맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

Summary

이 프로토콜은 DNA 캡처 비드 정제와 결합된 비드 박팅이 Mycobacterium tuberculosis 샘플에서 DNA를 추출하기 위한 빠르고 일관된 방법을 제공하여 차세대 염기서열분석 응용 분야에 효과적인 선택임을 보여줍니다.

Abstract

결핵은 치명적인 질병이며, 원인균인 결핵균인 마이코박테리움(Mycobacterium tuberculosis)에서 항생제 약물 내성이 발견되면서 치료 결과가 악화되고 있습니다. 염기서열분석 기술을 통한 정확하고 신속한 약물 내성 식별은 맞춤형 치료 요법을 통해 결핵 환자의 결과를 개선하는 데 필요합니다. DNA 추출 방법은 다운스트림 분자 분석에 매우 중요하며 Mycobacterium의 거친 세포벽, 많은 임상 샘플의 낮은 세균 부하 및 가래 기질의 복잡성으로 인해 복잡합니다. 수많은 M. tuberculosis DNA 추출 방법이 보고되었지만 현재 황금 표준은 없습니다. 더욱이, 이러한 방법들 중 몇 가지는 일관되게 효과가 있는 것으로 나타났으며, 많은 방법들이 자원이 적고 부담이 높은 결핵 환경에 적합하지 않습니다. 결과적으로 실험실에서는 자체 절차 수정을 자주 도입하여 분석법의 변동성이 크게 달라집니다. 여기에서는 qPCR에 적합한 DNA를 생성하고 임상 진단 실험실에서 사용하기 위해 고려해야 하는 임상 객담 및 배양 모두에서 Mycobacteria DNA를 추출하기 위한 비용 효율적이고 신속하며 표준화된 프로토콜을 제시합니다.

Introduction

표적 차세대 염기서열분석(NGS) 및 전장 게놈 염기서열분석(WGS)을 사용하여 약물 내성 결핵(TB)을 검출하려면 결 핵에서 고품질 DNA를 추출하는 것이 필요하지만 종종 간과되고 있습니다. 당사는 현재 세계보건기구(WHO)에서 약물 내성 결핵 진단을 위해 권장하는 Deeplex-MycTB(GenoScreen) 및 전체 게놈 염기서열 분석과 같은 표적 NGS 접근법을 포함하여 임상 NGS 응용 분야에 일관된 고품질 DNA를 제공하기 위해 표준화된 프로토콜을 개발했습니다. 특히 WHO는 이러한 NGS 기반 진단 전략을 권장하지만 이를 지원하기 위한 특정 DNA 추출 프로토콜을 지정하지 않습니다. 당사의 방법은 WHO가 승인한 테스트뿐만 아니라 고품질 마이코박테리아 DNA를 필요로 하는 신흥 기술에도 사용할 수 있습니다.

추출 문제는 M. tuberculosis의 독특한 세포벽에서 비롯되며, 이 세포벽은 마이콜산과 지질로 구성되어 있어 분리하기가 매우 어렵습니다. 현재 발표된 추출 용액은 용해(예: 초음파 처리, 화학, 열 및 비드 박동) 및 DNA 추출 방법(예: 페놀-클로로포름 추출, 에탄올 침전, CTAB 기반 및 컬럼 및 비드 기반 방법)에서 상당한 차이가 있어 DNA 수율, 순도 및 품질에 차이가 있습니다 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. 또한 연구 그룹은 동일한 DNA 추출 방법을 거의 사용하지 않으며 종종 성공을 다르게 측정합니다. 이로 인해 최적의 접근 방식이 분자 응용 유형에 따라 달라지기 때문에 어떤 방법이 가장 효과적인지 결정하기가 어렵습니다. 예를 들어, long-read 염기서열분석을 사용하여 객담에서 M. tuberculosis 구조적 변이를 해결하려면 rpoB의 작은 영역만 표적으로 하는 유료 진단 도구를 실행하는 것보다 더 높은 품질의 DNA와 더 정확한 중합효소가 필요합니다. DNA 추출 성공을 더욱 복잡하게 만드는 몇 가지 요인이 있습니다. 추출할 수 있는 DNA의 양은 샘플 유형, 존재하는 박테리아 수, 프로세스를 방해하는 물질(공동 추출된 비마이코박테리아 DNA 및 PCR 억제제)이 있는지 여부에 따라 다릅니다. 실험실 기술자 피펫이 얼마나 정밀하게 결과에 영향을 미칠 수 있는지와 같은 기술적 측면도 가능합니다. 현재의 방법은 임상 환경에서 일반적으로 발생하는 낮은 박테리아 부하 또는 높은 수준의 오염 DNA로 샘플을 처리할 때 종종 부족합니다 17,18,19.

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 한 후 비드 클린업 프로토콜이 뒤따르는 것은 다른 방법에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 이는 작업자에 따른 변동 가능성을 줄이고 다운스트림 NGS 응용 분야에서 DNA 무결성을 유지하는 간단하고 빠른 워크플로우입니다. 이 표준화된 접근법은 WHO에서 권장하는 NGS 약물 내성 분석 및 모든 WGS 응용 분야를 사용하여 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 찾는 임상 실험실에 특히 적합합니다.

Protocol

이 연구는 기관 생물안전성 위원회(BUA #BU198320-01GBUA/BABB)의 승인(BUA -01GBUA/BABB)에 따라 캘리포니아 샌프란시스코 대학교(UCSF)에서 수행되었으며 UCSF 연구 윤리 지침을 따릅니다. 우리는 IRB가 승인한 동의 포기 프로토콜에 따라 디스커버리 라이프 사이언스(Discovery Life Sciences)가 비결핵 호흡기 질환을 앓고 있는 개인으로부터 수집한 잔류 가래 샘플을 입수했습니다.

1. 완충액의 준비

1. 맞춤형 트리톤 완충액 100mL를 준비하려면 먼저 5M NaCl 2mL, 1M Tris-HCl(pH 8) 1mL, Triton X-100 1mL 및 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 0.2mL를 결합합니다. 초순수를 추가하여 총 부피를 100mL로 만듭니다. 필터는 사용하기 전에 살균하십시오. 최종 버퍼에는 100mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA 및 1% Triton X-100이 포함됩니다.
2. 낮은 EDTA TE (표 2) : 100mL의 낮은 EDTA TE 버퍼를 준비하려면 1M Tris-HCl (pH 8) 1ml와 0.02M EDTA 0.5mL를 결합하십시오. 초순수를 추가하여 총 부피를 100mL로 만듭니다. 최종 버퍼에는 10mM Tris-HCl 및 0.1mM EDTA가 포함됩니다.

2. 용해 튜브의 준비

1. 메스 칼날을 사용하여 변곡점 바로 아래에 있는 1.5mL 나사 캡 튜브의 바닥을 조심스럽게 잘라냅니다.
2. P1000 팁에서 팁을 자르고 끝 부분에 V자형 쐐기를 자른 다음 준비된 나사 캡 튜브의 바닥을 쐐기로 고정합니다. 스쿱의 다이어그램은 그림 1 을 참조하십시오.
3. 멸균 용기(예: 저장통 또는 페트리 접시)에 0.1mm 지르코니아-실리케이트 비드를 채우고 준비된 스쿱을 사용하여 1스쿱의 비드(~200mg)를 1.5mL 스크류 캡 튜브에 분배합니다.

그림 1: 사내 비드 분배 스쿠프. 스쿱은 ~200mg의 0.1mm 지르코늄 비드를 가공 튜브로 쉽게 옮길 수 있도록 설계되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 입력 준비

참고: 모든 샘플 준비는 시설의 생물 안전성 프로토콜에 따라 수행되어야 합니다. 에어로졸 노출 위험을 최소화하기 위해 Class II Biosafety Cabinet(BSC) 내부에서 감염 물질을 취급할 것을 강력히 권장합니다.

1. 박테리아 세포 배양
   1. 15mL 원추형 원심분리 튜브에서 10분 동안 최대 속도(≥ 3,000 x g)로 5mL의 M. 결핵 배양(MGIT 또는 탁도 액체 배양) ~ 5mL.
   2. 10 mL 혈청 학적 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상등액의 ~ 500 μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 제거하십시오. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.
   3. 위아래로 피펫팅하여 350 μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 펠릿을 재현탁합니다. 필요한 경우(즉, BSL-3 외부에서 처리하기 위해 샘플을 제거하려는 경우) 표준 작업 절차에 따라 샘플을 비활성화합니다.
2. 가래 제제
   1. 1-5mL의 가래 샘플(자연 또는 유도)을 멸균 50mL 원심분리 튜브에 옮깁니다.
3. DTT 액화
   1. 가래 샘플에 100mM dithiothreitol 4 부피를 추가합니다 (용량은 다를 수 있음). 상업용 시약을 사용하는 경우 제조업체의 희석 지침을 따르십시오.
   2. 30초 동안 완전히 소용돌이칩니다. 실온(20-25°C)에서 7분 동안 배양합니다. 다시 30초 동안 소용돌이칩니다.
   3. 3.3.1단계를 반복합니다. 및 3.3.2. 1x, 점성이 매우 높은 샘플의 경우 최대 5회의 배양 와류 주기를 수행합니다.
   4. 최대 속도(≥ 3,000 x g)에서 10분 동안 원심분리기. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 상등액 ~ 500μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.
   5. 펠릿을 350μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 재현탁합니다.
4. NALC-NaOH 액화
   1. NALC-NaOH 용액을 준비하려면 준비 및 희석에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   2. 객담 샘플에 4가지 부피의 NALC-NaOH 용액을 추가합니다(자연 또는 유도, 부피는 다를 수 있음).
   3. 30초 동안 소용돌이. 실온(20-25°C)에서 7분 동안 배양합니다. 3.4.1 및 3.4.2단계를 반복합니다. 1배. 점성이 매우 높은 샘플의 경우 최대 5회의 배양 와류 주기를 수행합니다.
   4. 50mL 표시에 PBS를 추가합니다. 소용돌이를 간단히 섞습니다. 최대 속도(≥ 3,000 x g)에서 10분 동안 원심분리기.
   5. 50mL 혈청학 피펫을 사용하여 상등액 ~ 500μL를 제외한 모든 것을 조심스럽게 폐기합니다. 펠릿을 방해하지 않고 P1000 피펫으로 남아 있는 상층액을 제거합니다.
   6. 펠릿을 350μL의 맞춤형 Triton 버퍼에 재현탁합니다. 필요한 경우(즉, BSL-3 외부에서 처리하기 위해 샘플을 제거하려는 경우) 표준 작업 절차에 따라 샘플을 비활성화합니다.

4. DNA 추출

1. 비활성화된 박테리아 현탁액(350 μL, 3단계)을 ~250 μL의 0.1 mm 지르코니아-실리케이트 비드가 들어 있는 잘 라벨링된 새로운 1.5 mL 스크류 캡 튜브로 옮깁니다.
2. 비드는 6.5m/s에서 45초 동안 용해물을 박동하고 실행 사이에 2분 휴식을 취합니다. 총 세 번의 구슬 치기 주기를 반복합니다.
3. 최대 속도(≥ 12,000 x g)에서 2분 동안 원심분리기를 진행하고 150μL의 상층액을 잘 라벨링된 새 튜브로 이송합니다. 비드나 세포 파편이 옮겨지지 않도록 주의하십시오.
4. 세척 마그네틱 비드가 30분 동안 실온과 평형을 이루도록 하고 사용하기 전에 완전히 재부유할 수 있도록 완전히 소용돌이치게 합니다.
5. 180 μL(1.2배 용량)의 클린업 마그네틱 비드를 추가하고 10배 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 실온에서 2분 동안 배양합니다.
6. 마그네틱 랙에 놓고 용액이 깨끗해질 때까지 ~ 2분 동안 기다립니다. P200 피펫을 사용하여 자성 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 폐기합니다.
7. 튜브를 마그네틱 랙에 올려 놓은 상태에서 새로 준비한 70%(v/v) 에탄올 500μL를 추가하고 반대쪽 튜브 벽을 따라 마그네틱 비드에 분배합니다. 30초 동안 기다립니다.
8. 4.5단계를 반복합니다. - 4.7. 총 두 번의 세탁을 위해. 마지막 세척이 끝나면 P10 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다. 구슬을 ~ 2 분 동안 짧게 말리십시오.
9. 비드 펠릿이 불투명해진 직후, 마그네틱 랙에서 튜브를 제거하고 20 μL의 Low EDTA Tris Buffer에 재현탁합니다. 구슬이 건조하거나 갈라지지 않도록 하십시오.
10. 피펫팅 또는 볼텍싱으로 혼합하여 모든 비드가 용액에 있는지 확인합니다. 실온에서 5분 동안 배양합니다.
11. 마그네틱 랙에 놓고 용액이 명확해질 때까지 ~ 2분 동안 기다립니다. 다운스트림 분석을 위해 용리된 DNA를 잘 라벨링된 새 튜브로 옮깁니다. 추출된 DNA의 <20 μL를 흡입하여 마그네틱 비드 캐리오버를 방지합니다.

5. 마이코박테리아 DNA의 qPCR 계수

1. 마이코박테리아 atpE (Rv1305)의 뉴클레오티드 99개를 표적으로 하는 정량적 PCR을 사용하여 마이코박테리아 DNA를 정량화하려면 범용 프로브 마스터 믹스(2x) 5μL, 전방 프라이머(5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10μM) 각각 0.4μL, 역방향 프라이머(5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10μM), 0.2μL의 TaqMan 프로브(5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL의 DNA 템플릿 및 2 μL의 뉴클레아제가 없는 물(표 3).
2. 다음과 같은 열 순환 조건을 사용하여 반응을 실행합니다: 95°C에서 60초 동안 초기 변성, 10초 동안 95°C, 30초 동안 60°C의 35회 사이클(여기에서 캡처, 2.11°C/s의 램프 속도 사용; 표 4).
   참고: 이 경우, qPCR은 QuantStudio 3 Real-Time PCR 시스템에서 VIC 표지 프로브가 있는 TaqMan 어세이를 사용하여 수행되었습니다.
3. 모든 샘플, 표준물질 및 대조군을 기술적 삼중으로 실행합니다. 정제된 M. tuberculosis DNA의 연속 희석을 사용하여 표준 곡선을 생성합니다. 분석 소프트웨어를 사용하여 상대 정량화 분석을 수행합니다.
4. 결과 상대 정량화 값을 CSV 형식으로 내보내고 R Studio(버전 2024.09.1+394)를 사용하여 시각화하여 추출 방법 간에 DNA 수율을 비교하는 상자 플롯을 생성합니다.

Results

배양된 M. tuberculosis 와 M. tuberculosis 스파이크 가래 샘플(각 조건에 대해 n = 3) 모두에서 DNA 추출 프로토콜을 테스트했습니다. 배양된 M. tuberculosis H37Rv mc² 7901을 사용하여 입력을 50μL당 8.4 x 10⁶ 세포로 표준화했으며, 이는 200GU에서 MGIT 배양 1mL에 해당합니다. 객담 실험을 위해 결핵이 아닌 호흡기 질환이 있는 개인(상업적으로 입수한)의 가래 풀링 1mL를 두 가지 다른 박테리아 농도(50,000, 대략 1+ 가래 도말 등급 및 10,000 간균, 대략 부족한 가래 도말 등급)로 스파이크하여 다양한 박테리아 부하에 걸쳐 방법의 성능을 평가했습니다.

단일 복제 유전자를 표적으로 하는 맞춤형 TaqMan qPCR을 사용하여 DNA 수율을 평가했습니다(그림 2). 순수 배양 및 ...

Discussion

이 연구에서는 다운스트림 분자 및 NGS 응용 분야를 위한 비드 비팅과 마그네틱 비드 클린업을 사용하여 고품질 M. tuberculosis DNA를 추출하기 위한 강력하고 검증된 프로토콜을 제시합니다.

이 방법은 기존 M. tuberculosis DNA 추출 프로토콜에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 기존의 페놀-클로로포름 추출은 일반적으로 며칠이 걸리고 유해 화학 물질이 유입되지만 이 방법은 최소한의 유해 폐기물로 60분 이내에 완료됩니다. 이 접근 방식은 시약 소싱에 유연성을 제공합니다 - 버퍼는 여러 공급업체에서 구매하거나 사내에서 준비할 수 있어 단일 공급업체에 대한 의존도를 줄일 수 있습니다. 심지어 자성 비드 자체조차도 중간 정도의 복잡성 실험실(²⁰)에서 합성될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 비드는 더 높은 수율을 제공할 수 있...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1mm 지르코니아-규산염 비드	바이오스펙 제품	11079101z	마이코박테리아 세포를 용해하기 위한 비드 박동 단계에 사용되는 비드
AMPure XP 비드	베크만 쿨터	A63880	분해 후 DNA 세척을 위한 마그네틱 비드
EDTA(0.5M, pH 8.0)	써모 피셔 사이언티픽	AM9260G	맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소
패스트프렙 24	MPbio, 미국	116004500	6.5m/s의 비드 박동 장비
포워드 프라이머	써모 피셔 사이언티픽	사용자 지정 합성	프라이머 서열: AATTCCTGGTTAGCGGTGG
H2O(물, 분자 생물학 등급)	써모 피셔 사이언티픽	BP2819-1	맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소
루나 유니버설 프로브	뉴잉글랜드 바이오랩스	M3004	마이코박테리아 DNA 계수를 위한 qPCR 시약
MycoPrep 키트	BD	SKU/REF 240863	NALC-NaOH 객담 처리를 위한 BD MycoPrep 검체 분해
NaCl(염화나트륨, 5M 용액)	써모 피셔 사이언티픽	AM9759	맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소
PBS	밀리포어 시그마	P2272	가래 처리
리버스 프라이머	써모 피셔 사이언티픽	사용자 지정 합성	프라이머 서열: GTTTACGGCGTGGACTACCA
TaqMan 프로브	써모 피셔 사이언티픽	사용자 지정 합성	프로브 시퀀스: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
트리스-HCl (1M, pH 8.0)	써모 피셔 사이언티픽	AM9855G	맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소
트리톤 X-100	써모 피셔 사이언티픽	28314	맞춤형 Triton/Low EDTA 완충액 구성 요소