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방법 논문

체외(In Vitro ) 소 연골 외식에서 치명적 연골 세포 손상을 일으키는 충격 모델

951 조회수

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DOI:

10.3791/68061

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2025년 6월 27일

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1Weldon School of Biomedical Engineering, Purdue University, 2Indiana Center for Musculoskeletal Health, Indiana University School of Medicine, 3School of Mechanical Engineering, Purdue University, 4Department of Orthopaedic Surgery, Indiana University School of Medicine

이 논문에서

요약

기계적 연골 과부하에 대한 연골 세포 손상 반응을 더 잘 이해하기 위해, 이 프로토콜은 24시간 동안 치명적이지 않은 체외 연골 충격 모델의 개발을 설명합니다.

초록

외상 후 골관절염(PTOA)은 일반적으로 심각한 관절 외상 후에 발생하는 흔하고 퇴행성이며 고통스러운 진행성 관절 질환으로 600만 명 이상의 미국인에게 영향을 미칩니다. 충격으로 인한 연골 외상은 PTOA에서 절정에 이르는 연골 세포 손상 반응을 초래합니다. 연골세포 손상과 관련된 분자 사건을 이해하는 것은 PTOA를 예방하거나 진행을 늦추기 위한 치료법을 개발하는 데 필요합니다. 이를 용이하게 하기 위해 24시간 동안 치명적이지 않은 생체 외 연골 충격 모델이 개발되었습니다. 골연골 외식은 소의 중수골 관절에서 수확되었으며, 드롭 타워를 사용하여 외식식물에 충격 하중을 전달했습니다. 관절 연골에 스트레스와 충격이 비교적 균일하게 가해지도록 하기 위해, 뼈 표면이 위를 향하도록 외식술을 배치하고 뼈를 위에서 충격을 가했습니다. 캐리지 높이 4.0cm, 4.5cm 및 5.0cm에서 외식에 상이한 하중이 가해졌으며 평균 피크 응력은 각각 10.87 ± 1.84 MPa, 11.69 ± 0.67 MPa 및 12.98 ± 0.75 MPa였습니다. 이 연구는 충격 후 배양 중 연골 내 연골의 존재와 충격 중 장착되거나 느슨한 홀더를 사용하는 효과를 분석하여 세포 생존력과 세포사멸을 평가했습니다. 4.5cm 높이에서 충격을 받은 관절 연골은 장착된 홀더 및 즉각적인 뼈 제거와 결합되어 충돌 후 24시간 이내에 세포 사멸을 최소화하면서 연골 손상을 유도할 수 있는 최적의 모델을 제공했습니다.

서론

외상 후 골관절염(PTOA)은 미국에서 500만 명 이상의 성인에게 영향을 미치는 쇠약하게 만드는 질병입니다1. 연골에 충격이 가해져도 연골세포 손상 반응이 유발되어 조기 증상이 나타나고 관절 통증 및 기능 장애로 평생 고생할 수 있습니다2. 연골은 내재적 복구 능력이 거의 또는 전혀 없기 때문에 질병의 진행을 조절하기 위한 치료법을 개발해야 할 필요성이 충족되지 않은 상태로 존재합니다3. PTOA는 명확하게 정의된 단일 외상 사건과 상관관계가 있기 때문에 질병이 진행되기 전에 개입할 수 있는 기회가 있습니다. 그러나 이러한 치료법의 개발은 연골 세포 손상 반응을 조절하고 외상 후 골관절염을 유발하는 분자 신호에 대한 지식의 격차로 인해 방해를 받고 있습니다 2,3,4. 연골세포 손상 후 분자 현상에 대한 더 나은 이해는 연골세포 손상 반응을 구하고 PTOA 2,5,6의 발달을 예방하거나 지연시키는 새로운 치료법을 설계하는 데 도움이 될 수 있습니다.

연골세포 손상의 분자 신호를 더 잘 이해하기 위해 이전 연구에서는 연골 이식에 기계적으로 충격을 가하여 손상 반응을 시작하는 드롭 타워 또는 이와 유사한 장치를 사용했습니다. 이러한 연구는 기계적 특성 및 구조7,8, 매트릭스 손상 및 합성 6,9,10,11, 미토콘드리아 기능 장애 12,13,14,15, 이온 수송 경로 16,17,18의 변화를 포함하여 이 반응의 여러 측면을 특성화하려고 했습니다.도 19, 및 유전자 발현 9,11,20,21,22,23. 그러나 이러한 연구의 많은 연구에서 세포 생존율이 보고되지 않았거나 손상되었으며, 일부 연구에서는 세포 생존율이 50% 이하였습니다 24,25,26. 낮은 세포 생존율의 교란 효과로 인해 손상 반응을 연구하기 어려울 수 있습니다. 관절 외상 직후 연골 세포 사멸은 되돌릴 수 없지만, 연골 세포 손상을 치료하는 치료법은 후속 PTOA27을 완화합니다. 생존 가능한 세포의 손실이 아닌 연골 세포 손상과 관련된 분자 변화를 확인하기 위해서는 일정 기간 동안 연골 세포 생존력을 유지하는 연골 영향 모델이 필요합니다. 또한, 연골 조직 전체에 걸쳐 비교적 균일한 연골 세포 손상 반응을 생성하는 연골 충격은 세포 거동을 분석하는 데 가장 일관된 결과를 제공할 것입니다.

이 연구의 목적은 급성 연골 손상 반응에 내재된 신호 경로를 연구하는 능력을 보존하는 관절 연골에 대한 비용 효율적인 생체 외 충격 손상 모델을 개발하고 특성화하는 것이었습니다. 또한 이러한 모델은 부상 반응을 구제하기 위한 잠재적 치료법을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 먼저 드릴 프레스에 장착된 다이아몬드 팁 코어링 비트를 사용하여 골격이 성숙한 동물의 소 중수골 관절에서 연골 외식식물을 수확하는 멸균 기술을 개발했습니다. 중수골 관절은 동물이 식용으로 가공될 때 도살장에 의해 버려지기 때문에 이 관절은 쉽게 접근할 수 있고 저렴한 조직 공급원이 됩니다. 다음으로, 우리는 골연골 표본을 드롭 타워 장치 아래의 홀더에 배치하는 충격 부상 모델을 확립했습니다. 이 모델에서, 골연골 표본은 관절 표면이 아래를 향하도록 #8 거울 광택 스테인리스 스틸 표면에 배치되었고, 뼈는 위에서 충격을 받아 연골 조직에 비교적 균일한 하중을 전달했습니다. 충돌 후 24시간 동안 연골 세포 생존력을 유지하면서 여전히 세포사멸 분자 손상 반응을 유발하는 충격 매개변수가 결정되었습니다. 충돌 중 표본의 다른 양의 측면 움직임을 허용하는 홀더는 세포 생존력과 세포사멸에 미치는 영향을 평가했습니다. 마지막으로, 충격 후 연골하골에서 연골을 제거하는 효과를 평가했습니다.

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프로토콜

지역 도살장에서 얻은 소 팔다리를 사용하는 것은 윤리적 승인이 필요하지 않았는데, 그 이유는 그 조직은 식용으로 가공된 동물로부터 사후 채취되었기 때문입니다.

1. 골연골 외식 수확

  1. 이식 적출 전에 오토클레이브를 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS, 조인트당 약 1L), 코어링 드릴 비트, 워터 스위블 어댑터, 오토클레이브 세척 병 1개, 메스 손잡이 1개, 집게 2개, 부검 톱날 1개를 멸균합니다.
  2. 드릴 프레스로 조직 배양 후드를 설치하고 PBS를 담을 수 있는 대야 내부에 바이스를 설치합니다. 드릴 프레스에 코어링 드릴 비트와 회전 어댑터를 조립하고 호스가 있는 회전 어댑터 노즐을 멸균된 PBS로 채워진 카보이에 연결합니다. 부검 톱을 조립하고 후드 내부에 넣습니다(그림 1A-B).
  3. 조직 배양 후드에 각 관절에 하나씩 일회용 언더패드를 쌓아 놓습니다.
    알림: 언더 패드는 관절을 여는 동안 떨어질 수 있는 PBS와 활액을 흡수합니다. 여러 개의 언더 패드를 쌓으면 너무 젖었을 때 상단 레이어를 쉽게 제거할 수 있어 절차 전반에 걸쳐 깨끗하고 건조한 작업 공간을 제공할 수 있습니다.
  4. PBS에 70% 에탄올이 함유된 50mL 시험관 1개와 0.13% v/v 베타딘이 함유된 50mL 시험관을 준비하여 후드에 넣습니다. 조직을 취급하는 동안 멸균 상태를 유지하기 위해 집게와 메스 손잡이를 에탄올 시험관에 넣고 후드 뒤쪽에 멸균 6웰 세포 배양 플레이트를 놓습니다.
  5. 예상 검체당 3mL의 세포 배양 배지를 준비합니다. 배양 배지는 0.9mM 피루브산 나트륨, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레늄(ITS), 50mg/mL L-아스코르브산, 최소 필수 배지(MEM) 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B가 포함된 변형 독수리 배지(DMEM)로 구성됩니다. 사용 당일 L-아스코르브산과 ITS를 첨가합니다28.
  6. 희생 제물 후 6시간 이내에 지역 도살장에서 골격적으로 성숙한 동물의 소 앞다리를 얻습니다. 운송 중에는 티슈를 얼음 위에 보관하십시오.
  7. 관절낭을 열지 않고 고기 띠톱을 사용하여 발굽을 제거하여 중수골 관절을 분리합니다. 관절낭에 구멍을 뚫지 않고 #22 메스 칼날을 사용하여 피부를 제거합니다.
  8. 생물 안전 캐비닛 외부의 각 다리를 찬물로 철저히 헹구어 먼지를 제거하고 베타딘으로 코팅하여 소독합니다.
  9. 조직 배양 후드 내부에서 새로운 #22 메스 블레이드를 사용하여 관절 캡슐을 엽니다. 원위 관절을 분리하고 세척 병에서 PBS로 관절 연골에 수분을 공급합니다(그림 1C). 수분을 유지하기 위해 PBS를 적신 멸균 거즈로 관절 연골을 덮습니다.
  10. 또한 부검 톱으로 중족골을 절단하여 원위 중수골 관절을 분리합니다(그림 1D). 덮인 연골이 위를 향하도록 원위 관절을 바이스에 넣고 고정될 때까지 조입니다. 전체 과정에서 PBS로 연골의 거즈를 정기적으로 적십니다.
  11. 거즈를 한쪽 과두에서 멀리 접고 코어링 비트가 관절 표면의 가장 평평한 영역 위에 있도록 바이스의 위치를 조정합니다(그림 1E).
  12. PBS가 코어링 비트를 통해 흐를 수 있도록 카보이 밸브를 엽니다. 세척 병을 사용하여 PBS로 조직에 지속적으로 수분을 공급하고 드릴링 중에 샘플을 냉각시킵니다.
    참고: 카보이와 세척병의 PBS는 코어링 과정에서 냉각 효과가 있습니다.
  13. 드릴 비트를 과두 표면으로 눌러 천천히 과두에 코어를 끼웁니다. 압력을 자주 해제하고 열이 발산되도록 하십시오. 코어링 깊이가 연골하 뼈로 약 2mm가 될 때까지 계속합니다. 각 면에 대해 반복합니다(그림 1E).
    알림: 과열의 징후에는 급격한 유체 증발 또는 타는 냄새가 포함됩니다.
  14. 부검 톱을 사용하여 관절 연골 표면과 평행하게 뼈를 절단하여 골연골 코어를 분리하고, 절단하는 동안 세척 병에서 부검 톱과 골연골 뼈의 경계면까지 PBS를 계속 짜냅니다. 이 단계에서는 탈수를 방지하기 위해 관절 연골 표면에 축축한 거즈를 유지하십시오.
  15. 모든 관절이 처리될 때까지 묽은 베타딘 용액(1.3단계 참조)에 골연골 코어(그림 1F)를 보관합니다.
  16. PBS에서 골연골 코어를 헹구고 3mL의 예열 배양 배지(0.9mM 피루브산 나트륨, 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 50mg/mL L-아스코르브산, 비필수 아미노산, 페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B가 포함된 DMEM)이 포함된 멸균 6웰 플레이트의 개별 웰로 샘플을 옮깁니다.28. 다음 날 충격 절차가 있을 때까지 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2 로 샘플을 유지합니다.

2. 골연골 이식 영향

  1. 경면 광택 임팩트 표면(보충 그림 1 및 보충 그림 2)이 있는 스테인리스강 임팩트 홀더를 제작하고 드롭 타워 베이스 플레이트(보충 그림 3)에 해당 구멍을 뚫습니다.
  2. 충격 절차 전에 오토클레이브를 사용하여 다음 재료를 멸균하십시오: 직경 15mm의 스테인리스강 구형 임팩터 헤드, 경면 광택 임팩트 표면이 있는 스테인리스 스틸 홀더, 4 6/32 나사, 4개의 와셔, 집게.
  3. 이전에 설계되고 제작된 드롭 타워를29 생물 안전 캐비닛에 놓습니다. 이 연구를 위해 총 캐리지 질량이 358.4g인 로드 셀과 가속도계(그림 2A)가 장착된 캐리지에 15mm 직경의 구형 임팩터 헤드가 장착된 드롭 타워를 사용합니다.
  4. 4개의 고압증기멸균 나사로 홀더를 드롭 타워의 베이스 플레이트에 고정합니다(그림 2B). 이 연구에서는 직경이 8.7mm 및 9.1mm인 원형 개구부를 가진 홀더를 테스트했습니다.
  5. 뼈가 위쪽을 향하도록 하여 드롭 타워의 임팩터 헤드 아래에 있는 홀더(보충 그림 1, 보충 그림 2, 보충 그림 3)에 골연골 코어를 놓습니다.
    참고: 뼈가 위쪽을 향하고 관절 표면이 아래쪽을 향하도록 골연골 코어를 배치하는 것이30 보다 균일한 하중을 위해 선택되었습니다.
  6. 드롭 타워 캐리지를 골격 상단을 기준으로 원하는 높이로 조정합니다. 파일럿 스터디에서 대략적인 드롭 타워 높이를 결정합니다. 본 연구에서는 4.0cm, 4.5cm, 5.0cm의 높이를 평가하였다.
  7. 스핀들 스톱(그림 2A)을 해제하고 임팩터 헤드가 중력의 무게를 견디지 못하고 샘플에 낙하하도록 하여 드롭 타워 캐리지를 해제하기 직전에 데이터 수집 소프트웨어(Supplementary Coding File 1)의 시작 버튼을 클릭합니다. 즉시 캐리지를 들어 올려 스핀들 스톱에 올려 놓습니다.
    참고: 충격이 가해지는 동안 데이터는 데이터 수집 모듈에 연결된 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 100kHz에서 수집되며, 이 소프트웨어는 임팩터 헤드와 캐리지 사이에 위치한 로드 셀과 가속도계의 신호를 기록합니다. 충돌 후 가능한 한 빨리 캐리지를 들어 올리지만, 두 번째 충격을 방지하기 위한 반동 방지 기능이나 기타 메커니즘이 없습니다.
  8. 데이터 수집 소프트웨어에서 생성된 .txt 파일을 Matlab 데이터 분석 코드(Supplementary Coding File 2, https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis 에서도 사용 가능)와 동일한 폴더에 배치하고 데이터 분석 코드를 실행하여 원시 데이터를 필터링하고 영향 파라미터를 계산합니다.
    참고: 데이터 분석 코드는 0.563mm의 연골 두께를 사용하여 충격 에너지를 계산합니다. 이는 바늘 방법31 과 Biomomentum Mach-1 기계적 테스터를 사용한 별도의 연구에서 5개 표본 각각에 대해 > 50개 위치에서 채취한 평균 연골 두께로 결정되었습니다. 충격 파라미터는 앞서 설명한 바와 같이 계산된다(32).
  9. 필요에 따라 #11 메스 날로 뼈에서 연골을 제거합니다. 다음 날 이미징할 때까지 37°C에서 5% CO2 로 샘플을 배지와 가습 인큐베이터에 반환합니다.
    참고: 충격 직후 또는 충격 후 24시간 후에 뼈에서 연골을 제거하는 효과를 본 연구에서 평가했습니다.

3. 연골 표본에서 세포 생존력의 특성화

  1. 필요한 경우 뼈에서 연골을 제거합니다. 날카로운 메스로 연골 표본을 반으로 자릅니다. 여러 번 자르지 마십시오. 부드러운 가장자리를 보장하기 위해 단일 절개를 목표로 합니다.
  2. 관심 있는 각 절반 표본을 PBS에서 5μM 에티듐 동형이머와 2.5μM 칼시엔 AM으로 구성된 용액에 담그십시오. 빛을 피하고 실온에서 30분 동안 배양하여 살아있는 염색을 완료합니다.
  3. PBS 2x로 샘플을 헹구고 이미징할 때까지 샘플을 PBS에 보관합니다. 염색이 완료된 후 가능한 한 빨리 이미지.
  4. 현미경 접시에 PBS 몇 방울 위에 연골 샘플을 똑바로 세워서 현미경 전면에서 전체 반원이 보이도록 합니다. 도립 컨포칼 현미경으로 이미지를 캡처합니다. 연골이 스스로 똑바로 서지 못하는 경우 집게로 연골을 약간 구부립니다.
  5. 번들 플러그인33이 포함된 ImageJ 배포판인 FIJI를 사용하여 먼저 Image > Type > 8-bit를 클릭하여 이미지를 8비트로 변환합니다. 그런 다음 Image > Adjust > Threshold(임계값 조정)에서 임계값을 설정하고 Apply(적용)를 클릭합니다. 다음으로, Process > Binary에서 Watershed 기능을 수행하고 Analyze Particles... 녹색 채널과 빨간색 채널 모두에 대해 분석합니다. 그룹 간의 정확한 비교를 위해 각 표본에 대해 일관된 z 높이에서 캡처된 이미지를 분석합니다.
  6. 살아있는 세포의 수를 샘플의 총 세포 수로 나누어 세포 생존율을 계산합니다.

4. 연골 표본에서 세포사멸의 특성화

  1. PBS의 8μM Caspase-3/7 Green 검출 시약에 관심 대상 시료 절반을 각각 담그십시오. 빛을 피하고 37°C에서 30분 동안 배양하십시오.
  2. PBS 3x로 샘플을 세척합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA)에서 15분 동안 배양하여 염색된 샘플을 고정합니다. PBS로 다시 세척하고 이미징할 때까지 PBS에 보관하십시오. 염색 후 24시간 이내의 이미지.
  3. 컨포칼 현미경을 사용한 이미지(위의 3.4단계 참조). 그룹 간 형광 강도를 유효하게 비교하려면 대물 렌즈, 여기 레이저 출력, 광전자 증배관 검출기 게인, 핀홀 크기, 광학 슬라이스 두께, 스캔 속도, 라인 평균화 및 이미지 해상도를 포함한 모든 샘플에 대해 일관된 이미징 매개변수를 유지하십시오.
  4. ImageJ의 FIJI 확장을 사용하여 Analyze > Set Measurements...(측정 분석...) 메뉴에서 평균 회색 값을 선택합니다.
  5. Polygon Section Tool을 사용하여 이미지에 표시된 샘플의 전체 영역을 간략하게 설명합니다. Analyze(분석) 메뉴에서 Measure(측정) 기능을 수행하고 그룹 간에 동일한 처리 매개변수를 사용하여 평균 회색 값을 기록합니다.
  6. 다각형 단면(Polygon Section) 도구를 사용하여 샘플이 포함되지 않은 이미지 영역을 선택하고 측정 기능을 다시 수행합니다. 이것을 배경 평균 회색 값으로 기록합니다.
  7. 표본 평균 회색 값에서 배경 평균 회색 값을 빼서 형광 강도를 계산합니다.

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결과

골연골 외식에 대한 기계적 충격 하중은 캐리지 높이가 조직 위로 4.0cm, 4.5cm 및 5.0cm(n = 3 또는 4)인 드롭 타워를 사용하여 적용되었습니다. 캐리지가 해제되기 전에 캐리지의 높이를 높이면 충격력, 평균 피크 응력, 적재 속도 및 충격 에너지가 높아집니다(표 1).

우리는 충돌 후 24시간 동안 치명적이지 않은 체외 연골 손상 모델을 개발하고자 했습니다. 낙하 타워 캐리지의 다양한 높이로 충돌 후 24시간 후 Live/Dead stain의 특성화는 수확 절차가 샘플 중앙에서 98.4% ± 0.05의 높은 세포 생존율을 가진 연골 외식재를 생성했음을 나타냅니다. 4.0cm 및 4.5cm 충격 그룹의 세포 생존율은 충돌 후 24시간 동안 충격을 받지 않은 샘플과 크게 다르지 않았지만 5.0cm 높이에서 상당한 감소가 관찰되었습니다(그림 3A). 또한, 세포사멸 신호...

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토론

이 연구의 목적은 연골 세포 손상 후 분자 사건을 연구하기 위해 세포 생존력을 손상시키지 않는 연골 충격 모델을 특성화하고 최적화하는 것이며, 최종 목표는 PTOA 진행을 방지하기 위해 손상된 세포를 구하는 치료법을 개발하는 것입니다. 이 목표를 달성하기 위해 골연골코어의 뼈 부분에 기계적 하중이 전달되어 연골 조직으로 하중이 전달되었습니다. 또한, 우리는 다양한 충격 높이, 충격 중 다른 홀더 플레이트의 영향, 충격 후 연골 조직 배양에서 뼈의 존재가 미치는 영향을 조사했습니다. 이러한 매개변수가 결합되어 모델에 대한 중요한 통찰력을 제공하며, 잘 맞는 홀더로 4.5cm의 충격 높이를 측정한 후 뼈에서 연골을 즉시 제거하는 것이 세포 생존력을 유지하면서 상당한 연골 세포 손상 반응을 유도하는 데 최적임을 시사합니다.

4.5cm 충격 높이를 선택한 이유는 평균 최대 응력(11.69 ± 0.67 MPa)이 세포 사멸을 유...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH NIAMS Grant R21 AR080255의 지원을 받았습니다. 저자는 이 프로젝트에 기계 가공 및 제작에 대한 전문 지식을 제공한 Kevin Carr에게 감사를 표합니다. 저자는 이 연구를 위해 조직을 제공한 Mooresville Butcher Shop(인디애나주 무어스빌)에 감사를 표합니다. 저자는 컨포칼 현미경 검사에 도움을 준 인디애나 생물 현미경 센터 핵심 시설의 직원들에게 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
#11 멸균 메스 칼날Thermo Fisher Scientific10-001-823뼈에서 연골 제거
#22 멸균 메스 칼날Thermo Fisher Scientific10-001-833소 조직에서 피부를 제거하고 인대를 절단하여 관절을 엽니다
10-1000 ul 피펫 팁Thermo Fisher Scientific02-707-411측정 및 전달  PBS, 배양 배지 및 기타 솔루션 
200 프루프 에탄올Thermo Fisher Scientific03-007-647수술 도구를 소독하고 조직 준비 및 처리 중에 멸균 환경을 유지하기 위해 멸균제로 70% 에탄올을 준비하는 데 사용됩니다.
50 mL 원심분리기 튜브(멸균)Thermo Fisher Scientific339652배지 및 샘플 보관에 사용
갤런 카보이Thermo Fisher Scientific04-355-233호스로 스위블 어댑터에 연결된 멸균 PBS 용기.
6-웰 플레이트(멸균)Thermo Fisher Scientific140685수집, 충격 연구 전 배양 및 이미징 중에 미리 예열된 배지를 사용하여 멸균 환경에서 골연골 코어를 임시로 보관하는 데 사용됩니다
속도계Kistler8743A5충격 동안 생성된 가속도를 측정하는 데 사용
사멸 염색 키트(CellEvent)Thermo Fisher ScientificC10423세포사멸 세포를 검출하고 시각화하는 데 사용 오
토클레이브 세척 병Nalgene2405-0500멸균 PBS로 채워 조직 수확 중에 연골에 수분을 공급합니다.
부검 톱MopecBD 810관절을 열거나 골연골 코어를 추출한 후 과도한 뼈를 제거합니다
검 톱날 MopecBD 101뼈를 절단하여 골연골 외식편을 분리하고 방출하는 데 사용됩니다.
베타딘아브리오 헬스 LP해당 사항 없음샘플을 후드로 옮기기 전에 외부를 소독하는 데 사용되며 최종 골연골 샘플을 소독하기 위해 희석됩니다.
투명 4피트 호스n/an/aPBS가 포함된 5리터 카보이를 드릴 프레스의 스위블 어댑터에 연결하는 데 사용됩니다
코어링 드릴 비트 UKAM 산업용 초경질 공구3EDCD7160관절 연골 및 연골하 뼈에 구멍을 뚫어 뼈에서 골연골 외식편을 추출하는 데 사용됩니다.-  드릴 비트의 직경: 7/16"(전기 도금 다이아몬드 코어 드릴)
초승달 렌치McMaster Carr5362A1클램프(조인트를 제자리에 고정)를 조이고 코어링 드릴 비트를 조이는 데 사용됩니다   
일회용 혈청학적 피펫Thermo Fisher Scientific13-678-11PBS 및 배양 배지 측정 및 이송
일회용 언더패드Thermo Fisher Scientific23-666-062보다 편리하고 위생적인 작업을 위해 수확 중에 물과 액체를 흡수하기 위해 카운터 스페이스를 덮는 데 사용
회용 진공 필터 장치Thermo Fisher ScientificSCGP00525필터 PBS 및 기타 솔루션
드릴 프레스   WEN433TV 3.25인치골연골 샘플 드릴에 힘 가하기- WEN 433TV 3.25인치 산업용 강도 벤치탑
드릴 프레스 틸팅 앵글 바이스WENTV434코어링 공정 중에 골연골 샘플을 원하는 각도로 고정된 위치에 고정합니다.
드롭 타워맞춤형n/a샘플에 영향을 미치는 데 사용
FIJI(ImageJ Extension)n/an/a세포 생존력 및 세포사멸 정량화를 포함한 현미경 이미지 처리 및 분석에 사용되는 소프트웨어
자Fisherbrand12-000-163후드에서 조직을 절단하고 관절을 열고 샘플을 옮기는 데 사용
즈(멸균)Dukal6412관절 캡슐을 개봉한 후 관절 연골에 수분을 공급하는 데 사용
1리터 미디어 병시그마 알드리치CLS13951LHTC멸균 PBS 를 보관하는 데 사용됩니다.
장갑Thermo Fisher Scientific19-130-1597D수집 팀 보호에 사용 인
슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS)Gibco41400-045미디어 보충
LabVIEW 데이터 수집 소프트웨어National Instrumentsn/a후속 분석을 위해 충격 테스트 중에 로드 셀 및 가속도계에서 데이터를 캡처합니다.
L-아스코르브산MerckA4403미디어 보충제
레이저 공초점 주사 현미경OlympusFV1000D염색된 조직 샘플의 고해상도 3차원 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다.
살아있는 세포와 죽은 세포 염색 키트Thermo Fisher ScientificL3224세포 생존력을 평가하기 위해 조직 샘플에서 살아있는 세포와 죽은 세포를 구별하는 데 사용됩니다
셀Kistler9712B5000충격 중에 가해지는 힘을 측정하는 데 사용됩니다.
매틀랩 스웍스 주식회사n/a
육류 밴드 톱SkymsenMSKLE소 샘플에서 수근발굽 제거
마이크로피펫 10-100 uLThermo Fisher ScientificFBE00100측정 및 이송  PBS 및 배양 배지
최소 필수 배지 (MEM) 비필수 아미노산 용액Gibco11140-050배지 보충
Modified Eagle' s 배지 (DMEM)Gibco10566-016골연골 외식편 배양.
페니실린-스트렙토마이신Thermo Fisher Scientific15-140-148배지 보충제
인산염 완충 식염수Thermo Fischer ScientificBP399-20생리적 상태를 유지하고 탈수를 방지하며 염색 용액을 준비하기 위해 조직을 헹구고, 수분을 공급하고, 냉각하는 데 사용됩니다
드롭 타워의 샘플 홀더맞춤형n/a충격 중에 골연골 코어를 고정합니다.
메스 손잡이 Thermo Fisher Scientific16-100-107정밀한 절단, 조직 해부 및 관절 개방에 사용됩니다.
나사 (CAD에 추가)6-32 스레드 크기-18-8 스테인레스 스틸 소켓 헤드 나사
피루브산 나트륨Gibco11360-070미디어 보충
형 임팩터 헤드McMaster Carr9292K52충격 절차 전 오토클레이브
용 마스크필터 마스크375101수집 팀을 보호하는 데 사용
스위블 어댑터 UKAM 산업용 초경질 공구7035812코어링 드릴 비트에 연결하여 드릴링 공정 중에 냉각  냉각을 위한 PBS의 지속적인 흐름을 제공합니다.
5. 가 세포. 부 소 . 일 겸 거 유리 로드 매제 구 수술 워터

참고문헌

  1. Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
  2. Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
  3. Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
  4. Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
  5. Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
  6. Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
  7. Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
  8. Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
  9. Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
  10. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  11. Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
  12. Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
  13. Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
  14. Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
  15. Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
  16. Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
  17. Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
  18. Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
  19. Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
  20. Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
  21. Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
  22. Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
  23. Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
  24. Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
  25. Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
  26. Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
  27. Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
  28. Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
  29. Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
  30. Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
  31. Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
  32. Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).

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