Method Article

In-Cloning 툴킷을 사용한 MoClo(Polycistronic Operons with Modular Cloning)의 표준화된 모듈식 어셈블리

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 모듈러 클로닝(MoClo)이 폴리시스트로닉 오페론의 클로닝에 어떻게 적용될 수 있는지 보여주는 단계별 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MoClo(Modular Cloning) 툴킷을 사용하면 다중 유전자 구조를 신속하게 조립할 수 있습니다. 그들은 인식 부위 외부를 절단하는 Type IIS 제한 효소를 사용하는 Golden Gate 복제를 기반으로 합니다. 인식 및 절단 서열이 분리되기 때문에 유형 IIS 제한 효소에 의해 생성된 돌출부를 의도적으로 선택할 수 있으며 복제 전략은 일반적으로 올바르게 결합된 DNA 단편의 절단을 방지합니다. 이를 통해 단일 반응에서 여러 DNA 단편을 매우 효율적으로 조립할 수 있습니다. MoClo에서는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 코딩 서열 및 터미네이터와 같은 개별 기능성 DNA 부분과 고차 어셈블리에 표준화된 오버행이 할당되어 재사용 가능한 부분 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 대부분의 박테리아 MoClo 툴킷은 모노시스트로닉 전사 단위를 복제하기 위해 설계되었으며 폴리시스트로닉 오페론의 조립을 위한 구조화된 경로를 제공하지 않습니다. 이 프로토콜은 In- & Out-Cloning 툴킷을 사용한 폴리시스트로닉 전사 단위의 조립을 보여줍니다. 동일한 접근 방식을 다른 MoClo 툴킷으로 이전할 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

플라스미드와 같은 복제본에 재조합 DNA를 도입하는 분자 복제는 분자 생물학의 기본 방법론입니다. DNA의 구성 및 조립 방법은 최근 수십 년 동안 점점 더 정교해졌습니다. 이제 연구자들은 합성된 DNA1에서 전체 합성 염색체와 게놈을 구축할 수 있습니다. 전통적인 분자 클로닝은 종종 임시 클로닝 전략에 의존하며 대규모 다중 유전자 구축의 경우 힘들고 비용이 많이 들 수 있습니다2. 최근 몇 년 동안 골든 게이트(GG) 클로닝 및 파생된 계층적 모듈러 클로닝(MoClo) 툴킷 2,3은 시간과 비용 효율적인 DNA 조립을 가능하게 하는 인기 있는 솔루션이 되었습니다.

유형 IIS 제한 효소는 방향성(비회문) 서열을 인식하고 이 인식 서열 외부에서 절단하는 엔도뉴클레아제입니다4. 결과적으로 절단에 의해 생성된 돌출부 서열은 인식 부위에 의존하지 않지만 선택할 수 있습니다4. 또한, 기능적 DNA 단편, 여기서 '부분'이라고 불리는 것은, 절단이 결합될 부분2의 끝으로부터 인식 부위를 제거하도록 설계될 수 있다. GG 클로닝 전략은 이를 활용하여 원팟 반응에서 효율적인 다중 파트 DNA 어셈블리를 가능하게 합니다5. MoClo 툴킷은 GG 클로닝을 기반으로 하며 다중 유전자 구조의 조립을 위한 모듈식 및 계층적 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 부품을 조립하는 데 사용되는 돌출부는 표준화되어 재사용 및 교체 가능한 부품 라이브러리를 생성할 수 있습니다. MoClo 툴킷은 여러 DNA 서열을 수용하고 조립된 산물을 방출하도록 설계된 수용체 플라스미드에 의존합니다. 각 수용체 플라스미드는 두 개의 서로 다른 유형 IIS 효소의 두 가지 인식 부위를 포함하며, 하나는 DNA 화물을 수용하는 데 사용되고 다른 하나는 조립된 DNA를 방출하는 데 사용됩니다 3,6. 그 원리의 그림은 개별 부분인 터미네이터를 MoClo 수용체 플라스미드(레벨 0)로 복제하는 데 대한 그림 1에 나와 있습니다. 수용체 플라스미드와 인서트 모두 제한 효소 BbsI에 의해 절단되며, 호환 가능한 돌출부를 남기고 BbsI 인식 부위를 제거합니다. 따라서 올바르게 결찰된 플라스미드는 더 이상 BbsI에 의해 절단되지 않습니다. 생성된 플라스미드를 IIS 효소 SapI로 절단하면 다음 조립 단계(레벨 1)에서 이전에 삽입된 단편이 방출됩니다.

이 프로토콜에서는 In- 및 Out-Cloning MoClo 도구 상자가 사용됩니다7. 여기서, 레벨 0 플라스미드는 5' 비번역 영역(UTR)을 갖는 프로모터, 코딩 서열 및 3'UTR을 갖는 터미네이터와 같은 정의된 기본 유전 부분을 포함하며, 그림 1은 레벨 0의 개략적 개요를 보여줍니다. 레벨 1에서는 여러 파트가 TU(Transcription Unit)로 어셈블되고 있으며, 그림 2는 레벨 1 파트 및 복제에 대한 개략적인 개요를 보여줍니다. 인-아웃 클로닝 MoClo는 3-뉴클레오티드 돌출부를 생성하는 Type IIS 효소를 사용하여 레벨 1에서 전사 단위의 흉터 없는 조립을 위해 설계되었습니다. 이를 통해 오버행은 조립을 위해 ATG 시작 및 TGA 정지 코돈을 사용하여 코딩 시퀀스의 코돈 래스터 내에 완전히 있을 수 있습니다. 레벨 M 및 P는 레벨 1 플라스미드 3,8에서 방출된 다중 전사 단위의 조립에 사용됩니다. 그림 3은 레벨 M 및 P로 복제하기 위한 부분의 개략적 개요와 레벨 M에서 바이시스트로닉 오페론의 조립을 보여줍니다(바이시스트로닉 오페론은 다중 코딩 서열(CDS)을 발현하는 전사 단위임). 레벨 P와 M은 조립할 수 있는 부품의 수에 대한 이론적 제한이 없도록 한 것에서 다른 것으로의 반복적인 순환을 허용하도록 설계되었지만, 이 프로토콜의 주요 초점은 바이시스트로닉 오페론의 조립을 보여주는 것이기 때문에 이 프로토콜에는 설명되지 않습니다. 조립할 수 있는 부품 수에는 제한이 없지만 조립할 수 있는 구조물의 크기에는 제한이 있습니다. MoClo 키트를 사용하여 최대 100,000 bp를 조립했습니다9. 또한, 독성 유전자를 포함하는 대형 구조물 또는 구조체는 세포에 부담을 줄 수 있습니다. 이러한 경우에 대해 수정된 프로토콜이 게시되었습니다10.

In- 및 Out-Cloning은 처음에 폴리시스트로닉 전사 단위의 조립을 위한 계획을 설명하지 않았습니다. 폴리시스트로닉 오페론은 박테리아 11,12,13에서 매우 일반적인 유전자 구성 모드이므로 모듈식 방식의 상향식 조립에 주목할만한 관심이 있습니다14. 여기에서는 In- 및 Out-Cloning을 사용하여 폴리시스트로닉 오페론을 조립하기 위한 구조화된 체계가 설명됩니다. 제시된 체계는 폴리시스트로닉 전사 단위 내에서 코딩 서열의 위치를 쉽게 교환할 수 있을 뿐만 아니라 모노 및 폴리시스트로닉 전사로 구성된 어셈블리를 가능하게 합니다.

다음 단계별 프로토콜은 In-및 Out-Cloning을 사용하여 폴리시스트로닉 오페론의 설계 및 클로닝을 보여줍니다. 폴리시스트로닉 전사 단위를 복제하기 위해 제시된 전략은 다른 MoClo 툴킷에 쉽게 적용할 수 있습니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 이 프로토콜은 In-Cloning 표준의 세 가지 수준(0, 1 및 M)을 통해 폴리시스트로닉 오페론의 설계 및 조립을 설명합니다. 여기에 조립된 폴리시스트로닉 오페론은 프로모터로 시작하여 리보솜 결합 부위(RBS), 코딩 서열(CDS), 두 번째 RBS, 두 번째 CDS, 마지막으로 터미네이터가 옵니다(그림 S1). 분자 복제 소프트웨어를 사용하여 인 실리코 복제를 시뮬레이션하여 설계된 복제 전략이 올바른지 확인하는 것이 좋습니다. 프로모터를 레벨 0 부품으로 조립하고, 코딩 서열과 터미네이터를 갖는 RBS를 레벨 1 전사 장치로 조립하고, 레벨 M에서 바이시스트로닉 오페론의 조립을 여기에 설명하고, 전체 어셈블리의 개략적인 개요를 도 S1에 나타내고 있다.

1. 레벨 0: 부품 가축화

참고: "가축화"라는 용어는 분자 부분이 MoClo 부분 라이브러리에 통합되었으며 MoClo 키트의 수준 전체에서 조립될 수 있음을 나타내는 데 사용됩니다. 전형적으로, 키트 내에서 사용되는 유형 IIS 제한 효소의 모든 인식 부위는 예를 들어, 동의어 재코딩에 의해 길들여질 부분으로부터 제거된다.

  1. 인서트의 디자인
    1. 프로모터, CDS 및 터미네이터와 같은 분자 부품을 선택하여 오페론에서 함께 조립합니다.
      참고: 이 프로토콜에서 오페론은 유도 화합물 N-(β-케토카프로일)-L-호모세린 락톤(OC6)17의 존재 하에서 단백질 LuxR에 의해 활성화될 수 있는 프로모터 PLuxB로 시작됩니다. GFP는 오페론의 첫 번째 CDS입니다. RBS는 iGEM BBa_B0064입니다. GFP 뒤에는 비터미널 링커인 '터미네이터 브리지'가 옵니다. 두 번째 CDS는 mTurquoise입니다. RBS는 RBS 계산기(18)에 의해 설계되었다. 마지막으로 오페론은 터미네이터L3S2P21 19로 종료됩니다.
    2. 부품을 조립해야 하는 위치를 선택하면 개요가 그림 1에 나와 있습니다. 위치에 따라 GG에 사용할 수용체 플라스미드를 선택합니다.
      알림: 부품은 나중에 다양한 위치에서 사용하기 위해 길들여질 수 있습니다. 예를 들어, 프로모터는 나중에 5'UTR 부품(pSL252)과 연결될 때 단일 부품으로 조립되거나 이미 포함된 5'UTR로 길들여질 수 있습니다(pSL099). CDS는 4개의 수용체 플라스미드로 조립될 수 있으며, 태그 없이 조립될 수 있고(pSL102), N-단말 태그(pSL104)로 조립되거나, C-단말 태그(pSL101)와 함께 조립되거나, N-단말 태그와 C-단말 태그(pSL103)로 조립될 수 있습니다. 주어진 예에서, 프로모터는 pSL252로 길들여지고, 제1 RBS는 pSL253으로 길들여지고, 제1 CDS는 pSL102로 길들여지고, 터미네이터 브리지는 pSL106으로 길들여지고, 제2 RBS는 pSL099로 길들여지고, 제2 CDS는 pSL102로 길들여지고, 터미네이터는 pSL106으로 길들여진다.
    3. 선택한 수용체 플라스미드를 기반으로 설계된 인서트에 확장을 추가합니다. 표 1은 수용체 플라스미드당 GG 조립에 필요한 확장에 대한 개요를 제공합니다. 이러한 확장은 PCR용 프라이머 설계, 부품을 구성하기 위해 두 개의 올리고를 어닐링하는 경우 올리고 설계 또는 유전자 합성 중에 추가되어야 합니다.
      참고: 부품을 길들이기 위해서는 부품 자체에 키트 내에서 사용되는 유형 IIS 효소, SapI(5'-GCTCTTC-3'), BbsI(5'-GAAGAC-3') 및 BsaI(5'-GGTCTC-3')의 인식 부위가 포함되어 있지 않은지 확인해야 합니다. 부품에 인식 부위가 존재하면 최종 제품이 사용된 Type IIS 효소에 의해 절단될 수 있기 때문에 올바른 조립의 효율성이 크게 감소합니다( 그림 1 참조).
  2. GG 반응
    1. GG 반응의 경우 원하는 인서트 50 fmol, 수용체 플라스미드 50 fmol, 10x T4 DNA 리가제 완충액 1 μL, T4 리가아제 1 μL 및 BbsI 1 μL를 첨가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 총 부피 10μL까지 첨가합니다. 또한 원하는 삽입물 없이 동일한 반응을 가진 음성 대조군을 포함합니다.
    2. 열순환기에서 다음 프로그램을 실행합니다: 3분 동안 37°C(37°C가 제한 효소의 최적 온도임) 및 16°C에서 4분(16°C가 T4 리가아제의 최적 온도임)의 25사이클, 50°C에서 20분 동안 최종 분해(50°C에서 T4 리가아제는 활성이 거의 또는 전혀 없음을 나타내며, 제한 효소가 여전히 기능할 수 있는 동안, 따라서 최종 제품에서 절단되지 않은 수용체 플라스미드의 양을 제한합니다) 및 80°C에서 20분 동안 효소의 열 비활성화(80°C에서 모든 효소가 열비활성화되고 반응이 종료됨)6.
    3. 화학적으로 유능한 대 장균 세포 50μL에 GG 반응 5μL를 첨가하여 GG 반응을 변형시키고, 이전에 발표된 프로토콜15에 설명된 바와 같이 회복 단계로 열충격 변형을 수행한다.
    4. 100μg/mL 스펙티노마이신과 함께 Luria-Bertani(LB) 한천 플레이트에 형질전환 성장 100μL를 퍼뜨립니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
    5. 두 플레이트의 흰색 콜로니 수를 계산하여 음성 대조군의 변환 효율을 전체 어셈블리의 변환 효율과 비교합니다. 어셈블리에 음성 대조군보다 약 10배(또는 그 이상)의 흰색 콜로니가 있는 경우 다음 단계로 진행합니다.
      참고: 결과 콜로니의 대부분은 흰색이어야 하며 빨간색 콜로니의 일부는 일부만 있어야 합니다. In-Cloning 툴킷의 수용체 플라스미드에는 mCherry (레벨 0 및 레벨 1) 또는 LacZα (레벨 M 및 레벨 P)와 자이라제 억제제를 암호화하는 ccdB 유전자를 포함하는 이중 선택 카세트가 있습니다. GG 반응의 형질전환은 ccdB 민감성 대장균 세포에서 수행되므로 조립된 플라스미드를 가진 세포만 성장할 수 있는 반면 원래의 수용체 플라스미드는 증식할 수 없습니다. ccdB 에 민감한 변형의 예로는 DH5α 및 TOP10이 있습니다. mCherry/LacZα 는 ccdB 메커니즘을 벗어나는 세포를 시각적으로 식별할 수 있습니다16.
    6. 각 어셈블리에 대해, 피펫 팁으로 콜로니의 일부 물질을 집어 들고 각각 100μg/mL 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지 5mL에 재현탁하여 2개의 흰색 콜로니를 배양하고 250rpm의 진탕 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 플라스미드 추출을 수행합니다. 추출된 플라스미드가 Sanger 시퀀싱에 의해 예상된 서열을 가지고 있는지 확인합니다.

2. 레벨 1: 위치 결정

참고: 레벨 1은 부품을 길들이는 것과 폴리시스트로닉 오페론을 조립하는 것 사이의 수준입니다(그림 2). 여기에서 최종 구성에서 중간 어셈블리의 위치가 결정됩니다. 오페론 내에서 레벨 1 어셈블리의 위치는 다른 레벨 1 수용체 플라스미드를 사용하여 변경할 수 있습니다. 주어진 예는 바이시스트로닉 장치의 조립을 설명하지만 주어진 체계는 최대 6개의 코딩 시퀀스(각각 RBS 포함)의 조립에 쉽게 적용할 수 있습니다. 더 많은 코딩 시퀀스를 조립하려면 레벨 P와 M 사이를 순환해야 합니다. 레벨 P와 M 사이의 반복 순환을 사용하면 단일 오페론으로 조립할 수 있는 코딩 시퀀스 수에 고정된 상한이 없습니다.

  1. 부품 및 수용체 플라스미드 선택
    1. 전사 단위로 조립할 레벨 0 부품을 선택합니다. 최소한 프로모터, CDS 및 터미네이터가 포함되어야 합니다.
    2. 오페론에서 전사 단위를 조립해야 하는 위치를 선택합니다. 해당 위치에 따라 적절한 수용체 플라스미드를 선택합니다. 개요는 그림 2에 나와 있습니다.
      참고: 예를 들어 바이시스트로닉 오페론의 구성을 위한 7개의 DNA 단편은 2개의 레벨 1 구조로 조립됩니다. 프로모터, 제1 RBS, 제1 CDS 및 터미네이터 브리지는 pSL68로 조립됩니다. 두 번째 RBS, 두 번째 CDS 및 터미네이터는 pSL69로 조립됩니다.
  2. GG 반응
    1. GG 반응의 경우, 원하는 각 인서트의 50 fmol, 수용체 플라스미드의 50 fmol, 10x T4 DNA 리가제 완충액 1 μL, T4 리가아제 1 μL 및 SapI 1 μL를 첨가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 총 부피 10μL까지 첨가합니다.
    2. 열순환기에서 다음 프로그램을 실행합니다: 37°C에서 3분, 16°C에서 4분 동안 25사이클, 50°C에서 20분 동안 최종 분해, 80°C에서 20분 동안 효소의 열 비활성화6.
    3. 선택 사항: GG 반응에 0.5μL의 SapI를 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 배양합니다.
      참고: SapI는 사용된 다른 유형 IIS 제한 효소만큼 안정적이지 않습니다. GG 반응 후 SapI를 사용한 소화 단계는 재결찰된 수용체 플라스미드를 운반하는 콜로니의 양을 감소시키는 것으로 밝혀졌습니다. SapI에는 이 최종 소화 단계가 필요하지 않을 수 있는 이소분열체인 BspQI가 있습니다.
    4. 화학적으로 유능한 대 장균 세포 50μL에서 GG 반응 5μL를 형질전환하고 1.2.3단계에서 수행된 대로 회복 단계를 사용하여 열 충격 형질전환을 수행합니다.
    5. 100μg/mL 암피실린이 있는 LB 한천 플레이트에 형질전환 성장 100μL를 플레이트합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
    6. 각각에 대해, 피펫 팁으로 콜로니의 일부 물질을 집어 들고 각각 100μg/mL 암피실린이 포함된 LB 배지 5mL에 재현탁하여 2개의 흰색 콜로니를 배양합니다. 250rpm의 진탕 인큐베이터에서 37°C에서 밤새 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 플라스미드 추출을 수행합니다.
    7. BbsI를 사용하여 제한 다이제스트를 통해 올바른 어셈블리를 확인하고 컷아웃의 크기가 인서트의 예상 크기와 일치하는지 확인합니다. 적절한 10x 분해 완충액 1μL와 BbsI 1μL를 첨가하여 1000ng의 플라스미드 DNA를 분해합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 총 부피 10μL까지 첨가합니다. 반응을 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
    8. 소화된 플라스미드를 1% 아가로스 겔에 로드하여 겔 전기영동을 수행하고 겔을 100V에서 35분 동안 실행합니다.
      참고: 예상되는 플라스미드의 인실리코 분해를 수행하여 결과를 예측하기 위해 아가로스 겔을 시뮬레이션할 수 있습니다.

3. 레벨 M : 폴리 시스트로닉 오페론의 조립

참고: 이 단계에서는 폴리시스트로닉 오페론이 조립됩니다. 제시된 바이시스트로닉 오페론의 경우 두 개의 레벨 1 인서트가 위치 1과 2에 조립됩니다. 따라서, 수용체 플라스미드 pMA60이 선택된다. 또한, 엔드 링커가 필요합니다. 모든 레벨 M 및 P 수용체 플라스미드는 두 번째 돌출부로 돌출부 GGGA를 갖습니다. 엔드 링커는 인서트와 수용체 플라스미드 사이를 연결하고 레벨 P 구조를 레벨 M으로 또는 그 반대로 조립할 수 있도록 합니다. 두 개의 레벨 1 인서트로 구성된 레벨 P 어셈블리의 경우 엔드 링커 pMA668이 사용되며 세 번째이자 최종 위치를 차지합니다. 레벨 M 및 P의 개요와 클로닝 단계의 시각화가 그림 3에 나와 있습니다. 레벨 M(또는 P)에서만 조립하면 최대 6개의 코딩 시퀀스의 오페론을 복제할 수 있습니다(위치 1-6). 위치 7은 엔드 링커에 의해 취해지고 있습니다. 오페론에서 더 많은 수의 코딩 시퀀스를 조립하는 것이 가능하지만 이 프로토콜에 설명되지 않은 레벨 M(또는 P)으로 순환해야 합니다.

  1. GG 반응을 위해 원하는 각 삽입물 50 fmol, 수용체 플라스미드 50 fmol, 10x T4 DNA 리가제 완충액 1 μL, T4 리가아제 1 μL 및 BbsI 1 μL를 첨가합니다. 뉴클레아제가 없는 물을 총 부피 10μL까지 첨가합니다.
  2. 열순환기에서 다음 프로그램을 실행합니다: 37°C에서 3분, 16°C에서 4분 동안 50회 사이클을 수행한 후 50°C에서 20분 동안 최종 분해하고 80°C에서 20분 동안 효소를 열 비활성화합니다6.
  3. 화학적으로 유능한 대 장균 세포 50μL에서 GG 반응 5μL를 형질전환하고 1.2.3단계에서 수행한 대로 회복 단계로 열 충격 형질전환을 수행합니다.
  4. 100μg/mL 스펙티노마이신과 함께 LB 한천 플레이트에 형질전환 성장 100μL를 퍼뜨립니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양하거나 어셈블리의 대사 부담 또는 독성이 예상되는 경우 30°C에서 배양합니다.
  5. 각 어셈블리에 대해 두 개의 백인 식민지에서 배양을 만듭니다. 이를 위해 피펫 팁을 콜로니에 담그고 이를 사용하여 LB 5mL에 100μg/mL 스펙티노마이신을 접종합니다. 37°C 또는 30°C에서 250rpm의 진탕 인큐베이터에서 밤새 배양합니다. 제조업체의 지침에 따라 컬럼 기반 플라스미드 추출을 수행합니다.
  6. 2.2.7단계에서 수행한 대로 컷아웃의 크기가 인서트의 예상 크기와 일치하는지 확인하고 BsaI를 사용하여 제한 다이제스트를 통해 올바른 조립을 확인합니다.
    참고: 구조가 너무 길어서 확인을 위해 Sanger 시퀀싱으로 다룰 수 없습니다. 그런 다음 여러 시퀀싱 서비스 제공업체에서 상용 서비스로 제공되는 전체 플라스미드 시퀀싱을 통해 확인할 수 있습니다.

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Results

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여기에서는 레벨 0에서 레벨 M까지 폴리시스트로닉 오페론의 상향식 조립 결과가 나와 있습니다(그림 S1). 오페론은 유도 화합물 N-(β-케토카프로일)-L-호모세린 락톤(OC6)17의 존재 하에서 단백질 LuxR에 의해 활성화될 수 있는 프로모터 PLuxB로 시작됩니다. GFP는 오페론의 첫 번째 CDS이며 RBS는 iGEM BBa_B0064입니다. GFP 뒤에는 비터미널 링커인 '터미네이터 브리지'가 옵니다. 제2 RBS는 RBS 계산기(18)에 의해 설계되고, 제2 CDS는 mTurquoise이다. 마지막으로 오페론은 터미네이터L3S2P21 19로 종료됩니다.

터미네이터의 길들여짐
설계된 폴리시스트로닉 오...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분자 복제는 시간이 많이 걸리고 번거로울 수 있으며, 특히 임시 복제 전략의 경우 더욱 그렇습니다. MoClo 툴킷은 모듈성, 계층적 조립 및 고효율 원팟 반응을 통해 분자 클로닝을 개선할 수 있습니다. 그들은 골든 게이트 반응을 통한 DNA 조립에 의존합니다. 표준화된 돌출부 덕분에 분자 부분 라이브러리를 재사용하고 다른 사람과 공유할 수 있습니다 3,6. 부분의 재사용성을 통해 다중 유전자 구조의 풀링되거나 배열된 조합 라이브러리를 생성할 수 있습니다. 이것은 예를 들어, 이상적인 프로모터 강도 또는 효소 정체성을 찾는 것과 관련하여 이종 경로의 최적화를 용이하게 합니다. 이 방법의 표준화된 특성으로 인해 자동화가 가능하여 DNA의 처리량이 높은 조립이 가능합니다. 또한, In- & Out-Cloning MoClo 툴킷의 ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV 및 DS는 MaxGENESYS 프로젝트의 틀 내에서 막스 플랑크 학회의 지원을 받았습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
암피실린머크 생명과학A9518
박테리아 한천피셔 사이언티픽  P0011B
BBSI-HF뉴잉글랜드 바이오랩스R3539
BsaI-HF V2뉴잉글랜드 바이오랩스R3733
E. coliDH5α 유능한 세포들
에펜도르프와 nbsp; 마스터사이클러  넥서스 열 사이클러에펜도르프6333000014
EzDrop 1000 마이크로 볼륨 분광광도계블루레이 바이오텍브레드-1000
GeneJET 플라스미드 미니프렙 키트써모 사이언티픽K0503
인- & 아웃- 클론 도구 키트
리가제 버퍼뉴잉글랜드 바이오랩스B0216
나클피셔 사이언티픽  BP358
뉴브런즈윅 이노바 & 그리고 nbsp; 42/42R - 스택 가능한 인큐베이터 셰이커에펜도르프M1335-0080
페노부스+가수 악기PHB-007
사프리뉴잉글랜드 바이오랩스R0569
스펙티노마이신머크 생명과학S4014
표준 실험실 도구
T4 DNA 리아제뉴잉글랜드 바이오랩스M0202
서몰믹스 MMB. 브라운 바이오테크 인터내셔널
트립톤피셔 사이언티픽  LP0042B
효모 추출물피셔 사이언티픽  LP0021B

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. The design and engineering of synthetic genomes. Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).
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