방사선 민감성 및 방사선 저항성 유전자 공개를 위한 게놈 와이드 CRISPR 스크리닝

생물학적 현상에 대한 연구는 본질적으로 세포 행동에 대한 연구와 얽혀 있으며, 세포 행동에 대한 조사는 근본적으로 게놈 탐사와 연결되어 있습니다. 현대 기술이 계속 발전함에 따라 의학 연구자들은 다양한 질병의 치료 결과를 향상시키기 위해 유전자 편집을 통해 세포 행동을 변화시키는 데 점진적으로 관심을 돌리고 있습니다. 이와 관련하여, CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 기술은 비교적 간단한 응용 프로그램으로 인해 게놈 편집을 위한 혁신적인 도구로 부상했습니다¹. CRISPR-Cas9 시스템은 Cas9 nuclease와 single-guide RNA (sgRNA)로 구성되며, 이는 표적 DNA 염기서열을 특이적으로 인식하고 결합하여 Cas9 nuclease가 해당 위치에서 절단되도록 유도하여 게놈 DNA ^2,3,4에서 이중 가닥 절단(DSB)을 초래합니다. 또한 다른 물질의 도입은 게놈에 특정 삽입, 결실 또는 돌연변이로 이어져 표적 유전자 편집을 가능하게 할 수 있습니다.

기능 유전체학 연구에서 RNA 간섭(RNAi) 스크리닝은 한때 암의 유전자 역할을 조사하기 위해 대규모 기능 상실 실험을 수행하는 데 널리 사용되는 방법이었습니다. RNAi 기술은 표적 유전자를 특이적으로 침묵시켜 유전자 기능을 연구하여 연구자들이 중요한 발암 요인을 식별하는 데 도움을 줍니다. 그러나 off-target 효과와 불완전한 유전자 녹다운 효율로 인해 제한됩니다. off-target 효과는 다른 비표적 유전자의 침묵으로 이어질 수 있으며, 이로 인해 실험 결과의 정확성과 신뢰성이 손상될 수 있습니다 ^1,2. 또한 RNAi는 특정 유전자에 대해 낮은 knockdown 효율을 나타내어 표적 유전자 발현을 완전히 억제하지 못할 수 있습니다. 기존의 RNAi 스크리닝과 달리 CRISPR 스크리닝은 더 높은 특이성과 효율성을 보여줍니다³. 이 기술은 특정 유전자의 정밀한 편집을 가능하게 할 뿐만 아니라 게놈 전체의 대규모 스크리닝을 가능하게 하여 유전자 기능 연구를 강력하게 지원합니다. CRISPR-Cas9 시스템을 기반으로 하는 강력한 유전자 편집 도구인 CRISPR 스크 리닝 기술은 세포 ^5,6,7,8 내 특정 유전자의 알려지지 않은 기능을 효율적으로 스크리닝하고 밝히는 데 사용됩니다. 연구자들은 특정 유전자 또는 유전자 영역에 대해 배치로 sgRNA를 설계하고 해당 sgRNA 라이브러리를 정밀하고 엄격하게 준비하여 무결성과 기능을 보장합니다⁹. 그런 다음 이러한 sgRNA 라이브러리는 렌티바이러스 입자로 캡슐화되어 숙주 세포를 효율적으로 감염시키는 데 사용됩니다. 성공적인 감염 후, 감염된 세포는 개인적으로 정의된 선별 검사 조건 하에서 배양됩니다. 스크리닝 시 스크리닝된 세포의 게놈 DNA가 추출되어 높은 수준의 순도와 양을 유지합니다. 그 후, sgRNA 관심의 표적 영역은 PCR 증폭, 핵산의 원하는 세그먼트를 정확하게 복제하는 과정인 ^3,9를 받습니다. 마지막으로, 증폭된 DNA 단편에 대해 고처리량 염기서열분석(high-throughput sequencing)을 수행하여 표적 부위를 포괄적이고 효율적으로 분석할 수 있게 함으로써 연구 대상 유전자의 기능과 행동에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다⁴.

암은 복잡한 질병으로서 인간의 건강에 무서운 위협이 되고 있습니다. 전 세계적으로 연구자와 임상의는 발암의 분자 메커니즘을 밝히고 새로운 치료 전략을 개발하기 위해 공동의 노력을 기울이고 있습니다. 기초 연구 결과를 임상 애플리케이션으로 빠르게 전환하기 위해 국제 협력이 구축되었으며, 궁극적인 목표는 환자 결과를 개선하는 것입니다. Sasmal 등은 전이성 암세포를 정확하게 표적화하기 위해 합성 숙주-게스트 시스템을 기반으로 하는 생체 직교 조립 전략을 제안했으며, 이는 수십 명의 과학자들이 의료 기술을 발전시키는 데 크게 도움이 되었습니다. 이들의 뛰어난 연구 작업은 높은 혁신성과 고유한 통찰력을 가지고 있어 과학계에 의미 있는 기여를 하고 있다¹⁰. 암은 DNA 손상 반응의 불규칙한 조절로 인해 발생하는 유전체 불안정성의 격동적인 상태를 특징으로 합니다^11-14. DNA 손상에는 단일 뉴클레오티드 결함, 단일 가닥 절단 및 DSB가 포함됩니다. 상동 재조합(HR) 및 비상동 말단 결합(NHEJ)은 서로 다른 단계에서 DSB의 복구에 참여합니다 15,16,17. 이러한 토대에 기초하여 방사선 요법은 고에너지 광선(예: X선 및 γ선)을 사용하여 종양 조직에 방사선을 조사하여 종양 세포의 DNA 손상을 일으킴으로써 종양 세포의 성장과 증식을 방해하는 실행 가능한 치료 옵션으로 부상했습니다¹⁸. 그러나 방사선 요법이 상당수의 암 환자에서 항상 원하는 효과를 나타내는 것은 아니며, 이는 잠재적으로 파라암 조직의 손상 및 방사선 요법에 대한 낮은 민감도와 같은 종양의 고유한 특성으로 인한 한계로 인해 발생할 수 있습니다 19,20,21.

이론적으로 모든 세포 유형을 CRISPR 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이된 집단에서 충분한 대표성을 유지하려면 많은 수의 시작 세포가 필요합니다. 존재 비중이 낮은 세포 유형은 게놈 전체 스크리닝에 특히 적합하지 않습니다. library의 선택과 관련하여, 대부분의 library는 target gene 당 3-6개의 gRNA를 포함하고 있으며, population 내에서 각 gRNA의 분포를 유지하는 것은 매우 중요하다¹⁸. 특정 gRNA의 농축 또는 고갈로 인한 representation의 상실은 불균일한 결과 분포로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해서는 시장 테스트를 거친 상업적으로 이용 가능한 CRISPR 라이브러리를 선택하는 것이 바람직할 수 있습니다²⁰. 시험관 내 동질적인 암 세포주를 사용하는 CRISPR 스크리닝은 in vivo 종양의 유전적 및 후성유전학적 이질성을 완전히 포착하지 못할 수 있습니다. 체외 검사는 DNA 손상 복구 및 방사선 유도 자가분비 신호전달에 관여하는 주요 유전자를 밝혀냈지만, 저산소증 유도 방사선 저항(ROS, 대사 적응 및 자가포식을 통해 ), 면역 매개 파라크린 효과 및 ECM 의존성 사이토카인 조절을 포함한 종양 미세환경을 완전히 복제하지는 못했습니다. 방사선 민감도 또는 내성과 관련된 유전자를 탐색하기 위해 CRISPR 스크리닝을 사용하기 전에 이러한 요인을 신중하게 고려해야 합니다. 현재의 치료 환경에 비추어 볼 때, 방사선 요법의 효능을 효과적으로 향상시키기 위해서는 방사선 내성 및 방사선 민감성과 관련된 요인을 파악하고 심층적으로 연구하는 것이 시급하다²². CRISPR 스크리닝이 알려지지 않은 유전자의 기능을 연구하는 데 있어 주요 이점을 감안할 때, 방사성 및 방사선 내성 유전자를 효율적으로 식별하기 위해 체계적으로 상세한 전체 게놈 CRISPR 스크리닝 기술이 제공됩니다.

이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 적정한 방사선 선량 선택

1. 부착 세포의 준비 및 도금
   1. 계대 및 세포 성장을 위해 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 완전 세포 배양 배지를 사용하여 세포 밀도를 mL당 5 x 10⁵ cells로 조정합니다. 세포를 3.5cm 배양 접시에 분배하여 다양한 용량의 방사선을 투여합니다. 각 접시에 2mL(1 x 10,⁶ 세포)를 추가하고 5% CO₂로 37°C에서 밤새 배양합니다.
2. 다양한 방사선 선량의 적용
   1. 3.5cm 배양 접시에 1부터 5까지 번호를 매깁니다. 그룹 #1을 대조군으로 활용하고 나머지 4개 그룹을 치료 그룹으로 지정합니다.
   2. 6웰 플레이트의 가장자리를 처리 그룹에 대한 밀봉 멤브레인으로 밀봉하고 각각 2, 4, 6 및 8 Gy의 방사선량을 투여합니다. 치료 후에는 접시를 인큐베이터에 다시 넣으십시오.
3. 방사선 치료 후 세포주 도금
   1. 6웰 플레이트와 96웰 플레이트를 준비합니다. PBS로 3.5cm 배양 접시에서 세포를 한 번 세척하고, 0.25% 트립신으로 대수적으로 성장하는 세포를 분해하고, 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 완전 배지를 사용하여 세포 밀도를 mL당 1 x 10⁵ 세포로 조정합니다.
   2. 10 μL/웰(1,000 세포/100 μL)을 6-웰 플레이트에 각각 방사선 선량에 대해 3회 반복하여 시딩합니다. 각 웰에 2mL의 완전한 배지를 추가하고 14일 후(각 클론 그룹에 약 50개의 세포가 있는 경우) 계수합니다.
   3. 30 μL/웰(3,000 세포/100 μL)을 96웰 플레이트에 각 방사선 선량에 대해 5회 반복하여 시딩합니다. 각 웰에 70μL의 완전한 배지를 추가하고 72시간 후 세포 생존율을 측정합니다.
4. 세포 생존율 측정
   참고: 클론 생성 억제율 = 1 - (치료군의 클론 수/대조군의 클론 수) x 100%. CCK-8 분석은 세포 탈수소 효소에 의해 환원될 수 있는 수용성 테트라졸륨 염(WST-8)을 사용하여 수용성이 높은 노란색 포르마잔 생성물을 생성합니다¹¹. 생산된 포르마잔의 양은 생존 가능한 세포의 수에 정비례하며, 광학 밀도(450nm 파장에서 측정)는 세포 대사 활동과 증식 상태를 정확하게 반영합니다^11,13. 이 잘 정립된 원리를 기반으로 하는 CCK-8 분석은 세포 증식 분석 및 종양 약물 감수성 검사를 포함한 다양한 응용 분야에 널리 채택되었습니다. 이 프로토콜에서는 CCK-8 분석을 사용하여 다양한 방사선 선량에서 세포 생존율을 체계적으로 평가합니다.
   1. CCK8 시약과 FBS가 없는 RPMI 1640 배지를 1:9 비율로 혼합합니다. 96웰 플레이트에서 배지를 버리고 각 웰에 100μL의 CCK8 함유 배지를 추가합니다.
   2. 어둠 속에서 1시간 동안 배양하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 OD 값을 측정합니다.
      참고: 세포 생존율 = [(처리군의 OD 값 - 블랭크 웰의 OD 값) / (대조군의 OD 값 - 블랭크 웰의 OD 값)] x 100%
5. 방사선량의 선정
   1. 연구 요구에 따라 적절한 방사선 선량을 선택하기 위해 클론 생성 억제율과 세포 생존율을 통합합니다. 방사선 내성 및 방사선 민감성 유전자를 모두 스크리닝하기 위해 억제율이 50%인 방사선 선량을 선택하십시오.

2. 적절한 MOI 및 퓨로마이신 농도 선택

1. 부착 세포의 도금
   1. 세포 밀도를 3 x 10 mL당⁵ 개 세포로 조정하고 웰당 1mL(3 x 10,⁵ 개 세포)를 12웰 플레이트에 접종합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 밤새 플레이트를 배양합니다.
2. 렌티바이러스 감염
   1. 피펫을 사용하여 12웰 플레이트에서 배지를 흡입하고 10% FBS를 함유한 1mL의 RPMI 1640 완전 배지로 교체합니다. 품질이 검사된 전체 게놈 CRISPR 렌티바이러스 라이브러리(시판되는 라이브러리 권장)를 준비하고 로그 농도 구배(예: 0-10-50-100-200-400-800)를 설정합니다^.4,5,6,7,8.
   2. 해당 양의 렌티바이러스를 2μL/접시의 폴리브레렌에 첨가하고 실온에서 5분 동안 평형을 이룹니다. 렌티바이러스와 폴리브레인 혼합물을 각 웰에 천천히 떨어뜨리고 잘 섞은 다음 37°C에서 5% CO₂로 밤새 배양합니다.
3. 세포 사멸을 위한 최소 퓨로마이신 농도 측정
   1. Parent Cell Density를 3 x 10⁵ cells/mL로 조정하고 웰당 1mL(3 x 10⁵ cells)를 12-well plate에 접종합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 밤새 플레이트를 배양합니다.
   2. 12웰 플레이트의 각 웰에 0-0.1-0.2-0.5-1-2-4-8 μM의 농도 구배로 퓨로마이신을 추가합니다.72시간 후에 세포를 계수합니다. 웰 내의 모든 세포를 죽이는 최소 농도는 세포 사멸을 위한 최소 퓨로마이신 농도이며, 이는 바이러스에 감염된 세포의 후속 스크리닝에 사용됩니다.
4. 감염 후 퓨로마이신 선택
   1. 감염 후 2일째에 각 웰에서 배지를 흡인하고 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 완전 배지 1mL로 교체합니다. 48시간 동안 계속 배양합니다.
   2. 감염 72시간 후, 기존 배지를 세포 사멸을 위한 최소 퓨로마이신 농도를 함유한 완전한 배지로 교체합니다. 렌티바이러스 감염이 없는 12웰 플레이트에 2개의 웰을 음성 및 양성 대조군으로 설정합니다. 음성 대조군은 퓨로마이신으로 치료하고 양성 대조군은 치료하지 않고 그대로 둡니다. 72시간 동안 배양을 계속합니다.
   3. 퓨로마이신 선택 72시간 후, 음성 대조군의 모든 부모 세포는 죽는 반면, 양성 대조군의 부모 세포는 최소한의 사멸을 보입니다. 각 웰에 대한 MOI를 계산합니다.
      참고: MOI = (바이러스 감염 그룹의 세포 수 / 양성 대조군의 세포 수) x 100%. 후속 스크리닝을 위해 MOI가 ~0.3인 바이러스 농도를 사용합니다.

3. 게놈 전체 CRISPR 렌티바이러스 라이브러리 감염

1. 부착 세포주(adherent cell line)의 파스(seeding)
   1. 계대 배양 및 세포 성장을 위해 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 완전 배지에서 세포 밀도를 1 x 10^{mL당 7} 세포로 조정합니다. 37°C에서 각 15cm 배양 접시에 1mL의 세포(1 x 10,⁷ 개 세포)를 5% CO₂ 로 8시간 동안 접종합니다. 세포가 부착되어 70%-80%의 합류점에 도달하면 바이러스 감염에 대한 준비가 된 것입니다(복제 수는 약 500개).
2. 렌티바이러스 감염
   1. 15cm 배양 접시에서 배지를 흡입하고 10% FBS를 함유한 15mL의 RPMI 1640 완전 배지로 교체합니다. 품질이 검사된 전체 게놈 CRISPR 렌티바이러스 라이브러리를 준비합니다.
   2. MOI = 0.3 - 30 μL/접시의 폴리브레렌과 함께 해당 양의 렌티바이러스를 첨가하고 실온에서 5분 동안 평형을 이루고, 렌티바이러스와 폴리브레렌 혼합물을 15cm 배양 접시에 천천히 떨어뜨리고 잘 섞은 다음 37°C에서 5%_CO2 로 하룻밤 동안 배양합니다. 동시에 부모 세포를 대조적으로 하는 15cm 배양 접시를 준비합니다.
3. 감염 후 퓨로마이신 선택
   1. 바이러스 감염 후 2일째에 15cm 배양 접시에서 배지를 흡인하고 10% FBS를 함유한 15mL의 RPMI 1640 완전 배지로 교체합니다. 48시간 동안 계속 배양합니다.
   2. 감염 후 72시간이 지나면 배지를 퓨로마이신의 최소 치사 농도를 함유한 완전한 배지로 교체하십시오. 감염되지 않은 부모 세포를 동일한 방식으로 음성 대조군으로 취급하고 72시간 동안 배양을 계속합니다. 퓨로마이신 선택 72시간 후, 음성 대조군의 부모 세포는 모두 사멸되고 렌티바이러스 감염에서 살아남은 세포는 성공적으로 감염된 것으로 간주됩니다.
4. Day 0 게놈 추출
   1. 0.25% 트립신을 사용하여 15cm 배양 접시 1개에서 세포를 분해하고, 10% FBS를 함유한 RPMI 1640 완전 배지에 재현탁하고, 세포 수를 계수합니다. 이 샘플에 Day 0이라는 레이블을 지정합니다.
   2. 300 x g 에서 5분(실온에서) 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다. PBS 1mL에 재현탁하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다. Day 0 게놈 DNA를 추출하고 나노드롭 UV 분광 광도계를 사용하여 DNA 농도와 순도를 측정합니다.
   3. sgRNA integrity 검출을 위해 agarose gel electrophoresis를 사용하여 증폭된 sgRNA 라이브러리를 분석하여 band가 깨끗하고 심각한 저하가 없는지 확인하여 library²³의 무결성을 보존합니다. 렌티바이러스 라이브러리 커버리지 평가를 위해 심층 염기서열분석 기술을 사용하여 라이브러리 내 sgRNA에 대한 염기서열분석 분석을 수행합니다^24,25.
   4. CRISPR 스크리닝에서 PCR 증폭은 sgRNA 단편 무결성 및 라이브러리 품질에 대한 예비 검증 역할을 합니다⁶. 라이브러리 커버리지 및 sgRNA 분포 패턴을 보다 종합적으로 분석하고 스크리닝 중 각 타겟 유전자에 대한 sgRNA의 적절한 표현을 보장하기 위해 NGS를 수행하여 스크리닝⁹의 견고성에 대한 심층적인 통찰력을 얻을 수 있습니다.
      참고: 스크리닝 전후 sgRNA 함량의 변화를 감지하고 잠재적인 sgRNA off-target integration 또는 라이브러리 오염을 식별함으로써 CRISPR 스크리닝의 정확도와 신뢰성을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 이러한 Day 0 샘플은 중요한 음성 대조군 역할을 하며 PCR 증폭 및 NGS를 통한 포괄적인 품질 평가를 거쳐 2가지 주요 목표를 달성합니다: (1) 필수 유전자 고갈 확인(적절한 라이브러리 표현 표시) 및 (2) 비필수 유전자의 안정적인 발현 입증(실험 기준선 조건 설정)⁹.
   5. 도서관의 다양성과 대표성을 보장하고 심사 과정에서 편견을 피하기 위해 적용 범위가 예상 수준에 도달하도록 합니다. 감염 효율 측정의 경우 형광 이미징을 사용하여 감염 효율을 평가하고 실험 요구 사항을 충족하는지 확인합니다.

4. 방사선을 선별 조건으로 적용

1. 그룹화
   1. CRISPR에 감염된 세포의 밀도를 mL당 1 x 10⁷ 세포로 조정하고 각 15cm 페트리 접시에 1mL를 접종합니다. 37 ° C에서 5 % CO₂로 밤새 배양하십시오.
2. 방사선 치료
   1. 세포를 무작위로 2개 그룹(치료 그룹과 대조군)으로 나누고 그룹당 6개의 접시를 제공합니다. 치료군의 세포에 적절한 선량의 방사선을 투여하고 대조군 세포는 정상적으로 증식하도록 처리하지 않은 상태로 둡니다. 방사선 투여 후 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 7 일 동안 계속 배양합니다.
   2. 두 번째 주에는 치료군 세포에 적절한 용량의 방사선을 반복적으로 투여하여 대조군 세포는 치료하지 않고 정상적으로 증식할 수 있도록 합니다. 방사선 요법 후 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 7 일 동안 계속 배양합니다.

5. 게놈 추출 및 염기서열분석

1. 14일째 추출
   1. 처리 14일 후, 0.25% 트립신으로 처리군과 대조군의 세포를 분해하고, 10% FBS를 함유한 완전한 RPMI 1640 배지를 사용하여 재현탁한 후 Day 14-RT 또는 Day 14-NC로 라벨링합니다.
   2. 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 버립니다. PBS 1mL에 재현탁하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 다시 버립니다. Day 14의 게놈 DNA를 추출하고 nanodrop UV 흡광도 분광법을 사용하여 DNA의 농도와 순도를 검출합니다.
2. PCR 증폭
   1. 서열의 해당 프라이머를 준비하고( 재료 표 참조) 10μM으로 희석합니다.멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 시약을 첨가하여 20μL 반응 시스템을 설정하고 300 x g에서 5초 동안 원심분리한 후 잘 혼합합니다. 증폭 조건에 따라 PCR 기기 매개변수를 설정하여 PCR 산물을 얻습니다.
3. Agarose gel 전기영동 검출
   1. 겔 주조 플레이트를 준비하고, 아가로 스로의 가장자리를 밀봉하고, 빗을 삽입하고, 샘플 DNA의 길이에 따라 적절한 농도의 아가로 스 젤을 준비합니다.
   2. 일정량의 아가로스 분말을 정확하게 계량하고 적당량의 전기영동 버퍼를 첨가하여 잘 섞어 전자레인지에서 가열하여 녹입니다. 약간 식힌 후 적당량의 핵산 염료를 넣고 부드럽게 섞어 겔 주조 금형에 천천히 붓습니다. 젤이 30분 동안 굳어지도록 합니다.
   3. 빗을 제거하고 겔을 덮을 때까지 전기영동 탱크에 적절한 양의 전기영동 완충액을 추가합니다. DNA 샘플에 적절한 양의 로딩 버퍼를 추가하고 잘 혼합한 후 피펫을 사용하여 혼합물을 샘플 웰에 천천히 첨가합니다.
   4. DNA 단편의 크기와 아가로스 겔의 농도에 따라 적절한 전압을 설정합니다. 전기영동 후 겔을 조심스럽게 제거하고 겔 이미저에 넣어 결과를 관찰하고 PCR 증폭이 성공적이었는지 확인합니다.
4. Illumina 염기서열분석
   1. 3개 그룹(Day 0 그룹, 대조군, 치료군)에서 유전체 DNA를 수집하여 라이브러리 구축 및 Illumina 염기서열분석을 위해 회사에 보냅니다. 생물정보학적 분석과 염기서열분석 결과의 시각화를 수행하여 방사선 치료에 민감하고 방사선 치료에 내성이 있는 유전자를 얻습니다²⁶.
   2. 데이터 분석을 위해 여러 번 반복되는 실험을 설정하고 실험 결과에 대한 통계 분석을 수행하여 데이터의 일관성과 재현성을 보장합니다^27,28.
5. 염기서열분석 데이터의 품질 평가
   1. 염기서열분석 정보의 정확성을 보장하기 위해 원시 데이터에 엄격한 필터링 및 품질 관리 메커니즘을 적용합니다⁵. 지정된 변환 알고리즘과 염기 호출²⁸ 중에 오류가 발생할 가능성을 평가하는 모델을 사용하여 염기서열분석 오류율을 기반으로 각 뉴클레오티드에 대한 Phred 점수(Qphred)를 계산합니다.
   2. 각 염기 위치에 대한 염기서열분석 오류율을 1%(Q30 임계값에 해당) 미만으로 유지하고, 염기서열분석 데이터의 최소 80%가 이 Q30 표준을 달성하여 후속 분석 절차를 지원하도록 합니다.
6. 데이터 처리 및 시료 수준 품질 관리
   참고: 자세한 내용은 이전에 발표된 보고서^29,30을 참조하십시오.
   1. 염기서열분석 데이터에서 필터링된 read를 sgRNA 라이브러리 염기서열과 정렬합니다. 완벽하게 정렬된 라이브러리의 sgRNA 수, sgRNA의 평균 함량, 검출되지 않은 sgRNA의 수, sgRNA 라이브러리에 성공적으로 매핑된 개별 샘플의 판독 비율을 포함한 통계를 보고합니다. 더 높은 매핑 비율을 사용하여 더 큰 적용 범위를 나타냅니다.
   2. 각 샘플에서 각 유전자(서로 다른 sgRNA에 의해 표적화됨)에 대한 판독 농축을 계산합니다. MAGeCK의 "중앙값" 정규화 방법을 사용하여 샘플 전체에서 각 sgRNA에 대한 지원 read를 정규화합니다. sgRNA 판독 횟수의 분포를 평가하고, 상자 플롯을 생성하고, 주성분 분석(PCA)을 수행하고, 상관 관계 히트맵을 구성하여 샘플 수준의 품질 관리를 수행합니다.
   3. sgRNA 판독 횟수가 푸아송 분포를 따른다고 가정합니다. 서로 다른 그룹의 정규화된 sgRNA 수를 상자 그림으로 묘사하여 샘플 내의 전체 데이터 분포를 시각화하고 그룹 간의 분포를 비교합니다.
   4. PCA를 사용하여 주성분 간의 차이와 각 성분 내의 변동률을 반영함으로써 데이터 분석을 단순화하고 그룹 내 및 그룹 간 변동을 쉽게 관찰할 수 있습니다. 상관 관계 히트맵을 사용하여 샘플 간의 관계를 설명할 수 있습니다.
7. 기본 분석
   1. 그룹 간 차등 sgRNA 분석을 수행하고 품질 관리 및 예비 데이터 처리 후 필수 유전자를 식별합니다. 관련 유전자의 기능적 농축 분석을 수행한다³⁰. MAGeCK 또는 MLE와 같은 다른 통계적 방법으로 계산한 RRA(Robust Rank Aggregation) 점수를 기반으로 필수 유전자의 순위를 매기며, RRA 점수가 낮을수록 중요도가 높음을 나타냅니다.
   2. R 언어 또는 다른 프로그래밍 언어를 사용하여 순위가 매겨진 결과에 대한 생물정보학 분석을 수행하고, GO 및 KEGG 분석 다이어그램³⁰을 사용하여 결과를 시각화한다. ID 매핑 또는 염기서열 주석을 통해 유전자 또는 단백질을 해당 GO 용어(molecular function, biological process 및 cellular component)에 연결합니다.
   3. KEGG를 데이터베이스로 사용하여 높은 수준의 기능과 생물학적 시스템을 이해하고, 식별된 유전자 카탈로그를 세포, 종 및 생태계 수준의 시스템 기능에 연결합니다. GO 및 KEGG 분석에서 상위 10개 또는 20개의 경로를 선택하여 경로 방향을 직관적으로 표시할 수 있습니다.

사망률이 가장 높은 폐암은 매우 공격적이고 널리 퍼져 있는 의학적 질병입니다. 폐암 세포주 A549를 예로 들어 방사선을 스크리닝 조건으로 하여 게놈 전체 CRISPR 스크리닝을 수행하는 데 개략적인 워크플로우를 그림 1에 보여주었습니다. 먼저, 클론 형성 및 CCK8 실험을 통해 다양한 방사선 선량에 대한 A549 세포의 민감도를 조사합니다(그림 2). 클론 생성 분석에서 콜로니 수는 2 Gy에서 140 ± 5.35 대 0 Gy에서 303 ± 31.63이었던 반면, CCK-8 분석에서 광학 밀도(OD) 값은 2 Gy에서 0.65 ± 0.05 대 0 Gy에서 1.35 ± 0.08이었습니다. 방사선 민감도 및 방사선 저항에 대한 후보 유전자를 조사하려면 후속 방사선 선량으로 2 Gy(IC50)를 선택합니다. A549 세포는 다른 용량의 푸로마이신으로 처리되고 72시간 후에 계수되었습니다. A549 세포에 대한 퓨로마이신의 최소 사멸 농도는 1μM로 검출되었습니다(그림 3). A549 세포는 서로 다른 구배 MOI에서 렌티바이러스에 감염되었습니다. 감염 72시간 후, 감염 효율을 형광 현미경으로 관찰하고 퓨로마이신 치료 72시간 전후에 계수했습니다. 감염 효율이 ~0.3인 MOI를 얻었습니다(표 1). 인간 게놈에는 19,050개의 유전자가 포함되어 있으며 각 유전자에 해당하는 6개의 sgRNA와 500(19,050 x 6 x 500 = 5.7 x 107 세포)의 복제 수가 있습니다. MOI = 0.3인 렌티바이러스를 사용하여 5.7 x 107 A549 세포를 감염시킵니다. 72시간 후, 세포를 추가로 72시간 동안 1μM 퓨로마이신으로 처리했습니다. Day 0 게놈을 수확하고 PCR 증폭을 수행했습니다. CRISPR 전체 게놈 라이브러리 내의 sgRNA 염기서열은 231개의 염기쌍 길이를 나타내며, 이는 아가로스 겔 전기영동 결과에 의해 확증됩니다(그림 4).

PCR 산물은 이후 데이터 품질 관리 및 샘플 수준 품질 관리를 위해 Novogene으로 보내졌습니다. 매핑 비율은 약 60%의 포괄적인 커버리지 비율을 산출했으며, 이는 전체 게놈 처리 중 순전히 복잡성과 불가피한 감소를 감안할 때 전체 게놈 스크리닝 절차에 적합한 것으로 간주되는 지표입니다(그림 5). sgRNA 판독 횟수는 이론적 기대치에 부합하는 푸아송 분포를 고수했습니다. PCA 플로팅 및 상관 관계 히트 매핑을 통한 후속 분석은 그룹 간 변동이 그룹 내 불일치보다 현저히 크면서 뚜렷한 그룹 간의 식별 가능한 차이를 생생하게 묘사했습니다. 더욱이, 그룹화된 샘플 내의 변동률은 허용 가능한 범위 내에 있었으며, 이는 샘플 수준 품질 관리 측정의 성공을 입증했습니다. 그 후, MAGeCK이 고안한 RRA 순위는 R 언어를 사용하여 순위 결과에 대한 기초적인 생물정보학 평가에 착수하는 데 활용될 것입니다. 특히, GO 측면에서 상위 15개 경로는 DNA 손상과 관련된 메커니즘을 두드러지게 특징으로 했으며, 이는 실험의 기본 스크리닝 기준과 완벽하게 일치합니다.

그림 1: A549 폐암 세포에서 게놈 전체 방사선 요법 CRISPR/Cas9 스크리닝의 개략도. 게놈 전체 CRISPR/Cas9 및 방사선 요법을 사용한 A549 세포의 스크리닝 워크플로우를 개략적으로 표현한 것입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: A549 세포에 대한 방사선 선량 최적화. (A) A549 세포는 증가하는 방사선 선량(0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy 및 8 Gy)에 노출되어 14일 동안 성장하도록 했습니다. 집락 형성 분석 이미지가 표시됩니다. 결과는 두 가지 독립적인 생물학적 실험을 대표합니다. (B) 클론 형성 분석 이미지의 정량화 결과. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 일원 분산 분석은 P < 0.01을 산출했습니다. 결과는 두 가지 독립적인 생물학적 실험을 대표합니다. (C) 다른 방사선 선량에 노출된 후 A549 세포의 선량-반응 생존 곡선. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 일원 분산 분석은 P < 0.01을 산출했습니다. 결과는 두 가지 독립적인 생물학적 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: A549 세포 선택에 필요한 최소 퓨로마이신 농도 측정. A549 세포를 증가하는 농도의 퓨로마이신으로 처리하고 72시간 동안 배양했습니다. 오차 막대는 표준 편차(n = 3)를 나타냅니다. 일원 분산 분석은 P < 0.01을 산출했습니다. 결과는 두 가지 독립적인 생물학적 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 아가로스 겔 전기영동에 의한 PCR 산물 검증. 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 PCR 산물 밴드의 존재 및 품질을 검사했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: PCR 증폭 제품의 품질 관리 및 기본 분석. (A) 매핑 비율은 참조 게놈의 약 60% 커버리지를 나타냈습니다. (B) sgRNA의 판독 횟수 분포는 푸아송 분포를 따랐습니다. (C) 상위 10개 유전자 온톨로지(GO) 용어 중 대부분은 DNA 손상 반응과 관련이 있었습니다. (D) 유전자 농축 패턴을 보여주는 화산 그래프로, 음의 농축 유전자는 빨간색, 양의 농축 유전자는 파란색, 유의하지 않은 유전자는 회색입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 다양한 바이러스 입자에서 퓨로마이신 선택 전후의 A549 세포 수. 다양한 바이러스 입자 하에서 퓨로마이신 처리 전후에 기록된 A549 세포의 수.

없음.