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In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

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이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

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MoClo(Modular Cloning) 툴킷을 사용하면 다중 유전자 구조를 신속하게 조립할 수 있습니다. 그들은 인식 부위 외부를 절단하는 Type IIS 제한 효소를 사용하는 Golden Gate 복제를 기반으로 합니다. 인식 및 절단 서열이 분리되기 때문에 유형 IIS 제한 효소에 의해 생성된 돌출부를 의도적으로 선택할 수 있으며 복제 전략은 일반적으로 올바르게 결합된 DNA 단편의 절단을 방지합니다. 이를 통해 단일 반응에서 여러 DNA 단편을 매우 효율적으로 조립할 수 있습니다. MoClo에서는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 코딩 서열 및 터미네이터와 같은 개별 기능성 DNA 부분과 고차 어셈블리에 표준화된 오버행이 할당되어 재사용 가능한 부분 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 대부분의 박테리아 MoClo 툴킷은 모노시스트로닉 전사 단위를 복제하기 위해 설계되었으며 폴리시스트로닉 오페론의 조립을 위한 구조화된 경로를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 In- & Out-Cloning 툴킷을 사용한 폴리시스트로닉 전사 단위의 조립을 보여줍니다. 동일한 접근 방식을 다른 MoClo 툴킷으로 이전할 수 있습니다.

Introduction

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플라스미드와 같은 복제본에 재조합 DNA를 도입하는 분자 복제는 분자 생물학의 기본 방법론입니다. DNA의 구성 및 조립 방법은 최근 수십 년 동안 점점 더 정교해졌습니다. 이제 연구자들은 합성된 DNA1에서 전체 합성 염색체와 게놈을 구축할 수 있습니다. 전통적인 분자 클로닝은 종종 임시 클로닝 전략에 의존하며 대규모 다중 유전자 구축의 경우 힘들고 비용이 많이 들 수 있습니다2. 최근 몇 년 동안 골든 게이트(GG) 클로닝 및 파생된 계층적 모듈러 클로닝(MoClo) 툴킷 2,3은 시간과 비용 효율적인 DNA 조립을 가능하게 하는 인기 있는 솔루션이 되었습니다.

유형 IIS 제한 효소는 방향성(비회문) 서열을 인식하고 이 인식 서열 외부에서 절단하는 엔도뉴클레아제입니다4. 결과적으로 절단에 의해 생성된 돌출부 서열은 인식 부위에 의존하지 않지만 선택할 수 있습니다4. 또한, 기능적 DNA 단....

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Protocol

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참고: 이 프로토콜은 In-Cloning 표준의 세 가지 수준(0, 1 및 M)을 통해 폴리시스트로닉 오페론의 설계 및 조립을 설명합니다. 여기에 조립된 폴리시스트로닉 오페론은 프로모터로 시작하여 리보솜 결합 부위(RBS), 코딩 서열(CDS), 두 번째 RBS, 두 번째 CDS, 마지막으로 터미네이터가 옵니다(그림 S1). 분자 복제 소프트웨어를 사용하여 인 실리코 복제를 시뮬레이션하여 설계된 복제 전략이 올바른지 확인하는 것이 좋습니다. 프로모터를 레벨 0 부품으로 조립하고, 코딩 서열과 터미네이터를 갖는 RBS를 레벨 1 전사 장치로 조립하고, 레벨 M에서 바이시스트로닉 오페론의 조립을 여기에 설명하고, 전체 어셈블리의 개략적인 개요를 도 S1에 나타내고 있다.

1. 레벨 0: 부품 가축화

참고: "가축화"라는 용어는 분자 부분이 MoClo 부분 라이브러리에 통합되었으며 MoClo 키트의 수준 전체에서 조립될 수 있음을 나타내는 데 사용됩니다. 전형적으로, 키트 내에서 사용되는 유형 IIS 제한 효소의 모든 인....

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Results

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여기에서는 레벨 0에서 레벨 M까지 폴리시스트로닉 오페론의 상향식 조립 결과가 나와 있습니다(그림 S1). 오페론은 유도 화합물 N-(β-케토카프로일)-L-호모세린 락톤(OC6)17의 존재 하에서 단백질 LuxR에 의해 활성화될 수 있는 프로모터 PLuxB로 시작됩니다. GFP는 오페론의 첫 번째 CDS이며 RBS는 iGEM BBa_B0064입니다. GFP 뒤에는 비터미널 링커인 '터미네이터 브리지'가 옵니다. 제2 RBS는 RBS 계산기(18)에 의해 설계되고, 제2 CDS는 mTurquoise이다. 마지막으로 오페론은 터미네이터L3S2P21 19로 종료됩니다.

터미네이터의 길들여짐
설계된 폴리시스트로닉 오.......

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Discussion

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분자 복제는 시간이 많이 걸리고 번거로울 수 있으며, 특히 임시 복제 전략의 경우 더욱 그렇습니다. MoClo 툴킷은 모듈성, 계층적 조립 및 고효율 원팟 반응을 통해 분자 클로닝을 개선할 수 있습니다. 그들은 골든 게이트 반응을 통한 DNA 조립에 의존합니다. 표준화된 돌출부 덕분에 분자 부분 라이브러리를 재사용하고 다른 사람과 공유할 수 있습니다 3,6. 부분의 재사용성을 통해 다중 유전자 구조의 풀링되거나 배열된 조합 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이것은 예를 들어, 이상적인 프로모터 강도 또는 효소 정체성을 찾는 것과 관련하여 이종 경로의 최적화를 용이하게 합니다. 이 방법의 표준화된 특성으로 인해 자동화가 가능하여 DNA의 처리량이 높은 조립이 가능합니다. 또한, In- & Out-Cloning MoClo 툴킷의 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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TAL, STdV 및 DS는 MaxGENESYS 프로젝트의 틀 내에서 막스 플랑크 학회의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
암피실린머크 생명과학A9518
박테리아 한천피셔 사이언티픽  P0011B
BBSI-HF뉴잉글랜드 바이오랩스R3539
BsaI-HF V2뉴잉글랜드 바이오랩스R3733
E. coliDH5α 유능한 세포들
에펜도르프와 nbsp; 마스터사이클러  넥서스 열 사이클러에펜도르프6333000014
EzDrop 1000 마이크로 볼륨 분광광도계블루레이 바이오텍브레드-1000
GeneJET 플라스미드 미니프렙 키트써모 사이언티픽K0503
인- & 아웃- 클론 도구 키트
리가제 버퍼뉴잉글랜드 바이오랩스B0216
나클피셔 사이언티픽  BP358
뉴브런즈윅 이노바 & 그리고 nbsp; 42/42R - 스택 가능한 인큐베이터 셰이커에펜도르프M1335-0080
페노부스+가수 악기PHB-007
사프리뉴잉글랜드 바이오랩스R0569
스펙티노마이신머크 생명과학S4014
표준 실험실 도구
T4 DNA 리아제뉴잉글랜드 바이오랩스M0202
서몰믹스 MMB. 브라운 바이오테크 인터내셔널
트립톤피셔 사이언티픽  LP0042B
효모 추출물피셔 사이언티픽  LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
  2. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6<....

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Modular CloningGolden Gate CloningPolycistronic OperonsType IIS EnzymesDNA AssemblyMultigene ConstructsStandardized OverhangsRibosome Binding SiteHeat Shock TransformationAgarose Gel Electrophoresis

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