내피세포 및 β세포 상호작용의 3D 연구를 위한 새로운 Islet 모델: 세포보호제 선별에 대한 관련성

요약

이 프로토콜은 쥐 췌장 섬의 안정적인 구체를 생성하는 상세 절차와 소형 크기에 맞게 3D 염색, 투명화 및 장착 방법을 상세히 제공합니다.

초록

이 프로토콜은 췌장 섬의 3D 모델에서 내피 및 인슐린 생성 β 세포 상호작용을 연구하기 위한 소형 안정 구형 생성, 배양 및 3D 영상 촬영을 위한 최적화된 방법을 상세히 설명합니다. 150-200 μm 구상체는 섬 크기의 가장 낮은 범위를 반영하며, 섬 내 내피세포 1개(MS-1 세포)와 인슐린 분비 세포 20개(β-TC-6)를 결합한 선택된 비율로 준비되었다. 저융점 아가로스와 CUBIC 클리어링 기법을 이용한 작은 구체의 염색, 투명화 및 장착 문제와 3D 구조의 효율적인 분석을 위한 핵심 사항들이 상세히 설명되어 있습니다. 데이터는 NTPDASE-엑토뉴클레오티다제 3가 구형 모델에서 인슐린과 동일 위치하지 않음을 시사하며, 이는 β-TC6의 성숙도와 기능 수준이 다양함을 시사하며, 전체 절차는 섬 내 혈관을 명확히 탐색하여 분리된 췌장섬에도 적용할 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 3D 영상 프로토콜이 섬 모델 내 복잡한 췌장 세포 조직과 상호작용을 밝히는 데 효과적임을 강조합니다.

서론

췌장 섬 이식은 즉각적인 혈액 매개 염증 반응(IBMIR)으로 인해 종종 복잡해지며, 이는 섬 내 내피세포(IEC)를 크게 손상시켜 이식편 관류와 기능에 영향을 미칩니다. 장기적으로는 이식 후 4년 후 환자에서 기능성 섬 질량 감소와 인슐린 독립성 상실이 보고됩니다^. 섬 이식의 마우스 또는 쥐 모델이 개발되었으나, IBMIR에 의해 유발된 사이토카인 기반 이식 손상 맥락에서 특히 중요한 섬 전처리의 약리학적 표적을 조사하는 표준화된 모델이 부족^하다. 실제로 구형 구조는 새로운 약리학적 표적 식별과 사이토카인 유발 세포 기능 장애에 대한 세포보호 분자 평가에 특히 적합합니다. 더 나아가, 제1형 당뇨병 및 섬 이식의 동물 모델 사용을 제한하는 대안적 접근법도 제시합니다.

섬 크기 범위를 가진 작은 구체에 적합한 염색, 광학 투명화 및 장착 조건을 찾는 것은 여전히 어렵습니다. 문헌에서는 작은 구형체의 취급과 그 주요 구조적 특성을 다루는 연구가 매우 적습니다. 또한 조직 침투, 신호 보존, 구조적 완전성을 균형 있게 유지하면서도 이러한 소형 3D 세포 구조의 섬세한 특성을 유지해야 한다는 점에서 어려움이 발생합니다. 또한, 기존 염색 방법은 구형체의 균일한 표지를 달성하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 이 문제는 조밀한 세포 조직으로 인해 심화되며, 항체와 염료의 침투가 제한되어 시약의 확산이 방해될 수 있습니다 ^3,4. 마지막으로, 광 산란 배경을 줄이고 영상 깊이를 향상시키는 데 필수적인 광학 클리닝 과정은 구형 구조를 파괴하거나 생물학적 특성을 변경하지 않도록 신중하게 최적화되어야 합니다^.

3D 현미경을 위해 작은 구형을 장착하는 것도 또 다른 도전 과제입니다. 전통적인 마운팅 매체는 이러한 섬세한 구조물을 충분히 지지하지 못할 수 있으며, 영상 촬영 중 변형이나 붕괴로 이어질 수 있습니다. 더불어, 최적의 영상 품질을 위해 필요한 굴절률 매칭은 구점 ^6,7 깊이 전반에 걸쳐 정확한 시각화를 보장하기 위해 정밀하게 제어되어야 합니다. 작은 구체에 맞춘 프로토콜 개발은 구체 배양에서 사용되는 다양한 세포 유형과 실험 조건으로 인해 더욱 복잡해집니다³. 마지막으로, 염색 및 투명화 과정에서 여러 세포 집단의 무결성을 유지하기 위한 특수한 접근법의 필요성은 세포 반응 평가에 매우 중요합니다.

IBMIR 매개 섬 스트레스 연구의 구체적 과제를 해결하기 위해, 췌장 섬에서 관찰된 것과 유사한 1:200 비율의 2000 세포 구형 모델이 설계되었으며, 쥐 IEC와 인슐린 분비 β β 세포를 결합했습니다. 또한, 이전 실험들은 이 구조가 96시간 동안 생존 가능성을 유지한다는 것을 확인하여, 짧은(한 시간 범위) 또는 긴 스트레스 유발 세포 반응(일)과 그 약리학적 조절을 관찰할 수 있는 생리학적으로 중요한 3D 모델을 제공했습니다. 구형 모델은 MS-1 생쥐 섬 내 내피 세포, 섬 미세혈관 특성, 그리고 β-TC-6⁸ β 세포에서 인슐린 분비를 구성하는 것으로 구성됩니다. 췌장 섬의 가장 작은 크기 범위(직경 50-200 μm)와 평균^{세포 번호 9}를 매우 유사하게 모방하도록 설계되었습니다.

소형 구형 취급(직경 150-200 μm)에 최적화된 새로운 수확 및 염색 방법론이 보고되어 형광 염료와 항체가 구형 구조 전반에 걸쳐 최적 침투와 최소한의 배경 효과를 가능하게 합니다. 프로토콜은 저융점(LMPA)을 이용한 마운팅 절차를 포함하여 섬세한 구형체에 부드러운 구조적 지지를 제공하면서 최적의 굴절률 매칭을 가능하게 합니다. LMPA는 겔링이 약 27°C, 녹는점이 약 65°C로 줄어든 변형된 아가로스로, 삽입 시 시료의 무결성을 유지하고, 자가형광이 최소화된 광학적으로 투명한 매트릭스를 ^{생성합니다.} 마지막으로, 광학 클리어링에는 투명 장애 없는 뇌/신체 영상 칵테일 및 계산 분석(CUBIC)¹⁰ 방법이 사용되어 내부 구조의 최대 시각화와 섬세한 세포 간 상호작용의 완전성을 보존할 수 있습니다 ^5,6,10.

프로토콜

인간 췌장 조직 및 모든 실험 프로토콜의 사용은 프랑스 정부 고등교육연구부(연구혁신총국, 생명윤리부)의 승인을 받았으며, DC-2019-3439로 등록되었습니다. 모든 피실험자의 법적 보호자로부터 사전 동의를 받았습니다.

1. 구형 준비

참고: 마우스 IEC 계통 MS-1과 마우스 β-췌장 세포주 β-TC6를 동시에 배양하여 구형 배양에 필요한 충분한 세포 수를 확보하였습니다. MS-1은 4.5 g/L 포도당 함유의 DMEM 고포도당 배지에 T75 부착 세포 플라스크에서 5% 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함께 37°C의 습한 대기 환경에서 배양하였다. 분리 후 트립신 EDTA 1회 및 행크 밸런스 용액(HBSS)에서 세 차례 세척하여 합류(2일 배양)에서 통로를 수행하였다. β-TC6는 4.5 g/L 포도당 함유의 DMEM 고포도당 배지에서 T75에서 어려운 부착 세포를 배양했으며, 15% 태아 소 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신을 37°C의 습한 대기 환경에서 배양하였다. 트립신 EDTA 1x 및 행크 밸런스 용액(HBSS)에서 3번 세척한 후 β-TC6 합류점(10일 배양)에서 통로가 수행되었습니다.

1. 구형 배양판을 준비하세요
2. 세포 부착을 방지하고 구형 형성을 촉진하기 위해 제조사에서 제공한 500 μL 반부착 세척액으로 플레이트를 세척하세요.
3. 판을 1,300 x g 에서 5분간 원심분리기로 판 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터에서 실온에서 돌립니다.
4. 광미현미경으로 판을 관찰하여 마이크로웰 내에 기포가 남아 있지 않은지 확인하세요. 그렇다면 1,300 x g 에서 5분간 두 번째 원심분리기를 사용하세요.
5. 부착 방지 세척은 버리고 따뜻한 HBSS 1mL로 3번 세척하세요.
6. HBSS를 버리고 500 μL 따뜻한 구형 배지로 대체합니다: 4.5 g/L 포도당, 10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신 함유 DMEM 고포도당.
7. 구형 현탁액을 준비하는 동안 플레이트를 습한 대기에서 37°C로 유지하세요.
8. MS-1과 β-TC6를 트립신 용액과 동시에 배양하고 각 계통의 살아있는 세포를 세는 것입니다.
   참고: 씨앗 시, 구체는 췌장 섬에서 흔히 볼 수 있는 1 IEC 대 20 β 세포 비율로 형성됩니다. 24웰 구형 배양판을 사용하며, 각 웰에는 300개의 마이크로웰이 들어 있고, 각 웰에는 2000개의 세포로 구성된 구형 하나가 들어 있을 수 있습니다. 총 600,000개의 세포가 웰당 가능해집니다. 본 연구에서는 48시간 구형 배양 후 선택된 β-TC6 및 MS1 세포주가 차지하는 구형 부피가 동일함을 측정한 결과가 나타났다.
9. 두 세포주를 1:20 비율로 혼합하여 24개의 웰에 대해 1:20 비율로 만든 후, 24mL의 구형 배지에 부탁합니다.
   참고: 현탁액을 균질화하기 위해 10 mL 또는 25 mL 피펫을 흡착-유동 방식으로 사용하세요.
10. 각 웰마다 1mL를 피펫팅하고, 세포 부유액을 고르게 분포시키기 위해 흡입-유동 동작으로 진행합니다.
11. 플레이트를 130 x g 에서 실온에서 플레이트 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터에서 5분간 원심분리합니다.
12. 세포가 마이크로웰에 균등하게 분포되어 있는지 확인하기 위해 플레이트를 현미경으로 관찰하세요.
    참고: 이 원심분리 단계에서는 가속 및 감속률이 높은 비율(가속 및 감속 척도의 70%-90%)을 사용하세요. 그렇지 않으면 셀 덩어리가 마이크로웰 측면으로 이동할 수 있습니다.
13. 플레이트를 37°C, 5%_CO2에서 배양하세요.
14. 광각 현미경을 이용해 구형 형성과 성장을 모니터링하세요.
    참고: β-TC6 / MS-1 구형은 배양 후 24시간 후에 형성되기 시작하며, 48시간 후에는 구형 형태를 이룹니다. 트립신에 의한 구형 파괴 후 중복 샘플에서 트립신이 구형 파괴 후 생존 가능성을 96시간(80%-90%) 유지할 수 있습니다.

2. 구형 수확 및 염색

1. P1000 피펫으로 구체를 부드럽게 재현탁하세요.
2. 구체를 15mL 팔콘에 작은 부피로 배출한 뒤, 130 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리합니다
3. 배지를 부드럽게 흡입하되, 구체가 들어있는 펠릿은 피하세요.
4. 펠릿을 2mL HBSS로 부드럽게 두 번 세척하여 구체의 해리를 방지하고, 130 x g 에서 5분간 원심분리합니다.
5. 화학 후드 아래에서 HBSS를 버리고 구형체를 4°C에서 4% PFA 용액 1mL에 하룻밤 재현탁하여 고정시킵니다.
6. 튜브를 130 x g 에서 5분간 원심분리한 후 4% PFA 용액을 버린 뒤, 실험실용 초순수수에 조제된 1x PBS 2mL로 3회 세척합니다.
7. HBSS 2.5mL에 재현탁하세요.
8. 구형 현탁을 6웰 플레이트에 공급합니다.
9. 쌍안경 확대경 아래에서 P200 피펫으로 20개에서 30개의 구체를 손으로 뽑아 1.5mL 튜브에 넣습니다.
   참고: 각 1.5mL 튜브는 20개에서 30개의 구체가 포함된 염색 상태입니다. 수확한 구형 20개 미만이면 이후에 다시 부유시키면 보기 어려워집니다.
10. 1.5 mL 튜브의 부피를 평형으로 맞추고 원심분리기를 800 x g 에서 5분간 조절합니다.
    참고: 이 시점부터 모든 용액 흡인 단계는 돋보기의 도움을 받아 수행됩니다. 인공 조명 아래에서는 구형 물체를 매우 잘 볼 수 없습니다. 항상 낮 시간대에 튜브를 낮에 비추고 다음 단계를 수행하세요. 모든 용액은 P1000 팁이 끝에 P10 팁을 얹어 흡기합니다.
11. 구면을 재현탁하지 않고 가능한 한 많은 HBSS를 제거하세요.
12. 구체를 400 μL 담금용액(0.5 M 글리신 1x PBS(pH 7-7.4))에 재현탁하여 PFA 고정 과정에서 남은 알데히드로 인한 향후 배경 잡음을 방지합니다. 37°C에서 2시간 배양하세요.
13. 800 x g 에서 원심분리기를 5분간 사용한 후 피펫으로 담금용액을 제거하세요.
14. 침투 버퍼 400 μL(0.2% Triton X-100, 0.3M 글리신, 20% DMSO 1x PBS)에 재현탁합니다. 이는 항체와 핵 탐침의 침투를 개선하는 데 도움이 될 것입니다. 37°C에서 2시간 배양하세요.
    참고: 이 단계부터는 스스로 정착하며 관 벽에 달라붙지 않습니다. 부피를 부드럽게 흡입하면서 구형 펠릿을 방해하지 않는다면 원심분리는 더 이상 필요하지 않습니다. 필요하다면 800 x g 에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
15. 침투 버퍼를 버리고 400 μL 차단 버퍼(0.2% Triton X-100, 1% BSA, 1% DMSO, 5% 염소 혈청 1x PBS에 담기)를 37°C에서 하룻밤 배양합니다.
16. 차단 버퍼를 버리고 37°C에서 1차 항체 용액 300 μL (0.2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% 염소 혈청 1x PBS)에 하룻밤 배양합니다.
    참고: 사용된 1차 항체는 항-CD31(최종 농도 2.2 μg/mL), 항인테그린 β1(1.43 μg/mL), 항인슐린(0.66 μg/mL), 항생쥐 NTPDase3¹¹ (희석 1:1000)(재료 표 참조)입니다. 동일한 아이소타입의 대조군 IgG는 형광 현미경으로 양성 표지를 확인하기 위해 동일한 구조에서 검증되어야 합니다.
17. 1차 항체 용액은 버리고 400 μL 세척 버퍼(0.2% Tween 20, 1% BSA 1x PBS)로 3회 세척합니다. 세탁 사이에 5분간 흔들어 주세요.
18. 2차 항체 용액 300 μL(DAPI (2 μg/mL), 0.2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% 염소 혈청을 1x PBS에 담아 37°C에서 하룻밤 인큐브합니다. 튜브는 알루미늄 호일로 보호하세요.
    참고: DAPI는 현미경 영상 시 구체를 찾기 쉽게 하고, 다양한 형광체/염료가 표백되지 않도록 염색 조건에 항상 첨가해야 합니다. 모든 2차 항체의 최종 농도는 2 μg/mL입니다( 재료표 참조).
19. 2차 항체 용액은 버리고 400 μL 두 번째 세척 버퍼(0.2% Tween 20, 1% BSA)를 1x PBS에 넣어 3회 세척합니다. 마지막 세척은 보관하고 튜브를 37°C에서 보관해 같은 날 장착할 때까지 보관하세요.

3. 용액 준비

1. 광학 클리어 용액 준비
   참고: 광학 클리어링 솔루션은 CUBIC¹⁰ 절차를 따르며, Gunasingh 등(⁴)이 제안한 대로 준비되었습니다. 성분 비율은 최종 용액 무게(w/w)의 백분율로 제시되어 있는데, 이는 쿼드롤/N,N,N′,N′-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민이 너무 점성이 높아 피펫으로 측정하기 어렵기 때문입니다.
   1. 유리병 안에는 N,N,N′,N′-에틸렌디아민 9%, 요소 22%, 자당 44%, 트리톤 X-100 0.1%, 실험실용 초순수수 24.9%(수/수)를 무게로 넣습니다.
      참고: 24웰 플레이트를 클리어하려면 약 60g의 용액이 필요합니다.
   2. 병 직경에 맞게 자석 바를 추가하세요.
   3. 용액을 56 °C로 가열하고 저어줍니다. 같은 접시 위에 물이 담긴 대조용 유리병을 보관해 온도 상승을 모니터링하세요.
   4. 저어 속도를 조절해 부드러운 액체 소용돌이를 유지하고, 모든 화합물이 완전히 녹을 때까지 저어줍니다. 용액은 완전히 액체이고 맑아야 합니다. 이 과정은 최대 1시간 정도 걸릴 수 있습니다.
   5. 실온에서 빛을 차단해 보관하세요.
      참고: 클리어링 용액은 광학 클라임 최소 24시간 전에 준비해야 하며, 이를 통해 용액이 탈기되고 기포가 제거될 수 있도록 해야 합니다. 기포가 생기지 않도록 용액을 다시는 흔들지 마세요. 절대 냉장 보관하지 마세요.
2. 2% LMPA 용액 제제
   1. 정밀 저울에 LMPA 0.5g을 무게 달고 100mL Erlenmeyer 플라스크에 넣으세요.
      주의: 소량의 Erlenmeyer는 복용하지 마세요. 넘치면 화상 위험이 있습니다.
   2. 실온에서 1x PBS 25mL에 녹입니다.
   3. Erlenmeyer 플라스크를 부드럽게 저어 1x PBS에 분말을 충분히 섞으세요.
      주의: 다음 단계에서는 장갑과 눈과 얼굴 마스크 등 보호 장비를 착용하여 튀김과 화상을 방지하는 것이 필수적입니다.
   4. 에를렌마이어 플라스크를 전자레인지에 데워.
   5. 용액이 끓기 시작한 시점(액체 내 기포 존재)을 관찰하고, 끓기 직전에 바로 제거하세요.
   6. 에를렌마이어를 부드럽게 저어 가루를 섞으세요.
      주의: 액체가 넘치거나 과하게 끓어 튀길 수 있으니 너무 세게 저어서는 안 됩니다.
   7. Erlenmeyer를 다시 전자레인지에 넣고, LMPA가 완전히 녹을 때까지 반복합니다.
   8. 얼렌마이어를 제거하고 LMPA가 굳기 전에 2% LMPA 용액 1mL를 1.5mL 튜브에 빠르게 분리합니다. 실온에서 보관하세요.
      참고: 이 과정은 시간이 많이 소요됩니다. 미리 용액을 준비해 나중에 사용할 수 있도록 보관하세요.

4. 장착 및 광학 클리어링

1. 플레이트 원심분리기를 40 °C로 예열한 후 긴 사이클을 돌려 샘플 플레이트를 준비합니다.
   참고: LMPA 겔은 30 °C에서 사용됩니다. 원심분리기는 40°C 이하로 돌리지 마세요. 원심분리기가 허용한다면 50 °C로 올리세요.
2. 2% LMPA 알리코트를 70°C의 물욕조나 튜브 히터에서 5분에서 10분 정도 액화합니다.
3. 2% LMPA의 온도를 55°C로 낮추고 유지하세요.
4. 영상판을 50°C로 예열한 워머 위에 부드럽게 올려놓으세요.
   참고: 웰의 베이스로 사용되는 연약한 폴리머가 깨지거나 긁히지 않도록 주의하세요.
5. 2% LMPA를 넣기 전에 플레이트가 뜨거울 때 주의하세요. 이 단계에서는 잘 맞아떨어지지 않을 것이다.
6. 각 웰에 2% LMPA 200 μL 피펫을 넣습니다. 지지대 하단 전체를 덮어 첫 번째 액체 베이스를 얻어 구체의 더 유동적인 분포를 가능하게 합니다.
7. 세척 완충제를 튜브에서 버리고, 구체를 2% LMPA 300 μL에 재현탁한 후 직접 웰에 피펫 넣습니다. 항상 부드러운 부유액 부유를 하여 기포를 피하세요.
8. 형광체를 보호하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮으세요.
9. 알루미늄 호일 없이 접시를 재고 다시 접시 워머로 돌려주세요.
10. 24웰 플레이트를 준비하고, 평형을 위해 물을 추가하세요.
11. 알루미늄 호일로 판을 플레이트 워머에서 빠르게 떼어내어 2차 항체와 결합된 형광체를 보호하세요. 손에 쥐고, 차가운 표면에 두지 마세요.
12. 알루미늄 호일을 제거하고 판 원심분리기에 넣으세요.
13. 1000 x g 에서 40°C에서 15분간 원심분리기. 로터 온도를 확인해 보세요. 로터는 실온이어야 합니다.
14. 원심분리 중에는 얼음 트레이를 준비하세요: 얼음을 납작하게 만들어 평평한 표면에 올려놓을 수 있게 하세요.
15. 접시를 떼어내어 얼음 위에 올려놓고, 트레이나 접시를 알루미늄 호일로 덮으세요. 접시를 얼음에 10분간 보관하세요.
16. 얼음에서 플레이트를 떼어내고 알루미늄 안에 넣어 실온에서 20분간 안정시키세요.
17. 웰당 1에서 1.5mL의 클리어링 용액을 피펫팅한 후 알루미늄 호일로 덮은 뒤, 빛을 차단한 실온에서 최소 48시간 이상 광학적으로 투명하게 둡니다.
    참고: 플레이트를 절대 4°C에서 보관하지 마세요. LMPA는 수축하여 우물 바닥에서 떨어져 나가 정화 용액 위에 떠 있을 수 있습니다. 정리 후 일주일 이내에 촬영한 사진입니다.

5. 영상

1. 공초점 회전 디스크 현미경을 사용하고, 최소한 30배 대물렌즈를 선택하세요.
2. 클리어링 솔루션은 굴절률을 균질화하고 3D 영상을 더 쉽게 만들어 주기 때문에 보관하세요.
3. 다른 형광체를 표백하지 않도록 DAPI 채널을 선택하여 구형체를 찾으세요.
4. Z-스택 함수를 사용하여 이미지를 획득할 수 있습니다. 구체의 상단과 하단을 선택하고 광학 슬라이스를 10 μm 간격으로 배치합니다.
   참고: 이미지 획득 및 분석 작업은 CRBS의 영상 플랫폼인 PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra에서 수행되었습니다.

결과

라벨링과 광학 클리어링의 효과를 평가하기 위해 여러 모델이 동일한 프로토콜을 적용하고 이후 고정되었습니다(그림 1). 위 설명 방법에 따라 1 IEC 대 20 β 셀, 1 IEC 대 50 β 셀 비율의 구체가 배양되었다. 주목할 점은, 1 IEC 대 20 β 세포 비율이 인간 췌장섬의 근사치를 기준으로 한다는 것입니다. 트리판 블루를 이용해 교란된 구상체를 염색한 결과, 96시간 동안 생존 세포(80-90%)를 유지한다는 것이 확인되었습니다. 이 관찰은 섬 이식 맥락에서 IBMIR 사이토카인에 의해 유발되는 점진적 세포 변형과 세포 보호제 규명에 특히 중요합니다.

사이토카인 스트레스의 결과 중 하나는 IEC 형태와 기능의 변화로, 이는 β세포 생존과 인슐린 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 우리는 GLP1 유사체인 둘라글루타이드를 이용해 사이토카인 유발 스트레스에...

토론

MS-1 쥐 IEC와 β-TC6 쥐 β세포를 포함하는 구형 모델이 췌장 섬의 3차원 구조를 모방하여 개발되었습니다. 이 모델은 72시간 동안 스트레스로 유발된 IEC 기능 장애와 그것이 β세포 생존 및 기능에 미치는 영향 분석에 적합하며, 섬 이식 연구와 관련이 있습니다. 중요하게도, 쥐 세포로 구성된 구체는 본질적으로 균질하며 섬 내 내피 계통을 가졌다.

중요한 성과는 150-200 μm 소형 구형체를 수확, 염색, 광학적으로 투명화하는 프로토콜의 개발 및 검증으로, 염료 침투 강화, LMPA를 통한 구조적 지지, 세포 완전성을 유지하면서도 시각화를 개선하는 CUBIC 광학 클리어링 기법 등 3차원 영상의 과제를 해결했습니다. 이 프로토콜의 효능은 IEC 대 β세포 비율이 다양한 구체(1:20 및 1:50)와 분리된 인간 췌장 섬에서 입증되었습니다.

균일한 염색, 정밀...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
&마이크로판 24웰 블랙 ID 14mm	이비디	82426
AggreWell 800 (24개의 우물)	스템셀	34815
부착 방지 헹정 솔루션	스템셀	7010
항-CD31 항체 [P2B1]	ABCAM	AB24590	최종 농도 2.2&미세; g/mL
안티인테그린 및 베타; 1 항체, 클론 MB1.2	머크	MAB1997	최종 농도 1.43&마이크로; g/mL
세포 배양 플라스크, T-75, 표면, 표면 : 세포+, 필터 캡	사르스테트	83.3911.302	β-TC6 문화
세포 배양 플라스크, T-75, 표면: 표준, 2단계 스크류 캡	사르스테트	83.3911.02	MS-1 문화
DAPI 디하이드로클로라이드	써모피셔,	D1306	최종 농도 2&미세; g/mL
디메틸 설폭사이드	시그마	D8418-250ML
DMEM, 고혈당, GlutaMAX ™ 보충제, 피루브산염	열섬유 과학	31966047
둘라글루타이드
둘라글루타이드	릴리	트룰리시티 1.5mg 펜
태아 소 혈청	바이오웨스트	S1810-500
글리신	시그마	G7126-1KG
염소 항기니피그 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor™ 555	열섬유	A21435	최종 농도 2&미세; g/mL
염소 항마우스 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa fluor™ 488	열섬유	그리고 nbsp; A-11029	최종 농도 2&미세; g/mL
염소 항토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa fluor™ 633	열섬유	A-21071	최종 농도 2&미세; g/mL
염소 항쥐 IgG (H+L) 교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 555	열섬유	A21434	최종 농도 2&미세; g/mL
염소 혈청	시그마	S26-100ML
칼슘 없는 HBSS & 마그네슘  & 페놀 레드	코닝	21-022-CV
인슐린 (C27C9) 토끼 mAb	세포 신호 전달	3014S	최종 농도는 0.66&마이크로; g/mL
분리된 인간 췌장 섬	센터 유럽 및 예선; en d'Etude du Diabete (CeeD)		Dr. Karim Bouzakri의 친절한 선물입니다. 임상 등급, 지침에 따라 격리됨.
저겔링 온도 아가로스	머크	A9414-10G
MS-1 세포	ATCC	CRL-2279
파라포름알데히드 용액, PBS 1% 내 4%	피셔 사이언티브	15670799
PBS 10x	유로메덱스	ET330-A	실험실용 초순수수에 1배 희석한 물에
페니실린-스트렙토마이신	PAN 바이오텍	P06-07100
다클론 기니피그 항생쥐 NTPDase3 항체	mN3-1CI4; mN3-2C(I4, I5); mN3-3C(I4,I5)와 nbsp;	https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.php	희석 1:1000
쿼드롤/N,N,N′,N′-테트라키스(2-하이드록시프로필) 에틸렌디아민	시그마	122262-1L
회전 디스크 올림푸스 IXplore SPIN	올림푸스 사이언티픽 솔루션즈
분자생물학을 위한 자당	시그마	S0389-1KG
Triton X-100 생물품질 실험실 등급	유로메덱스	2000-A
트립신/EDTA (10배)	PAN 바이오텍	P10-025100
트윈-20	유로메덱스	//
요소	시그마	U-5128
β-TC6 세포	ATCC	CRL-11506