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방법 논문

반복적인 표백을 위해 최적화된 워크플로우는 고도의 자가형광 임상 샘플의 멀티플렉시티 이미징을 확장합니다.

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/67980

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2025년 7월 11일

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1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

수동 IBEX 방법을 사용하여 저비용의 다목적 광조사 기술을 구현하면 상당한 네이티브 자가형광으로 인체 조직을 최적으로 이미징할 수 있습니다. 이 프로토콜은 도립 현미경, 널리 사용 가능한 시약 및 이미지 정렬 및 처리를 위한 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 보관된 임상 샘플에서 다중화된 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 자세히 설명합니다.

초록

비결핵 마이코박테리아(NTM)로 인한 폐 질환의 유병률은 전 세계적으로 증가하고 있습니다. NTM에 의한 폐 질환은 종종 기관지 확장증, 폐 결절 및 공동 질환을 동반하지만, 이러한 뚜렷한 폐 손상 패턴과 관련된 숙주 반응은 현장에서 잘 규명되지 않았습니다. 우리는 NTM 질환 환자의 폐 조직 내 면역 세포 집단에 대한 심층 표현형 분석을 수행하여 육아종 염증, 결핵(TB) 폐 질환의 황금 표준과 비교하여 NTM 유발 병리학의 메커니즘을 평가하고자 했습니다.

파종성 NTM, 폐 NTM 또는 폐결핵 질환 환자의 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 폐 차단을 IBEX(Iterative Bleaching Extends multi-pleXity) 이미징 방법의 수정된 버전에 따라 절단하고 염색했습니다. IBEX 방법의 최적화는 FFPE 보존과 FFPE 블록의 나이에 의해 악화되는 폐 조직에 고유한 콜라겐, 엘라스틴 및 적혈구의 높은 밀도로 인한 폐 절편의 상당한 내인성 형광을 해결하기 위해 먼저 필요했습니다. 이 프로토콜에서는 임상적으로 보관된 샘플의 자가형광을 감소시키는 광조사 프로토콜과 수정된 항원 검색 방법에 대해 자세히 설명합니다.

또한 교차 반응성, 광조사 후 에피토프 손실, 인접한 형광단 간의 스펙트럼 중첩, 특정 표적에 대한 낮은 신호 대 잡음비와 같은 일반적인 문제를 포함하여 항체 패널 설계에 대한 지침을 제공합니다. 전체 폐 조직 절편의 효율적인 이미징을 용이하게 하기 위해 슬라이드는 광시야 현미경으로 이미지화하고 오픈 소스 소프트웨어로 후처리하여 이미지 품질을 개선했습니다. 이 워크플로우는 널리 사용 가능한 기기 및 시약을 사용하여 까다로운 샘플에서 고도로 다중화된, 고해상도, 전체 슬라이드 이미지를 얻는 방법을 문서화함으로써 중요한 요구 사항을 해결합니다. 임상 샘플의 정량적 이미징 외에도 이러한 기술은 다양한 샘플 유형에 적용하여 내인성 및 외인성 형광 소스를 모두 극복할 수 있습니다.

서론

결핵(TB)은 주요 사망 원인 중 하나로, 매년 약 130만 명이 결핵 감염으로 사망합니다1. 결핵만큼 치명적이지는 않지만, 최근 몇 년 동안 비결핵성 마이코박테리아(NTM)로 인한 폐 감염 및 그에 따른 질병이 크게 증가하고 있습니다2. 조직 수준에서 폐 결핵균(Mtb ) 감염에 대한 숙주 면역 반응은 잘 연구되어 왔으며 육아종, 림프구의 이질적인 응집체, 수지상 세포, 대식세포 및 호중구의 형성을 포함합니다3. 육아종 염증은 NTM 감염에 대한 숙주 면역의 근본적인 특징이기도 하지만, 면역 세포 집단과 이 반응의 공간적 특성은 여전히 연구가 부족합니다. 면역병리학과 상처 치유의 조직 구성 요소에 대한 자세한 이해를 얻는 것은 치료법(예: 숙주 유도 요법) 및 예방적(즉, 백신) 치료 전략의 개발에 매우 중요합니다.

이 연구에서 우리 팀은 Mtb 또는 NTM 감염 환자의 폐 절제 또는 부검 중에 얻은 희귀하고 보관된 임상 샘플에 액세스할 수 있었습니다. 이러한 샘플의 대부분은 10년 이상 된 것으로 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 샘플로 보존되어 조직학적 분석으로 사용이 제한되었습니다. 기존 면역조직화학(IHC) 및 면역형광(IF) 이미징의 마커 한계를 극복하기 위해 오픈 소스, 고도의 다중화 이미징 방법인 IBEX(Iterative Bleaching Extends multi-pleXity) 방법을 활용했습니다 4,5. IBEX 방법을 인간 폐 FFPE 샘플로 확장하려면 높은 수준의 내인성 형광으로 인해 상당한 최적화가 필요했으며, 이는 다중 항체 기반 이미징에 대한 잘 설명된 장애물입니다6.

여기에서는 폐 FFPE 조직 절편에 최적화된 광조사 방법을 사용하여 자가형광을 줄이기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다 7,8. 중요한 것은 여기에 설명된 방법이 자가형광이 높은 다른 시료 전처리로 확장할 수 있는 저렴하고 널리 사용 가능한 라이트 박스를 사용한다는 것입니다. 이미지 획득 전에 자가형광을 줄이는 것 외에도 저농도 마커와 밝은 형광단 표지를 페어링하고, 항체 표지에 대한 광조사의 영향을 평가하고, 내인성 형광이 높은 채널에서 2차 항체를 사용한 증폭과 같은 항체 패널 설계에 대한 지침을 제공합니다. 평균적으로 하나의 조직 절편에 해당하는 5개의 슬라이드를 처리했으며, 각 슬라이드는 37mm에서 114mm2 사이였습니다. 마지막으로, 광시야 기기를 사용하여 전체 슬라이드 이미지를 획득하는 방법을 보여줍니다. 요약하면, 이 프로토콜은 보관된 임상 샘플에 IBEX를 채택하는 방법을 설명하고 고도의 자가형광 샘플을 이미징할 때 일반적으로 발생하는 문제를 해결하는 방법에 대한 지침을 추가로 제공합니다.

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프로토콜

보관된 부검 및 외과적 폐 조직 절제술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 임상 센터 병리학 연구소(National Institutes of Health Clinical Center Laboratory of Pathology)에서 프로토콜 09-H-0172(NCT00943514), 기관지 확장증의 자연사(Natural History of Bronchiectasis)에 따라 수집되었습니다. 이 프로토콜은 IRB의 승인을 받았으며 참가자는 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 자동 항원 회수

참고: 탈파라핀화 및 항원 검색은 자동화된 연구용 염색 플랫폼을 사용하여 수행되었습니다(그림 1). 이전 연구에서는 시트르산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액(ER1)을 사용한 후 EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)을 사용한 30분으로 구성된 이중 항원 회수 접근법이 FFPE 조직에 대해 최상의 면역 표지 결과를 산출하는 것으로 확인되었습니다9. 수동 탈왁싱(manual dewaxing) 및 이중 항원 회수(dual antigen retrieval)를 사용하여 IBEX Imaging Community10,11에서 제공하는 다른 설명 방법 및 지원을 사용하여 유사한 결과를 얻을 수 있습니다.

  1. 슬라이드 및 자동 항원 회수 용품(슬라이드 커버, 연구 검출 시스템, 구연산염 기반 pH 6 항원결정기 회수 용액(ER1), EDTA 기반 pH 9 항원결정기 회수 용액(ER2) 등)을 수집합니다.
  2. 기기를 켜고 20분 동안 초기화한 다음 연구 감지 암을 기기에 넣고 시약 용기를 기계 바닥에 삽입합니다.
  3. 소프트웨어를 열고 슬라이드 설정을 클릭한 다음 연구 추가를 선택하고 스터디의 새 이름을 만듭니다.
  4. 슬라이드 추가를 선택하고 원하는 대로 슬라이드에 레이블을 지정합니다.
  5. 이 프로토콜을 따르려면 ER1의 30분과 ER2의 30분으로 구성된 HIER 프로토콜로 Bake 및 Dewax 프로토콜을 수행합니다.
  6. 레이블을 인쇄하여 슬라이드 위에 놓습니다. 기기에서 검은색 슬라이드 랙을 제거하고 관심 있는 슬라이드를 랙에 놓습니다. 각 슬라이드에 투명 슬라이드 덮개를 놓고 슬라이드 랙을 기기로 되돌린 다음 랙 아래의 버튼을 눌러 기기에 슬라이드의 바코드 스캔을 수행하라는 메시지를 표시합니다.
  7. 재생 | 확인을 선택하고 약 3시간의 지속 시간으로 자동 항원 검색이 시작되도록 합니다.

2. 광조사 전 항체 라벨링

  1. 항원 검색이 완료되면 슬라이드를 PBS에 담급니다.
    참고: 특정 에피토프는 광조사에 민감하며 LED에 하룻밤 동안 노출되면 성능이 저하됩니다. 민감한 항원결정기는 경험적으로 결정해야 하며, 발견 시 이 단계에서 이러한 항원결정기의 면역 표지가 이루어져야 합니다. 항원 회수 후 슬라이드가 항상 젖은 상태로 유지되는지 확인하십시오.
  2. PBS에서 하나의 슬라이드를 제거하고 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 슬라이드의 모든 초과 PBS를 건조시킵니다. 티슈를 만지지 않도록 주의하세요. 소수성 펜으로 조직 주위에 테두리를 그립니다. 나머지 모든 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다. 소수성 장벽을 10분 동안 건조시킵니다.
  3. 각 우물의 바닥에 소량의 물을 넣어 슬라이드 수분 챔버를 준비합니다. 슬라이드 수분 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 조직 표본에 직접 닿지 않고 조직에서 PBS를 흡수합니다.
  4. 각 슬라이드에 200μL의 차단 버퍼(Table of Materials)를 추가합니다. Slide Moisture Chamber를 일정한 온도를 유지하기 위한 메커니즘이 있는 비가열 과학용 전자레인지에 넣습니다.
  5. 이전에 수립된 프로그램4: 2-1-2-1-2-1-2-1-2-1-2 프로그램을 실행하여 비특이적 항체 라벨링을 차단하며, 여기서 "2"는 100W에서 2분, "1"은 0W에서 1분을 나타냅니다. 블로킹을 위해 위의 프로그램을 한 번 실행합니다. 이 기기를 사용할 수 없는 경우 앞서 설명한 대로 37°C에서 1시간 동안 조직 절편(5-10μm)을 차단합니다5.
  6. 차단 버퍼 배양 중 Primary Antibody Staining Solution #1 (Cycle 1) (Table of Materials)을 생성합니다.  Table of Materials에 따라 항체 혼합물을 준비합니다. 항체 칵테일을 부드럽게 혼합하고 미니 원심분리기로 2,680 × g에서 30 초 동안 항체 혼합물을 회전시킵니다.
    참고: 이 염색 용액에는 2주기 실험 기간 동안 충분해야 하는 1:5000 희석액의 Hoechst가 포함되어 있습니다. 사용자는 조직 및 이미징 구성에 대한 최적의 결과를 얻기 위해 Hoechst 및 기타 항체를 적정해야 할 수 있습니다.
  7. 사이클이 완료되면 전자레인지에서 Slide Moisture Chamber를 제거하고 각 조직에서 차단 완충 용액을 흡수합니다. 각 슬라이드에 200μL의 1차 항체 염색 용액 #1(주기 1)(재료 표)을 추가합니다. 슬라이드가 있는 챔버를 다시 마이크로파에 넣고 약 30분 동안 1차 항체 프로그램을 실행합니다: 1차 항체 라벨링을 위해 2-1-2-1-2-1-2-1-2 프로그램을 두 번 실행합니다.
    참고: 여기서 200μL의 1차 항체 용액은 추정치입니다. 조직 섹션의 전체 표면을 덮을 수 있도록 적절한 양의 용액을 사용하십시오.
  8. 1차 항체 라벨링 단계가 완료되면 슬라이드를 수직으로 기울이고 PBS를 조직에 피펫팅한 다음 PBS가 흘러내리도록 하여 각 슬라이드를 1,000μL의 PBS로 세척합니다. 이 단계를 3-5회 반복합니다.
  9. 과도한 PBS를 제거하고 습도 챔버의 실온에서 10분 동안 1% 파라포름알데히드(PFA)로 슬라이드를 고정합니다.
    참고: PFA 고정은 항원결정기를 마스킹하여 항체가 의도한 표적에 결합하는 것을 방지할 수 있습니다. 항체 패널을 처음 구축할 때, 면역 라벨링 전에 고정제의 유무에 관계없이 처리된 조직 절편의 라벨링 패턴을 비교하여 부드러운 고정(10분 동안 1% PFA)의 영향을 평가하는 것이 좋습니다. 항체가 1% PFA 고정에 민감한 경우 고정 후 단계 전에 이 항체를 이동합니다.
  10. 1,000μL의 PBS 3-5x로 슬라이드를 광범위하게 세척합니다. 광조사 단계까지 조직에 PBS를 남겨 둡니다.

3. 조직 광조사

  1. 광조사 상자(그림 2)를 준비하려면 150W LED 램프, 40W RGBW 투광 LED 램프, 대형 플라스틱 용기(20갤런[75.71L] 부피 이상), 신선한 1x PBS 및 페트리 접시를 준비합니다.
  2. 페트리 접시를 150W 램프 중앙에 놓고 1x PBS로 채웁니다. 슬라이드를 PBS에 담글 수 있을 만큼 충분한 볼륨을 사용합니다. 램프의 발열을 최소화하기 위해 냉장실에서 광조사 과정을 수행합니다.
  3. 슬라이드 수분 챔버에서 슬라이드를 제거하고 페트리 접시에 넣고 모든 슬라이드가 PBS에 잠기도록 합니다.
  4. 40W 램프를 광원이 슬라이드를 향하도록 페트리 접시 바로 위에 놓습니다. 40W lamp 배치하기 전에 빨간색 표시등 설정으로 설정되어 있습니다.
  5. 150W 및 40W 램프를 모두 켭니다. 플라스틱 용기 뚜껑으로 광조사 설정을 덮습니다. 40W 램프를 유지합니다.amp 2시간 동안 적색 표시등 설정을 켠 다음 나머지 16시간 동안 포함된 리모컨을 통해 녹색 표시등 설정으로 전환합니다.
    참고: 슬라이드 조직의 원치 않는 열 변형을 방지하기 위해 약 4°C에서 광조사를 수행하는 것이 필수적입니다. 일시 중지 지점: 하룻밤 동안 광방사선 조사를 수행할 수 있으며 다음 날 아침에 프로토콜을 재개할 수 있습니다.

4. 광조사 후 항체 라벨링

  1. 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 Coplin 용기, 50mL 원뿔형 튜브 또는 슬라이드 염색 시스템의 버킷에 1x PBS에 담그십시오. Primary Antibody Staining Solution #2 (Cycle 1) (Table of Materials)를 권장 희석액으로 준비합니다(표 1). 각 슬라이드에 200μL의 용액을 사용합니다.
  2. 보푸라기가 없는 닦음으로 각 슬라이드에서 과도한 PBS를 흡수하여 조직 자체를 건드리지 않고 조직 주변 영역을 건조시킵니다. 슬라이드 수분 챔버에 슬라이드를 놓습니다.
  3. Primary Antibody Staining Solution #2(사이클 1)를 부드럽게 와류로 도용하고 각 슬라이드에 200μL를 추가하여 전체 조직이 덮이도록 합니다.
  4. 슬라이드가 있는 슬라이드 수분 챔버를 다시 전자레인지에 넣고 2.7단계에 설명된 대로 약 30분 동안 기본 항체 프로그램을 실행합니다.
  5. 1차 항체 라벨링 중에 2차 항체 염색 용액 #1(주기 1) 용액(Table of Materials)을 만듭니다.
  6. 마이크로웨이브 프로그램이 완료되면 슬라이드 수분 챔버를 제거하고 각 슬라이드를 1,000μL의 1x PBS로 3-5x 세척합니다.
  7. 보푸라기 없는 와이프로 각 슬라이드에서 과도한 PBS를 제거하고, 2차 항체 염색 용액을 와류로 가열하고, 각 슬라이드에 200μL를 추가합니다.
  8. 슬라이드 수분 챔버를 마이크로파에 넣고 2차 항체 프로그램을 실행합니다: 2-1-2-1-2-1-2-1-2-1-2 프로그램, 여기서 "2"는 100W에서 2분, "1"은 0W에서 1분을 나타냅니다. 2차 항체 라벨링을 위해 위의 프로그램을 한 번 실행합니다.
  9. 1x PBS 1mL로 슬라이드를 3-5회 광범위하게 세척하고 각 슬라이드에서 과도한 PBS를 흡수합니다.
  10. 직접 접합 항체를 포함하는 Primary Antibody Staining Solution #3(주기 1)을 각 슬라이드에 추가합니다. 2.7단계에서 설명한 대로 마이크로파 또는 대안(37°C에서 1시간)을 사용하여 항체 염색을 수행합니다.
  11. 1x PBS 1mL로 슬라이드를 3-5회 다시 세척하고 각 슬라이드에서 과도한 PBS를 조심스럽게 흡수합니다.
  12. 30μL의 마운팅 배지를 각 조직 섹션에 직접 추가하고 조직 섹션 전체를 덮는 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드에 기포가 있는지 검사하고 부드러운 압력으로 기포를 슬라이드 주변으로 밀어 넣습니다. 나머지 슬라이드에 대해 이 과정을 반복합니다.
  13. 보푸라기가 없는 천으로 여분의 장착 매체를 제거하고 광학 렌즈 클리너를 사용하여 커버슬립 표면에 남아 있는 잔여물을 청소합니다. 현미경에서 이미지 획득을 수행하기 전에 모든 슬라이드를 실온에서 10-15분 동안 설정하도록 합니다.

5. 현미경 검사 설정 및 이미지 획득

  1. 광시야 현미경과 LED8 광원을 켭니다. 소프트웨어를 실행합니다. 대물렌즈를 선택합니다(여기서는 20x/0.8 건조 대물렌즈). 구성 탭에서 카메라를 16비트 모드로 설정합니다. 항체 패널에 존재하는 형광단을 기반으로 필요한 채널을 선택합니다(추가 지침은 표 1 참조).
    참고: 참조된 현미경에 대해 다음 단계가 지정되어 있습니다. 여러 형광단의 여기 및 방출을 위한 유사한 광원 및 필터 큐브와 정밀 스테이지를 갖춘 동등한 광시야 현미경을 사용할 수 있습니다.
  2. 이미징 직전에 렌즈 클리너와 렌즈 종이로 커버슬립을 청소하십시오. 이미징하기 전에 커버슬립을 육안으로 검사하고 표면에서 먼지나 보푸라기를 제거하십시오. 슬라이드를 스테이지 인서트의 왼쪽 상단 모서리(또는 이에 상응하는 모서리)에 단단히 배치하여 조직이 XY 평면에 일관되게 배치되도록 합니다(주기적 이미지의 정렬에 중요).
  3. 항체 패널에 포함된 각 형광단에 해당하는 채널을 생성하여 획득 설정을 지정합니다. 각 형광단에 해당하는 필터 큐브 와 LED 를 선택합니다. 각 LED의 강도와 각 채널의 노출 시간을 조정합니다. 여기에 사용된 이미지 설정 목록은 표 1 을 참조하십시오.
  4. 이미지를 획득하기 전에 Hoechst 채널을 선택하고 Linked Shading을 켭니다. 링크된 음영 처리 마법사를 사용하여 선택한 목표에 대해 이 옵션을 설정합니다.
    참고: 이 프로토콜은 큰 타일 스캔을 획득하여 전체 슬라이드 이미지를 수행하는 방법을 자세히 설명합니다. 타일링 이미지에서 고르지 않은 조명을 극복하기 위해 연결된 음영 또는 음영 보정이 필요합니다.
  5. 소프트웨어에서 라이브 버튼을 클릭하여 Hoechst 채널을 시각화합니다. 거친 초점 손잡이를 사용하여 조직 부분에 초점을 맞춥니다.
  6. 각 형광 채널을 선택하고 주기 내 모든 형광 표지 항체에 대해 예상되는 염색 패턴에 대한 조직 단면을 평가합니다.
  7. 소프트웨어에서 Navigator를 선택합니다. Navigator의 Hoechst 채널 및 나선형 기능을 사용하여 이미징할 전체 조직 섹션 또는 관심 영역을 매핑합니다. 슬라이드당 여러 조직 단면을 이미지화하는 경우 이 단계를 반복하여 Navigator를 사용하여 조직의 맵을 만듭니다.
  8. Navigator에서 폴리곤, 마술 지팡이 또는 기타 ROI 선택 도구를 사용하여 이미지화할 ROI를 식별합니다. 원하는 ROI를 커버하는 데 필요한 가장 적은 타일을 캡처하기 위해 조직 윤곽을 조심스럽게 그립니다. 추가 타일을 삭제하여 총 획득 시간을 줄입니다.
  9. ROI가 생성되면 채널 설정을 검토하고 조정하여 포화 픽셀을 최소화하고 신호 대 잡음을 최적화합니다. 이미지 표시 창에서 히트맵 조회 테이블을 선택합니다. 색상은 픽셀의 채우기 수준을 나타내며 빨간색, 주황색, 노란색 및 흰색은 보기 쉬운 강도 변화를 나타냅니다. 파란색 픽셀은 포화 픽셀을 나타냅니다. 정보 손실과 이미지 품질 저하를 방지하려면 노출 시간을 줄여 채도(파란색) 픽셀의 수를 최소화하십시오.
  10. Navigator에서 Focus Map 도구를 사용하여 조직의 지형도를 생성합니다. 큰 타일 또는 고르지 않은 샘플에 대해 3-4 FOV마다 초점 맵 포인트를 설정합니다.
    참고: 이 단계는 전체 슬라이드 이미징에 필요한 대형 타일 스캔에 중요합니다. 일반적으로 이미지의 품질은 선택한 초점 맵 포인트의 수에 따라 조정됩니다. 그러나 이 프로세스는 특히 큰 타일 스캔의 경우 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.
    1. 현미경으로 스캔할 순서대로 Focus Map Point를 생성합니다. 참조된 현미경의 타일 스캔 순서와 일치시키려면 현미경에서 사용하는 경로와 일치하는 구불구불한 경로를 따라 Focus Map Points를 선택합니다.
    2. 수동 초점을 사용하여 첫 번째 초점 맵 포인트를 설정합니다. 나머지 포커스 맵 포인트에 대해 자동 초점을 사용합니다. 앉아서 각 초점 맵 포인트에 대해 최적의 초점이 선택되었는지 확인하십시오. 필요에 따라 초점 맵 포인트를 수동으로 조정합니다. 고르지 않거나 큰 조직에 대한 각 Focus Map Point를 찾는 데 사용되는 범위를 늘립니다.
  11. 다음 매개변수를 사용하여 처리를 설정합니다: RI(굴절률)가 장착 매체(여기서는 1.4)와 일치하도록 설정된 SVCC(Small Volume Computational Clearing); 강도는 98%로 설정되고 형상 크기는 멤브레인 마커의 경우 2,000nm, 핵 마커의 경우 3,000nm로 설정됩니다. 영상을 획득하는 동안 계산 지우기 프로토콜을 실행합니다.
  12. 타일 스캔을 시작합니다. 타일 번호를 기록하고 모든 사이클에서 ROI를 일정하게 유지합니다.
  13. 이미지 획득 후, Smooth 옵션을 선택한 상태에서 Process 탭에 있는 Mosaic Merge를 사용하여 계산적으로 지워진 이미지를 병합합니다. 각 이미지에 스티칭 오류가 있는지 육안으로 검사하고 타일링 오류가 있는 경우 새 매개변수로 Mosaic Merge를 반복합니다.
    참고: 잘못 정렬된 이미지는 반복적으로 획득한 이미지의 정합을 방지합니다.
  14. 필요한 경우 Dye Separation 모듈을 사용하여 앞서 설명한 대로 채널 간 스펙트럼 스필오버를 보상합니다5.

6. 염료 불활성화, 항체 라벨링 및 이미지 획득 주기

  1. 이미지 획득이 완료된 후 커버슬립이 떨어질 때까지 멸균 1x PBS의 50mL 원뿔형 튜브에 슬라이드를 담그십시오. 커버슬립이 떨어지지 않으면 PBS를 슬라이드 바로 위에 대거나 핀셋을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 제거합니다.
  2. 플라스틱 계량 보트에 3-5mg의 분말을 측정하여 리튬 수소화물(LiBH4) 용액을 준비합니다. 분말에 직접 1:1 비율로 diH2O를 첨가하고(예: 3.2mg의 LiBH4 및 3.2mL의 diH2O) 용액을 피펫으로 균질화합니다. 주사기를 사용하여 0.2μm 필터를 통해 용액을 50mL 원뿔형 튜브에 넣고 농도와 용액이 생성된 정확한 시간을 기록합니다. 용액 전체에 큰 기포가 보일 때까지 용액을 실온에서 3-5분 동안 배양합니다.
    참고: 준비 후 4시간 이내에 염료 불활화 용액을 사용하는 것이 좋습니다. 주의: 화학 흄 후드에서 다음 단계를 수행하고 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오. 이 반응은 가연성이 높은 수소 가스를 생성할 수 있습니다. 항상 소량의 LiBH4(<10mg)로 작업하는 것이 중요합니다. 추가 지침은 IBEX Knowledge-Base10,11에서 LiBH4를 안전하게 준비하는 방법에 대한 튜토리얼 비디오를 시청하십시오.
    LiBH4 바이알은 공기에 반복적으로 노출된 후 표백 효과가 감소하므로 4주 사용 후 교체하십시오. 소량의 LiBH4 (1g)를 구입하는 것이 좋습니다.
  3. 1x PBS 담그기에서 각 슬라이드를 제거하고 보푸라기가 없는 닦음으로 여분의 PBS를 흡수한 다음 슬라이드 수분 챔버에 넣습니다.
  4. 조직을 덮을 수 있을 만큼 충분한 부피로 슬라이드에 용액을 직접 피펫으로 주입하여 4분 동안 LiBH4로 덮이지 않은 각 슬라이드를 처리합니다. 각 슬라이드에서 기존 LiBH4 용액을 제거하고 동일한 LiBH4 원액에서 10분 및 20분에 LiBH4의 새 부분 표본으로 새로 고칩니다.
  5. 1x PBS로 슬라이드를 3-5x 광범위하게 세척하십시오. PBS의 빠른 교환을 사용하여 세탁당 1분 동안 슬라이드를 담그십시오.
  6. 배경 빼기를 위한 이미지를 획득하려면 4.12-4.13단계에 설명된 대로 각 슬라이드에 새 커버슬립을 배치하고 조직 후 염료 비활성화의 이미지를 획득합니다. 배경 빼기 이미지에 대한 새 프로젝트를 만들고 5.2-5.14단계를 반복하여 이미지를 획득합니다. 사이클 1 이미지에 대해 설정된 것과 동일한 수의 타일, 채널, 채널 설정 및 FOV를 사용하여 이미지. 초점 맵 포인트는 동일한 FOV에 유지하되 자동 초점을 사용하여 이 새 이미지의 각 초점 맵 포인트를 조정합니다.
    참고: 반복되는 기준 마커(Hoechst)가 포함된 채널을 사용하여 '실시간' 이미지(예: 배경 빼기 이미지) 및 이전 이미지(주기 1)에 존재하는 고유한 구조(핵 모양)를 식별합니다.
  7. 두 번째 항체 주기에서 비오틴화된 항체의 비특이적 형광 신호를 최소화하려면 아비딘 및 비오틴 차단을 수행합니다.
    1. 과도한 PBS를 제거하고 실온에서 15분 동안 각 슬라이드에 avidin 차단 용액을 도포합니다.
    2. 1x PBS로 슬라이드를 3-5x 세척하고 세척이 완료되면 여분의 PBS를 흡수합니다.
    3. 실온에서 15분 동안 각 슬라이드에 비오틴 차단 용액을 바르고 6.7.2단계와 같이 1x PBS로 슬라이드를 3-5x 세척합니다.
  8. 다음을 위한 새로운 BSA-free 차단 버퍼(주기 2)(재료 표)를 준비합니다.
    1차 항체 염색 용액 #4(주기 2) 및 2차 항체 염색 용액 #2(주기 2).
    참고: 이러한 용액에는 BSA가 아비딘/비오틴 차단 단계를 손상시킬 수 있기 때문에 소 혈청 알부민이 필요하지 않습니다.
  9. 1차 항체를 Primary Antibody Staining Solution #4(주기 2)에서 제조업체에서 권장하는 농도로 희석합니다. 이 용액을 부드럽게 와류로 만들고 습도 챔버 내의 각 슬라이드에 추가하여 조직이 기본 항체 용액으로 완전히 덮이도록 합니다. 슬라이드가 있는 슬라이드 수분 챔버를 전자레인지에 넣고 30-2.7단계에 설명된 대로 약 2.8분 동안 1차 항체 프로그램을 실행합니다.
  10. 4.6-4.9단계에 설명된 대로 Secondary Antibody Staining Solution #2(주기 2)를 사용하여 2차 항체 라벨링을 수행합니다. 염색이 완료되면 앞서 4.12-4.13단계에서 설명한 대로 각 슬라이드에 새 커버슬립을 놓습니다. 슬라이드를 현미경 스테이지에 다시 놓고 이전 이미지와 동일한 XY 평면에 있도록 슬라이드를 재배치합니다.
    참고: 반복되는 기준 마커(Hoechst)가 포함된 채널을 사용하여 '실시간' 이미지(예: 사이클 2)와 이전 이미지(사이클 1)에 존재하는 고유한 구조(핵 모양)를 식별합니다.
  11. 주기 2 이미지에 대한 새 프로젝트를 만들고 5.2-5.14단계를 반복하여 주기 2 이미지를 획득합니다. 사이클 1 이미지에 대해 설정된 것과 동일한 수의 타일, 채널, 채널 설정 및 FOV를 사용하여 이미지. 포커스 맵 포인트를 동일한 FOV에 유지하되 자동 초점을 사용하여 이 새 이미지의 각 포커스 맵 포인트를 조정합니다. cycle 2 이미지가 획득되면 이미지 정렬을 진행하거나 직접 접합된 항체를 사용한 추가 cycles에 대해 섹션 6의 단계를 반복합니다. 참고: 반복되는 기준 마커(Hoechst)가 포함된 채널을 사용하여 '실시간' 이미지(예: 사이클 2 이미지)와 이전 이미지(사이클 1)에 존재하는 고유한 구조(핵 모양)를 식별합니다. 추가 주기에는 IBEX가 항체를 제거하지 않기 때문에 직접 접합 항체가 필요합니다.

7. 이미지 정렬

  1. 현미경 출력 .lif 파일의 원시 이미지를 무료 파일 변환기를 사용하여 .ims 파일로 변환하고 앞에서 설명한 대로 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리를 수행하며5 IBEX Knowledge-Base10,11의 비디오에 자세히 설명되어 있습니다.
  2. 각 이미징 주기에 대해 파일을 편집하고 원하는 처리 단계(예: 채널 이름 지정, 채널 의사 착색)를 적용합니다.
    1. SimpleITK용으로 생성된 채널 산술 함수를 사용하여 배경 빼기 및 채널 임계값 설정을 수행하여 자가형광 신호(https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html)를 줄입니다.
      참고: 하나의 합성 이미지로 정렬하기 전에 각 이미지(예: Cycle 1, Cycle 2)에 대해 이 단계를 수행합니다. 이는 큰 결합 이미지보다 더 작은 개별 이미지에서 작업하는 것이 더 쉽기 때문입니다.
  3. 등록 소프트웨어를 사용하기 위해 일관된 명명 전략을 고안합니다. 접두사 구분 기호 문자-접미사(예: 'Cycle1 CD8_AF647')가 있는 채널 이름을 구분 기호로 사용하고 첫 번째 주기에서 anti-CD8 AF647 항체가 사용된 채널을 나타내기 위해 공백을 표시합니다.
    참고: 자세한 내용은 도움말 파일 확장자를 참조하십시오. https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. 모든 채널의 이름을 적절하게 지정한 후 등록 소프트웨어를 시작하고 Imaris 확장 | 심플ITK | 아피네.
  5. 파일 이름 옆에 있는 찾아보기 단추를 사용하여 각 주기에 대한 .ims 파일을 업로드합니다. 채널 이름 접두사 구분 기호 문자를 입력합니다. 위의 예를 따르는 경우 공백 하나를 입력하고 Next를 클릭합니다.
  6. 사이클 사이의 공통 기준 마커로 사용되는 등록 채널을 선택합니다(예: Hoechst).
  7. 다른 이미지가 등록될 이미지인 고정 이미지를 선택합니다.
    참고: 반복 이미지의 Cycle 2에 등록하는 것이 좋습니다.
  8. '출력 파일'에 대해 원하는 디렉토리를 선택합니다. Start registration at resolution(해상도에서 등록 시작 ) 옵션은 가능한 최상의 등록을 허용하기 위해 기본적으로 최대 해상도로 설정됩니다. 컴퓨팅 파워가 제한되어 있으면 이 매개 변수를 줄이십시오.
    참고: 여기에 설명된 데이터(이미지당 12-15GB)의 경우 최대 해상도 5를 사용했습니다.
  9. 등록을 클릭하여 시작합니다. 등록이 완료되면 Resample 및 Save Combined Image 버튼이 나타날 때까지 기다렸다가 클릭한 다음 진행률 표시줄이 완료될 때까지 기다립니다.
  10. 처리 소프트웨어에서 완료된 출력 파일을 엽니다. 모든 사이클 및 채널 정보와 함께 등록된 이미지를 사용할 수 있으며 분석 또는 게시할 준비가 됩니다.

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결과

multiplexed antibody-based imaging panel을 설계하려면 상당한 시간, 노력 및 자원이 필요합니다12. 이러한 문제는 여기에 설명된 대로 고자가형광 조직에서 보관된 FFPE 샘플에 대한 패널을 설계할 때 특히 두드러집니다(그림 1). 이러한 문제를 극복하기 위해 먼저 dye inactivation 프로토콜과 호환되는 가장 밝은 형광단을 식별했습니다(표 1). 예를 들어, Alexa Fluor Plus 2차 항체는 Alexa Fluor 항체에 비해 면역형광 분석에서 신호 대 잡음비가 4배 더 높은 것으로 보고되었습니다(출처: AF Plus 제품 데이터 시트). 둘째, 밝은 형광단을 발현이 낮은 마커와 짝을 이루고, 가능할 때마다 1차 및 2차 항체 또는 스트렙타비딘-비오틴을 사용한 간접 면역 표지를 사용하여 신호를 증폭했습니다(표 1). 셋째, 자...

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토론

폐결핵으로 인한 임상적 폐 병리학은 괴사성 육아종 염증이 특징입니다. NTM 폐 병리학은 주로 두 가지 별개의 병리학적 패턴을 가진 두 개의 별개의 환자 집단에서 발생한다: 면역 능력이 있는 개인에서 세기관지 소실 및 공동 형성을 동반한 육아종 염증을 특징으로 하는 고립성 폐 손상 또는 면역 결핍 개인의 폐 및 기타 장기에 영향을 미치는 미만성 결절 질환 13,14,15,16. 이 세 가지 형태의 마이코박테리아 폐 병리학을 비교할 때, 국소 염증의 면역학적 세포 구성, 세포-세포 상호 작용의 공간적 맥락, 손상 부위에서 두드러진 염증성 대 조절 사이토카인 생성의 차이점 또는 유사성에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 우리는 희귀한 역사적 ...

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공개 사항

A.J.R.은 Leica Microsystems, Inc.의 직원입니다. 다른 저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 DIR/NIAID, NCI 및 NHLBI의 교내 연구 프로그램의 지원을 받았습니다. 그림 1 은 NIH와의 기관 라이선스 계약에 따라 BioRender를 사용하여 제작되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.3% 트리톤-X-100시그마-알드리치T8787버퍼 차단용 솔루션
1% BSA시그마-알드리치A4503버퍼 차단용 솔루션
1% 인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220버퍼 차단에 필요한 Fc 블록
150W LED 램프아마존B07VH3CVSF조직 광조사용 LED 광원
1x PBS 깁코10010-023버퍼 및 세척 단계를 차단하기 위한 솔루션
20갤런 저장 용기아마존B001B1C4G0광조사 공정용 용기
40W RGBW 투광 LED 램프 아마존B08QFPJSMD조직 광조사용 RGB 광원
Ag85B아브캠AB43019/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
알파 평활근 액틴 DyLight 755노부스 바이오로제스NBP2-345221R/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
아비딘/비오틴 차단 키트아브캠AB64212아비딘 및 비오틴 차단 용액
BD 사이토픽스/사이토퍼름BD 바이오사이언스554714고정 솔루션
BOND 탈랍 솔루션라이카 바이오시스템즈NC0221076탈파라핀화 용액
BOND 에피토프 회출 솔루션 1라이카 바이오시스템즈NC0235529구연산염 기반 pH 6 에피토프 회수 용액(ER1)
BOND 에피토프 회출 솔루션 2라이카 바이오시스템즈NC0235530EDTA 기반 pH 9 에피토프 회수 용액(ER2)
BOND 연구 탐지 시스템라이카 바이오시스템즈NC0396648자동 연구용 염색 시약
BOND RX 연구 염색기라이카 바이오시스템즈NA자동화된 연구용 염색 플랫폼
BOND 워시 솔루션라이카 바이오시스템즈NC0221077세척 완충액
CD15BD 바이오사이언스347420/AB_400298IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-82/AB_11150959IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD4 알렉사 플루어 488R& D 시스템FAB8165G/AB_2728839IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD45 피코에리트린(PE)노부스 바이오로제스NBP2-34528PE/NAIBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
CD68 아이플루어 594카프리코 바이오테크놀로지1064135/AB_2892745IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488써모 피셔 사이언티픽A32814/AB_2762838IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647써모 피셔 사이언티픽A32787/ AB_2762830IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488잭슨 면역 연구715-545-020/AB_2340844IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555써모 피셔 사이언티픽A32794/AB_2762834IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
EasyDip 염색 시스템신규 공급5300킷슬라이드 염색 시스템
플루오로마운트-G써모 피셔 사이언티픽00-4958-02마운팅 미디어
회크스트생물 유통40046IBEX 이미징을 위한 핵 염색. 표 1을 참조하십시오.
Imaris 파일 변환기 x64 10.2.0이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트무료 파일 변환기
ImarisViewer 소프트웨어 x64 10.2.0이마리스 옥스퍼드 인스트루먼트무료 이미지 처리 소프트웨어
ImmEdge 펜벡터 연구소H-4000소수성 배리어 펜
수소화붕리튬(1g)STREM 화학93-0397염료 비활성화용 화학 물질, 이 화학 물질의 작은 분취량(1g)을 구입하십시오.
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF2846IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
마이크로 커버 안경VWR48393-241유리 슬라이드 커버
범사이토케라틴 알렉사 플루어 750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF750/AB_2868569IBEX 이미징용 항체. 표 1을 참조하십시오.
PELCO BioWave Pro 마이크로파 시스템테드 펠라 Inc36500-230비가열 과학 전자레인지
PELCO 스테디템프 프로테드 펠라 Inc50062과학용 전자레인지를 위한 완전 자동화된 온도 제어
심플이케이오픈 소스 소프트웨어등록 및 채널 처리 소프트웨어
스트렙타비딘 알렉사 플루어 594써모 피셔 사이언티픽S11227IBEX 이미징용 라벨링 시약. 표 1을 참조하십시오.
광시야 현미경라이카 마이크로시스템즈NALED8 광원과 LAS X 소프트웨어(3.7.1.21655)가 있는 라이카 마이크로시스템즈 THUNDER 이미저. 형광 이미징의 경우, 외부 필터 휠(PN: 11536075)과 2개의 추가 단일 대역 필터(PN: 8118215)가 있는 맞춤형 쿼드 밴드 필터를 사용하여 패스당 7개의 염료 채널을 이미지화했습니다. 필터 여기, 이색성 및 방출선은 (1) 쿼드 밴드 큐브: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31에서 이색성, 여기 또는 방출 필터 없음; (2) 외부 필터 휠 위치 1: 434/32, 위치 2: 520/40, 위치 3: 585/20, 위치 4: 720/60, 위치 5: 통과; (3) 단일 대역 1— 585/22 여기, 594 이색성, 625/30 방출; (4) 단일 대역 2— 635/20 여기, 647 이색성, 667/30 방출.
Zeiss 광학 렌즈 클리너아마존B00GPVQVCO현미경 대물 렌즈 클리너
항체
Ag85B아브캠AB43019다클론 토끼 IgG, 주기 1
알파 평활근 액틴 DyLight 755노부스 바이오로제스NBP2-345221R1A4/asm-1, 사이클 1
CD4 알렉사 플루어 488R& D 시스템FAB8165G다클론 염소 IgG, 주기 1
CD8 알렉사 플루어 647바이오레전드372906C8/144B, 사이클 1
CD68 아이플루어 594카프리코 바이오테크놀로지1064135KP1, 주기 1
당나귀 안티 염소 IgG Alexa Fluor Plus 488써모 피셔 사이언티픽A32814다클론 당나귀, 주기 1
당나귀 안티 마우스 IgG Alexa Fluor Plus AF647써모 피셔 사이언티픽A32787다클론 당나귀, 주기 1
당나귀 안티 토끼 IgG Alexa Fluor Plus AF555써모 피셔 사이언티픽A32794다클론 당나귀, 주기 1
회크스트생물 유통40046핵 라벨, 사이클 1
CD15BD 바이오사이언스347420MMA, 사이클 2
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-82L26, 주기 2
CD45 피코에리트린(PE)노부스 바이오로제스NBP2-34528PE2B11 + PD7/26, 사이클 2
당나귀 안티 마우스 IgM Alexa Fluor 488잭슨 면역 연구715-545-020다클론 당나귀, 주기 2
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF2846다클론 염소 IgG, 주기 2
범사이토케라틴 알렉사 플루어 750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF750AE-1/AE-3, 사이클 2
스트렙타비딘 알렉사 플루어 594써모 피셔 사이언티픽S11227N/A, 주기 2
회크스트생물 유통40046주기 2
솔루션
차단 버퍼(주기 1)
트리톤-X-100시그마-알드리치T87870.3% 부피 기준
BSA시그마-알드리치A4503부피 기준 1%
인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220부피 기준 1%
1x PBS 깁코10010-02397.7% (부피 기준)
<강>1차 항체 염색액 #1(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
회크스트생물 유통400461:5000
CD8 AF647바이오레전드3729061:10
1차 항체 염색 용액 #2(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD4  AF488R& D 시스템FAB8165G1:10
Ag85B아브캠AB43019/NA1:100
<강함>2차 항체 염색액 #1(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
당나귀 안티 염소 AF 플러스 488써모 피셔 사이언티픽A32814/AB_27628381:100
당나귀 안티 토끼 AF 플러스 555써모 피셔 사이언티픽A32794/AB_27628341:100
당나귀 안티 마우스 AF 플러스 647써모 피셔 사이언티픽A32787/AB_27628301:50
<강함>1차 항체 염색액 #3(사이클 1)
차단 버퍼(주기 1)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD68 iF594카프리코 바이오테크놀로지10641351:10
a-SMA DL755노부스 바이오로제스NBP2-345221R/NA1:30
BSA 프리 차단 완충액(사이클 2) 
트리톤-X-100시그마-알드리치T87870.3% 부피 기준
인간 BD Fc 블록BD 바이오사이언스564220부피 기준 1%
1x PBS 깁코10010-02398.7% (부피 기준)
<강함>1차 항체 염색액 #4(사이클 2)
BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
CD15BD 바이오사이언스3474201:30
루미칸 비오틴R& D 시스템BAF28461:100
CD45 PE노부스 바이오로제스NBP2-34528PE1:20
CD20 e플루어 660써모 피셔 사이언티픽50-0202-821:10
범사이토케라틴 AF750노부스 바이오로제스NBP2-33200AF7501:10
<강>2차 항체 염색액 #2(사이클 2)
BSA 프리 블로킹 버퍼(사이클 2)위 참조항체 추가 후 볼륨까지 보충
당나귀 안티 마우스 IgM AF488잭슨 면역 연구715-545-020/AB_23408441:100
스트레파비딘 AF594써모 피셔 사이언티픽S112271:200

참고문헌

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  9. Radtke, A. J., et al. Multi-omic profiling of follicular lymphoma reveals changes in tissue architecture and enhanced stromal remodeling in high-risk patients. Cancer Cell. 42 (3), 444-463.e10 (2024).
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  23. Laurent, G. J. Lung collagen: More than scaffolding. Thorax. 41 (6), 418-428 (1986).
  24. Lakowicz, J. R. Principles of frequency-domain fluorescence spectroscopy and applications to cell membranes. Subcell Biochem. 13, 89-126 (1988).

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