방법 논문

시험관 내 공기-액체 계면에서 폐 상피 세포의 대마초 노출

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DOI:

10.3791/68102

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2025년 6월 20일

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

이 논문에서

요약

우리는 공기-액체 계면에서 대마초 증기 노출을 연구하기 위한 표준화된 체외 모델을 수립합니다. 이 모델은 기화된 대마초의 영향을 조사하기 위한 체계적인 접근 방식을 제공하여 흡연의 대안으로 대마초 기화기에 대한 증가하는 관심을 해결합니다.

초록

대마초는 전 세계적으로 약 1억 9,200만 명이 사용하는 것으로 추정됩니다. 대부분의 사람들은 폐 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 연소 부산물을 포함하는 대마초 연기를 흡입하여 대마를 사용합니다. 이러한 위험에 대한 지식으로 인해 건조한 대마초 꽃을 타지 않고 가열하는 대마초 기화기에 대한 관심이 높아졌습니다. 기화 대마는 여전히 흡입을 위해 칸 나비 노이드를 방출하지만 식물 재료를 더 낮은 온도에서 가열합니다. 현재 건조 대마초 증기의 영향을 평가하기 위한 표준화된 체외 모델은 없습니다. 따라서 우리는 공기-액체 계면(ALI)에서 폐 세포 배양액을 노출시키기 위한 모델을 수립했으며, 이를 통해 세포는 기화된 대마초에 정점에 노출되어 폐 상피 세포 생리학을 보다 정확하게 시뮬레이션했습니다. 이 프로토콜은 대마초 증기를 세포 표면으로 일관되고 재현 가능한 전달을 보장하여 기화된 대마의 세포 및 분자 영향을 조사하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 연구는 체외 대마초 증기 전달 방법을 표준화 한 최초의 연구이며, 이는 향후 전임상 대마초 연구의 벤치 마크 역할을 할 수 있습니다.

서론

대마초는 일반적으로 레크리에이션 또는 의약 목적으로 식물의 꽃을 관절 형태로 태울 때 나오는 연기를 흡입하여 사용됩니다. 대마초의 주요 생물학적 활성은 흡입시 신체로 방출되는 Δ9- 테트라 하이드로 칸 나비 놀 (Δ 9-THC) 및 칸 나비 디올 (CBD)과 같은 칸 나비 노이드 때문입니다. 대마초 연기에는 또한 발암 물질, 돌연변이 유발 물질 및 기형 유발 물질을 포함한 발열성 화합물이 포함되어 있어 건강에 해로운 결과를 초래할 가능성이 있습니다1. 이러한 우려를 감안할 때, 연소 생성물 없이 후속 흡입을 위해 카나비노이드를 방출할 수 있기를 바라며 대마초 꽃을 태우지 않고 가열하는 대마초 기화기로 전환하는 데 관심이 있습니다. 대마초 증기의 화학 성분을 특성화하기 위해 일부 작업이 수행되었으며, 카나비노이드뿐만 아니라 다양한 호흡기 독성 물질의 존재를 보여주며 이러한 장치가 안전하다는 개념에 도전합니다 2,3. 기화 된 대마가 폐와 다른 장기에 어떤 영향을 미치는지에 대한 지식에는 상당한 격차가 있습니다.

세포 배양 연구는 세포 수준에서 흡입 물질의 특정 효과를 분리하고 이해하기 위해 독성학에서 필수적이며, 이를 통해 인간 생물학과 관련된 높은 처리량, 비용 효율적이며 기계적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 세포를 배양하는 방법은 또한 시험관 실험 에서 얻은 전체 결과의 중요한 결정 요인입니다. 대부분의 세포 배양 연구는 세포가 플라스틱에서 성장하고 수성 매체에 정점으로 노출되는 수중 환경을 사용하여 수행됩니다. 그러나 기도 상피 세포는 이와 관련하여 독특한 문제를 제시합니다. 호흡기 시스템 전체에서 상피 세포의 정점 표면은 공기와 접촉합니다. 폐포 내에서 상피 세포는 계면 활성제를 생산하는 반면 다른 기도 상피 세포는 점액을 생산합니다. 총체적으로 이것은 폐 기능을 보호하고 유지합니다. 수중 배양물은 정점 공기 노출을 복제하지 못하여 생체 내 환경을 정확하게 모델링하는 능력이 제한됩니다. 수중 배양 모델의 대안은 공기-액체 계면(ALI)에서 배양하는 것인데, 여기서 호흡기 상피 세포는 기저측 쪽에 배지가 있는 콜라겐으로 코팅된 막에서 성장하고 정점으로 공기에 노출됩니다. ALI에서 배양된 상피 세포는 이러한 환경에서 분극화하고, 계면활성제 또는 점액을 생성하고, 접합부를 형성할 수 있기 때문에 호흡기 상피의 보다 정확한 모델입니다4.

전통적인 수중 세포 배양 방법이 직면 한 추가 고려 사항은 칸 나비 노이드와 같은 소수성 화합물이 수성 매체에서 잘 용해되지 않는다는 것입니다5. 에탄올 추출물은 물속에 잠긴 배양 6,7,8,9,10,11,12 에 있는 소수성 화합물을 공부하는 일반적인 용매 입니다. 이러한 추출물은 소수성 및 친수성 화합물이 모두 수성 매체에 용해되도록 합니다. 그러나 화합물 응집뿐만 아니라 배지와 상호 작용하는 화합물의 가능성은 한계가 있으며, 둘 다 생체 이용률을 변경할 수 있습니다13,14. 최근에는 expoCube15(ALI/Transwell in vitro/ex vivo 노출 시스템) 등과 같은 고급 노출 시스템을 사용하여 용매 또는 매체가 없는 상태에서 에어로졸 상 화합물을 세포에 전달할 수 있는 개발이 있었습니다. 고급 노출 시스템을 사용하여 에어로졸 및 입자 현탁액을 직접 증착하면 입자 물리화학적 특성을 실질적으로 변경하는 것으로 알려진 수중 노출에 중요한 수집-재부유 과정을 제거할 수 있습니다16. 여기에서는 ALI에서 폐포 상피 세포주를 노출하기 위한 표준화된 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. ALI에서 폐 상피 세포 배양

참고: 여기에서는 ALI에서 A549 세포를 배양하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 연구에 사용할 세포 유형에 대한 문헌을 검토하십시오. 서로 다른 세포주는 ALI에서 분화하고, 긴밀한 연접을 형성하고, 계면활성제/점액을 생산하는 데 다른 시간이 필요합니다.

  1. 세포 배양
    1. DMEM 500mL 병에 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) 50mL, 글루타맥스 5mL, 항생제-항진균제 5mL, 겐타마이신 500μL를 첨가하여 배지를 준비합니다.
    2. 준비된 배지를 수조에 10-15분 동안 넣어 37°C로 예열합니다.
    3. 생물 안전 캐비닛에 70% 에탄올을 뿌리고 닦아냅니다. 배지가 따뜻해지면 멸균된 생물 안전 캐비닛 아래에 놓습니다.
    4. 배양 후드 아래에서 약 10mL의 배지를 15mL 튜브에 피펫으로 주입합니다.
    5. 액체 질소에서 세포를 회수하고 수조에서 부드럽게 교반하여 해동합니다.
    6. 배양 후드 아래에서 cryovial의 해동된 세포를 15mL 튜브에 피펫으로 넣습니다.
    7. 15mL 튜브를 300g에서 5분 동안 원심분리 합니다.
    8. 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 제거하십시오.
    9. 펠릿을 매체와 혼합하여 T75 플라스크로 옮깁니다.
    10. 현미경으로 T75 플라스크를 확인하십시오.
    11. 포화 습도와 함께 37 ° C, 5 % CO2 에서 세포를 배양합니다.
    12. 2-3일마다 세포 배양 배지를 새로 고칩니다.
    13. 원하는 세포 수에 도달할 때까지 세포를 계대하고 성장시킵니다. 하나의 12웰 플레이트를 파종하려면 3 × 106 셀이 필요합니다.
  2. 트랜스웰의 콜라겐 코팅
    1. 콜라겐 용액의 준비
      1. 콜라겐 IV형 10mg을 ddH2O20mL에 빙초산 50μL와 함께 용해시킵니다.
      2. 37 ° C에서 30 분 동안 배양하고 완전히 녹을 때까지 가끔 소용돌이 치십시오.
      3. 0.22μm 필터를 통해 여과하여 용액을 살균합니다.
      4. 용액 1.5mL를 15mL 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
    2. 콜라겐 타입 IV로 트랜스웰 필터 코팅
      1. 콜라겐 IV형(50μg/mL)의 튜브 1개를 -20°C에서 해동합니다.
      2. 각 Transwell 필터에 콜라겐 150μL를 추가합니다.
        알림: 12웰 플레이트만 노출 시스템과 호환됩니다.
      3. 뚜껑이 열린 플레이트를 생물 안전 캐비닛(BSC)에 18시간 동안 건조시킵니다.
      4. 자외선(UV)에 30분 동안 노출시켜 살균합니다.
    3. 접시를 파라필름으로 싸서 4°C에서 최대 30일 동안 보관하십시오.
    4. 세포를 도금하기 전에 필터의 양쪽을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 헹굽니다.
  3. inserts의 cell seeding 및 ALI로 전환
    1. plate and cell 현탁액의 준비
      1. 예열된 준비된 배지 1.5mL를 12웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다.
      2. 플레이트를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 넣습니다.
      3. 준비된 배지에서 5 × 105 cells/mL 농도의 세포 현탁액을 준비합니다.
    2. 삽입물에서 세포 파종
      1. 인큐베이터에서 준비된 세포 배양 플레이트를 제거하고 멸균된 생물 안전 캐비닛 아래에 놓습니다.
      2. 세포 현탁액 0.5mL(2.5 × 105 cells/insert)를 삽입물의 멤브레인 상단에 피펫으로 만듭니다.
      3. 플레이트 커버로 플레이트를 덮고 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 다시 넣습니다.
    3. ALI 설립
      1. 세포 파종 후 24시간 후에 정점 매체를 제거합니다.
      2. 기저측 배지를 0.6mL의 준비된 배지로 교체합니다. 이 시점에서 세포는 정점적으로 공기에 노출되어 ALI를 형성합니다.
      3. ALI에서 최대 2주 동안 A549 세포를 배양하고, 이전에 특성화된 바와 같이 세포가 분화할 수 있도록 2일마다 배지를 교체합니다4.

2. LC/MS를 이용한 대마초 증기 노출의 선량 측정 평가

참고 : 프로토콜의이 부분에서는 Δ9-THC 농도를 분석하여 각 웰 내에 퇴적된 대마초 증기의 용량을 특성화하기 위해 cell-free 방법을 사용했습니다. Δ9-THC는 플라스틱 재료에 접착되므로 샘플 수집에는 유리 바이알만 사용해야 합니다. 이 방법은 선택한 대마초 품종에 Δ 9-THC가 포함되어 있어야합니다.

  1. 노출 시스템의 준비 및 설정
    1. 지정된 흐름 경로에 따라 노출 시스템용 튜브를 설정합니다(그림 1A, B): ENDS 장치 > 응축기 > 퍼핑 펌프 > 등각 투영 샘플링 어셈블리 Aeroneb 펌프 > expoCube > 습도 센서(필터 > expoCube 노출 흐름 포트 포함).
    2. 온도 제어를 켜서 시스템을 35°C 및 50°C로 가열합니다.
    3. 흐름 테스트를 수행하여 시스템에 누출이 없고 압력이 올바르게 설정되었는지 확인합니다(SCIREQ Technote A Guide to Troubleshooting Uneven Flows in the expoCube 참조).
    4. 75% 이상의 상대 습도를 달성하도록 Aeroneb 펌프를 시작하십시오.
  2. 선량 측정 테스트 및 기화기 준비
    1. 대마초 기화기 준비
      1. 허브 그라인더를 사용하여 대마초 꽃을 갈아줍니다.
      2. 0.25g의 분취액을 계량하고 알약 분리기를 사용하여 각 부분을 정리합니다.
      3. 스테인리스강 인서트를 노출 시스템 내 12웰 트랜스웰 플레이트의 노출 행에 놓습니다.
  3. 스테인리스 스틸 인서트를 대마초 증기에 노출
    1. 노출 시작
      1. 기화기 오븐에 대마초 0.25g을 포장하십시오.
      2. 안전한 개스킷을 사용하여 대마초 기화기를 노출 시스템의 ENDS 장치에 부착하고 원하는 퍼핑 요법을 시작합니다. 기화기를 Smart Path Level 2 온도 설정으로 설정합니다.
        참고: 이 연구에 사용된 노출 시스템에는 레벨 1(176-188°C), 레벨 2(188-199°C), 레벨 3(199-210°C) 및 레벨 4(210-221°C)를 포함하여 선택할 수 있는 4가지 스마트 경로 레벨이 있습니다.
      3. flexiWare 소프트웨어(데이터 수집 소프트웨어, SCIREQ 기술 노트: FlexiWare 8용 프로파일 생성 가이드 참조)에서 퍼프 프로파일을 생성합니다. 이 프로토콜의 경우 70mL 퍼프 용량과 4회 퍼프/분 빈도를 사용합니다.
      4. 기화기 오븐에서 대마초 꽃을 제거하고 기화기에 새로운 대마초 0.25g을 추가하여 대마를 전환하기 전에 건조 허브 기화기를 5분 동안 실행합니다. 지속적인 노출을 위해 두 개의 기화기를 번갈아 가며 사용합니다.
      5. 원하는 노출 시간에 도달할 때까지 2.3.1.1-2.3.1.4 단계를 계속합니다.
    2. 각 노출 후에는 핀셋을 사용하여 노출 시스템에서 인서트를 조심스럽게 제거하고 아래 설명된 대로 샘플 수집을 위해 준비합니다.
  4. LC/MS 분석을 위한 시료 채취 및 준비
    1. 핀셋을 사용하여 각 노출에 해당하는 필터를 10mL의 LC/MS 등급 메탄올(예: 노출 1, 노출 2, 노출 3)이 들어 있는 라벨이 부착된 유리 바이알에 넣습니다.
    2. 인서트를 세척하십시오.
      1. 노출된 각 스테인리스강 삽입물을 10mL의 LC/MS 등급 메탄올이 들어 있는 라벨이 부착된 유리 바이알에 넣습니다.
      2. 노출에 따라 바이알에 라벨을 붙입니다(예: 노출 1 웰 1-4).
    3. 추출물 Δ9-THC
      1. 초음파 발생기 수조를 사용하여 바이알을 인서트로 10분 동안 초음파 처리하여 Δ 9-THC를 추출합니다.
      2. 10mL의 새 메탄올이 담긴 두 번째 유리 바이알 세트에 삽입물을 옮기고 추가로 10분 동안 초음파 처리합니다.
    4. Δ 9-THC 수준을 정량화하기 위해 LC/MS 분석을 위해 준비된 모든 샘플(웰, 세척 및 필터)을 제출합니다.
  5. 선량 측정 계산
    1. LC/MS 분석 결과를 사용하여 증착된 Δ 9-THC의 양을 계산하여 노출 흐름의 선량계(필터에 증착된 양)와 웰의 선량 측정을 결정합니다.
    2. Δ 9-THC에 대한 노출 흐름 필터와 우물 증착 사이의 비율을 계산합니다.
    3. 이 비율을 사용하여 노출 중 세포에 전달될 용량을 결정합니다.

3. 석영 결정 마이크로 저울을 사용한 대마초 증기 노출의 선량 측정 평가

참고: 이 방법은 노출 중에 침전된 대마초 증기 입자의 질량을 평가하기 위해 QCM(Quartz Crystal Microbalance)의 설정 및 보정에 대해 자세히 설명합니다. 각 QCM은 실시간 측정을 제공하여 대마초 증기 노출의 정확한 선량 측정을 가능하게 합니다.

  1. 노광 시스템에서 QCM의 준비 및 설정
    1. 앞에서 설명한 대로 노출 시스템을 구성합니다.
    2. 클립 커넥터를 사용하여 각 QCM을 전자 모듈에 연결하고 7핀 커넥터를 사용하여 모듈을 inExpose(흡입 노출 플랫폼) 장치 입력에 연결합니다.
    3. QCM 인서트를 노출 시스템의 노출 쪽에 있는 웰 플레이트에 배치하여 QCM이 잘 정렬되었는지 확인합니다.
    4. 시스템이 목표 온도인 35°C 및 50°C에서 안정화될 때까지 부착된 QCM으로 노출 시스템을 예열합니다.
    5. 실험 설정에 따라 microflows 및 exposure flows를 활성화합니다.
  2. QCM 보정
    1. 데이터 수집 소프트웨어 보정 마법사를 사용하여 각 노출 실행 전에 QCM을 보정합니다.
    2. 파란색 보정 막대가 안정화될 때까지 기다린 후 다음을 선택하여 정확한 질량 계산을 위해 QCM 공진 주파수를 기록합니다.
      참고: 예상 보정 범위는 -15%에서 15%입니다. 편차는 더러운 QCM 또는 분리된 LEMO 커넥터와 같은 문제를 나타낼 수 있습니다.
  3. QCM 신호의 실시간 모니터링
    1. QCM 출력을 모니터링합니다. 시스템은 증착된 누적 질량을 출력합니다. 이 값은 데이터 수집 소프트웨어에서 그래프의 일부와 실제 현재 값으로 표시됩니다.
      참고: 각 실험 실행에 대해 최대 및 최소 증착도 소프트웨어에 보고됩니다.
  4. QCM 청소
    1. 정확도를 유지하려면 각 실험 후에 QCM을 청소하십시오.
    2. 각 QCM 인서트 내부에 70% 이소프로필 알코올 1mL를 추가합니다.
    3. 알코올 용액을 위아래로 2-3회 피펫팅하여 잔류물을 용해합니다.
    4. 알코올 용액을 제거하고 다음에 사용하기 전에 QCM을 먼지가 없는 환경에서 완전히 건조시키십시오.

4. 세포를 대마초 증기에 노출시킨 결과

참고: 이 프로토콜은 expoCube 시스템을 사용하여 ALI에서 배양된 호흡기 세포에 대한 대마초 증기의 영향을 평가하도록 설계되었습니다. 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 및 lactate dehydrogenase(LDH)를 포함한 노출 후 분석은 용량 의존적 세포 독성 및 대사 활성에 대한 통찰력을 제공합니다.

  1. 대마초 증기 전달
    1. 위에서 설명한 대로 노출 시스템을 설정합니다. 시스템이 35°C 및 50°C의 온도에 도달했으며 상대 습도 수준이 75% 이상인지 확인합니다.
    2. QCM을 사용하는 경우 클립 커넥터를 사용하여 장치를 전자 모듈에 연결하고 7핀 커넥터를 사용하여 모듈을 흡입 노출 장치 입력에 연결합니다. 단일 QCM 인서트를 expoCube의 노출 면에 있는 웰 플레이트에 배치하여 QCM이 잘 정렬되었는지 확인합니다.
    3. 노광 시스템을 열고 세포 배양 플레이트를 내부에 놓습니다.
    4. 섹션 2에 따라 원하는 기간 동안 퍼프 요법을 시작합니다. QCM을 사용하면 증착된 총 증기를 실시간으로 추적할 수 있습니다.
    5. 노출 후, 원하는 분석 시점까지 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.
    6. 기저측 격실(basolateral compartment), 정점 격실 세척(apical compartment wash)(계면활성제 또는 점액용) 및 세포 용해물(cell lysate)을 포함한 다양한 격실에서 필요에 따라 시료를 수집합니다.
    7. 용량 선택 분석: LDH 및 MTT 분석을 사용하여 최적의 용량과 잠재적 세포 독성을 결정할 수 있습니다.
  2. ALI에서 세포에 대한 LDH 분석
    1. 배지 수집: 노출 후 원하는 시점에 기저측 구획에서 배지를 수집합니다.
    2. 수집된 100μL의 배지를 투명한 96웰 마이크로플레이트로 옮깁니다.
    3. 각 웰에 새로 준비된 LDH 반응 혼합물 100μL를 추가합니다.
    4. 플레이트를 실온(15-25°C)에서 30분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
    5. 600nm 이상의 기준 파장을 사용하여 490-492nm에서 흡광도를 측정합니다.
    6. 다음 공식을 사용하여 세포 독성을 계산합니다.
      세포독성(%) = (실험값-음성 대조군)/(양성 대조군-음성 대조군) x 100
  3. ALI의 세포에 대한 MTT 분석
    1. 이전에 확립된 바와 같이 ALI에서 A549 세포를 배양합니다.
    2. 노출 시스템에서 노출을 전달한 후 원하는 분석 시점까지 세포를 인큐베이터로 되돌립니다.
    3. PBS 1mL에 MTT 1mg을 용해시켜 MTT 용액을 만듭니다.
    4. 500μL의 MTT 용액을 세포의 정점 쪽에 추가하고 500μL의 MTT 용액을 기저측 구획에 추가합니다.
    5. 세포를 37°C 인큐베이터에 1시간 동안 다시 넣습니다.
    6. 모든 미디어를 조심스럽게 제거합니다.
    7. 정점 쪽에 500μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 추가하고 기저측 쪽에 1,000μL의 DMSO를 추가합니다.
    8. 포르마잔 결정을 용해시키기 위해 1시간 동안 배양합니다.
    9. 정점 쪽과 기저 쪽 모두에서 용액을 수집하고 결합합니다.
    10. 690nm(OD690)에서 기준으로 540nm(OD540)에서 흡광도를 측정합니다.
    11. 다음 공식을 사용하여 세포 생존도를 계산합니다.
      세포 생존율(%) = 100 ×(평균 OD_exposure/평균 OD_negative 대조군)

결과

expoCube 시스템을 사용한 실험 중에 4 개의 우물은 대마초 증기에 노출되고, 4 개의 우물은 차량 제어로 조절 된 공기에 노출되며, 나머지 4 개의 우물은 음성 대조군으로 완전히 밀폐됩니다 (그림 1C) 17. 이 설정을 통해 처리된 상태, 차량 상태 및 음성 상태를 정확하게 비교할 수 있습니다. 시스템은 세포 배양에 적합한 환경을 조성하기 위해 가습되며(그림 2), 시스템 내의 온도 조절은 열영동을 통한 입자 증착을 향상시켜 기화된 화합물을 세포에 효율적으로 전달할 수 있도록 합니다(18). 노출을 정량화하기 위해, 우리는 세포 노출 부위에서 대마초 증기 증착의 마커로 Δ 9-THC의 양을 측정합니다. 이러한 정량화는 노출 시간과 선량을 최적화하는 데 매우 중요하며, 연구자는 세포 배양 실험에서 원하는 선량을 달성하기 위해 활성 노출 기간을 조정할 수 있습니다(그림 3). 노출 흐름 필터에서 수집된 Δ9-THC의 비율을 개별 웰에 증착된 양에 대해 계산함으로써 세포에 전달되는 실제 용량을 추정할 수 있습니다(표 1). 이 계산 된 선량은 원하는 노출 범위를 알려주어 일관되고 측정 가능한 방식으로 대마초 증기에 대한 세포 반응을 연구하기위한 최적의 매개 변수를 결정하는 데 도움이됩니다. 이것은 선택된 대마초 균주의 칸나비노이드 프로파일에 따라 다른 칸나비노이드에 대해 수행될 수 있습니다. 또한 QCM 분석을 수행하여 실시간 대마초 증기 증착을 측정할 수 있습니다. 그림 4는 기화기와 대마초 재료가 5분마다 변경되는 30분 시간 경과에 걸친 대마초 증기 증착을 보여줍니다. 각 우물은 시간이 지남에 따라 질량이 지속적으로 증가하여 전체 대마초 증기 입자의 효과적이고 지속적인 증착을 나타냅니다.

figure-results-1
그림 1: ALI에서 대마초 증기 노출을 위한 ALI/Transwell in vitro/ex vivo 노출 시스템의 개략도. (A) DaVinci MIQRO 기화기는 대마초 증기를 생성하는 데 사용되었습니다. 이 샘플은 가습되고 등속성 샘플러를 통해 노출 부위로 셔틀됩니다. 제어 장치를 사용하면 공기 흐름 출력 및 온도 구배를 조정할 수 있습니다. (B) 노출 시스템 설정 사진. (C) expoCube 내부는 대마초 증기 노출에 대한 테스트 행, 조절된 공기의 차량 제어 행, 공기 흐름에 영향을 받지 않는 밀폐된 네거티브 제어 행의 세 줄로 구분됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 시간 경과에 따라 기록된 상대 습도(%) 프로파일. 이 데이터는 Aeronebs가 활성화되어 평균 습도 75%에 도달하고 유지될 때 상대 습도 수준을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3 : 대마초 증기에 30 분 노출 된 후 LC / MS 분석을 통한 Δ 9-THC 증착 의 정량화.(ᅡ-C) Δ9-THC 증착은 각각 1.5g의 높은 THC 대마초 품종을 사용하여 3 번의 독립적 인 30 분 증기 노출 후 각 웰에서 측정되었습니다. Δ9-THC 수준은 LC / MS에 의해 정량화되었습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 30분 노출 요법에 대한 ALI/Transwell in vitro/ex vivo 노출 시스템에서 대마초 증기 증착의 QCM 측정.(A-D) 각 그래프는 웰 1-4에서 대마초 증기 입자의 누적 침착을 나타내며 질량은 시간 경과에 따라 마이크로그램(μg) 단위로 측정됩니다. 증착 속도는 모든 유정에 걸쳐 꾸준한 축적을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1차 플로우 필터 증착(μg)우물 증착 (μg)유정에 침전된 1차 흐름의 백분율(%)
노출 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
노출 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
노출 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
평균의2422.94.30.18
표준 편차292.80.40.03

표 1. 노출 흐름 필터와 세포 노출 부위 사이의 ALI/Transwell in vitro/ex vivo 노출 시스템에서 Δ9-THC 증착 비교.

토론

ALI에서 세포를 배양하는 것은 기존의 수중 배양에 비해 생체 내 기도 상태를 보다 정확하게 나타낼 수 있는 능력으로 인해 호흡기 연구에서 중요한 방법입니다19. ALI에서 배양하면 폐 상피 세포가 정점 표면의 공기에 직접 노출되는 동시에 기저측 배양 배지의 필수 영양소를 유지할 수 있습니다. 이러한 설정을 통해 세포는 흡입된 입자와 병원체를 포획하고 제거하는 데 중요한 호흡기 방어 메커니즘의 핵심 구성 요소인 계면활성제 또는 점액을 생산할 수 있습니다 20,21,22. A549 세포는 일반적으로 체외 연구에 사용되지만 ALI에 사용할 수 있는 많은 호흡기 상피 세포 배양 중 하나일 뿐입니다. Silva 등은 비강에서 폐포까지 ALI에 대한 호흡 상피의 세포주와 1차 배양을 검토했다22. 제시된 ALI 노출 시스템의 유연성으로 인해 다양한 세포주와 일차 세포에 맞게 조정할 수 있습니다.

ALI 배양은 체외 흡입 연구, 특히 대기 오염 물질, 미립자 물질 및 기타 흡입 물질에 대한 연구에서 "황금 표준"으로 점점 더 간주되고 있습니다23. ALI 모델의 주요 장점은 in vivo human effects로 더 잘 번역할 수 있는 통찰력을 제공할 수 있다는 것입니다. 그러나 주목할 만한 단점은 ALI 노출에 대한 표준화된 프로토콜이 없다는 점이며, 이는 연구 간의 재현성과 비교 가능성에 영향을 미칩니다. 이러한 격차 중 하나는 표준화된 노출 워크플로우입니다. ALI에서 세포를 대마초 증기에 노출시킴으로써, 대마초가 세포 기능, 생존력 및 세포 독성에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이러한 노출을 통해 세포 독성, 염증 및 산화 스트레스의 마커를 포함한 생물학적 결과를 자세히 평가할 수 있습니다. 증착 된 칸 나비 노이드의 정확한 정량화는 대마초 증기 (및 다른 형태의 대마초 제품)의 세포 효과에 대한 재현 가능한 연구를 가능하게하여 통제 된 실험실 환경에서 잠재적 인 건강 영향에 대한 이해를 발전시킵니다.

고급 노출 시스템은 세포 표면에 입자를 직접 증착할 수 있도록 하여 생리학적으로 더 관련성 있는 노출을 제공함으로써 기존 수중 배양의 한계를 해결합니다. 이것은 또한 용매 또는 담체의 잠재적 영향을 줄입니다. 이러한 용매 없이 직접 입자 증착을 허용함으로써 노출 시스템은 차량 관련 영향을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 그럼에도 불구하고 차량과 관련된 몇 가지 고려 사항이 남아 있습니다. 예를 들어, 습도 수준을 조절하지 않으면 원치 않는 세포 스트레스24가 발생하여 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 최적의 수준에 도달하기 위해 습도를 신중하게 조절하는 것은 세포의 안정성과 결과의 정확성을 유지하는 데 필수적입니다. 추가적으로, 각 입자, 에어로졸 또는 기체 혼합물은 그 자체의 독특한 물리화학적 특성을 가지며, 이는 세포 표면(25) 상의 증착을 변경할 수 있다. 따라서 각 고유 제품에 대한 노출 요법을 특성화하는 것이 중요합니다. 입자 증착에 영향을 줄 수 있는 요인에는 열영동(thermophoresis), 더 높은 온도에서 더 낮은 온도로 입자가 이동하는 것이 포함됩니다26. 열영동은 입자를 세포 쪽으로 유도하는 데 도움이 되고 증착 효율을 향상시킵니다.

투여 일관성 및 정밀도는 ALI에서 노출 시스템으로 작업할 때, 특히 에어로졸 또는 입자가 관련된 경우 추가적인 과제입니다. 폐 내 생체 내 입자 증착은 입자 크기, 모양, 밀도 및 용해도뿐만 아니라 노출되는 폐의 특정 영역에 의해 영향을 받는 복잡한 과정입니다27. 이러한 요인으로 인해 in vitro에서 복제하기 어려울 수 있는 다양한 증착 속도가 발생합니다. MPPD(Multi-path particle dosemetry)와 같은 수학적 모델은 in vivo 증착 속도를 추정하고 in vitro dose translation을 안내하는 데 유용한 도구입니다28. 그러나 생체 내 노출 시나리오와 시험관 내 투여를 일치시키는 것은 특히 이질적인 구성을 가진 복잡한 에어로졸의 경우 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다.

cell-free 용량 특성화의 경우, 스테인리스강 인서트 세척은 화합물이 인서트의 벽과 세포가 일반적으로 위치하는 베이스에 모두 부착될 수 있기 때문에 증착을 과대평가하는 경향이 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. QCM은 세포 배양 위치에 직접 증착된 질량만 측정하여 세포 노출과 특히 관련된 침착에 대한 보다 정확한 평가를 제공함으로써 이점을 제공합니다.

독성학이 생리학적으로 보다 관련성 있는 모델로 이동함에 따라 통합 ALI 노출 프로토콜의 채택은 체외 발견과 생체 내 인간 반응 사이의 격차를 해소하는 데 근본이 될 것이며, 궁극적으로 호흡기 독성 물질과 건강에 미치는 영향에 대한 보다 신뢰할 수 있는 평가를 지원할 것입니다.

공개 사항

PG 및 BU는 SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc.에서 근무하고 있습니다. ETW는 Mitacs Accelerate Program을 통해 SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc.에서 인턴십을 마쳤습니다. 다른 저자는 공개할 상충이 없습니다

감사의 글

이 작업은 캐나다 보건 연구소(CIHR) 프로젝트 보조금 162273의 지원을 받았습니다. CJB는 FRQS(Fonds de Recherche du Québec -Santé)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 ETW에 대한 Mitacs 보조금 #IT34076의 지원도 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원심분리기 튜브, 랙(폴리스티렌 랙), 멸균Montreal Biotech Inc.MBI601051C
30mL 유리 바이알Thomas Scientific1755F32
A549 세포ATCCCCL-185
항생제-항진균제(100x)Wisent450-115-EL
대마초 허브 분쇄기 겐치https://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
iMSJ9.WX_vMBLeAHzc6JplZiba8i
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NA0Tr8j5nGMqrGq1BW75hAV8Fr3
SDCGH7O7zwsmmCWOxvdAEN4
97Npj07w0FHMuNDtuKZ3hKv9d8
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-O1V0qNYQiRk6SQo2WId2wOHS
Mz_zo4YCbkDQf2rNGy81iXhuBzV
qu9LhvOcI1xnPUd-JPLx_4rZdSC92
Q_QZODiSxBhH-ellca78LW2iV4XXU
vIr-fVWIKdhrS49MD7KV1lCjdBcT_
K3l4bT0mBgZB1_Qpgf_5tmrj-kf.-ctY
GDLXKn-ovr6On-5g1G0_oK5mrHdj
CN3LXumyu8Q& dib_tag=se&
키워드=herb%2Bgrinder& qid=1736346511&
접두사=herb%2Bgrinder%2Caps%
2C168& sr=8-10& th=인간
, IV형Sigma-AldrichC7521
Costar 12mm 트랜스웰, 0.4 & m 기공 폴리에스테르 멤브레인 인서트Stemcell Technologies38023
세포 독성 검출 키트(LDH)Roche11644793001
Davinci MIQRO-C 드라이 허브 기화기DAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimethyl sulfoxideSigma-Aldrich34869
DMEM 배지Wisent319-005-CL
말린 대마초 꽃Socié 티&이큐트; qué bé coise du 대마초https://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1=THC		칸나비노이드 함량: 17– 23% THC < 0.1% CBD 
태아 소 혈청Wisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/버전 8.4.1
겐타마이신위센트450-134-XL
빙초산시그마-알드리치100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube 체외 노출 패키지   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
LC/MS 등급 메탄올Sigma-Aldrich106035
인산염 완충 식염수ThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC 표면, 필터 캡ThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC 표면, 필터 캡ThermoFisher Scientific156499
티아졸릴블루 테트라졸륨 브로마이드시그마 알드리치M 2128MTT
트리톤 X-100시그마 알드리치108603
초음파 세척기 목욕VWR18303초음파 처리기 목욕
주간 알약 정리HealthSmart640-8223-0000
태반에서 추출한 콜라겐 1 개

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