방법 논문

컨포칼 현미경을 사용한 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태 측정

DOI:

10.3791/68167

⸱

2025년 7월 3일

 ,  ,  ,  , 
1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

이 논문에서

요약

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이 연구에서는 단계별 프로토콜을 설명하고 샘플 준비, 이미지 획득 및 데이터 분석을 포함하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아의 형태학적 특성을 결정하기 위한 주요 세부 사항을 강조합니다. 이 방법은 다양한 조건을 연구하기 위해 미토콘드리아 형태를 검사하는 데 일반적으로 사용됩니다.

초록

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미토콘드리아 융합과 분열의 동적 균형은 미토콘드리아 항상성에 직접적으로 기여하며, 이는 아데노신 삼인산(ATP) 항상성 외에도 수많은 세포 기능에 영향을 미칩니다. 따라서 스트레스 조건에서 미토콘드리아 형태를 평가하는 것은 기계론적 연구에 필수적입니다. 이 연구는 MitoTracker 솔루션의 준비, 미토콘드리아 염색, 이미징 매개변수의 최적화 및 형태학적 특징의 검출을 포함하여 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. MitoTracker는 일반적으로 사용되는 비용 효율적인 미토콘드리아 전용 염료입니다. 그러나 부적절한 취급으로 인해 미토콘드리아 형태의 일부 변화가 발생할 수 있으며, 이는 감지할 수 없고 미토콘드리아의 실제 상태를 반영하지 못할 수 있습니다. 따라서 MitoTrackers를 사용하여 미토콘드리아 형태의 변화를 분석하는 방법을 이해해야 합니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 형태학적 분석의 프로토콜을 설명하기 위해 1-메틸-4-페닐피리디늄 요오드화물(MPP+)로 자극된 SH-SY5Y 세포를 사용했습니다. 대조 세포와 비교했을 때, MPP+ 자극 세포는 더 작고 더 단편화된 미토콘드리아를 나타냈으며, 형태학적 매개변수는 미토콘드리아 발자국이 감소했음을 나타냅니다. 이러한 결과는 MitoTracker 염색이 미토콘드리아 형태학적 분석을 위한 효과적이고 실현 가능한 방법이며, (약간의 수정으로) 다양한 조건을 연구하는 데 적용할 수 있음을 시사합니다.

서론

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미토콘드리아 형태는 미토콘드리아 융합과 분열의 동적 균형에 의해 유지되므로 에너지 항상성 및 기타 수많은 세포 기능에 영향을 미쳐 신경 퇴행성 질환, 암 및 염증과 같은 다양한 병리학을 유발합니다 1,2,3,4,5 . 미토콘드리아 형태학을 관찰하기 위해 프로브와 항체를 모두 포함하는 여러 미토콘드리아 선택적 염색이 컨포칼 현미경과 함께 사용하도록 개발되었습니다. 테트라메틸로사민(tetramethylrosamine) 및 로다민(rhodamine) 123과 같은 일부 미토콘드리아 특이적 프로브는 미토콘드리아 막 전위(MMP)를 기반으로 기능하며, 이는 MMP 파괴 조건 연구에서의 적용 가능성을 제한합니다 6,7. 반대로, 항체 염색은 고정된 세포에서 미토콘드리아 형태를 검사하기 위한 MMP 독립적 형태학적 평가를 제공합니다. 적절한 염색을 통해 고정된 세포에서 미토콘드리아 형태를 평가할 수 있지만, 일부 유도 물질에 의해 손상된 살아있는 세포에서 미토콘드리아 형태를 검사하는 것은 여전히 어렵습니다. 세포 투과성 양이온 및 미토콘드리아 특이적 형광 프로브인 MitoTracker는 살아있는 세포와 고정된 세포 모두를 염색할 수 있는 이 문제에 대한 솔루션을 제공합니다. 이 프로브는 다양한 질병 8,9,10,11에 대한 연구에서 미토콘드리아 형태를 조사하는 데 널리 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고 일부 연구에서는 프로브가 제조업체가 제공한 지침에 따라 엄격하게 사용되는 경우에도 높은 백그라운드 신호 및 비특이적 결합과 같은 문제를 보고했습니다. 이러한 관찰은 미토콘드리아 형태의 성공적인 분석을 위해 시료 준비 및 이미지 획득에 대한 철저한 이해의 중요성을 강조합니다.

미토콘드리아 형태학의 분석을 용이하게 하기 위해 다양한 이미지 처리 프로그램과 알고리즘이 개발되었습니다 12,13,14,15,16. 본 연구에서는 미토콘드리아 형태학을 분석하기 위해 ImageJ에서 매크로 도구인 Mitochondrial Network Analysis (MiNA)를 사용하였다13. 이 도구는 개체 수(가지가 없는 구조), 네트워크 수(하나 이상의 접합 픽셀이 있는 물체의 수), 평균 길이(모든 막대 및 가지의 평균 길이), 중간 길이(모든 막대 및 가지의 중간 길이), 길이 표준 편차(개별 길이의 표준 편차), 평균 네트워크 크기(네트워크당 평균 분기 수), 중앙값 네트워크 크기(네트워크당 분기 수의 중간 값), 네트워크 크기 표준 편차(네트워크당 분기 수의 표준 편차) 및 미토콘드리아 발자국(백그라운드 분리 후 총 신호 영역). 이 프로토콜에서는 미토콘드리아 발자국이 대표 파라미터로 선택되었습니다.

이 연구의 목적은 주요 세부 사항에 초점을 맞춰 미토콘드리아 형태학적 분석을 위한 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜을 입증하기 위해 MPP+ 유도 SH-SY5Y 셀을 사용했습니다. MPP+는 도파민 뉴런에서 미토콘드리아 호흡 사슬의 복합체 I을 억제하여 미토콘드리아 형태와 기능을 손상시킵니다 8,17. 이 연구에서 설명한 형태학적 분석 프로토콜은 고해상도 이미지를 획득하고 관련 매개변수를 평가하여 미토콘드리아 네트워크의 형태학적 특징을 정의할 수 있도록 합니다.

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프로토콜

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1. 준비

  1. MPP+ 를 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 1mM 원액을 만들고 -30°C의 어두운 곳에서 보관합니다( 재료 표 참조).
  2. 50μg의 MitoTracker(MitoTracker Red CMXRos)를 94μL의 DMSO에 용해시켜 1mM 원액을 만듭니다. 원액을 여러 개의 마이크로 원심분리기 튜브에 분취하고 나중에 사용할 때까지 -30°C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
  3. 37°C에서 5% CO2 및 95% 공기로 가습된 환경에서 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 배지를 사용하여 플라스크에서 SH-SY5Y 세포를 배양합니다. 계대 배양의 경우 0.05% 트립신 용액으로 세포를 1분 동안 분리하고 100×g에서 3 분 동안 원 심분리합니다.

2. MPP+ 자극

  1. SH-SY5Y 세포를 바닥이 유리인 컨포칼 접시에 파종하고 1%(v/v) FBS가 보충된 DMEM/F12 배지에서 하룻밤 동안 유지합니다.
  2. 배양 배지를 교체한 다음 MPP+ 가 있거나 없는 세포를 24시간 동안 배양합니다.

3. MitoTracker 염색

  1. DMEM/F12를 예열한 다음 MitoTracker 스톡 용액을 DMEM/F12로 희석하여 50nM 작동 용액을 얻습니다. 전체 절차 동안 용액을 빛으로부터 보호하십시오.
  2. 세포 배양 배지를 제거하고 컨포칼 접시를 새 DMEM/F12로 2x 세척합니다.
  3. 1mL의 MitoTracker 작업 용액으로 각 접시의 세포를 어두운 곳에서 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
  4. MitoTracker 작업 용액을 제거하고 DMEM/F12로 2회 세척합니다.
  5. 각 접시에 1mL의 DMEM/F12를 추가하고 이미징 전에 세포 배양기에서 배양합니다.

4. 컨포칼 현미경을 위한 이미징 매개변수

  1. 후속 작업을 위해 현미경을 사전 평형화합니다. Acquisition 패널에서 excitation 및 emission 파장을 설정하여 광 경로 관련 매개변수를 조정합니다.
  2. 매개변수를 다음과 같이 설정합니다: 핀홀 크기, 1.2AU; 픽셀 스캔 크기, 1,024 x 1,024; 픽셀 체류 시간, 2.4μs(평균 2배)( 보정을 위해 일관성 유지).

5. 이미징 매개변수 최적화

주의 : 가시 및/또는 보이지 않는 레이저의 직접 및 산란 방사선에 눈에 노출되지 않도록 하십시오.

  1. 광독성을 피하기 위해 plan apochromatic 60x 대물 렌즈(1.4 NA)를 사용하여 할로겐 광선을 사용하여 세포에 초점을 맞춥니다.
  2. 레이저 출력과 고전압(HV)을 채도 수준 바로 아래로 조정하고 확대/축소 계수를 3으로 설정한 다음 이미지를 캡처합니다.
  3. 관심 영역을 이동하고 셀에 초점을 맞춰 설정을 변경하지 않고 이미지를 캡처합니다.

6. 데이터 분석

참고: 데이터는 MiNA 플러그인13이 사전 설치된 ImageJ를 사용하여 분석되었습니다. 정확한 관련 측정값을 얻으려면 이미지가 깨끗하고 밝은 염색으로 독립적으로 분해된 미토콘드리아를 캡처해야 합니다.

  1. 이진 변환 및 스켈레톤화 전에 이미지 품질을 향상시키려면 이미지를 열고 예비 처리를 수행합니다. ROI 도구를 사용하여 단일 셀의 영역을 선택합니다. 프로세스 적용 | 필터 | 선명도를 높이기 위한 언샵 마스크 기능, 그리고 프로세스 | 노이즈 과잉 증폭을 줄이기 위해 Contrast 기능을 향상시킵니다. 특히 소금과 후추 소음을 제거하려면 Process | 필터 | 중앙값 함수(보충 그림 S1 참조).
  2. 설명 매개변수를 계산하기 위해 단순화된 형태학 모델을 구성하려면 임계값을 통해 이미지를 이진으로 변환합니다( 프로세스 | 바이너리 | Make Binary)를 선택한 다음 Skeletonize 함수 ( Process | 바이너리 | Skeletonize)를 참조하십시오( 보충 그림 S2 참조).
  3. Analyze | 스켈레톤 | Analyze Skeleton (2D/3D) 기능. MiNA 툴을 사용하여 스켈레톤화된 이미지에서 9개의 설명 파라미터를 계산함으로써 분석을 단순화합니다(보충 그림 S3 참조).

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결과

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이 프로토콜은 세 가지 상호 의존적인 최적화 모듈(표본 준비 프로토콜의 표준화, 컨포칼 현미경 이미징을 위한 광학 매개변수의 체계적인 최적화, 컴퓨터 이미지 처리 지침)을 통해 미토콘드리아 형태학적 분석을 위한 상세한 단계별 절차를 설명합니다. 최적의 시료 전처리 프로토콜은 신뢰할 수 있는 미토콘드리아 이미징 데이터를 얻는 데 매우 중요합니다. MitoTracker Red CMXRos 농도에 대한 체계적인 평가는 농도에 따른 형광 특성을 입증했습니다. 25nM 처리는 높은 농도에 비해 현저히 약한 형광 신호를 나타냈습니다(그림 1A). 특히, 50nM과 100nM 처리 간에 표지 효율의 유의미한 차이는 관찰되지 않았지만 200nM 조건은 두 가지 중요한 한계를 나타냈습니다: 더 낮은 레이저 조사 임계값을 필요로 하는 광감도 증가와 상당한 세포질 배경 염색.

또한 배경 형광 신호에 대한 PBS와 배양 배지의 영향을 평가했습니다....

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토론

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본 연구는 스트레스 조건에서 살아있는 세포의 미토콘드리아 형태를 분석하기 위한 체계적인 방법론을 확립했습니다. 미토콘드리아 이미징의 중요한 절차적 단계에는 MitoTracker 프로브의 적절한 농도, 이미지 획득 전에 컨포칼 접시를 철저히 세척, 세포 상태에 대한 방해 최소화 및 적절한 이미징 매개변수 설정이 포함됩니다.

더 높은 농도의 MitoTracker를 사용하면 세포 독성을 유발하여 미토콘드리아를 레이저 출력에 민감하게 만들고 잠재적으로 염료가 다른 세포 구조를 염색하게 할 수 있습니다(그림 1A). 이러한 결과를 바탕으로 50nM가 최적의 농도로 결정되었으며, 강한 신호 강도와 최소한의 광독성 효과의 균형을 맞췄습니다. 마찬가지로, MitoTrackers의 실험 농도 및 배양 시간은 다른 세포 유형...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, 81974501)의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-메틸-4-페닐피리디늄요오드화물(MPP+)맥클린M875357산화 스트레스 유도에 사용
공초점 접시둥지801001세포 배양에 사용
공초점 현미경니콘씨2이미지 캡처에 사용
Dulbecco's Modified Eagle 배지/영양 혼합물 F-12써모피셔 사이언티픽11320033세포에 영양을 공급하는 데 사용됩니다.
디메틸 설폭사이드(DMSO)비요타임ST038mitotracker 프로브를 용해하는 데 사용됩니다.
소 태아 혈청(FBS)써모피셔 사이언티픽A3161001C세포에 영양을 공급하는 데 사용됩니다.
이미지J국립 보건원이미지J미토콘드리아 형태 분석에 사용
미토트래커 레드 CMXRos써모피셔 사이언티픽M7512미토콘드리아를 시각화하는 데 사용됩니다.
인산염 완충 식염수(PBS)써모피셔 사이언티픽C10010500BT공초점 접시의 세포를 세척하는 데 사용됩니다.
SH-SY5Y 셀ATCCCRL-2266미토콘드리아 형태 분석 워크플로를 시연하는 데 사용됩니다.
TI-SH-U 스테이지 어댑터니콘MEC59110시편 고정에 사용

참고문헌

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