human CD59/intermedilysin cell ablation 도구를 사용하여 신장 대식세포의 재생을 연구하기 위한 신장 대식세포의 선택적 절제에 대한 프로토콜이 여기에 보고되어 있습니다. 이 방법은 신장, 간 및 지방 조직에 있는 다른 세포 집단의 기능 및 재생을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
방법 논문
human CD59/intermedilysin cell ablation 도구를 사용하여 신장 대식세포의 재생을 연구하기 위한 신장 대식세포의 선택적 절제에 대한 프로토콜이 여기에 보고되어 있습니다. 이 방법은 신장, 간 및 지방 조직에 있는 다른 세포 집단의 기능 및 재생을 연구하는 데에도 적용할 수 있습니다.
신장 대식세포(RM)는 신장 건강, 면역 감시, 조직 항상성 및 부상에 대한 반응을 조율하는 데 필수적입니다. 이전에 우리는 human CD59 (hCD59)/intermedilysin (ILY) 세포 절제 도구를 사용하여 골수 또는 배아 기원의 RM의 뚜렷한 운명, 역학 및 틈새를 연구했다고 보고했습니다. RM은 난황낭 유래 대식세포, 태아 간 단핵구, 골수 유래 단핵구에서 유래하며, 순환 단핵구의 국소 증식 및 모집을 통해 성인이 되어서도 유지됩니다. 여기에서는 1) 마우스 RM에서 hCD59의 Cre-inducible 발현의 생성 및 특성화, 2) ILY의 정제 및 ILY 활성의 특성화, 3) 복합 마우스에서 RM의 hCD59 발현 유도, 4) ILY 매개 RM 절제 후 재생의 특성화를 포함하여 RM의 재생을 연구하기 위한 선택적 절제에 대한 자세한 프로토콜을 보고합니다. ILY는 복합 마우스에서 RM을 특이적이고 빠르게 고갈시키며, ILY 투여 후 1일 이내에 효율적인 대식세포 절제를 실시합니다. 신장 대식세포 재생은 절제 후 3일째에 시작되어 7일째까지 ~88%의 회복율을 보였습니다. 이 모델은 대식세포 생물학을 연구하기 위한 강력한 도구를 제공하며 신장, 간 및 지방 조직의 다른 세포 집단을 선택적으로 절제하여 이들의 기능과 재생을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
신장 대식세포(RM)는 신장의 항상성을 유지하고, 면역 반응을 조절하며, 손상 후 조직 복구를 촉진하는 필수 면역 세포입니다. 그들은 phagocytosis, 항원 제시, 염증 및 항염증 반응의 오케스트레이션을 포함한 다양한 기능을 수행합니다 1,2,3. 지역 환경에 따라 RM은 전염증성(M1) 또는 항염증성(M2) 표현형으로 분극화될 수 있으며, 이는 부상을 악화시키거나 치유를 촉진할 수 있습니다 4,5,6. RM의 조절 장애는 급성 신장 손상(AKI) 및 만성 신장 질환(CKD)의 발병 및 진행과 관련이 있어 신장 건강 및 병리학에 중요한 역할을 합니다 7,8. RM은 배발생 시 난황낭 유래 대식세포, 태아 간 단핵구, 성인기 골수 유래 단핵구를 포함한 다양한 출처에서 발생합니다. RM은 출생 ....
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동물 연구 프로토콜은 Tulane University School of Medicine의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호 1482). 생후 10-12주, 체중 25-30g의 실험용 마우스 Cx3cr1CreER+/+ 및 ihCD59+/+는 대학의 동물 시설에서 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 사육되었습니다. 신장 격리와 관련된 모든 절차는 무균 환경에서 진행되었으며, 연구원들은 오염을 방지하기 위해 장갑과 안면 마스크를 착용했습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에서 확인할 수 있습니다.
1. 동물 준비
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His-Tag 재조합 ILY의 정제는앞서 14에서 설명한 것과 동일한 프로토콜을 따랐습니다. ILY는 E. coli BL21(DE3) 세포에서 성공적으로 발현되었으며, Streptococcus intermedius의 ILY 유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질전환되었습니다. IPTG를 유도한 결과, 표적 단백질의 과발현이 명백했습니다. 발현 후, ILY는 니켈-NTA 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하고, 특정 결합을 위해 C-말단 His-tag를 활용했습니다. ILY(~54kDa)의 순도 및 분자량은 SDS-PAGE 분석으로 확인되었습니다(그림 1A). 단백질 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 밀도 측정으로 정량화되었으며, 단백질 농도는 분광 광도계 분석으로 추가로 검증되어 최종 농도는 1.27mg/mL였습니다. 정제된 ILY의 생물학적 활성은 콜레스테롤 의존성 사이토리신을 평가하기 .......
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본 연구에서 His-tagged 재조합 ILY의 성공적인 발현, 정제 및 기능적 검증은 잘 확립된 프로토콜15을 따랐다. 그러나 이 과정에는 높은 단백질 수율, 순도 및 생물학적 활성을 보장하는 몇 가지 중요한 단계가 포함되었습니다. E. coli BL21(DE3) 세포의 IPTG 유도는 봉입체 형성을 최소화하면서 단백질 발현 수준의 균형을 맞추기 위해 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 견고함에도 불구하고 수율과 기능을 극대화하기 위해 특정 수정 및 문제 해결 단계가 필요했습니다. 한 가지 주요 수정 사항은 IPTG 농도 및 유도 온도를 최적화하는 것인데, 이는 더 높은 온도에서 과도한 발현으로 인해 불용성 응집체가 생성되었기 때문입니다. 37°C에서 IPTG가 0.2mM에서 0.5mM로 단계적으로 증가하면 용해도가 크게 향.......
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저자들은 이 원고에 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없음을 선언합니다. 재정적, 비재무적, 전문적 또는 개인적 제휴를 포함한 어떠한 이해 상충도 연구의 설계, 수행, 해석 또는 발표에 영향을 미치지 않았습니다.
우리는 이 연구에 사용된 프로토콜의 개발 및 개선에 기여한 Qin Lab의 전현직 구성원 모두에게 감사를 표합니다. 또한 이 연구에 중요한 역할을 한 재조합 ILY 플라스미드를 아낌없이 제공한 오클라호마 대학 보건 과학 센터의 R. K. Tweten 박사 그룹에도 감사드립니다. 이 연구는 NIH 5 P51OD011104-58, R01DK129881(X.Q.) 및 R21OD024931(X.Q.) 보조금을 통해 미국 국립보건원(NIH)의 지원을 받았습니다.
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