Method Article

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

DOI:

10.3791/67980

⸱

July 11th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

수동 IBEX 방법을 사용하여 저비용의 다목적 광조사 기술을 구현하면 상당한 네이티브 자가형광으로 인체 조직을 최적으로 이미징할 수 있습니다. 이 프로토콜은 도립 현미경, 널리 사용 가능한 시약 및 이미지 정렬 및 처리를 위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 보관된 임상 샘플에서 다중화된 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

비결핵 마이코박테리아(NTM)로 인한 폐 질환의 유병률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. NTM에 의한 폐 질환은 종종 기관지 확장증, 폐 결절 및 공동 질환을 동반하지만, 이러한 뚜렷한 폐 손상 패턴과 관련된 숙주 반응은 현장에서 잘 규명되지 않았습니다. 우리는 NTM 질환 환자의 폐 조직 내 면역 세포 집단에 대한 심층 표현형 분석을 수행하여 육아종 염증, 결핵(TB) 폐 질환의 황금 표준과 비교하여 NTM 유발 병리학의 메커니즘을 평가하고자 했습니다.

파종성 NTM, 폐 NTM 또는 폐결핵 질환 환자의 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 폐 차단을 IBEX(Iterative Bleaching Extends multi-pleXity) 이미징 방법의 수정된 버전에 따라 절단하고 염색했습니다. IBEX 방법의 최적화는 FFPE 보존과 FFPE 블록의 나이에 의해 악화되는 폐 조직에 고유한 콜라겐, 엘라스틴 및 적혈구의 높은 밀도로 인한 폐 절편의 상당한 내인성 형광을 해결하기 위해 먼저 필요했습니다. 이 프로토콜에서는 임상적으로 보관된 샘플의 자가형광을 감소시키는 광조사 프로토콜과 수정된 항원 검색 방법에 대해 자세히 설명합니다.

또한 교차 반응성, 광조사 후 에피토프 손실, 인접한 형광단 간의 스펙트럼 중첩, 특정 표적에 대한 낮은 신호 대 잡음비와 같은 일반적인 문제를 포함하여 항체 패널 설계에 대한 지침을 제공합니다. 전체 폐 조직 절편의 효율적인 이미징을 용이하게 하기 위해 슬라이드는 광시야 현미경으로 이미지화하고 오픈 소스 소프트웨어로 후처리하여 이미지 품질을 개선했습니다. 이 워크플로우는 널리 사용 가능한 기기 및 시약을 사용하여 까다로운 샘플에서 고도로 다중화된, 고해상도, 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 문서화함으로써 중요한 요구 사항을 해결합니다. 임상 샘플의 정량적 이미징 외에도 이러한 기술은 다양한 샘플 유형에 적용하여 내인성 및 외인성 형광 소스를 모두 극복할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

결핵(TB)은 주요 사망 원인 중 하나로, 매년 약 130만 명이 결핵 감염으로 사망합니다1. 결핵만큼 치명적이지는 않지만, 최근 몇 년 동안 비결핵성 마이코박테리아(NTM)로 인한 폐 감염 및 그에 따른 질병이 크게 증가하고 있습니다2. 조직 수준에서 폐 결핵균(Mtb ) 감염에 대한 숙주 면역 반응은 잘 연구되어 왔으며 육아종, 림프구의 이질적인 응집체, 수지상 세포, 대식세포 및 호중구의 형성을 포함합니다3. 육아종 염증은 NTM 감염에 대한 숙주 면역의 근본적인 특징이기도 하지만, 면역 세포 집단과 이 반응의 공간적 특성은 여전히 연구가 부족합니다. 면역병리학과 상처 치유의 조직 구성 요소에 대한 자세한 이해를 얻는 것은 치료법(예: 숙주 유도 요법) 및 예방적(즉, 백신) 치료 전략의 개발에 매우 중요합니다.

이 연구에서 우리 팀은 Mtb 또는 NTM 감염 환자의 폐 절제 또는 부검 중에 얻은 희귀하고 보관된 임상 샘플에 액세스할 수 있었습니다. 이러한 샘플의 대부분은 10년 이상 된 것으로 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) ....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

보관된 부검 및 외과적 폐 조직 절제술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 임상 센터 병리학 연구소(National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology)에서 프로토콜 09-H-0172(NCT00943514), 기관지 확장증의 자연사(Natural History of Bronchiectasis)에 따라 수집되었습니다. 이 프로토콜은 IRB의 승인을 받았으며 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 자동 항원 회수

참고: 탈파라핀화 및 항원 검색은 자동화된 연구용 염색 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다(그림 1). 이전 연구에서는 시트르산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액(ER1)을 사용한 후 EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)을 사용한 30분으로 구성된 이중 항원 회수 접근법이 FFPE 조직에 대해 최상의 면역 표지 결과를 산출하는 것으로 확인되었습니다9. 수동 탈왁싱(manual dewaxing) 및 ....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

multiplexed antibody-based imaging panel을 설계하려면 상당한 시간, 노력 및 자원이 필요합니다12. 이러한 문제는 여기에 설명된 대로 고자가형광 조직에서 보관된 FFPE 샘플에 대한 패널을 설계할 때 특히 두드러집니다(그림 1). 이러한 문제를 극복하기 위해 먼저 dye inactivation 프로토콜과 호환되는 가장 밝은 형광단을 식별했습니다(표 1). 예를 들어, Alexa Fluor Plus 2차 항체는 Alexa Fluor 항체에 비해 면역형광 분석에서 신호 대 잡음비가 4배 더 높은 것으로 보고되었습니다(출처: AF Plus 제품 데이터 시트). 둘째, 밝은 형광단을 발현이 낮은 마커와 짝을 이루고, 가능할 때마다 1차 및 2차 항체 또는 스트렙타비딘-비오틴을 사용한 간접 면역 표지를 사용하여 신호를 증폭했습니다(표 1). 셋째, 자.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐결핵으로 인한 임상적 폐 병리학은 괴사성 육아종 염증이 특징입니다. NTM 폐 병리학은 주로 두 가지 별개의 병리학적 패턴을 가진 두 개의 별개의 환자 집단에서 발생한다: 면역 능력이 있는 개인에서 세기관지 소실 및 공동 형성을 동반한 육아종 염증을 특징으로 하는 고립성 폐 손상 또는 면역 결핍 개인의 폐 및 기타 장기에 영향을 미치는 미만성 결절 질환 13,14,15,16. 이 세 가지 형태의 마이코박테리아 폐 병리학을 비교할 때, 국소 염증의 면역학적 세포 구성, 세포-세포 상호 작용의 공간적 맥락, 손상 부위에서 두드러진 염증성 대 조절 사이토카인 생성의 차이점 또는 유사성에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 우리는 희귀한 역사적 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.J.R.은 Leica Microsystems, Inc.의 직원입니다. 다른 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 DIR/NIAID, NCI 및 NHLBI의 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 NIH와의 기관 라이선스 계약에 따라 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.3% 트리톤-X-100시그마-알드리치T8787버퍼 차단용 솔루션
1% BSA시그마-알드리치A4503버퍼 차단용 솔루션
1% 인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220버퍼 차단에 필요한 Fc 블록
150W LED 램프아마존B07VH3CVSF조직 광조사용 LED 광원
1x PBS 깁코10010-023버퍼 및 세척 단계를 차단하기 위한 솔루션
20갤런 저장 용기아마존B001B1C4G0광조사 공정용 용기
40W RGBW 투광 LED 램프 아마존B08QFPJSMD조직 광조사용 RGB 광원
Ag85B아브캠AB43019/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
알파 평활근 액틴 DyLight 755노부스 바이오로제스NBP2-345221R/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
아비딘/비오틴 차단 키트아브캠AB64212아비딘 및 비오틴 차단 용액
BD 사이토픽스/사이토퍼름BD 바이오사이언스554714고정 솔루션
BOND 탈랍 솔루션라이카 바이오시스템즈NC0221076탈파라핀화 용액
BOND 에피토프 회출 솔루션 1라이카 바이오시스템즈NC0235529구연산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액(ER1)
BOND 에피토프 회출 솔루션 2라이카 바이오시스템즈NC0235530EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)
BOND 연구 탐지 시스템라이카 바이오시스템즈NC0396648자동 연구용 염색 시약
BOND RX 연구 염색기라이카 바이오시스템즈NA자동화된 연구용 염색 플랫폼
BOND 워시 솔루션라이카 바이오시스템즈NC0221077세척 완충액
CD15BD 바이오사이언스347420/AB_400298IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-82/AB_11150959IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD4 알렉사 플루어 488R& D 시스템FAB8165G/AB_2728839IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD45 피코에리트린(PE)노부스 바이오로제스NBP2-34528PE/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD68 아이플루어 594카프리코 바이오테크놀로지1064135/AB_2892745IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488써모 피셔 사이언티픽A32814/AB_2762838IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647써모 피셔 사이언티픽A32787/ AB_2762830IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488잭슨 면역 연구715-545-020/AB_2340844IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555써모 피셔 사이언티픽A32794/AB_2762834IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
EasyDip 염색 시스템신규 공급5300킷슬라이드 염색 시스템
플루오로마운트-G써모 피셔 사이언티픽00-4958-02마운팅 미디어
회크스트생물 유통40046IBEX 이미징을 위한 핵 염색. 표 1을 참조하십시오.
Imaris 파일 변환기 x64 10.2.0이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트무료 파일 변환기
ImarisViewer 소프트웨어 x64 10.2.0이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트무료 이미지 처리 소프트웨어
ImmEdge 펜벡터 연구소H-4000소수성 배리어 펜
수소화붕리튬(1g)STREM 화학93-0397염료 비활성화용 화학 물질, 이 화학 물질의 작은 분취량(1g)을 구입하십시오.
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF2846IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
마이크로 커버 안경VWR48393-241유리 슬라이드 커버
범사이토케라틴 알렉사 플루어 750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
PELCO BioWave Pro 마이크로파 시스템테드 펠라 Inc36500-230비가열 과학 전자레인지
PELCO 스테디템프 프로테드 펠라 Inc50062과학용 전자레인지를 위한 완전 자동화된 온도 제어
심플이케이오픈 소스 소프트웨어등록 및 채널 처리 소프트웨어
스트렙타비딘 알렉사 플루어 594써모 피셔 사이언티픽S11227IBEX 이미징용 라벨링 시약. 표 1을 참조하십시오.
광시야 현미경라이카 마이크로시스템즈NALED8 광원과 LAS X 소프트웨어(3.7.1.21655)가 있는 라이카 마이크로시스템즈 THUNDER 이미저. 형광 이미징의 경우, 외부 필터 휠(PN: 11536075)과 2개의 추가 단일 대역 필터(PN: 8118215)가 있는 맞춤형 쿼드 밴드 필터를 사용하여 패스당 7개의 염료 채널을 이미지화했습니다. 필터 여기, 이색성 및 방출선은 (1) 쿼드 밴드 큐브: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31에서 이색성, 여기 또는 방출 필터 없음; (2) 외부 필터 휠 위치 1: 434/32, 위치 2: 520/40, 위치 3: 585/20, 위치 4: 720/60, 위치 5: 통과; (3) 단일 대역 1— 585/22 여기, 594 이색성, 625/30 방출; (4) 단일 대역 2— 635/20 여기, 647 이색성, 667/30 방출.
Zeiss 광학 렌즈 클리너아마존B00GPVQVCO현미경 대물 렌즈 클리너
항체
Ag85B아브캠AB43019다클론 토끼 IgG, 주기 1
알파 평활근 액틴 DyLight 755노부스 바이오로제스NBP2-345221R1A4/asm-1, 사이클 1
CD4 알렉사 플루어 488R& D 시스템FAB8165G다클론 염소 IgG, 주기 1
CD8 알렉사 플루어 647바이오레전드372906C8/144B, 사이클 1
CD68 아이플루어 594카프리코 바이오테크놀로지1064135KP1, 주기 1
당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488써모 피셔 사이언티픽A32814다클론 당나귀, 주기 1
당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647써모 피셔 사이언티픽A32787다클론 당나귀, 주기 1
당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555써모 피셔 사이언티픽A32794다클론 당나귀, 주기 1
회크스트생물 유통40046핵 라벨, 사이클 1
CD15BD 바이오사이언스347420MMA, 사이클 2
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-82L26, 주기 2
CD45 피코에리트린(PE)노부스 바이오로제스NBP2-34528PE2B11 + PD7/26, 사이클 2
당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488잭슨 면역 연구715-545-020다클론 당나귀, 주기 2
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF2846다클론 염소 IgG, 주기 2
범사이토케라틴 알렉사 플루어 750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF750AE-1/AE-3, 사이클 2
스트렙타비딘 알렉사 플루어 594써모 피셔 사이언티픽S11227N/A, 주기 2
회크스트생물 유통40046주기 2
솔루션
차단 버퍼(주기 1)
트리톤-X-100시그마-알드리치T87870.3% 부피 기준
BSA시그마-알드리치A4503부피 기준 1%
인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220부피 기준 1%
1x PBS 깁코10010-02397.7% (부피 기준)
<강>1차 항체 염색액 #1(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
회크스트생물 유통400461:5000
CD8 AF647바이오레전드3729061:10
1차 항체 염색 용액 #2(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD4  AF488R& D 시스템FAB8165G1:10
Ag85B아브캠AB43019/NA1:100
<강함>2차 항체 염색액 #1(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
당나귀 안티 염소 AF 플러스 488써모 피셔 사이언티픽A32814/AB_27628381:100
당나귀 안티 토끼 AF 플러스 555써모 피셔 사이언티픽A32794/AB_27628341:100
당나귀 안티 마우스 AF 플러스 647써모 피셔 사이언티픽A32787/AB_27628301:50
<강함>1차 항체 염색액 #3(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD68 iF594카프리코 바이오테크놀로지10641351:10
a-SMA DL755노부스 바이오로제스NBP2-345221R/NA1:30
BSA 프리 차단 완충액(사이클 2) 
트리톤-X-100시그마-알드리치T87870.3% 부피 기준
인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220부피 기준 1%
1x PBS 깁코10010-02398.7% (부피 기준)
<강함>1차 항체 염색액 #4(사이클 2)
BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD15BD 바이오사이언스3474201:30
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF28461:100
CD45 PE노부스 바이오로제스NBP2-34528PE1:20
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-821:10
범사이토케라틴 AF750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF7501:10
<강>2차 항체 염색액 #2(사이클 2)
BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
당나귀 안티 마우스 IgM AF488잭슨 면역 연구715-545-020/AB_23408441:100
스트레파비딘 AF594써모 피셔 사이언티픽S112271:200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global tuberculosis report 2023. , World Health Organization. https://iris.who.int/bitstream/handle/10665/373828/9789240083851-eng.pdf?sequence=1 (2023).
  2. Dahl, V. N., et al. Global trends of pulmonary infections with nontuberculous mycobacteria: A systematic review. Int J Infect Dis. 125, 120-131 (2....

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Iterative BleachingMultiplex ImagingAutofluorescent SamplesSpatial ProteomicsFFPE Lung TissuePhotoirradiation ProtocolAntibody Panel DesignWhole Slide ImagingGranulomatous InflammationImmune Cell Mapping

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