, 세뇨관 상피 세포의 팽창 및 탈락, 간질 염증 세포 침투 정도 및 사구체 글리코겐 침착이 현저히 완화되었습니다. 파란색 콜라겐 섬유의 면적이 현저히 감소했습니다. COI-I 및 α-SMA에 양성인 영역의 비율이 크게 감소했습니다. 위의 결과는 YHT가 DKD 마우스에서 신장 병리학적 손상 및 신장 섬유증을 약화시킬 수 있음을 나타냅니다.

DKD 마우스의 podocyte 손상 감쇠
DKD 마우스의 발 세포 손상은 IHC, PCR 및 WB에 의해 관찰되었습니다. IHC 결과는 MOD군에서 발세포 기능적 마커 단백질인 CD2AP 및 WT-1의 발현량이 CON군에 비해 유의하게 감소한 것으로 나타났으며, 이는 신장 발세포가 손상되었음을 나타냅니다. YHT 처리는 CD2AP 및 WT-1의 발현 수준을 증가시키고 발 세포의 손상을 감소시켰습니다(그림 3A-C). PCR 및 WB 결과는 발 세포 기능 마커 단백질인 CD2AP 및 WT-1의 상대적 mRNA 및 단백질 발현 수준이 CON 그룹에 비해 MOD 그룹에서 유의하게 감소했으며, YHT 처리 후 CD2AP 및 WT-1의 상대적 mRNA 및 단백질 발현 수준이 유의하게 증가했음을 보여주었습니다(그림 3D-H). 위의 결과는 YHT가 DKD 마우스에서 포도사이트 손상을 감쇠시킬 수 있음을 나타냅니다.

네트워크 약리학을 통해 DKD에 대한 YHT의 효과와 관련된 잠재적 표적 및 신호 전달 경로의 규명
YHT(291)의 활성 성분은 TCMSP 및 BATMAN-TCM 데이터베이스를 통해 스크리닝되었으며, 그 중 39개의 활성 성분이 OB ≥ 30% 및 DL ≥ 0.18의 기준을 충족했습니다. 활성 성분을 데이터베이스에서 검색하여 표적을 식별하고, 중복 값을 병합 및 삭제한 후 총 303개의 표적을 얻었습니다(그림 4A). GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank, DisGeNET 등 5개 데이터베이스의 결과를 병합하고 중복값을 제거한 결과, 최종적으로 1,867개의 DKD 관련 target을 확보했습니다. 다음으로, 스크리닝된 YHT 활성 성분을 DKD 타겟과 교차시키기 위해 http://www.bioinformatics.com.cn/ 를 사용하여 84개의 교차 타겟을 생성했습니다(그림 4B). 이 84개의 표적을 Cytoscape 소프트웨어로 가져와 PPI 네트워크 다이어그램을 그리고 AKT, IL-1 β, CASP3, APOE 및 JUN을 포함하여 DKD의 YHT 치료를 위한 잠재적인 주요 표적을 식별했습니다(그림 4C). GO 기능 강화 분석은 총 1,246개 항목을 산출했으며, 이는 YHT가 호르몬에 대한 반응과 같은 생물학적 과정과 단백질 동질이합체 활성 및 산화환원효소 활성을 포함한 분자 기능뿐만 아니라 막 뗏목 및 막 미세도메인과 같은 세포 구성 요소를 조절하여 DKD에 치료 효과를 발휘할 수 있음을 나타냅니다(그림 4D). 총 263개의 KEGG 농축 결과가 얻어졌으며, 주로 당뇨병 복합체, 알코올성 간 질환, 지질 및 죽상동맥경화증 경로에서 AGE-RAGE 신호 경로와 관련이 있습니다. P-값을 기반으로 상위 10개의 결과를 선택하여 KEGG 시각화 버블 차트를 그렸습니다(그림 4E). AGE-RAGE 신호전달 경로는 당뇨병 복합체에서 매우 풍부하며, PI3K, AKT 및 IL-1β와 같은 PPI의 여러 핵심 표적이 이 경로에서 강화됩니다. 따라서, 이 신호전달 경로는 후속 검증을 위해 선택되었습니다.

PI3K/AKT/NF-κB 신호전달 경로를 억제하여 포도사이트 손상 감쇠
PI3K/AKT/NF-κB 신호전달 경로와 관련된 유전자 및 단백질의 발현 수준은 PCR 및 WB에 의해 추가로 조사되었습니다. PCR 결과는 MOD 그룹에서 Pi3k, Akt, Nf-κb 및 Il-1β의 상대적 mRNA 발현 수준이 CON 그룹에 비해 유의하게 증가했으며 YHT 투여 후 유의하게 감소했음을 보여주었습니다(그림 5A-D). WB 결과는 P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB 및 IL-1β의 상대 단백질 수준도 CON 그룹에 비해 MOD 그룹에서 유의하게 증가한 반면, YHT 투여 후에는 크게 감소한 것으로 나타났습니다(그림 5E-I). 이러한 결과는 YHT가 DKD 마우스의 포도사이트 손상을 약화시켜 PI3K/AKT/NF-κB 신호 경로를 억제할 수 있음을 시사했습니다.

figure-results-1
그림 1: DKD 마우스의 혈당, 간 및 신장 기능, 지질 대사 장애 개선. (A) 무작위 혈당에 대한 YHT의 효과; (B-D) 24시간 소변 단백질, 혈액 크레아티닌 및 요소 질소를 포함한 신장 기능; (E-G) 혈청 알부민, 알라닌 아미노전이효소 및 아스파르트산 아미노전이효소를 포함하는 간 기능; 및 (H,I) 총 콜레스테롤 및 트리글리세리드를 포함한 지질 대사 조절. 데이터는 6개의 독립적인 표본의 평균± 표준편차로 표현되며, 블랭크 그룹 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001과 비교되며, 모델 그룹 #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001과 비교하면 이러한 통계 표기법이 모든 그림에서 일관되게 사용됩니다. 약어: YHT = yinhuo Tang; DKD = 당뇨병성 신장 질환; ALB = 알부민; ALT = 알라닌 아미노전이효소; AST = 아스파르테이트 아미노전이효소; TC = 총 콜레스테롤; TG = 트리글리세리드; CON = 대조군; MOD = 모델 그룹; POS = 발사르탄 양성 대조군; YH-L = YHT의 저용량 그룹; YH-M = YHT의 중간 용량 그룹; YH-H = YHT의 고용량 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: DKD 마우스에서 신장의 조직병리학적 손상 개선. (A,B) H&E 및 PAS 염색에 의한 신장 조직학(스케일 바 = 20μm); (C) 신장 섬유증의 정도를 관찰하기 위한 Masson 염색 및 (D) ImageJ 소프트웨어를 사용한 반정량 분석; (예) IHC 및 ImageJ 소프트웨어(스케일 바 = 20μm)를 사용하여 신장 조직에서 COI-I 및 α-SMA의 상대 발현 수준에 대한 반정량 분석. 약어: YHT = yinhuo Tang; DKD = 당뇨병성 신장 질환; H&E = 헤마톡실린 및 에오신 염색; PAS = 주기적 산-쉬프 염색; COI-I = 콜라겐 유형 I; α-SMA = α평활근 액틴; CON = 대조군; MOD = 모델 그룹; POS = 발사르탄 양성 대조군; YH-L = YHT의 저용량 그룹; YH-M = YHT의 중간 용량 그룹; YH-H = YHT의 고용량 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: DKD 마우스의 포도사이트 손상 감쇠. (A-C) IHC는 신장 조직(스케일 바 = 20μm)에서 CD2AP 및 WT-1의 상대 발현 수준을 감지했습니다. (디,이) PCR은 신장 조직에서 CD2AP 및 WT-1 의 상대적 mRNA 발현을 검출하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 반정량 분석을 수행했습니다. (F-H) WB는 신장 조직에서 CD2AP 및 WT-1의 상대적 단백질 발현 수준을 검출하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 반정량 분석을 수행했습니다. Image J 소프트웨어를 사용한 정량 분석. 약어: YHT = yinhuo Tang; DKD = 당뇨병성 신장 질환; IHC = 면역조직화학; WB = 웨스턴 블로팅; CD2AP = CD2 관련 단백질; WT-1 = 윌름스 종양 1; CON = 대조군; MOD = 모델 그룹; POS = 발사르탄 양성 대조군; YH-L = YHT의 저용량 그룹; YH-M = YHT의 중간 용량 그룹; YH-H = YHT의 고용량 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: DKD 치료를 위한 YHT의 네트워크 약리학적 분석. (A) DKD 치료를 위한 YHT의 활성 성분-질병 표적 플롯. (B) YHT와 DKD의 교차 대상에 대한 벤 다이어그램. 주황색은 DKD에 대한 관련 대상의 수를 나타냅니다. 녹색은 YHT 활성 성분의 치료 대상의 수를 나타냅니다. 교차하는 부분은 교차하는 대상의 수(DKD에 대한 YHT의 대상의 수)를 나타냅니다. (C) YHT 및 DKD의 교차 대상의 PPI 네트워크 다이어그램. (D) DKD 치료를 위한 YHT의 가장 중요한 10가지 표적에 대한 GO 농축 분석. (E) DKD의 YHT 치료를 위한 가장 중요한 10가지 표적에 대한 KEGG 농축 분석. 약어: YHT = yinhuo Tang; DKD = 당뇨병성 신장 질환; PPI = 단백질-단백질 상호 작용; GO = 유전자 온톨로지; KEGG = 교토 유전자 및 게놈 백과사전; CON = 대조군; MOD = 모델 그룹; POS = 발사르탄 양성 대조군; YH-L = YHT의 저용량 그룹; YH-M = YHT의 중간 용량 그룹; YH-H = YHT의 고용량 그룹. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: PI3K/AKT/NF-κB 신호 전달 경로를 억제하여 podocyte 손상의 감쇠. (A-D) PCR을 통해 신장 조직에서 Pi3k, Akt, Nf-κb, Il-1β 의 상대 mRNA 발현을 검출합니다. (E-I) WB를 사용하여 신장 조직에서 P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB 및 IL-1β의 상대적 단백질 발현 수준을 검출하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 반정량 분석을 수행했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: Yinhuo Tang의 구성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: qRT-PCR 프라이머의 세부 정보. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜의 중요한 단계 중 하나는 네트워크 약리학을 사용하여 YHT의 활성 구성 요소를 식별하고 DKD 관련 표적과의 상호 작용을 예측하는 것입니다. 이 단계에는 데이터베이스(예: TCMSP, DrugBank 및 GeneCards)와 같은 생물정보학 도구를 사용하여 대규모 생물학적 데이터를 분석하여 YHT의 영향을 받는 분자 경로와 잠재적인 생물학적 네트워크를 매핑하는 작업이 포함됩니다. 이 예측은 DKD의 동물 모델을 통한 실험적 검증으로 이어졌으며, 여기서 이러한 경로에 대한 YHT의 가설화된 효과를 테스트했습니다. 컴퓨팅 예측과 데이터의 통합은 연구 결과의 신뢰성을 높이고 이론적 예측과 실제 결과 사이의 격차를 해소하기 때문에 우리 접근 방식의 중요한 측면입니다. 또한 동물 모델의 사용은 YHT의 치료 효과를 검증하는 또 다른 중요한 단계입니다. 동물의 DKD는 인간 질병의 진행을 밀접하게 모방하여 사구체 손상과 신장 섬유증에 대한 YHT의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다. 조직병리학적 평가와 함께 Scr, BUN 및 단백뇨와 같은 신장 기능 마커에 대한 세심한 모니터링은 YHT의 치료 효능을 평가하는 데 필수적입니다.

우리의 프로토콜은 강력한 계산 방법과 실험 방법을 결합하지만 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 네트워크 약리학 접근법은 공개 데이터베이스에서 사용 가능한 데이터에 크게 의존하며, YHT 또는 DKD 관련 경로의 특정 구성 요소에 대한 편향 또는 누락된 정보가 있을 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해 여러 데이터베이스를 상호 참조했지만 일부 관련 상호 작용은 여전히 간과될 수 있습니다. 둘째, 본 연구는 실험동물 수준에서 포도사이트 손상을 줄이는 YHT의 기전을 탐구했을 뿐이며, 실험 결과를 검증하기 위해서는 세포 실험 및 임상적 대규모 표본 연구가 필요하다. 마지막으로, 네트워크 약리학은 YHT를 사용한 DKD 치료가 알코올성 간 질환, 지질 대사 및 죽상 경화증, 지방 세포의 지방 분해 조절과도 관련이 있음을 보여주었습니다. 이 연구는 YHT에 의한 PI3K/AKT/NF-κB 신호 경로의 조절이 DKD의 진행을 지연시킬 수 있는지 여부만 확인했습니다. 그 결과는 더 많은 연구가 필요합니다.

PI3K/AKT/NF-κB 신호전달 경로는 세포 성장, 증식, 생존 및 염증 반응과 같은 다양한 생물학적 과정의 조절에 관여하는 중요한 세포 내 신호 경로입니다22. 연구에 따르면 소아적혈구 손상의 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다23,24. NF-κB는 PI3K/Akt 경로의 중요한 다운스트림 구성 요소이며 다양한 세포 내 신호의 전달과 여러 유전자의 발현에 참여합니다. PI3K/AKT 신호전달 경로의 억제는 NF-κB 억제 단백질 IκB의 분해를 유도하고, 이는 다시 NF-κB의 인산화 및 핵 진입을 유도하며, 다양한 케모카인 및 염증 인자의 생성을 유도하여 포도사이트 손상 및 신장 간질성 섬유증을 유발한다25. 일부 연구에서는 PI3K/AKT/NF-κB 신호전달 경로의 활성화를 억제하면 염증 반응과 신장 섬유증을 효과적으로 억제하여 DKD의 진행을 지연시킬 수 있다고 밝혔습니다26.

연구에 따르면 지질 대사 장애는 DKD27,28의 발병과 진행에 중요한 역할을 합니다. DKD 환자는 종종 LDL, TG 및 지방산 축적 수치 상승을 포함하여 비정상적인 지질 대사를 보입니다. 이러한 이상은 사구체 경화증(glomerulosclerosis) 및 세뇨관 간질성 섬유증(tubulointerstitial fibrosis)과 같은 병리학적 변화와 밀접한 관련이 있다29,30. 연구에 따르면 지질 대사 장애는 여러 신호 전달 경로를 통해 DKD 진행을 촉진할 수 있습니다31,32. 첫째, mTOR 신호 경로는 지질 대사 조절의 핵심 경로입니다. 과잉 활성화는 포도사이트 손상과 단백뇨를 유발합니다33,34. 고지방 환경은 PI3K/AKT/mTOR 축을 통해 지질 축적을 촉진하여 포도사이트 세포사멸을 유도하고 궁극적으로 신장 기능 저하를 악화시킬 수 있습니다 35,36,37. 둘째, 세포 에너지 대사의 중요한 조절자인 AMP-activated protein kinase(AMPK)는 지방산 산화를 촉진하고 지질 합성을 억제하며 지질 독성을 감소시켜 대사 장애로부터 신장을 보호합니다 38,39,40. AMPK 불활성화는 DKD 진행에서 중요한 메커니즘으로 간주됩니다. 메트포르민(metformin)과 같은 AMPK 활성제는 상당한 재노화 보호 효과를 보였으며 DKD41의 유망한 치료 표적입니다.

마지막으로, 연구에 따르면 과산화소체 증식제 활성화 수용체α(PPARα/γ γ)는 지질 대사와 DKD42,43을 조절하는 데 필수적인 역할을 합니다. PPARα 활성화는 지방산 산화를 촉진하고 신장의 지질 축적을 감소시키는 반면, PPARγ는 인슐린 감수성을 개선하고 항염증 효과를 발휘합니다44,45. 피브레이트(fibrates)와 같은 PPAR 작용제는 DKD 환자의 단백뇨를 감소시키는 데 잠재적인 임상적 이점을 보여주었다46. 결론적으로, 지질 대사 장애는 여러 신호 전달 경로를 통해 DKD의 병리학적 진행에 영향을 미칩니다. 이러한 경로 간의 상호 작용은 복잡한 병리학적 네트워크를 형성합니다. 지질 대사를 표적으로 하는 것은 DKD에 대한 새로운 치료 전략을 제공할 수 있습니다.

시스테인 특이적 프로테아제(cysteine-specific protease)의 일종인 카스파아제(caspase, CASP) 계열은 세포에서 널리 발견되는 프로테아제의 일종으로, 주로 세포사멸 및 염증 반응의 조절에 관여합니다47,48. CASP 계열의 구성원은 구조적 유사성을 공유하며 일반적으로 일련의 반응을 통해 활성화되는 zymogen으로 존재하여 apoptosis, pyroptosis 및 기타 프로그래밍된 세포 사멸 과정을 유발합니다49. 그 중에서도 일반적으로 zymogen으로 존재하는 보존된 구조를 가진 caspase (CASP) 계열의 구성원인 CASP3는 특정 세포 단백질의 절단을 촉매하는 세포사멸 실행 단계의 핵심 단백질 분해 효소로, 정상적인 세포 성장을 조절하고 내부 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다50,51. Caspase-8은 세포사멸 연쇄반응(apoptotic cascades)의 개시자로 작용하며, 세포 성장 조절의 핵심 인자인 NPK의 활성화를 통해 염증 반응의 조절에 참여합니다. Caspase-8은 세포사멸 연쇄반응(apoptotic cascade)의 개시인자로 작용하며, NLRP1 및 NLRP3와 같은 염증성 소포를 활성화하여 세포 파이롭토시스(cellular pyroptosis)를 유발함으로써 염증 반응의 조절에도 참여합니다52. 꽃자루세포에서 세포사멸(apoptosis)과 파이롭토시스(pyroptosis)를 매개하는 CASP 신호전달 경로의 중요한 역할을 바탕으로, YHT, CASP3/8, 꽃자멸 세포 및 DKD 간의 관계에 대한 심층적인 연구가 앞으로 이루어질 것이 확실합니다.

일반적으로 규제 명확성 및 예측 가능성을 위해 잘 정의된 단일 표적 메커니즘을 강조하는 기존 약물 발견 접근 방식과 비교하여, 당사의 네트워크 약리학 기반 전략은 YHT와 같은 TCM 제형에 내재된 다중 표적 상호 작용에 대한 체계적인 탐색을 가능하게 합니다. 이러한 복잡성은 한의학의 전체론적 특성과 잠재적인 치료 범위를 반영하지만, 신중한 검증과 해석이 필요한 의도하지 않은 off-target 효과의 문제를 강조하기도 합니다. YHT 작용의 다중 표적 및 다중 경로 특성을 고려함으로써 DKD 치료에 대한 치료 효과에 대한 보다 전체적인 이해를 제공합니다. 또한 네트워크 약리학은 잠재적인 약물 상호 작용 및 부작용을 예측할 수 있으며, 이는 다중 구성 요소 요법의 안전성과 효능을 보장하는 데 매우 중요합니다. 현재 DKD 치료는 기저 질환 기전을 해결하기보다는 증상을 관리하거나 진행을 늦추는 데 주로 초점을 맞추고 있습니다. 이 연구는 최신 생물정보학 도구를 실험적 검증과 통합함으로써 특히 DKD와 같은 만성 질환에서 TCM의 효능을 개선하는 데 있어 시스템 생물학의 중요성을 강조합니다.

앞으로 이 기술은 TCM 연구, 특히 DKD와 같은 복잡한 질병의 치료에서 네트워크 약리학의 범위를 확장할 수 있는 중요한 가능성을 가지고 있습니다. 우리의 접근 방식은 신장 질환, 심혈관 질환 및 대사 질환 치료에 대한 치료 잠재력을 위해 다른 TCM 제형 또는 개별 허브를 탐색하는 데 적용될 수 있습니다. 또한 이 방법론은 DKD 치료에서 기존 약물의 새로운 용도를 식별하여 약물 용도 변경을 조사하도록 확장될 수 있습니다. 우리 접근 방식의 또 다른 잠재적 응용 분야는 개인 맞춤형 의료에 있습니다. 환자별 데이터를 통합함으로써 네트워크 약리학을 사용하여 개별 분자 프로필을 기반으로 한의학 치료 전략을 맞춤화하여 치료 효능을 높이고 부작용을 최소화할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 길림성 자연과학재단(No.20210101201JC)의 지원을 받았다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
무수 에탄올China National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
동물 실험 센터장춘 중국 전통 의학 대학SYXK (JI) 2023-0014
BATMAN-TCM 데이터베이스http://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
BCA 단백질 분석 키트SolarbioPC0020
차단 버퍼BeyotimeP0023B
세라믹 냄비MideaMD-DG30E103
화학 발광 이미징 시스템Hangzhou Shenhua Technology Co., LtdSH-523
클로로포름중국 국가 제약 그룹 화학 시약 Co., Ltd10006818
Cytoscape 3.8.0 소프트웨어---
DAB 시약 키트ServicebioG1212-200T
db/db 마우스Nanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL 기판 용액친화력KF8003
전기 항온 수조 냄비Fisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
전기영동 기기 전원 공급 장치Beijing Longfang Technology Co., LtdLF-600S
유리 균질화 기SolarbioYA0852
유리 슬라이드Nantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
염소 안티 토끼 IgG HRP(2차 항체)친화력S0001IHC용 1:3000, WB용 1:10000
HematoxylinWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
고속 냉장 원심분리기 Hunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA 와이퍼)VAZYMER223-01
수평 셰이커Jiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdTS-1
이미징 시스템Nikon Nikon DS-U3
지능형 디지털 자기 가열 교반기Hangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
이소프로판올중국 국가 제약 그룹 화학 시약 유한 공사80109218
마커 (20-120KD)GenScriptM00521
Masson 염색 키트BASOBA4079B
의료 거즈Jianerkang 의료-
Metascape 플랫폼http://metascape.org/gp/index.html--
메탄올온도67-56-1
미생물학 웹사이트http://www.bioinformatics.com.cn/--
현미경NikonECLIPSE Ci
전자 레인지Galanz 전자 레인지 전기 제품 Co., 주식 회사P70D20TL-P4
다 표본 조직 분쇄상해 Jingxin 산업 Development Co., LtdTissuelyser-24L
다기능 분석 전자 저울Changzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
중성 수지Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Normal Goat SerumSolarbioSL038
오븐Shanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
팜 원심 분리기Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS 염색 키트BASOBA4114B
병리학 슬라이서Shanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
PCR 기기Hangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
피펫 건DragonKE0003087/KA0056573
1차 항체 희석 완충액BeyotimeP0023A
단백질 인산가수분해효소 억제제 복합체MeilunbioMB12707-1
PVDF 멤브레인(0.22 μ m)SolarbioISEQ00010
빠른 1 차 / 2 차 항체 희석제SolarbioA1811
Rabbit anti-CD2APAffinityDF22981 : 200 IHC, 1 : 1000
Rabbit anti-COI-IAffinityDF12149IHC 1 : 200, WB
Rabbit anti-IL-1 & betaAffinityAF51031:1000 WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAffinityAF32191:1000 WB
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Rabbit anti-WT-1AffinityDF6331 IHC용 1:200, WB Rabbit anti-&alpha용 1:1000
;-SMAAffinityAF1032IHC용 1:200, WB Rabbit anti-&beta용 1:1000
;-WB용 ActinAffinityAF70181:1000
Real-Time PCR 시스템ABIQuantStudio 6
RIPA 용해 완충액MeilunbioMA0151
RNase-free ddH2OSolarbioR1600
2차 항체 희석 완충액BeyotimeP0023D
슬라이드 및 커버 유리Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd10212432C
SPSS 26.0 소프트웨어---
String 데이터베이스 웹사이트 https://cn.string-db.org/--
초순수 기기Zhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolymeraseTIANGENET105-02
TCMSP 데이터베이스 https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php--
조직 분쇄아름다운 벽MB-96
TrizolAmbion15596-026
트윈 20중국 국가 제약 그룹 화학 시약 Co., Ltd30189328
울트라 마이크로 UV 가시 분광 광도계Hangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Uniprot 단백질 데이터베이스https://www.uniprot.org--
정립 광학 현미경NikonNikon Eclipse CI
소변 단백질 테스트 키트난징 Jiancheng 생명공학 연구소C035-2
진공 동결 건조기Ningbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
수직 전기 영동 탱크베이징 61 기기 공장DYCZ-24DN
와류 믹서Wuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Western BlockingBuffer SolarbioSW3010
xyleneChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
Yihong무한 Lingsi 생명 공학 Co., LtdE8090
기 WB 1 : 1000;기

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