실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인을 사용한 식수 내 미세 플라스틱의 멀티모달 분석

Summary

여기에서는 식수 내 오염 입자를 효율적으로 포집하고 분석하기 위해 광학적으로 투명하고 평평한 기판을 보여주는 프로토콜을 제시합니다. 여기에 제시된 것은 실리콘 나노멤브레인 분석 파이프라인(SNAP)입니다: 액체 매체에서 입자의 포집, 정량화 및 식별을 위한 유연한 파이프라인입니다.

Abstract

인간의 음식과 수원에 대한 미세 플라스틱 오염의 생물학적 영향은 대부분 알려져 있지 않으며 식수원도 이러한 미세 플라스틱 오염에서 예외는 아닙니다. 여기에서는 식수에서 미세 플라스틱을 포집, 정량화 및 식별하기 위한 간소화된 접근 방식을 보여줍니다. 우리는 동일한 기판에서 개별화되고 정량화 가능한 다중 모드 입자 분석을 위해 부유 입자를 평면화된 관찰 영역으로 통합하는 상당한 "농도 계수"를 가능하게 하는 새로운 질화규소 나노멤브레인을 활용하는 SNAP(Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline)라는 분석 워크플로를 제시합니다. SNAP의 주요 장점은 기존 크기의 필터 디스크에 들어 있는 초박형 질화규소 기반 멤브레인을 사용하여 비고분자 배경에서 고분자 MP를 직접 포획하고 분석할 수 있다는 점에서 비롯됩니다. 뉴욕 로체스터 지역에서 공급된 식수 샘플은 주거용 수돗물에서 수집하여 SNAP를 사용하여 분석했습니다. 각 샘플의 입자는 광학 및 주사 전자 현미경(SEM), 라만 분광법 및 에너지 분산 X선 분광법(EDX)으로 특성화되었으며, 식별된 다양한 구성 성분은 포집된 총 입자에 비례하여 정량화되었습니다.

Introduction

미세 플라스틱은 크기가^5mm 미만인 합성 폴리머로 정의됩니다 ^1,2. 미세 플라스틱(MP) 오염은 인간의 건강, 환경 및 생태학적 우려가 커지고 있습니다. MP 오염은 모든 유형의 수원에서 발견되었습니다. 담수, 바다, 심지어 식수원³. MP는 1차 플라스틱 공급원⁴과 합성 섬유^5,6,7의 분해에서 생성됩니다. MP는 어디에나 존재하며 인간 태반, 대변 및 혈액과 같은 인간 조직에서 발견됩니다 ^8,9,10. 2023년과 2024년에 각각 4,100건과 4,600건 이상의 간행물(PubMed 데이터, 키워드 "미세 플라스틱")에서 알 수 있듯이 MP 연구에 대한 관심이 증가하고 있으며, MP에 대한 인체 노출에 대한 대중의 우려가 증가하고 있습니다.증가하는 대중의 우려에 대응하여 캘리포니아 주¹¹ 및 여러 EU 국가¹²와 같은 여러 정부 규제 기관이 있습니다, 식수의 MP 수준에 대한 규정을 시행해 왔습니다(또는 시행할 예정). 위의 모든 사항을 고려하여 미국 환경 보호국은 최근 MP를 새로운 우려 오염 물질로 발표했습니다. 그러나 MP의 신뢰할 수 있고 재현 가능한 검출 방법이 부족하여 인적 위험 평가가 심각하게 방해를 받고 있습니다.

MP의 특성화는 MP7의 시각적^{특성과 그} 조성을 각각 이해하기 위해 광학 및 전자 현미경¹³, 분광 및 분광 기술 ^1,14,15과 같은 분석 방법에 의존합니다. MP를 함유한 샘플에는 MP를 특성화, 식별 및 정량화하기 위한 여러 분석이 포함되어야 하며, Science of the Total Environment¹⁶과 같은 환경 샘플의 플라스틱 측정에 대한 일부 저널 최소 요구 사항에 따라 최소한 분광학/분광법(즉, 라만 분광법, 적외선 분광법 또는 열분해 가스 크로마토그래피-질량 분광법 등)이 필요합니다.. 라만 분광법은 적외선(IR) 분광법보다 더 다재다능하며, 특히 생물학적 시료의 물질 식별과 관련하여 유용합니다. 라만 분광법은 광 산란 기법으로, IR보다 작은 입자를 더 쉽게 분석할 수 있으며, IR은 더 큰 입자가 필요하고 시료 배치에 더 많은 제약이 있는 광 흡수 기법입니다¹⁷. 실리콘 또는 실리콘 산화물을 포함하는 라만 분광법용 기판은 최소한의 배경 잡음으로 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있다는 것이 이전에 제안되었습니다¹⁸.

일반적으로 한 가지 유형의 분석과 호환되는 특정 분석 기법용 기판(즉, IR 분광법에 필요한 금 코팅 기판)은 투과 및/또는 반사광 현미경과 호환되지 않는 경우가 많습니다. 그 후, 반복 하위 샘플링은 각 개별 분석에 적합한 샘플을 생성하기 위해 연구자들 사이에서 인기가 있지만 하위 샘플링은 시간이 많이 걸리고 저농도 미립자 ^1,2,6을 제외할 수 있습니다. 일반적으로 서로 다른 분석 양식에 의한 특성화 및 식별을 위해 동일한 입자를 분석하기 위해 한 기판에서 다음 기판으로 미립자를 수동으로 전달해야 하지만, 이러한 느린 수동 전달은 편향, 오염 및 손실의 가능성을 증가시킬 뿐만 아니라 MP의 분석을 수동으로 조작할 수 있는 가장 큰 크기의 입자로만 제한합니다¹³. 이러한 차선의 워크플로우는 수많은 문제와 신뢰성 문제를 야기하며, 문헌에 보고된 MP 정량화의 상당한 변동성에 기여합니다 ^3,7.

여기에서는 MP를 캡처, 특성화, 식별 및 정량화하고 뉴욕 로체스터 지역에서 공급되는 식수 샘플을 분석하여 SNAP의 유용성을 입증하기 위해 SNAP(Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline)라고 하는 분석 워크플로를 제시합니다. SNAP는 여러 기술을 사용하여 음용수에서 MP를 농축하고 분석하기 위한 균일한 기판을 제공하는 통합 실리콘 나노멤브레인(멤브레인 특성은 보충 표 S1 참조)이 있는 기존 크기의 25mm 직경 필터 디스크로 활성화됩니다^15,19. 컷오프 크기(원통형 기공이 있는 20μm 미세 다공성 질화규소(MPSN) 및 직사각형 프리즘 기공이 있는 8.0μm 마이크로 슬릿 질화규소(MSSN))가 감소하면서 MP를 나노멤브레인에 순차적으로 농축하고 캡처한 후, SNAP은 1) 샘플 염색, 광학 현미경 및 MP 정량화, 2) 라만 분광법을 통한 입자 식별, 3) 주사 전자 현미경(SEM)을 통한 입자 특성화의 세 가지 연속 분석 단계를 용이하게 합니다. 하나의 나노멤브레인 기질에 포착된 동일한 입자에 대한 여러 분석을 가능하게 합니다.

코팅되지 않은 실리콘 나노멤브레인(SiN) 필터 디스크와 금 코팅 실리콘 나노멤브레인(Au-SiN) 필터 디스크를 모두 활용하여 여러 SNAP 파이프라인을 시연합니다. 파이프라인 A) SNAP은 SiN에서 수행되고 여러 분석 기술을 통해 동일한 MP를 순차적으로 특성화합니다. 파이프라인 B) 라만 분광법으로 Au-SiN에서 수행된 SNAP; 및 파이프라인 C) SNAP은 에너지 분산 X선 분광법(EDX)이 장착된 SEM을 사용하여 Au-SiN에서 수행되었습니다(그림 1). 따라서 SNAP 변형은 다양한 시료 유형 및 분석 기술에 사용할 수 있는 유연하고 간소화된 분석 워크플로우입니다. 고분자 멤브레인¹¹에 의존하는 이전에 발표된 방법과 달리, SNAP의 장점은 합성 폴리머 MP가 비고분자 실리콘 기반 멤브레인에 포획되어 비고분자 배경에서 MP의 조성 식별을 가능하게 하는 실리콘 나노멤브레인의 사용에서 비롯됩니다. 또한, 실리콘 나노멤브레인은 주름이 생기는 경향이 있는 고분자 멤브레인과 달리 균일한 초점면을 제공하여 여러 자동 현미경 및 분광학 기술을 가능하게 합니다.

우리는 이전에 분석 모델링, 모델 입자 챌린지, 음용수 및 공기 샘플(^19,20)을 통해 MP 분석을 위한 실리콘 나노멤브레인의 사용을 특성화했으며, 모델 입자를 사용하여 여과 및 광학 현미경 특성을 4개의 널리 사용되는 멤브레인(¹⁵)과 비교했습니다. 이 프로토콜에서는 4개의 음용수 샘플에서 MP를 분석하기 위한 SNAP의 유용성을 휴리스틱으로 입증합니다. 샘플은 뉴욕 로체스터 지역 주변의 4개의 서로 다른 수원에서 수집되었습니다. 이 연구에 포함된 각 샘플은 온타리오 호수, 헴록 호수, 헴록과 온타리오가 혼합된 호수, 캐넌다이과 호수와 같은 별개의 지표수 공급원에서 유래했습니다(그림 2). 이러한 식수원에서 포집된 입자에는 폴리스티렌(PS) 및 폴리에틸렌(PE)과 같은 널리 퍼진 플라스틱, 철, 실리카와 같은 중금속 및 비합성 입자가 포함되었습니다.

Protocol

1. 품질 관리 절차 및 초순수 용액 준비

1. 층류 후드 및 장갑 청소
   1. Don PPE(개인 보호 장비): 100% 면 실험실 코트와 니트릴 장갑.
      참고: PPE는 프로토콜 전반에 걸쳐 연속적입니다.
   2. 니트릴 장갑에 99% 이소프로필 알코올(IPA)을 스프레이합니다. 손을 문지른 다음 ~18MΩ, 0.22μm 여과수로 헹굽니다. 이 작업을 3번 수행하여 장갑에서 이형제를 제거합니다.
   3. 천연 섬유의 섬세한 작업 와이프를 4등분한 다음 70% IPA를 뿌립니다. 후드 표면을 뒤에서 앞으로 길게 닦고 섬세한 작업 와이프를 두 번마다 사용하지 않는 표면으로 다시 접습니다. 모든 표면이 청소될 때까지 후드를 계속 청소하고 더러워지면 물티슈를 새 것으로 교체하십시오.
   4. 실리콘 롤러 매트를 열고 후드 표면을 가로질러 굴려 남아 있는 입자를 집어냅니다. 실리콘 롤러를 청소하려면 99% IPA를 뿌리고 장갑을 낀 손으로 문지른 다음 18MΩ, 0.22μm 여과수로 헹굽니다. 3회 반복한 다음 후드에서 자연 건조시킵니다.
   5. 1.1.2단계와 같이 장갑을 다시 헹굽니다.
2. 초순수 및 IPA 생성.
   1. 1L 비커에 18MΩ의 물을 채우고 후드에 넣습니다.
   2. 주사기와 부착된 필터를 통해 최소 200mL의 18MΩ 물을 여과하여 60mL 주사기와 부착된 0.22μm 컷오프 주사기 필터를 프라임합니다.
      참고: 주사기 펌프는 시간을 절약하지만 설명된 프로토콜을 수행하기 위한 요구 사항은 아닙니다.
   3. 유리 나사 뚜껑 용기를 18MΩ, 0.22μm 여과수로 3번 헹굽니다. 0.22μm 주사기 여과 18MΩ 여과수를 채웁니다.
   4. 18MΩ, 0.22μm 여과수 대신 원하는 IPA 농도 %로 1.2.1-1.2.3 단계를 반복하여 초순수 IPA를 생성합니다.

2. 여과를 통한 액체 시료의 입자 포착

참고: 아래 프로토콜은 물 이외의 액체 샘플과 함께 사용할 수 있습니다. 검증된 검체 채취 방법은 연구 및 검체의 필요에 따라 연구자의 재량에 맡겨야 합니다.

1. PPE를 착용하십시오.
   알림: 장갑과 후드 표면이 1.1.2-1.1.5 단계에 따라 청소되었는지 확인하십시오.
2. 실리콘 개스킷에 Ultrapure 99% IPA를 뿌리고 장갑을 낀 손가락으로 문지른 다음 초순수로 헹굽니다. 각 개스킷에 대해 이 작업을 3번 반복합니다.
   참고: 여과에 사용할 개스킷의 수는 사용할 필터 디스크의 수에 1을 더한 값과 같습니다. 그림 1B 를 참조하여 시각적 어셈블리 그래픽을 참조하십시오.
3. 1.1.2단계에서 프라이밍된 주사기를 사용하여 초순수 30mL와 공기 30mL를 주사기에 흡수하여 60mL 주사기 내부를 초순수로 헹굽니다. 주사기 필터를 조인 다음 세게 흔들어 분배합니다. 이 작업을 3회 반복합니다.
   참고: 샘플의 부피에 따라 필요에 따라 모든 크기의 주사기를 사용할 수 있습니다.
4. 그림 1B의 시각적 조립 그래픽에 표시된 대로 여과 장치를 조립합니다.
   알림: 깨끗한 핀셋을 사용하여 조립 및 분해 중에 필터 디스크와 개스킷을 처리하십시오.
   1. 순차 여과의 경우 디스크와 지지 프릿 사이에 개스킷, 각 디스크 사이에 개스킷, 디스크와 여과 깔때기 사이에 개스킷이 있는지 확인하십시오.
   2. 스택의 맨 위에 가장 큰 차단 필터가 있고 맨 아래에 가장 작은 차단 필터가 있는 디스크를 주문해야 합니다.
5. 필터 디스크 스택을 통해 음의 흐름이 있도록 장치의 진공을 켭니다.
6. 배경 오염 측정
   참고: 다음 프로세스를 통해 주사기 세척 및 초순수 매체 생성을 평가하고 시스템 구성 요소에 의해 기여한 배경 입자를 확인할 수 있습니다.
   1. 헹궈낸 주사기로 50mL의 초순수를 상단 디스크 중앙의 나노멤브레인 위로 천천히 분배하여 분배된 모든 액체가 여과되도록 합니다.
      참고: 더 큰 s를 필터링하는 경우ample(예: >50mL), 유리 여과 깔때기를 사용하는 것이 좋습니다. 2.3단계와 같이 유리 여과 깔때기를 청소합니다. 추가 실험기구는 추가적인 입자 오염 위험을 초래할 수 있습니다. 세척 절차를 성실히 진행하고 관심 샘플을 사용하기 전에 항상 블랭크 여과로 청결도를 확인하십시오.
   2. 초순수가 여과되도록 합니다. 여과 후 1분 더 진공 청소기를 켜두십시오. 샘플이 완전히 건조되면 진공을 끕니다.
   3. 깨끗한 핀셋을 사용하여 개스킷에서 필터 디스크를 조심스럽게 제거하고 유리 페트리 접시 또는 어두운 상자와 같이 보관할 수 있도록 깨끗하고 레이블이 표시된 적절한 용기에 디스크를 넣습니다.
   4. 광학 분석, 입자 계수 등을 위해 현미경으로 필터 디스크를 이미지화합니다.
7. 액체 샘플의 경우 2.2단계와 같이 추가 개스킷을 청소합니다. 각각의 고유한 액체 매체 샘플에 대해 새 주사기를 구하고 2.3단계를 반복합니다.
8. 원하는 양의 샘플을 흡수하고 상단 디스크 중앙의 나노멤브레인 위로 샘플을 천천히 분배합니다.
9. 샘플 여과가 완료되면 초순수 1mL로 3회 헹굼을 수행하여 샘플의 모든 입자가 모든 표면에서 필터 디스크 중앙의 멤브레인으로 충분히 헹궈졌는지 확인합니다.
10. 3x 헹굼된 샘플을 완전히 건조시키기 위해 진공 청소기를 1분 더 켜둔 상태로 유지한 다음 진공 청소기를 끕니다.
    1. 2.7-2.10단계를 반복합니다. 관심 있는 샘플에 대해 각 반복실험을 수행합니다.

3. 형광성 염료 준비 및 염색

참고: Nile Red 및/또는 Trypan Blue를 사용한 형광 염색은 관심 있는 라만 분광 레이저를 방해할 수 있습니다.

1. 나일 레드(NR)로 염색
   1. PPE를 착용하십시오.
   2. 1.1.2-1.1.5단계와 같이 장갑과 후드를 청소합니다.
   3. 완전한 samp2.7-2.10단계에 설명된 대로 여과.
   4. 두 개의 유리 나사 캡 용기를 초순수 3x로 헹굽니다.
   5. 깨끗한 유리 용기에 초순수 99% IPA에 0.1mg/mL의 NR 용액을 준비합니다.
   6. 10배로 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
   7. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 NR 용액을 두 번째 유리 나사 캡 용기에 여과합니다.
      알림: NR을 사전 필터링하는 데 사용되는 필터는 샘플을 필터링하는 데 사용되는 필터보다 컷오프가 작아야 합니다.
   8. 염색할 필터 디스크를 진공 수집 플라스크의 지지 프릿에 놓습니다.
   9. 0.1mg/mL NR 용액 20μL를 필터 디스크 중앙의 나노멤브레인에 피펫팅합니다.
      참고: 얼룩은 나노멤브레인의 다공성 표면을 완전히 덮어야 합니다. 20μL가 충분하지 않은 경우 나노멤브레인의 모든 다공성 영역이 적절하게 염색으로 덮일 때까지 추가 염색을 추가합니다.
   10. 얼룩을 5분 동안 배양합니다.
   11. 배양이 완료되면 얼룩을 진공 여과하십시오.
   12. 1mL의 초순수 99% IPA로 3번 헹구어 과도한 NR 얼룩을 제거합니다.
       참고: 카운터 염색을 수행하려면 이 단계 후에 아래의 Trypan Blue 염색 섹션으로 진행하십시오.
   13. 필터 디스크를 진공 청소기가 켜진 상태에서 지지대 프릿에 2분 동안 놓아 잔류 액체를 걸러내고 건조시킵니다. 2분 후에도 건조되지 않으면 깨끗한 유리 페트리 접시를 사용하여 필터 디스크를 70°C 오븐에 2-5분 동안 옮깁니다.
   14. 건조되면 2.6.4단계에서 설명한 대로 형광 현미경 검사를 수행하고 섹션 4로 진행합니다.
2. 트리판 블루(TB)로 염색
   1. PPE를 착용하십시오.
   2. 1.1.2-1.1.5 단계에 설명된 대로 장갑과 후드를 청소합니다.
   3. 2.7-2.10단계에서 샘플 여과를 완료하거나 3.2.4단계부터 시작합니다.
   4. 두 개의 유리 나사 캡 용기를 초순수 3x로 헹굽니다.
   5. 하나의 용기에 0.4% TB 얼룩을 준비합니다.
      참고: TB를 사전 여과하는 데 사용되는 필터는 샘플을 여과하는 데 사용되는 필터보다 컷오프가 작아야 합니다.
   6. 10배로 부드럽게 뒤집어 섞습니다.
   7. 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 TB 염색 용액을 두 번째 유리 나사 뚜껑 용기에 여과합니다.
      참고: TB를 사전 여과하는 데 사용되는 필터는 샘플을 여과하는 데 사용되는 필터보다 컷오프가 작아야 합니다.
   8. 염색할 필터 디스크를 진공 수집 플라스크의 지지 프릿에 놓습니다.
   9. 0.4% TB 중 20μL를 필터 디스크 중앙의 나노멤브레인에 피펫으로 염색합니다.
      참고: 얼룩은 나노멤브레인의 다공성 표면을 완전히 덮어야 합니다. 20μL가 충분하지 않은 경우 나노멤브레인의 모든 다공성 영역이 염색으로 적절하게 덮일 때까지 추가 염색을 적가합니다.
   10. 얼룩을 5분 동안 배양합니다.
   11. 5분 동안 배양한 후 얼룩을 진공 여과합니다.
   12. 1mL 용량의 초순수 3x로 헹굽니다.
   13. 필터 디스크를 진공 청소기가 켜진 상태에서 지지대 프릿에 2분 동안 놓아 잔류 액체를 걸러내고 건조시킵니다. 2분 후에도 건조되지 않으면 깨끗한 유리 페트리 접시를 사용하여 필터 디스크를 70°C 오븐에 2-5분 동안 옮깁니다.
   14. 건조되면 2.6.4단계에서 설명한 대로 형광 현미경 검사를 수행하고 섹션 4로 진행합니다.

4. 형광 현미경 검사법을 통한 입자 정량화

1. 광학 현미경 이미지 캡처
   1. 실리콘 개스킷을 사용하여 현미경 슬라이드에서 필터 디스크를 고정하거나 현미경 스테이지와 함께 필터 디스크 사용에 특화된 정렬 슬라이드를 활용합니다. 이미징할 필터 디스크를 현미경 스테이지로 이동합니다.
   2. 최대 검출 횟수가 검출기 카메라의 최대 범위의 ~ 90%가 되도록 명시야 조명을 사용하여 나노멤브레인을 이미지화합니다.
      알림: 이 90% 값은 흰색 수준이 65,535인 16비트 감지기의 경우 ~59,000입니다.
   3. 형광등을 사용하여 나노멤브레인을 이미지화하여 최대 픽셀 강도 가 검출기 카메라의 최대 범위의 약 ~25%가 되도록 합니다.
   4. 이미지를 16비트 복합 TIFF 형식으로 저장합니다.
2. 형광 현미경 검사를 통한 입자 정량화
   1. 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 Split-Channels 기능을 사용하여 4.1.4에서 생성된 복합 TIFF의 형광 채널을 명시야 채널과 분리합니다.
   2. Threshold 함수를 사용하여 픽셀 강도를 10,000 값으로 임계값을 설정합니다.
      참고: 파티클에 블룸이 존재하면 임계값이 너무 낮으므로 높여야 합니다.
   3. 별도의 이미지를 PNG 형식으로 저장합니다.
   4. Despeckle 함수를 사용하여 노이즈 픽셀을 제거하려면 이미지를 Despeckle 합니다.
   5. Watershed 함수를 사용하여 이미지를 유역화합니다.
      참고: 이 기능은 큰 인접 입자를 더 작은 조각으로 분해하는 대신 비슷한 크기의 인접한 입자를 분리합니다. 큰 입자보다 작은 입자가 더 많은 경우가 많기 때문에 이는 좋은 절충안이 될 수 있지만 긴 섬유를 작은 입자 가닥으로 분해하는 것과 같은 의도하지 않은 효과를 초래할 수 있습니다. 데이터를 수락하기 전에 이미지 결과를 검사합니다.
   6. 임계값이 있는 형광 이미지의 스케일은 명시야 이미지에서 기공의 너비를 측정하여 설정합니다. 측정된 기공 너비를 사용하여 스케일을 픽셀/μm 단위로 설정합니다.
      알림: 직사각형 기공의 경우 가장 작은 너비가 제품 라벨과 일치합니다. 원형 기공의 경우, 직경은 나노멤브레인의 기공 크기(즉, 컷오프)를 지정하는 제품 라벨과 일치합니다.
   7. 이미지 분석 플랫폼의 Count Particles 기능을 임계값 형광 이미지에 적용하여 Area, min 및 max를 평가합니다.
   8. 형광 및 명시야 이미지를 처리하여 형광 영역을 시각화하는 복합체를 만듭니다.
   9. 4.2.2단계와 동일한 값을 사용하여 형광 이미지의 임계값을 설정합니다.
   10. 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 채널을 병합합니다. 형광 채널을 Red 채널에 할당하고 명시야 이미지를 Grays 채널에 할당합니다.
   11. 합성을 PNG 파일로 저장합니다.

5. 라만 분광법

1. 라만 기기 및 관련 컴퓨터를 켜서 각각이 시작될 수 있도록 합니다.
2. 라만 기기에 연결된 컴퓨터에서 소프트웨어를 엽니다.
3. 소프트웨어가 초기화되면 프로그램 화면의 하단 리본에 있는 Current System Activity 및 Detector 상태가 각각 Ready 로 표시되고 녹색으로 표시되는지 확인합니다.
4. 화면 하단의 자동 보정(AC) 버튼이 빨간색이면 원하는 자동 보정 을 실행하고 계속하기 전에 완료될 때까지 기다립니다.
5. 하나의 레이저와 하나의 격자만 사용하는 경우:
   1. Autocalibration 화면에서 Exit를 클릭한 다음 Acquisition 탭의 Instrument Setup 아래에 있는 해당 드롭다운 목록에서 원하는 레이저와 격자를 선택합니다.
   2. 화면 하단의 빨간색 AC 버튼으로 돌아가서 Current laser/Grating(현재 레이저/격자 )을 클릭하고 보정 루틴을 실행합니다.
6. 모든 레이저 및 격자를 사용하는 경우 모든 레이저 및 격자를 선택하고 시스템을 실행하기만 하면 됩니다.
7. 하나 이상의 레이저 및/또는 격자를 사용하는 경우 사용자 정의 레이저/격자 를 선택하고 원하는 모든 설정을 선택합니다. 그런 다음 보정을 실행합니다.
8. 기기 터렛과 소프트웨어 내의 Acquisition 탭의 기기 설정에서 20x long working distance(LWD) 목표를 선택합니다.
9. 이 대물렌즈를 사용할 수 없는 경우 필터 디스크의 높이를 수용하는 작동 거리와 함께 대체 저배율 대물렌즈(예: 5x 또는 10x)를 사용하십시오.
   참고: 더 낮은 배율 목표부터 시작하여 필터 디스크의 나노멤브레인을 가로지르는 초기 탐색을 더 쉽게 만듭니다.
10. 필터 디스크를 현미경 스테이지에 놓아 광학 경로 내에 있도록 합니다.
11. 상단 리본에서 Video Acquisition(비디오 획득 )을 클릭하여 시각화 광학 장치를 켭니다.
12. 기기의 굵고 미세한 초점 휠을 사용하여 필터 디스크의 나노멤브레인에 초점을 맞춥니다.
13. 컴퓨터 화면의 포인트 커서 선으로 모공을 대략적으로 제곱합니다.
14. 스테이지에서 필터 디스크를 부드럽게 회전하여 이러한 제곱 정렬을 달성하거나 현미경 스테이지에서 필터 디스크 사용에 특화된 정렬 슬라이드를 활용합니다.
15. 오른쪽 상단의 Acquisition 탭에서 선택한 조명기 모드가 최상의 결과를 위한 Dark field 인지 확인합니다.
16. 스티칭된 이미지를 얻으려면 Data Tabs 리본의 Video 탭으로 이동합니다.
17. 원하는 첫 번째 시야로 이동한 다음 비디오 창의 오른쪽 상단에 있는 모자이크 버튼을 클릭하고 지도에 추가합니다. 기기 조이스틱으로 원하는 영역의 바깥쪽 반대쪽 모서리로 이동하여 지도에 추가합니다.
18. ViewSharp로 모자이크 획득을 실행하여 최종 이미지에서 모든 영역이 제대로 초점이 맞춰졌는지 확인합니다.
    참고: 배율이 낮은 대물렌즈는 이미지 모자이크 획득에 더 적은 시간이 소요되는 반면, 고배율 대물렌즈는 더 오래 걸립니다.
19. 이미지 모자이크가 생성되면 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ParticleFinder로 보내기를 누릅니다.
20. 오른쪽 상단 리본의 ParticleFinder 탭으로 이동하여 임계값 설정과 상호 작용합니다.
21. 적절한 파티클이 선택되었는지 확인하려면 ParticleFinder 데이터 탭에서 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 Center, Particle, Transparency 상자를 선택합니다. 투명도 슬라이더를 50%로 설정하고 중앙의 픽셀 크기를 2px로 설정합니다.
    참고: Center 선택은 각 파티클의 중앙에 점을 배치하고, Particle 선택은 50% 투명도로 파티클로 결정된 각 영역에 오버레이를 배치합니다. 이 설정은 각 파티클을 찾고 각 파티클의 가장자리를 정의합니다.
22. 필요한 경우 프로그램 오른쪽의 ParticleFinder 탭에서 입자 임계값 및 형태/크기 선택 매개변수를 편집하여 모든 입자와 크기/모양 매개변수가 올바르게 식별되었는지 확인합니다. 형태학적 매개변수를 적용하는 방법에 대한 예는 보충 표 S2를 참조하십시오.
    1. 자동 입자 감지가 충분하지 않은 경우 수동으로 전환하고 올바른 물체의 대다수가 입자로 식별될 때까지 임계값을 점진적으로 조정하십시오.
    2. 감지된 입자의 형태를 더 세분화해야 하는 경우 형태학 필터 적용 옆의 확인란을 선택합니다. 결과 드롭다운 메뉴에서 적절한 매개변수와 강도를 선택합니다.
       참고: 매개변수가 선택되는 순서는 출력에 영향을 줄 수 있습니다.
23. 입자의 크기, 모양 또는 기타 형태학적 특성이 중요한 요소인 경우 Apply particles pre-filter(입자 사전 필터 적용) 옆의 확인란을 선택한 다음 필요에 따라 매개변수를 선택하고 편집합니다.
24. 파티클이 식별되고 선택한 모양/가장자리가 허용되면 결과 섹션에서 스크롤 가능한 파티클 이미지의 미리보기 목록을 탐색합니다. 연관된 파티클 이미지를 클릭하여 관심 있는 파티클을 선택합니다.
25. 라이브 켜기 view 화면 상단의 비디오 카메라 버튼으로 표시합니다.
26. 배율 번호를 클릭하고 하단 리본의 애플리케이션 내 드롭다운 메뉴에서 해당 대물렌즈를 선택하여 50x LWD 대물렌즈로 전환합니다.
27. 필요한 경우 미세 조정 손잡이를 사용하여 입자의 초점을 다시 맞춥니다.
28. 개별 입자의 이미지를 캡처하여 라만 분광법으로 분석하고 이미지를 적절한 이름의 별도 파일로 저장합니다.
29. 라만 분광법으로 분석할 입자의 원하는 영역이 레이저 빔 위치 아래에 올바르게 배치되었는지 확인합니다.
30. 분석을 위해 입자의 적절한 영역이 선택되면 창 상단의 STOP ALL 버튼을 눌러 시각화 광학 장치를 끕니다.
31. 레이저를 532nm, 염색되지 않은 입자의 경우 1% 출력으로, 형광 염색 입자의 경우 785nm 또는 830nm로 설정합니다.
32. 획득 시간을 10초로 설정하고 누적을 5로 설정합니다.
33. 데이터 탭 메뉴에서 Spectra 탭을 선택한 다음 재생 버튼을 눌러 실시간 디스플레이(RTD)를 시작합니다.
    참고: RTD 중에 얻은 정보를 활용하여 설정을 최적화합니다.
34. 설정 및 결과에 만족하면 STOP ALL을 눌러 RTD를 중지합니다.
35. 이제 RTD 버튼 옆에 있는 원형 Spectrum Aquisition 버튼을 눌러 최종 획득을 수집할 수 있습니다.
36. 수집된 스펙트럼을 적절한 이름의 별도 파일로 저장합니다.
37. 5.28-5.36단계를 반복합니다. 관심 있는 각 입자에 대해.
38. 샘플 작업이 끝나면 필터 디스크를 제거하고 스코프와 소프트웨어 내에서 수동으로 대물렌즈를 20X LWD로 되돌립니다.
39. 새 샘플에 대해 5.10-5.37 단계를 반복합니다.

6. 스펙트럼 식별

1. 구매하거나 자체 구축한 라만 스펙트럼 데이터베이스를 사용할 수 없는 경우 오픈 소스 분광학 라이브러리로 이동합니다 https://www.openanalysis.org/openspecy/
   참고: OpenSpecy는 환경 MP 및 섬유²¹을 식별하는 데 적용할 수 있는 276개의 폴리머 및 재료로 구성된 3개의 서로 다른 라이브러리의 636개 스펙트럼을 포함하는 오픈 소스 라만 및 IR 분광학 데이터베이스입니다. 사전 처리된 스펙트럼 데이터와 사후 처리된 스펙트럼 데이터는 이 리소스와 함께 사용할 수 있습니다.
2. 라만 스펙트럼을 개별 .csv 파일로 저장합니다.
   1. A 열은 스펙트럼의 파수 다음에 오는 파수로, B 열에는 Intensity 다음에 파수당 피크 intensity 값으로 표시해야 합니다.
3. .csv 파일을 왼쪽 상단의 찾아보기 표시줄로 끌어다 놓아 스펙트럼을 엽니다.
4. Preprocessing and Identification( 전처리 및 식별)을 켭니다.
5. Preprocessing(전처리)에서 Threshold Signal Noise, Min-Max Normalize, Smoothing/Derivative, Conform Wavenumbers 및 Baseline Correction을 켭니다.
   참고: 그 안의 특정 설정은 분석되는 스펙트럼의 개별 특성에 따라 조정될 수 있습니다.
6. Identification에서 Raman을 스펙트럼 유형으로 선택하고 Derivative를 Library Transformation으로 선택합니다.
   참고: 이 라이브러리는 IR 분광법에도 사용할 수 있습니다. 분석 창에는 분석을 위해 업로드된 스펙트럼인 흰색 스펙트럼과 식별 일치가 의심되는 빨간색 스펙트럼이 표시됩니다.
7. 0.70> 일치하는 값을 반환하지 않는 스펙트럼 또는 합리적인 피크 형상 상관 관계를 사용하는 경우, 상위 5개의 제안된 결과를 선호하는 잠재적 일치 항목 연구를 시작할 수 있는 위치로 활용합니다.
8. 측정된 피크 값이 선택한 참조 스펙트럼에서 해당 피크의 ±10 파장 내에 있는지 확인한 후 해당 피크에 대한 일치를 확인합니다.
9. 스펙트럼 상관 관계, 상관 관계 값 및 의심되는 일치가 시작된 데이터베이스를 기록합니다.
10. 개인의 필요에 따라 파일을 다운로드합니다.

7. 주사 전자 현미경 검사

알림: SEM 분석 전에 필터 디스크를 금속 코팅하지 않은 경우 섹션 7.2로 건너뜁니다.

1. SEM용 샘플의 금속 코팅
   1. 탄소 테이프를 사용하여 강철 SEM 스텁에 필터 디스크를 장착합니다.
   2. 스퍼터러에 삽입하고 챔버를 50mTorr까지 펌핑합니다.
   3. 스퍼터링 Ar(아르곤) 격리 밸브를 엽니다.
   4. 니들 밸브를 통해 Ar을 300mTorr 압력으로 챔버에 도입하여 시스템을 퍼지한 다음 챔버를 50mTorr까지 배출합니다. 3회 반복합니다.
   5. 니들 밸브를 통해 최종 압력을 100mTorr로 조정합니다.
   6. Au 타겟을 사용하여 스퍼터링을 통해 필터 디스크에 Au를 증착합니다.
      참고: Au 대신 다른 대상 소스(예: Pt, Ir, Si 등)를 대안적으로 사용할 수 있습니다. 20mA 전류는 100mTorr에서 0.1 옹스트롬 / 초의 증착을 생성합니다.
   7. 시스템을 환기시키고 필터 디스크를 제거합니다. 필터 디스크를 스테인리스 스틸 스터브에 부착하십시오.
2. SEM 이미지 캡처
   1. 스텁을 다단계 Zeiss Auriga 홀더에 고정 나사로 고정합니다.
   2. SEM과 SEM을 실행하는 컴퓨터를 켜고 각 컴퓨터가 시작되도록 허용합니다.
   3. SEM에 연결된 소프트웨어를 엽니다.
   4. 시스템이 진공 상태인지 확인합니다(5e-6 Torr).
   5. 로드록 챔버의 본체에 있는 Vent를 눌러 로드록을 환기시키고 로드록을 엽니다.
   6. 다단계 홀더를 테프론 코팅된 삽입 지그에 장착하고 부착된 나사 플레이트를 사용하여 전사 암을 고정합니다.
   7. 로드록을 닫고 로드록 챔버 본체의 Store 를 눌러 로드록을 펌핑합니다.
      알림: Store 버튼에서 녹색 표시등이 깜박임을 멈추면 완료됩니다.
   8. 다단계 홀더를 메인 관찰실의 스테이지에 트랜스퍼 게이트를 열어 로드합니다.
   9. 로드 록의 본체에 있는 Transfer 를 누릅니다. 게이트가 떨어지고 내부 챔버가 노출됩니다.
   10. 로드록 암(멀티스테이지 홀더에 나사로 고정)을 삽입하고 멀티스테이지 홀더를 스테이지에 고정합니다.
   11. 로드록 트랜스퍼 암의 나사를 풀고 암을 완전히 집어넣어 로드록에 위치하도록 합니다.
   12. Transfer를 눌러 전송 게이트를 닫습니다.
   13. 소프트웨어의 오른쪽 하단 모서리에 있는 EHT를 눌러 차단 밸브를 엽니다.
   14. 소프트웨어의 데이터 영역에서 작동 거리를 5mm로 조정하고 가속 전압을 20kV로 조정합니다.
   15. XY 및 Z 조이스틱을 사용하여 필터 디스크 멤브레인의 위치를 파악합니다.
   16. stage는 이미지에 초점이 맞춰질 때까지 Z 조이스틱을 사용하여 수행합니다.
   17. 중앙 콘솔에서 XY 스티그메이터 노브와 포커스 휠을 조정하여 난시를 교정합니다.
   18. 중앙 콘솔의 확대 휠을 조정하여 원하는 배율로 입자를 샘플링하고 8비트 또는 16비트 tiff 형식으로 2,048 x 1,536 해상도 이미지를 캡처합니다.
3. EDX 입자 분석
   1. SEM 컴퓨터의 바탕 화면에서 ChamberScope CCD를 끕니다.
      알림: 이 단계가 완료되지 않으면 EDX 검출기가 신호에 압도되어 데이터가 기록되지 않습니다.
   2. EDX 컴퓨터에서 APEX EDX 소프트웨어를 열고 오른쪽 상단 모서리 메뉴에서 감지기의 전원을 켜서 EDX 감지기를 식힙니다.
   3. Capture Image(이미지 캡처)를 클릭하여 매핑에 사용할 수 있는 저해상도 SEM 이미지를 캡처합니다.
   4. 소프트웨어 화면 상단에 있는 매핑 탭 메뉴를 엽니다.
   5. 설정에서 해상도(256 x 256), 픽셀 체류 시간(0.16μs) 및 프레임 번호(32-64)를 조정하여 ~5분 길이의 예상 캡처 시간을 제공합니다.
   6. 메뉴의 왼쪽 상단 모서리에 있는 Create Map(맵 만들기 )을 클릭합니다.
   7. Confirm Element Preview를 선택하여 요소 검색을 수동으로 조정하거나 소프트웨어의 Auto Identified peaks를 사용합니다.
   8. 완료 시 매핑 소프트웨어의 오른쪽 상단 섹션에 있는 AutoReport 기능을 사용하여 보고서를 생성합니다.

Results

공정 블랭크 및 배경 오염
허용 가능한 빈 결과는 입자가 없거나 입자가 너무 적어 배경(즉, 공정) 오염(있는 경우)이 실험 결과를 혼동하거나 방해할 가능성이 높지 않은 결과입니다. 차선의 blank 결과는 관심 입자가 배경 오염과 구별하기 어려운 입자가 많이 포함된 결과입니다.

공정 오염의 허용 수준은 가능한 한 0 또는 0에 가까워야 하지만, 0을 달성할 수 없는 경우 관찰된 배경 입자 수의 일관성이 중요합니다. 여러 개의 빈 샘플을 실행하여 결과의 일관성을 확인합니다. 품질 관리 프로토콜(섹션 1 참조)의 성실함, 오염 완화 및 처리 중 적절한 환경 조건은 낮은 배경 오염 수준을 유지하는 데 가장 중요합니다. 배경 오염 결과 및 수용 가능성은 또한 사용 중인 나노멤브레인의 절단과 실험실 조건의 전반적인 청결도에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 컷오프 멤브레인이 더 낮은 더 작은 입자(예: < 8μm)를 분석할 때 관심 입자와 유사한 크기의 배경 오염 물질의 상대적 존재량이 모두 기하급수적으로 증가하므로 더 높은 수준의 품질 관리 엄격성을 적용해야 한다는 점을 고려하십시오²². 어떤 수준의 오염도 허용되지 않지만, 조건이 엄격하게 제어되고 높은 수준의 일관성이 달성되는 한 환경 미세 플라스틱에 대한 양호한 분석 또는 관심 있는 분석은 여전히 수행될 수 있습니다.

시료 여과
그림 3의 예시 데이터 캐스케이드에서 볼 수 있듯이 충실한 멀티모달 분석을 생성하기 위해서는 이상적인 샘플 여과가 필요합니다. 이러한 샘플 여과는 나노멤브레인 표면 전체에 걸쳐 잘 분산된 입자를 생성합니다(예: 멤브레인 표면적의 약 1/3 범위). 입자 응집(겹치는 입자의 큰 덩어리)의 경우와 같이 잘 분산되지 않은 입자는 겹치는 입자를 자신 있게 쉽게 구별할 수 없기 때문에 수동 및 자동 입자 계수 방법 모두에 혼동을 줄 수 있습니다. 이러한 데이터는 일반적으로 분석에서 제외되어 관심 있는 중요한 정보가 손실될 수 있습니다. 그림 4A, B에서 볼 수 있듯이 잘 분산된 입자는 다양한 조성의 입자가 쌓이거나 겹쳐서 분광 또는 정량화 분석이 복잡해지지 않도록 하여 정확한 해석, 식별 및 정량화가 더 어려운 결과를 반환할 수 있습니다.

나일 레드 및 트리판 블루 염색
최적의 형광 입자 염색 인스턴스의 대표적인 이미지는 20μm 차단 SiN 필터 디스크의 그림 3B 에 나와 있습니다. 나노멤브레인 표면에서 NR 또는 TB 염색을 과소 헹구면 위양성 결과가 생성될 수 있습니다. 불충분한 헹굼으로 인해 멤브레인 표면에 남아 있는 얼룩으로 구성된 잔류 미립자는 염색된 입자로 잘못 해석될 수 있습니다. 헹굼이 불충분하다는 징후는 그림 5A와 같이 여과된 샘플에서 입자 또는 검출 가능한 잔류 필름/잔류물이 없는 나노멤브레인 영역이 관찰 중에 형광을 발하는 경우입니다. 이미징 후 필터 디스크가 깨끗한 상태로 유지되는 한 개별 나노멤브레인 필터 디스크를 진공 여과 장치(개스킷 제외)에 다시 놓고 진공을 켜고 다른 부피의 초순수 99% IPA(NR용) 또는 초순수(TB)를 필터 디스크의 나노멤브레인에 여과하여 다시 헹굼을 수행할 수 있습니다. 사용된 추가 헹굼 매체의 총 부피를 기록합니다. 최상의 결과를 얻으려면 재헹굼을 수행하기 전에 전체 나노멤브레인 표면의 현미경 이미지를 촬영하여 재헹굼 단계로 인해 발생할 수 있는 오염을 고려하십시오.

라만 분광법
코팅되지 않은 SiN에서 수행된 라만 분광법은 레이저 파장에 따라 두드러진 피크를 생성할 수 있으며, 이 피크는 대략 ^520cm-1 파수 영역⁽²³) 내에서 낮은 존재 신호를 마스킹할 수 있습니다. 관심 라만 스펙트럼이 실리콘 또는 실리콘 질화물 백그라운드 피크에서 충분히 분리된 경우 코팅되지 않은 SiN 필터 디스크를 사용하면 적절한 라만 분광법 결과를 얻을 수 있습니다. 이 보고서에서 파이프라인 B와 C는 모두 Au-SiN 필터 디스크를 사용했습니다. Au-SiN의 금 코팅은 고유한 Si 피크를 마스킹하여 ^520cm-1 파수 근처 또는 에서 낮은 농도의 스펙트럼을 보다 안정적으로 수집할 수 있습니다. 또한 Raman을 사용할 수 없는 경우 Au-SiN을 IR 분광법과 함께 사용할 수 있습니다. 항상 기기의 가장 낮은 출력 설정(즉, 레이저 강도)으로 시작한 다음 일부 관심 입자는 산화된 입자와 같이 깨지기 쉬울 수 있고 레이저에 의해 손상되거나 파괴될 수 있으므로 점차 증가시키십시오.

라만 분광법으로 선택한 입자를 분석할 때 반환된 스펙트럼의 신뢰성을 결정하는 것이 중요합니다. 일부 입자는 자동 형광을 발할 수 있으며, 이 형광은 스펙트럼 측정에 노이즈를 추가하여 입자 신호 해석을 가리거나 복잡하게 만들 수 있습니다. 이 잡음은 광범위한 파수에 걸쳐 있는 고강도 대역의 형태를 취하여 기본 데이터를 융합합니다. 그림 3C와 그림 4C,D에서 보여 준 적절한 스펙트럼은 베이스라인 보정 전에도 더 짧은 파수 범위에 걸쳐 명확하게 정의된 피크를 가질 것입니다. 주변 신호보다 최소 3배 더 큰 피크가 발생하지 않는 경우, 수집된 스펙트럼이 배경 잡음이거나 해당 입자를 분석하기 위해 다른 기기 설정이 필요할 수 있습니다. 각 샘플에 대해 적절한 레이저 파장이 선택되었는지 확인합니다. 532nm 레이저와 같은 저파장 레이저는 형광에 의해 생성된 신호를 충분히 처리할 수 없습니다. 782nm 또는 830nm 레이저와 같은 더 높은 파장의 레이저는 스펙트럼을 반환하기에 충분한 형광을 충분히 무시할 수 있습니다. 샘플의 유형에 따라 다양한 입자 유형에 대해 다른 레이저가 적합할 수 있으며, 가능한 경우 단일 필터 디스크에서 데이터를 수집하는 동안 교체할 수 있습니다.

입자의 구성을 결정하기 위해 수집된 스펙트럼을 참조 스펙트럼 데이터베이스의 스펙트럼과 비교합니다. 주어진 입자 스펙트럼을 신뢰할 수 있게 식별하면 70%(r > 0.70)보다 큰 Pearson의 계수(r)가 생성됩니다. 차선의 라만 데이터는 그림 5B에 나와 있으며, 여기서 는 0.70<. MP 식별 결과는 MP 오염의 잠재적 원인을 결정하는 데 유용합니다. 입자 식별 결과를 표시하기 위해 분석된 입자의 이미지와 스펙트럼을 그림 3C 및 그림 4C와 같이 표시할 수 있습니다.

주사 전자 현미경
SiN 및 Au-SiN 필터 디스크는 모두 여과에 의한 입자 포집 직후 SEM과 호환됩니다. SEM 전과 입자 포획 후에 SiN 필터 디스크가 Au 또는 Pt로 코팅되지 않은 경우 일부 입자는 SEM의 이온화 빔에 의해 더 쉽게 "충전"될 수 있으며, 이로 인해 입자가 빛나거나 이미지에서 매우 밝게 나타날 수 있습니다. 이러한 밝기/발광은 입자의 형태를 마스킹하는 것과 같은 좋지 않은 대비로 인해 시각화에 문제를 일으킬 수 있습니다. 이를 완화하기 위해 SEM 전에 광학/형광 현미경 및 라만 분광법을 수행하여 나중에 SEM/EDX 분석을 위해 분석하기 어렵거나 관심 있는 작은 입자를 표시한 다음 프로토콜 섹션 7에 설명된 대로 나노멤브레인을 Au 또는 Pt로 코팅하고 SEM/EDX를 수행합니다.

입자 포집 후 그리고 SEM 분석 전에 SiN 또는 Au-SiN을 Au 또는 Pt로 코팅하면 입자가 더 이상 폐기된 금속층 아래에서 이온화에 취약하지 않기 때문에 이미징 중 이러한 전하 효과를 방지하는 데 도움이 됩니다. 이 코팅은 대비와 해상도를 개선하므로 그림 3D (섬유 대 조각) 또는 표면 형태(예: 산화된 입자의 구덩이 및 균열)에서 볼 수 있듯이 주어진 입자에 대한 형태학적 이해를 높일 수 있습니다. SEM 분석 전에 금속 코팅 입자를 사용하면 분광학 또는 형광 이미징으로 추가 분석할 수 없으므로 SEM/EDX 분석만 계속 가능합니다. 따라서 입자를 코팅하고 SEM/EDX를 수행하는 것은 의도한 경우 모든 공정의 마지막 단계여야 합니다.

EDX 측정은 금속 코팅 전후에 포집된 입자에 대해 수행할 수 있습니다. EDX는 주어진 입자 또는 영역의 특정 원소 조성을 나타낼 수 있으며, 이는 라만 분석을 위한 검출 크기 한계보다 작은 입자 또는 금속, 합금, 수분 포화 미립자 및 사용 가능한 라만 레이저 빔에 노출될 때 강하게 형광을 발하는 입자와 같은 특정 라만 레이저 파장으로 분석하기 어려울 수 있는 원소 조성과 잘 쌍을 이룹니다. 이 연구에서 입자는 6nm 두께의 Au 층으로 코팅되었습니다. SEM 이미징은 20kV 빔 파워와 5mm의 초점 거리로 200x-3,000x 배율 사이에서 수행되었습니다. 선택된 입자의 각 SEM 이미지가 그림 3D에 나와 있습니다.

대표적인 EDX 결과는 그림 3F에 나와 있습니다. 퍼센트 중량이 1% 미만인 경우 감지된 요소는 기기의 감도에 따라 미량 또는 신뢰할 수 없는 것으로 간주될 수 있습니다. 따라서 임계값을 1%로 설정합니다. EDX 분석을 위해 선택한 입자가 코팅된 경우 검출 가능한 양의 코팅이 원소 데이터 보고서에 표시됩니다. 코팅되지 않은 SiN 필터 디스크를 사용하는 경우 그림 3F와 같이 Si 및 N 신호가 관찰됩니다. 불행히도 생물학적 공급원의 대부분의 비합성 입자도 동일한 원소로 만들어지기 때문에 대부분의 합성 고분자 입자에는 C, H 및 O 원소도 포함되지만 비합성 입자에는 단백질의 경우와 같이 S와 같은 원소도 포함될 수 있습니다. 이러한 조성의 유사성으로 인해 Nile Red 및 Trypan Blue의 counterstaining 방법이 합성 입자와 비합성 입자를 구별하는 데 유용하지만, Nile Red는 특정 경우에도 비합성 입자를 염색할 수 있기 때문에 완전한 식별 도구는 아닙니다. 위에서 제안한 것과 같은 추가 분석 매개변수는 결과를 확인하기 위해 모든 염색 절차와 함께 사용해야 합니다. 또한 EDX는 라만 분광법의 검출 크기 한계를 벗어난 입자(즉, 1μm < 측정하는 나노 플라스틱)를 잠재적으로 식별하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다.

그림 1: SNAP 파이프라인.(A) 일련의 서로 다른 분석 기술을 통해 동일한 나노멤브레인에서 동일한 입자를 특성화하는 SNAP 파이프라인의 개략도. 파이프라인 A) 1) 진공 여과를 통해 음용수 샘플에서 포착된 관심 입자는 2) 합성 및 비합성 고분자 입자를 각각 구별하기 위해 Nile Red 및 Trypan Blue로 염색한 다음, 3) 라만 분광법을 통한 입자 식별, 4) 입자 형태 및 원소 식별을 특성화하기 위한 SEM/EDX를 보여줍니다. 파이프라인 B) 1) Au-SiN에 입자 포획 후 2) 라만 분광법을 보여줍니다. 파이프라인 C) 1) Au-SiN에 대한 입자 포획 후 SEM/EDX를 보여줍니다. (B) 진공 장치의 여과 설정에서 필터 디스크 및 실리콘 개스킷의 개략도, 20μm MPSN을 통한 순차 여과를 묘사한 다음 실리콘 개스킷으로 분리된 8.0μm MSSN 나노멤브레인을 통한 순차 여과를 묘사합니다. 약어: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = 주사 전자 현미경; EDX = 에너지 분산 X선 분광법; MPSN = 미세 다공성 질화규소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 음용수 시료 채취 출처. 먼로 카운티 수자원 관리국(Monroe County Water Authority)에서 발행한 지역 지도는 뉴욕 그레이터 로체스터 지역에서 4개의 식수 샘플이 각각 수집된 위치를 보여줍니다. 샘플은 온타리오 호수(파란색), 헴록 호수(녹색), 헴록 호수와 온타리오 호수(노란색), 캐넌다이과 호수(보라색)와 같은 다양한 지표수 공급원에서 유래했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 음용수 샘플에서 포집된 입자에 대해 수행된 SNAP Pipeline A의 분석 요약. (A) 20μm 컷오프 SiN에서 하나의 대표적인 음용수 샘플에서 포집된 입자의 그레이스케일 이미지. (B) Nile Red(거짓 착색된 적색 입자) 및 Trypan Blue(거짓 착색된 청색 입자)를 나타내는 대조 염색 입자의 가색 오버레이 이미지. (C) 나일 레드 염색 입자를 Pearson의 r 값이 0.97인 폴리에틸렌으로 식별하는 참조(빨간색) 및 수집된 라만 스펙트럼, 분석된 입자의 대표 이미지. (D) Trypan Blue 염색을 차지하는 섬유(상단 패널)와 단편(하단 패널)의 입자 형태 분석을 보여주는 두 가지 다른 입자 유형의 전자 현미경 사진. (E) 20μm 및 8μm 컷오프 나노멤브레인에 순차적으로 캡처된 나일 레드 염색 입자의 정량화. (F) 무작위로 선택된 단편에 대한 요약된 EDX 원소 분석 및 분석된 입자의 대표적인 SEM 이미지와 함께 결과의 분석 세부 정보. 약어: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = 주사 전자 현미경; EDX = 에너지 분산 X선 분광법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 음용수 샘플에서 포집한 입자에 대해 수행된 SNAP 파이프라인 B의 분석 요약. 20μm MPSN 및 8.0μm MSSN Au-SiN 필터 디스크에 캡처된 4개의 가정용 식수 샘플에서 추출한 3개의 무작위 입자에 대한 라만 스펙트럼 분석. 20 μm 및 8 μm Au-SiN에 대한 전체 활성 막 면적의 대표적인 암시야 이미지가 각각 A 와 B에 표시됩니다. 이 이미징 모드에서 입자는 노란색으로 나타나고 배경은 어둡게 유지되어 자동 입자 계수를 쉽게 할 수 있습니다. (C) 20 μm 및 (D) 8.0 μm Au-SiN에서 합성 및 비합성 입자의 대표적인 라만 스펙트럼. (E) 20 μm 및 (F) 8.0 μm Au-SiN에 대한 총 입자 수는 자동 입자 탐지 소프트웨어에 의해 결정된 크기 범위에 따라 비닝됩니다. 약어: SNAP = Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline; SEM = 주사 전자 현미경; EDX = 에너지 분산 X선 분광법; MPSN = 미세 다공성 질화 규소; MSSN = 마이크로슬릿 질화규소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 차선의 형광 이미징 및 라만 분광법 결과. (A) 착색된 입자의 차선의 형광 이미지(왼쪽 패널), 멤브레인이 헹굼 부족으로 인해 나일 레드 염색을 유지한 경우. Trypan Blue-stained fiber와 Nile Red-stained fragment(오른쪽 패널)의 두 입자가 Raman 분광법을 위해 선택되었습니다. (B) Pearson의 계수(r)가 70%(r < 0.70) 미만인 경우 차선의 라만 분광법 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S1: 필터 디스크 내 실리콘 나노막의 특성. 이 표에는 최소 기공 크기, 다공성 비율, Au 코팅이 있거나 없는 멤브레인의 두께, 멤브레인의 활성 면적, 설정된 일정한 압력에서 양압이 가해진 멤브레인을 통한 가스 투과율을 포함하여 SiN 필터 디스크 내 멤브레인의 특성이 나와 있습니다. 컷오프(즉, 기공 크기), 다공성, 두께 및 멤브레인 면적은 SEM 이미지의 특징을 측정하여 결정됩니다. 가스 투과 데이터는 103.42kPa± 적용된 N 2 양압에 대한 평균 표준 편차(n = 10)로 보고됩니다. 약어: Au = 금; Si_{x N y} = 비화학량론적 질화규소. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 S2: ParticleFinder 입자 수 및 매개변수. 각 샘플에 대해 전체 멤브레인 영역 이미지 모자이크를 촬영하고 각 이미지 모자이크를 분석하여 총 입자 수를 수집했습니다. 이 표에는 사용된 매개변수와 각 샘플 이미지의 총 입자 수, 지정된 크기 분율에서의 입자 수를 결정하는 순서가 나와 있습니다. 매개변수는 입자의 유형, 양 및 모양뿐만 아니라 이미징 중 각 멤브레인의 특정 반사율을 고려하여 샘플마다 다릅니다. 이 테이블의 데이터는 그림 4에 시각화되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

미세 플라스틱 오염 완화는 점점 더 우려되는 주제입니다. 완화의 첫 번째 단계는 오염의 존재를 식별하는 것입니다. 간소화된 캡처 및 즉각적인 분석 방법은 조사자의 시간을 절약하고 민감한 샘플 메트릭을 보존하는 데 매우 중요합니다. 이 보고서는 수행된 모든 분석에 단일 기질을 사용하여 액체 샘플에서 이러한 MP를 분석하기 위해 개발한 SNAP 방법의 변형을 기반으로 하는 유연한 워크플로우를 설명합니다. 샘플은 입자가 포착되어 필터 디스크 내부에 있는 실리콘 나노멤브레인에 분리되도록 진공 여과되어야 합니다. 의미 있는 결과를 얻으려면 배경 오염을 충분히 완화하는 것이 중요합니다. 여과 중 디스펜싱 주사기 또는 유리 진공 깔때기의 오염 입자는 샘플을 오염시키고 동시에 포집될 수 있으므로 정확한 결과를 얻으려면 섹션 1 품질 관리 프로토콜을 성실히 따르는 것이 중요합니다. 개별 프로세스 및 실험실 조건에 특정한 배경 오염을 조사자에게 알리기 위해 매체 전용 통제가 권장됩니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 액체 시료의 진공 여과에 의존할 뿐만 아니라, 두 개의 상이한 컷오프 SiN 필터 디스크에서 시료로부터 입자를 포착하고 분리하는 것에 의존한다. 모든 파이프라인에서 입자 포집 및 분리는 다른 방법보다 우선해야 하지만 다른 모든 식별 방법은 연구자에게 가장 적합한 순서로 수행할 수 있습니다.

이 연구에는 기기 간 결과의 반복성을 입증하기 위해 두 개의 형광 현미경이 사용되었습니다. 교육 단계는 형광 현미경 투시를 위한 Olympus BX61의 사용에 대해 구체적으로 자세히 설명하고 그레이스케일 이미징을 위한 명시야, TRITC 채널(예: ~543nm; 그들. ~593 nm) NR 염색 입자 이미징의 경우 Cy5 채널(예: ~649 nm; 그들. ~667 nm)을 사용하여 TB 염색 입자 이미징을 수행할 수 있습니다. 염색 결과를 표시하려면 2,048 x 2,040 픽셀의 해상도와 16비트 깊이로 채널 이미지의 오버레이(이미지 처리를 위해 FIJI/ImageJ를 사용하며 이후 이미지 분석 플랫폼이라고 함)를 구성하는 것이 좋습니다. 전체 나노멤브레인 이미지는 그림 4A, B 와 같이 표시하거나 그림 3A, B와 같이 선택한 관심 영역으로 표시할 수 있습니다.

나일 레드는 일반적으로 합성 고분자 MP를 염색하는 데 사용되지만 친유성 및 소수성 특성으로 인해 생물학적 공급원에서 비합성 고분자를 염색할 수 있으며, MP 정량화 결과를 왜곡하는 위양성을 유발할 수 있습니다 24,25,26. 프로토콜 섹션 3에 설명된 바와 같이 Trypan Blue 대조염색 단계는 위양성 이벤트를 구별하는 데 도움이 되도록 권장되지만 완전한 솔루션은 아니므로 결과를 확인하기 위해 추가 분석 메트릭과 페어링해야 합니다. 입자의 나일 레드 형광은 배경 신호를 크게 증가시킬 수 있기 때문에 라만 분광법 분석에서 우려 사항입니다. 그러나 이 연구에서는 830nm 레이저로 라만 분광법을 사용하기 전에 Nile Red 및 Trypan Blue로 폴리머를 대조염색했으며 그림 3과 같이 노이즈가 거의 관찰되지 않았습니다.

라만 분광법(Raman spectroscopy)에 적합한 레이저의 일부 파장은 532nm 레이저와 같이 염색된 입자의 형광을 무시할 수 없으므로 관심 입자의 조성을 정확하게 추정하는 데 상당한 어려움을 초래할 수 있습니다. 포집 후 입자를 금속으로 코팅하면 SEM 이미징 중 대비를 향상시키는 데 유용하지만 후속 분광 또는 형광 분석에는 적합하지 않습니다. 실험 설정 전에 원하는 모든 측정값을 기록하여 공정 흐름과 코팅 유형이 적절하게 고려되었는지 확인하십시오. Au-SiN 필터 디스크는 투과 현미경 검사가 작업 흐름에 중요하지 않거나 라만 또는 IR 분광법이 사용되는 경우 언급된 모든 분석에 사용할 수 있습니다.

여기에 표시된 방법과 관심 입자를 포착하고 분리하는 데 사용되는 나노멤브레인은 개별 연구자의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 나노멤브레인은 여러 분광 분석에 적합하며, 조사자는 여과되는 배지를 소화된 동물 조직²⁷, 주사 가능한 의약품 및 오일 샘플을 포함하되 이에 국한되지 않는 다른 관심 샘플 매체로 교체할 수 있습니다. 이 연구에는 두 개의 라만 분광학 기기가 사용되었으며, 교육 단계에서는 그림 4에 표시된 모든 데이터를 수집하고 처리한 Horiba XploRA Plus 라만 기기의 사용에 대해 구체적으로 자세히 설명합니다. 또한 각 라만 현미경의 검출 크기 한계를 인정하여 관심 입자를 기기 레이저의 스폿 크기로 적절하게 분석할 수 있는지 확인하는 것도 중요합니다. Raman을 사용한 입자 식별 결과를 표시하기 위해 참조 및 샘플 스펙트럼과 분석된 입자의 이미지를 그림 3C 및 그림 4C와 같이 표시할 수 있습니다.

프로토콜 섹션 6은 오픈 소스 스펙트럼 라이브러리를 사용한 입자 식별에 대한 지침을 자세히 설명합니다. 균일하게 평평한 멤브레인에 대한 입자의 평면화된 캡처와 멤브레인의 규칙적인 기공 배열은 예측 가능하고 자동화된 이미징을 가능하게 합니다. 400nm 또는 1,000nm 두께의 SiN과 질화규소 조성은 모두 뛰어난 광학 투명도를 제공하지만 일부 분광 기기 매개변수에서 강렬한 실리콘 피크를 반환할 수도 있습니다. 라만 분석과 함께 베어, 비금속 코팅된 SiN을 사용할 때는 주의해야 합니다. Si 피크는 교정 신호로 기능할 수 있지만, 피크의 강도는 Si의 신호와 동일한 파수 영역에서 더 낮은 강도 스펙트럼의 신호를 마스킹할 수도 있습니다. 이러한 Si 피크는 본 연구에서 830nm 레이저를 사용할 때 관찰되지 않았습니다.

여기에 사용된 SiN(400nm 또는 1,000nm 두께) 및 Au-SiN(520nm 또는 1,120nm 두께)의 초박형 특성으로 인해 우수한 여과, 광학 및 분광 특성을 부여받았습니다. 그러나 이러한 멤브레인은 과도한 차압(예: ≥-206kPa), 핀셋이나 손가락으로 직접 만지거나 부적절한 개스킷 배치와 같은 물리적 손상으로부터 보호되어야 합니다. 멤브레인을 수용하는 필터 디스크는 멤브레인을 보호하고 정상적인 사용 시 쉽게 취급할 수 있습니다. 필터 디스크를 조작할 때는 검은색 바깥쪽 링만 만지고 활성 멤브레인 영역은 절대 만지지 마십시오. 여기에 정량적으로 보고되지는 않았지만, 포집된 입자를 소량의 멤브레인 표면적(20μm의 경우 3 x 3mm, 8.0μm 컷오프 멤브레인의 경우 각각 3 x 0.7 x 3mm)에 모으면 관심 입자를 찾고 분석하는 데 필요한 시간을 줄여 총 샘플 분석 시간을 줄일 수 있습니다. 이 "농도 계수"는 향후 연구할 가치가 있으며 연구자에게 SiN 필터 디스크의 고유한 이점을 제공할 수 있습니다. MP 특성화¹⁵에 널리 사용되는 다른 멤브레인에 비해 더 높은 표면적 정규화 유속과 함께, 균일하게 평평하고 초점이 맞는 SiN의 상대적으로 작은 영역만 이미징하면 되는 자동화된 입자 이미징 루틴은 총 분석 시간을 더욱 단축할 수 있습니다. 그러나 가정된 농도 계수와 관련된 모든 이점은 기존 필터 디스크와 SiN 필터 디스크의 총 처리 시간(여과에서 이미지 분석까지)을 비교하여 경험적으로 입증해야 합니다.

우리는 지역 수돗물 샘플에 대한 SNAP 변형의 유용성을 경험적으로 입증했습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 뉴욕주 로체스터 주변의 식수원에서 MP를 캡처하는 데 중점을 둡니다. 샘플 채취는 다음과 같이 진행되었습니다: 각 샘플 채취에 대해, 채취가 시작되기 전에 최소 1리터의 물이 수도꼭지를 통해 흘러나왔습니다. 밀봉된 새 폴리프로필렌 병을 흐르는 수도꼭지로 가져가 수거 직전에 열었습니다. 수거가 진행되기 전에 병을 식수로 헹구지 않았습니다. 각 샘플은 두 개의 500mL 병으로 구성되었으며, 한 병씩 바로 다른 병을 수집했습니다. 각 물 샘플은 서로 다른 가정의 파이프 시스템에서 가져왔으며 파이프 재료는 샘플링 전반에 걸쳐 일관되지 않았습니다. 최근 물 사용량, 수집 시간, 파이프 수명, 샘플이 나온 집의 나이와 같은 변수는 이 연구에서 제어할 수 없었습니다. 이는 검증된 샘플 채취 프로토콜이 아닙니다. 각 조사관은 자신의 수집 절차를 개발하고 검증해야 합니다. 다만, 방법의 완전한 개시를 위하여 위와 같은 설명을 포함한다. 필터 디스크를 사용하면 여러 분석 방법에 대해 동일한 기질에 대한 반복 분석이 가능합니다. 표준 임상시험 반복 실험 외에는 하위 샘플링 또는 여러 샘플이 필요하지 않습니다. 하위 샘플링 및 다중 샘플의 필요성을 제거하면 저농도 표적에 대한 정보 캡처에 대한 신뢰도가 높아집니다. 다중 모드 분석 방법을 가능하게 하는 것 외에도 SiN 필터 디스크는 단위 면적당 더 빠른 여과 속도의 시간 절약 품질로 인해 다른 유사한 여과 매체에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다¹⁵.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L 유리 비커	파이렉스	1000-1L
1 L 유리 진공 수집 플라스크	Millipore Sigma	Z290459-1EA
100 % 면 실험실 코	Landau	LA-3172
100 mL 유리 여과 깔때기	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
99% 이소프로필 알코올	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX		EDX 소프트웨어는 포집된 입자에 대한 EDX 분석을 수행하는 데 사용됩니다.
Denton Prep 스퍼터링 시스템	Denton Vacuum	DESK II : 293618089	금 코팅 시스템
FIJI, 이미지 분석 플랫폼	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI는 ImageJ입니다) - ImageJ 의 배포판;
유리 스크류 캡 병	Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Horiba Raman 소프트웨어(ParticleFinder 및 ViewSharp
층류 후드	Science	VLF-72A
현미경	올림푸스  / 니콘	BX61 / Ti2e	적절한 형광을 가진 모든 현미경을 광학 현미경에 활용할 수 있습니다.
MPSN SiN 필터	SiMPore Inc.	FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Monoject 60mL 주사기	Coviden	8881560265
나일 적색 분말	TCI	N0659
니트릴 장갑	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		오픈 소스, 스펙트럼 라이브러리
오븐	VWR	1310	Gravity 대류 유틸리티 오븐
P20 피펫	Brandtech	705872
피펫 팁	프리미엄 바이알	GS 151140R
붓는 지지 프릿	Advantec	311000	번들
라만 기기	Horiba	Xplora PLUS
고무 마개	Advantec	311000	번들
SEM 기기의 일부	Ziess	Auriga	Auriga 시리즈, 모듈식 크로스빔 워크스테이션
실리콘 개스킷	SiMPore	개스킷-25-R	클리어 캐스트 PDMS 개스킷, 0.8mm 두께
실리콘 롤러	Sanyue	( ASIN: B07XDTNPS3)	실리콘 롤러 -  8 x 5 x 2인치
SmartSEM	Zeiss V8 Zeiss	V7273	SEM 소프트웨어를 작동하는 데 사용되며 Zeiss Auriga
스프레이 병	Uline	S-7273
사기 필터	Thermo Scientific	CH2225-PES	0.22 및 마이크로; M 루어 잠금 주사기 필터, 25mm 
사기 펌프	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	선택 사항이지만 권장
판 블루 - 0.4%	Millipore Sigma	T8154-20ML
핀셋	SiMPore	K6TWZR
진공 펌프	Welch	847-676-8800
진공 튜브	Grainger	ZUSA-HT-4037