방법 논문

FEN1 nuclease 활성의 형광 기반 검출 및 소분자 억제제의 스크리닝

DOI:

10.3791/67968

⸱

2025년 6월 27일

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1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 FEN1(Flap Endonuclease 1) 활성 및 억제제 개발을 측정하기 위한 겔 시프트 생화학적 분석을 설명합니다.

초록

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FEN1(Flap Endonuclease 1)은 DNA 복제 및 손상 복구에 관여하는 핵심 DNA 뉴클레아제로, 게놈 안정성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. FEN1 활성의 높은 수준은 다양한 암의 발병과 밀접한 관련이 있으며, FEN1은 폐암, 유방암 및 전립선암에 대한 인정받는 바이오마커 및 약물 표적이 되었습니다. FEN1 뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 기존의 방사성 동위원소 태깅 방법은 편의성과 안전성 측면에서 어려움을 겪고 있습니다. 본 연구에서는 플랩 구조를 가진 DNA 단편 기질을 in vitro에서 합성하였다. 이 기질은 플랩의 5' 말단에 형광단으로 표지되어 FEN1 뉴클레아제가 지정된 부위를 특이적으로 인식하고 절단할 수 있도록 합니다. 그런 다음 겔 전기영동 후 형광단 신호를 검출하여 FEN1 활성을 측정했습니다. 이 방법을 사용하면 FEN1 nuclease 활성을 빠르고 효과적으로 평가하고 억제제를 스크리닝할 수 있습니다. FEN1 활성을 분석하고 저분자 억제제의 효능을 평가하기 위한 민감하고 구체적인 접근 방식을 제공합니다. 또한 DNA 손상 복구 및 암 발병에 대한 연구에 크게 기여하여 질병 메커니즘에 대한 임상 연구 및 유전 독성 물질 검출을 위한 새로운 전략을 제공합니다.

서론

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DNA 복제가 항상 흠잡을 데 없는 것은 아니며 내부 및 외부 요인에 의해 중단될 수 있습니다. 결과적으로, DNA 복제 및 손상 복구 메커니즘은 세포 생존과 게놈 안정성에 필수적입니다. 이 과정에서 핵심 DNA 뉴클레아제인 인간 분지 구조 특이적 엔도뉴클레아제 FEN1(Flap Endonuclease 1)이 중요한 역할을 합니다 1,2,3.

FEN1은 주로 DNA 복제에 관여하며 지체 가닥 4,5에서 오카자키 단편의 성숙에 필수적입니다. 이를 통해 DNA 복제의 효율적인 진행과 손상된 DNA의 정확한 복구를 보장할 수 있습니다. 그러나 FEN1 수치의 비정상적인 증가는 폐암 및 유방암7과 같은 다양한 암의 발병과 밀접한 관련이 있습니다 6,7. 따라서 FEN1은 DNA 복제 및 복구에 필수적일 뿐만 아니라 암 진단을 위한 바이오마커 및 잠재적인 치료 표적으로서 상당한 주목을 받고 있습니다 8,9. FEN1 활성의 검출은 암의 조기 진단과 표적 치료에 대한 연구를 진전시키는 데 필수적입니다.

FEN1의 중요성과 조기 암 진단 및 표적 치료제 개발을 위한 FEN1의 활성을 연구해야 할 필요성을 감안할 때, 이 실험에서 개발된 방법의 주요 목표는 FEN1 뉴클레아제 활성을 정확하고 효율적으로 측정하는 것이었습니다. 이 방법은 FEN1을 표적으로 하는 저분자 억제제를 스크리닝하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공하는 것을 목표로 합니다. 이러한 목표를 달성함으로써 이 연구는 암에서 FEN1의 역할을 더 잘 이해하고 새로운 치료 전략의 발견을 촉진하는 데 기여하고자 합니다.

FEN1 뉴클레아제 활성을 검출하기 위한 수많은 기술이 존재하며, 각 기술은 고유한 특성, 원리, 장점, 제한 사항 및 적용 가능한 시나리오를 가지고 있습니다. 예를 들어, 겔 전기영동 및 HPLC 기반 기질 분리 방법은 직관적인 결과를 제공하지만 절차가 번거롭고 처리량이 적습니다10,11. 형광 편광(FP) 분석은 FP 신호에 영향을 미치는 복합 자가형광 또는 광 산란의 간섭으로 인해 FEN1 활성을 평가하는 데 어려움을 겪습니다. 카운터 스크리닝 전략은 위양성을 부분적으로 배제할 수 있지만, 1차 활성 화합물의 약 15%는 기술적 간섭으로 인해 여전히 잘못 식별됩니다12. 형광 공여체/소광제 쌍(예: TAMRA/BHQ-2)과 AlphaScreen 화학발광을 함께 사용하면 복잡한 트리플 플랩 형광 기질의 높은 합성 비용과 같은 단점이 있으며, 특히 대규모 스크리닝에서 유용성이 제한됩니다. 또한 기질의 이중 플랩 구조는 FEN1과의 최적 결합을 방해하여 효소 절단 효율을 감소시키고 검출 감도를 손상시킬 수 있습니다. 또한 이 접근 방식은 특수 기기(예: ViewLux, EnVision)에 크게 의존하여 자원이 제한된 실험실에서의 채택을 제한합니다 13,14,15. 은 나노클러스터(DNA-AgNC)로 기능화된 이중 플랩 덤벨 모양의 DNA 나노프로브를 기반으로 하는 형광 검출 방법은 정밀한 어닐링 및 현장 핵형성 단계에 의존하기 때문에 배치 간 변동성이 있어 재현성과 확장성을 저해합니다. 높은 비용과 긴 절차는 실제 적용을 더욱 제한합니다16.

이 기사에서는 현재의 기술적 한계를 해결하고 FEN1 활성을 연구하기 위한 보다 안전하고 사용자가 액세스할 수 있는 방법에 대한 증가하는 수요를 충족하기 위해 형광 라벨링 기반 분석법을 개발했습니다. 이 기술은 형광 검출의 특이성과 높은 감도뿐만 아니라 FEN1에 의해 인식되고 절단될 수 있는 정의된 구조를 가진 DNA 기질을 엔지니어링할 수 있는 기능을 활용합니다(그림 1). 이 방법은 FEN1 nuclease 활성을 평가하는 데 높은 정확도를 유지하면서 실험 절차를 간소화합니다. 기존의 겔 전기영동 및 HPLC 기반 기술과 비교하여 작동이 단순화되고 처리 시간이 더 빠릅니다. 형광 편광 분석과 달리 이 접근법은 화합물의 신속한 정성적 스크리닝을 가능하게 하여 예비 효소 평가를 위한 효율적인 전략을 수립합니다.

이 방법은 방사성 물질에 대한 접근이 제한된 실험실 환경에서 FEN1 nuclease 활성을 연구하는 데 적합합니다. 또한 비교적 짧은 시간에 많은 수의 저분자 억제제를 스크리닝하는 데 적합하며, 특히 높은 감도와 특이성이 필요한 경우에 적합합니다. 그러나 매우 높은 정밀도의 절대 정량화가 필요한 연구나 기본 형광 검출 장비와 형광 신호 분석에 대한 전문 지식이 부족한 실험실에는 적합하지 않습니다. FEN1 거동이 현재 체외 분석 설계에서 복제되지 않은 복잡한 생물학적 요인에 의해 영향을 받을 수 있는 생체 내 응용 분야에 초점을 맞춘 연구의 경우 추가 개선 또는 대체 방법이 필요할 수 있습니다.

이 형광 분석은 매우 민감하고 특이적이어서 FEN1 활성을 연구하고 억제제를 개발하기 위한 안전하고 편리하며 효과적인 도구를 제공합니다.

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프로토콜

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이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. FEN1 단백질 발현 정제

  1. 단백질 정제
    1. 타겟 플라스미드( 재료 표 참조)를 포함하는 박테리아 스톡을 -80°C에서 제거합니다. 실온에서 해동하고 200μL 피펫 팁을 사용하여 동결된 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에서 50μg/mL 카나마이신이 포함된 20mL LB 배지에 200μL를 접종합니다.
      참고: 균주는 E. coli BL21(DE3)-FEN1입니다.
    2. 37 ° C에서 160 rpm으로 12 시간 동안 흔들면서 배양합니다.
    3. 박테리아 현탁액을 50μg/mL 카나마이신이 보충된 LB 배지가 함유된 200mL 삼각 플라스크로 옮깁니다. 37 ° C에서 160 rpm으로 2-3 시간 동안 흔들면서 배양을 계속합니다.
    4. 배양물의 OD600 이 약 0.6에 도달하면 IPTG 2mL(최종 농도: 1mM)를 첨가합니다. 25 ° C, 160 rpm에서 10 시간 동안 배양을 계속합니다.
    5. 유도된 배양액을 사전 칭량된 50mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 4°C 및 2500×g에서 15분 동안 원 심분리기. 상등액을 버리십시오. 펠릿 함유 튜브의 무게를 측정하고 빈 튜브의 무게를 빼서 펠릿 질량을 계산합니다.
    6. 습식 세포 펠릿 1g당 7mL의 용해 완충액을 추가합니다. 피펫을 사용하여 위아래로 피펫팅하여 펠릿을 완전히 재현탁합니다.
      참고: 용해 완충액(총 10mL)에는 20mM의 Tris-HCl, 250mM의 NaCl, 2% Triton X-100 및 ddH2O가 포함되어 있습니다. 화학 시약의 안전한 취급을 보장하기 위해 흄 후드에서 이 단계를 수행하십시오.
    7. 용해 완충액의 박테리아 현탁액을 -80°C 냉동고로 옮기고 밤새 동결합니다. 다음 날, 4°C 셰이커에서 현탁액을 1시간 동안 해동하여 용해 효율을 높입니다.
    8. 초음파를 사용하여 75% 전력으로 45분 동안 세포를 용해합니다. 용해물을 12,000 × g 에서 4 °C에서 20 분 동안 원심 분리하여 펠릿에서 상층액을 분리합니다.
      참고: 용해물이 탁한 상태로 유지되면 용해 완충액의 부피를 늘리거나 동결-해동 주기를 반복하십시오. 단백질 무결성을 보존하고 분해를 방지하기 위해 뉴클레아제 억제제를 추가할 수도 있습니다.
    9. 준비된 단백질 정제 수지가 들어 있는 튜브의 벽을 따라 정화된 상등액을 도포합니다. 10mL의 용출 완충액으로 세척하여 특이적으로 결합되지 않은 단백질을 제거합니다.
      참고: 용리 완충액에는 20mM의 Tris-HCl(pH 7.5), 250mM의 NaCl, 2% Triton X-100, 200mM의 이미다졸 및 증류수가 포함되어 있습니다.
    10. 튜브의 내벽을 따라 5mL의 용리 완충액을 추가하여 FEN1 단백질을 용리시킵니다.
  2. 신속한 coomassie brilliant blue 염색에 의한 표적 단백질 식별
    1. FEN12의 예상 크기에 따라 5% 분리 젤과 1% 스태킹 젤을 사용하여 SDS-PAGE 젤을 준비합니다.
    2. 표적 단백질 샘플과 BSA 표준물질을 5× 샘플 버퍼와 1:4 비율로 혼합합니다. 혼합물을 95°C에서 5분 동안 가열하여 단백질을 완전히 변성시킵니다.
    3. BSA 표준 및 변성 단백질 샘플 각각을 20μL를 SDS-PAGE 겔의 별도 웰에 로드합니다.
    4. 전기영동 장치를 연결합니다. 전압을 90V로 설정하고 1시간 40분 동안 실행합니다.
    5. 전기영동 후 겔을 염색 용기로 옮깁니다. 탈이온수로 헹군 다음 단백질 염색 용액 30mL를 넣고 25분 동안 염색합니다. 염색 용액을 회수하고 20mL의 탈이온수로 겔을 헹구고 수평 셰이커에서 밤새 탈색합니다.
    6. 탈색 후 투명한 플라스틱 접시에 젤을 놓고 백색광 아래에서 단백질 띠를 관찰합니다.
      참고: 밴드가 희미하거나 단백질 농도가 낮으면 한외여과 튜브를 사용하여 샘플을 농축하십시오. 이 단계는 과도한 용매 및 저분자를 제거하여 단백질 농도를 개선하고 후속 실험에서 정확한 분석을 보장합니다.

2. FEN1 TAMRA 표지 DNA 기질 준비

  1. TAMRA 표지 DNA 기질 준비
    1. 발표된 방법17을 참조하여 FEN1의 특정 절단 활성을 기반으로 DNA 올리고뉴클레오티드 가닥을 설계합니다( 표 1 참조). D1 염기서열의 5' 말단은 형광 TAMRA 라벨로 변형됩니다.
    2. 5 μL의 D1(10 pmol/μL), 10 μL의 T1(10 pmol/μL) 및 7.5 μL의 U2(10 pmol/μL) 용량의 어닐링 완충액 10 μL에 혼합 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드를 추가합니다. 탈이온수를 추가하여 총 부피를 50μL로 만듭니다.
      알림: 어닐링 버퍼에는 100mM의 Tris-HCl(pH 7.5)과 10mM의 MgCl2가 포함되어 있습니다.
    3. 반응 혼합물을 100°C의 금속 수조에서 1분 동안 가열한 다음 즉시 72°C에서 10분 동안 가열합니다18.
      참고: 최종 DNA 기질의 길이는 80개의 뉴클레오티드입니다. 높은 초기 온도(100°C)는 변성을 보장하고 어닐링 온도(72°C)는 정확한 스트랜드 쌍을 촉진합니다.
    4. 열원을 끄고 용액을 실온으로 서서히 냉각시켜 완전한 이중 가닥 DNA 기질을 형성합니다.
  2. TAMRA 표지 DNA 기질 분석
    1. 30% 아크릴아미드 4.8mL(29:1), 6M 요소 4.32mL, 5× TBE 2.4mL, 10% APS 50μL, TEMED 5μL 및 탈이온수 0.48mL를 혼합하여 12% 변성 폴리아크릴아미드 겔을 준비합니다. 젤을 준비하기 위해 철저히 섞습니다.
    2. 겔을 37°C 오븐에 30분 동안 넣어 굳힙니다.
    3. 검출을 위해 합성된 DNA 기질 2 μL를 증류수 18 μL에 피펫팅하고 7.7 μL Stop Buffer를 첨가합니다.
    4. 참고로, 2 μL의 TAMRA 표지 D1을 18 μL의 증류수에 피펫팅하고 7.7 μL의 Stop Buffer를 추가합니다.
    5. 준비된 각 시료 20μL를 겔에 로드하고 SDS-PAGE 전기영동을 수행하여 DNA 기질 형성을 분석합니다.

3. FEN1 뉴클레아제 활성 분석

  1. FEN1 효소 활성 분석
    1. 반응 완충액에서 2 μL의 DNA 기질과 FEN1 뉴클레아제를 결합하여 20 μL의 반응 혼합물을 준비합니다.
      참고: 반응 완충액은 100mM의 Tris-HCl(pH 7.5), 200mM의 MgCl2, 2mM의 DTT, 0.2mg/mL BSA 및 탈이온수로 구성됩니다.
    2. 반응 혼합물을 37°C의 금속 수조에서 15분 동안 배양합니다.
    3. 20 μL의 2× 종결 버퍼를 추가하여 반응을 종료합니다.
    4. 반응된 시료 20μL를 사전 준비된 12% 변성 폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 100V에서 60분 동안 전기영동을 수행합니다.
    5. 전기영동 후 형광 이미징 시스템(600 pathway)을 사용하여 결과를 시각화합니다.

4. FEN1 nuclease의 소분자 억제제 스크리닝

  1. 소분자 억제제 스크리닝
    1. 피펫을 사용하여 2μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    2. 튜브에 2μL의 FEN1 뉴클레아제와 10μL의 2× 반응 완충액을 추가합니다.
    3. 완전히 섞고 혼합물을 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다.
    4. 2 μL의 DNA 기질과 4 μL의 탈이온수를 첨가하고 철저히 혼합하여 총 반응 부피를 20 μL로 만듭니다.
    5. DMSO에서 1M 원액의 2배 연속 희석을 수행하여 FEN1 nuclease 억제제인 FEN1-IN-4의 작업 희석을 준비합니다.
    6. 2 μL의 FEN1 nuclease(0.03 μg/μL) 및 2 μL의 희석된 FEN1-IN-4 억제제를 새로운 1.5 mL microcentrifuge tube에 피펫팅합니다. 10 μL의 2× 반응 버퍼와 4 μL의 탈이온수를 추가합니다. 부드럽게 섞어 얼음 위에서 10분 동안 배양하여 억제제와 효소 사이의 충분한 상호 작용을 보장합니다.
    7. 튜브에 2 μL의 DNA 기질을 추가하여 최종 20 μL 반응 혼합물을 형성합니다.
    8. 37°C의 금속 수조에서 15분 동안 반응을 배양합니다.
    9. 20 μL의 2× 종결 버퍼를 추가하여 반응을 종료합니다.

5. FEN1--IN-4 소분자 억제제의 억제 효능 평가

  1. 마이크로피펫을 사용하여 10μL의 2× 반응 버퍼를 흡수하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 추가합니다.
  2. 0.03 μg/μL 농도의 FEN1 nuclease 2 μL와 다른 농도의 FEN1 inhibitor FEN1-IN-4 2 μL를 추가합니다.
    참고: 실험 요구 사항에 따라 다중 농도 구배를 설정해야 합니다.
  3. 4μL의 탈이온수를 넣고 용액을 철저히 혼합합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브를 얼음 위에 놓고 10분 동안 배양합니다.
  4. 2 μL의 이중 가닥 DNA 기질을 튜브에 추가하여 20 μL 반응 시스템을 형성합니다.
  5. EP 튜브를 37°C 금속 수조에 15분 동안 놓습니다.
  6. 반응이 완료된 후 20 μL의 2× stop buffer를 반응 혼합물에 추가하여 반응을 종료합니다.
  7. 형광 이미징 장치를 사용하여 결과를 관찰하고 IC50 곡선19를 플로팅합니다.
    참고: Fiji/ImageJ20을 사용하여 형광 강도 정량화를 수행한 후 그래프 및 분석 소프트웨어21을 사용하여 통계 분석 및 시각화를 수행했습니다.

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결과

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그림 2A에서 볼 수 있듯이 염색 시약은 단백질에 결합하여 단백질이 겔에 파란색 띠로 나타나게 합니다. 첫 번째 레인에는 BSA 표준 단백질 밴드는 70kDa의 분자량에 해당하고 FEN1 핵산 단백질 밴드는 45kDa의 분자량에 해당하는 분자량 참조로 사용되는 라벨링된 단백질이 포함되어 있습니다. 실험 결과는 FEN1 nuclease가 약 45kDa에서 clear band로 나타나 유도된 단백질 발현의 성공적인 정제를 나타내는 것으로 나타났습니다.

그림 2B에서 볼 수 있듯이, 레인 2의 D1은 59kDa의 밴드 크기를 갖는 플루오레세인 표지 단일 가닥 DNA 기질을 나타냅니다. 레인 3의 SF는 80kDa의 띠 크기를 갖는 합성된 플루오레세인 표지 이중 기판입니다. lane 2와 비교했을 때, 결과는 fluorescein-labeled double-stranded DNA ...

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토론

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FEN1 뉴클레아제 활성 분석 및 소분자 억제제 스크리닝은 DNA 손상 복구 및 암 발병에 대한 연구의 핵심입니다. 기존의 방사성 표지 기술과 비교했을 때, 현재의 방법은 비용 효율적이고 효율적이며 작동하기 쉽고 안전한 대안을 제공합니다. 또한 형광 버스트 기반 FEN1 분석과 달리 이 접근법은 기질 절단을 보다 직관적으로 시각화하여 효소 활성을 보다 정확하게 평가하고 관련 연구를 위한 보다 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다14.

결과의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해서는 몇 가지 주요 단계가 중요합니다. 첫째, 원핵생물 발현 시스템(E. coli BL21)을 사용하여 재조합 FEN1 단백질을 생산하여 효소 분석을 위한 대규모 단백질 생산을 가능하게 했습니다. N-말단 His 태그로 태그된 단백질은 니켈 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제되고 이미다졸로 용출...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 Jiangsu Higher Education Institution Innovative Research Team for Science and Technology(2021), Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center 프로그램(2023), Suzhou People's Livelihood Technology Projects(SYWD2024099)의 핵심 기술 프로그램, Soochow University(GZK12023013) 국가 방사선 의학 및 보호 핵심 연구소 프로젝트, Suoczhou Vocational Health College(SZWZYTD202201, SZWZYTD202205), 중국 장쑤성 칭란 프로젝트(2021, 2022).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1M 트리스-HCL비요타임ST774
30% Acr-Bis (29:1)비요타임ST003-500ml
5M 나클비요타임ST347
비요블루 플러스비요타임P0003S
BL21(DE3)-FEN1바지메C504-F1 시리즈
BSA비요타임P0007
탈색 셰이커킬린벨TS-100 시리즈
DL-디티오스레이톨비요타임ST041
건식 목욕 인큐베이터루이청DH200
전기영동 장치베이징 류이 바이오테크놀로지디디-6D
FEN1-IN-4타겟MOL티8545
IPTG다카바9030
카나마이신 슬러페이트바이오샤프BS152
실험실 원심분리기열SL 16R
LB 국물솔라바이오L8291
Ni-NTA His 바인드 수지7SE 생명공학PANF001-001C
오디세이 FC오디세이LI-코르
SDS-페이지비요타임P0015엘
트리션-x-100슈위안예에스15022

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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