방법 논문

DNA Microarray Chip Method에 의한 Mycobacterium 종 동정

DOI:

10.3791/68234

⸱

2025년 6월 24일

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 Mycobacterium 종을 식별하기 위한 DNA 마이크로어레이 칩 방법을 제시하며, 이는 임상적 사용을 위한 관련 질병의 진단 정확도와 효율성을 향상시킬 것입니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 Mycobacterium 종의 정확한 식별을 위해 설계된 DNA 마이크로어레이 칩 방법을 제시합니다. 비대칭 PCR 증폭 및 혼성화 원리를 활용한 이 방법은 Mycobacterium tuberculosis 복합체 및 다양한 비결핵 마이코박테리아를 포함하여 17종의 일반적인 마이코박테리아를 표적으로 합니다. 마이코박테리아 질환이 의심되는 환자의 객담, 고름, 기관지폐포 세척액, 뇌척수액 및 천자액과 같은 광범위한 임상 검체에 적용할 수 있습니다. 이 분석법은 비대칭 PCR을 통해 Mycobacterium 게놈의 표적 염기서열을 증폭한 다음 마이크로어레이 칩의 프로브와 혼성화하는 것을 포함합니다. 고유한 프로브 배열(12열 x 10열 마이크로어레이에서 5회 반복)과 제어 프로브를 사용하여 신뢰성을 향상시킵니다. 1,724개의 샘플을 사용한 임상시험에서 높은 성능이 입증되었습니다. 이 방법은 검출 범위를 벗어난 2개의 희귀한 비결핵성 마이코박테리아 샘플을 제외하고는 염기서열분석 결과와 비교하여 100%의 임상 특이성, 민감도 및 전반적인 일치성을 달성했습니다. 이 DNA microarray 칩 방법은 전통적인 진단 기술에 비해 상당한 개선을 제공하여 진단 시간을 단축하고 보다 포괄적인 탐지를 제공하므로 마이코박테리아 질병의 진단 및 관리에 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

박테리아의 한 속인 마이코박테리움(Mycobacterium)은 인간과 동물의 건강에 중요한 영향을 미치는 다양한 유기체 그룹을 포함합니다. 결핵(TB)의 원인균인 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)은 오랫동안 전 세계적으로 건강상의 골칫거리였습니다. 수십 년 동안 예방과 치료를 위한 노력에도 불구하고 결핵은 여전히 주요 공중 보건 위협으로남아 있으며, 전 세계적으로 연간 사망자와 신규 감염자 수가 1,2 증가하고 있습니다. 비결핵성 마이코박테리아(NTM)는 특히 특정 환자 집단 및 환경 환경에서 중요한 병원체로 점점 더 많이 인식되고 있습니다.

Mycobacterium 종의 정확한 식별은 효과적인 질병 관리의 초석입니다 3,4. 전통적인 진단 방법에는 고유한 한계가 있습니다. 역사적으로 의존해 온 문화 기반 기술은 시간이 많이 걸리는 것으로 악명이 높습니다. 마이코박테리아를 분리하고 배양하는 과정은 몇 주에서 몇 달이 걸릴 수 있으며, 이 과정에서 환자는 질병이 진행되고 다른 사람에게 전염될 가능성이 있습니다. 더욱이, 일부 마이코박테리아 종은 배양이 매우 어려워 위음성 결과가 나타나고 치료가 지연되거나 부정확한 결과를 초래할 수 있습니다 5,6.

일반적으로 사용되는 또 다른 방법인 Acid-fast staining은 탈색에 저항하는 고유한 세포벽 특성을 기반으로 마이코박테리아를 식별할 수 있습니다. 그러나 서로 다른 Mycobacterium 종을 구별하기 위한 특이성이 부족하여 Mycobacteria의 존재에 대한 광범위한 표시만 제공합니다7. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 분자 분석법이 이러한 단점 중 일부를 극복하기 위한 대안으로 떠올랐습니다. PCR은 배양 방법보다 더 빠르게 마이코박테리아 DNA를 검출할 수 있어 더 빠른 진단이 가능합니다. 그러나 기존 PCR 분석은 일반적으로 제한된 수의 유전자를 표적으로 하며, 특히 밀접하게 관련된 Mycobacterium 종을 다룰 때 포괄적인 종 식별을 제공하지 못할 수 있습니다5.

DNA 마이크로어레이 기술은 미생물학 및 진단 분야에 혁명을 일으켰습니다. 여러 유전자 표적을 동시에 분석할 수 있는 기능을 제공하여 미생물 개체군에 대한 보다 포괄적이고 상세한 관점을 제공합니다 8,9. 이 분야에 대한 최근 연구는 마이코박테리움 식별을 위한 고급 분자 기술의 잠재력과 중요성을 더욱 조명했습니다. 예를 들어, Wang et al.10의 연구는 임상 환경에서 희귀한 Mycobacterium 종을 검출할 때 변형된 DNA 마이크로어레이 칩의 향상된 민감도와 특이성을 입증했습니다. 그들의 연구 결과는 마이크로어레이 기술의 지속적인 최적화의 가치를 강조했습니다. Wang과 동료들의 또 다른 연구는 DNA 마이크로어레이 데이터와 결핵 환자의 임상 결과를 통합하는데 초점을 맞췄습니다. 그 결과 정확한 Mycobacterium 종 식별의 예후 가치와 개인 맞춤형 의학의 잠재력에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

테스트 원리
이 키트는 Mycobacterium 종의 식별을 위해 비대칭 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭 및 혼성화 원리와 결합된 DNA 마이크로어레이 칩 기술을 사용합니다. 이 키트에는 Mycobacterium 종 식별 칩과 비대칭 PCR 증폭 시약이 포함되어 있습니다. 이 칩은 Mycobacterium 종의 검출 및 식별을 위해 종 특이적 프로브로 고정되어 있습니다. 검출 대상에는 임상적으로 흔한 17종 또는 그룹, 예: Mycobacterium tuberculosis complex, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae 및 Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum 및 Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai 및 Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi 및 Mycobacterium smegmatis.

이 17종의 마이코박테리움(Mycobacterium)을 검출하는 것은 정확한 임상 진단과 맞춤형 환자 관리에 매우 중요합니다. 결핵균 복합체(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)는 결핵에 대한 역할로 인해 우선순위가 지정되며, 전염을 억제하고 약물 내성을 해결하기 위해 즉각적인 격리 및 다제요법이 필요합니다. M. avium 및 M. intracellulare와 같은 Mycobacterium avium-intracellulare complex(MAC) 내의 종은 주로 면역이 저하된 개인(예: HIV/AIDS) 또는 만성 폐 질환이 있는 개인에게 영향을 미치므로 장기간의 마크로라이드 기반 요법이 필요합니다. M. abscessus 및 M. fortuitum과 같이 빠르게 성장하는 마이코박테리아(RGM)는 항생제 내성으로 악명이 높으며 종종 심각한 피부, 연조직 또는 폐 감염을 유발하여 수술과 표적 항생제(예: 아미카신, 마크로라이드)의 공격적인 조합을 요구합니다. M. gordonae 또는 M. smegmatis와 같은 환경 종은 빈번한 오염 물질이지만 특정 상황에서 기회 감염을 일으킬 수 있으므로 불필요한 치료를 피하기 위해 신중한 임상 상관 관계가 필요합니다. M. marinum(수생 노출과 관련됨) 및 M. ulcerans(부룰리 궤양을 유발함)와 같은 병원체는 뚜렷한 역학적 틈새를 가지고 있어 노출 이력 평가를 안내합니다. 드물지만 임상적으로 관련성이 있는 종(예: M. szulgai, M. malmoense)은 결핵을 모방하며 종 특이적 요법이 필요합니다. 치료 기간, 약물 선택(예: M. kansasii의 rifampin 감수성 대 NTM의 내재적 내성) 및 예후가 크게 다르기 때문에 정확한 식별이 가장 중요합니다. 분자 진단 및 항생제 감수성 검사는 특히 면역이 저하된 집단 또는 복잡한 감염에서 결과를 최적화하는 데 필수적입니다.

먼저, Mycobacterium 게놈의 표적 염기서열은 비대칭 PCR을 통해 증폭됩니다. 그런 다음, 증폭된 생성물은 칩의 프로브와 하이브리드화됩니다. 표적 Mycobacterium 이 샘플에 존재하는 경우, 증폭된 산물은 칩의 해당 프로브에 특이적으로 결합합니다. 마지막으로, 칩의 혼성화 신호를 스캔하여 샘플의 Mycobacterium 종을 결정할 수 있습니다.

유전자 칩 마이크로 어레이 기술을 사용하여 앞서 언급한 유전자를 검출하기 위한 특정 프로브와 다양한 제어 프로브가 기판에 고정됩니다. 각 검출 프로브와 제어 프로브는 5회 반복되어 12열 x 10열 마이크로어레이를 형성합니다. 프로브 배열은 그림 1에 나와 있습니다. 각 칩에는 4개의 동일한 마이크로어레이가 포함되어 있으며 각 마이크로어레이는 하나의 샘플을 감지할 수 있습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 푸젠 의과대학 부속 취안저우 제1병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호 2024-K035). 임상 검체를 수집하기 전에 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 환자들은 연구의 목적, 관련된 절차, 그리고 치료에 영향을 미치지 않고 언제든지 중단할 수 있는 권리에 대해 설명받았습니다.

1. 샘플 요구 사항

참고: 이 키트로 테스트하기 위해 임상적으로 의심되는 결핵 및 비결핵 마이코박테리아(NTM) 질환이 있는 환자로부터 샘플을 수집할 때 다음 단계를 따르십시오.

  1. 환자로부터 객담, 고름 또는 분비물, 기관지폐포 세척액, 천자액(뇌척수액, 흉막 및 복막액, 심낭액, 관절액 및 담즙 포함) 및 소변과 같은 샘플을 수집합니다.
    1. 가래 샘플의 경우:
      1. 환자에게 아침에 깨끗한 물로 입을 헹구고 멸균 샘플 보관 용기에 깊은 가래를 토해내고 밀봉한 다음 검사를 위해 보내도록 지시합니다.
      2. NaOH 4%의 1-2배를 넣고 흔든 후 골고루 섞습니다.
      3. 15-20분 후 동일한 부피의 pH 6.8 인산염 완충액을 넣고 골고루 섞습니다.
      4. 실온에서 2,000 ×g에서 15 분 동안 원 심분리한 후 상층액을 버립니다. 피펫을 통해 1mL의 0.9% NaCl을 넣고 철저히 섞습니다. 감지에 사용합니다.
    2. 고름 또는 분비물 샘플의 경우:
      1. 멸균 생리식염수로 표면을 헹굽니다. 멸균 면봉으로 고름이나 분비물을 모아 밀봉하고 검사를 위해 보냅니다.
      2. NaOH 4%의 3배를 넣고 잘 섞이도록 잘 흔들어줍니다.
      3. 실온에서 20분 동안 방치하고(이 시간 동안 수동으로 2회 흔들어) 실온에서 2,000× g 으로 15분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버립니다. 피펫을 통해 1mL의 0.9% NaCl을 넣고 골고루 섞습니다. 감지에 사용합니다.
    3. 기관지폐포 세척액의 경우:
      1. 보호된 기관지폐포 세척(PBAL) 튜브를 통해 생리식염수 10-20mL를 주입합니다.
      2. 음압 흡입으로 멸균 병에 샘플을 수집하고 테스트를 위해 보냅니다.
    4. 뇌척수액의 경우:
      1. 무균 기법을 사용하여 최소 2mL의 샘플을 수집합니다.
      2. 실온에서 2,000 × g 에서 15분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 피펫을 통해 0.9% 염화나트륨 용액 1mL를 넣고 완전히 섞은 후 테스트에 사용합니다.
    5. 소변 샘플의 경우:
      참고: 아침에 처음 소변을 가득 모으거나 중야와 늦은 밤에 소변을 사용하는 것이 좋습니다. 소변은 카테터 삽입으로 채취할 수도 있습니다.
      1. 멸균 용기에 검체를 수집하고 채취한 소변 검체를 4-5시간 동안 그대로 두십시오.
      2. 실온에서 2,000 × g 의 원심분리기에서 15분 동안 원심분리기. 상등액을 버리십시오. 피펫을 통해 0.9% 염화나트륨 용액 1mL를 넣고 완전히 섞은 후 테스트에 사용합니다.
  2. 시료 보관
    참고: 고체 매체의 샘플은 동결이 후속 작업에 영향을 미칠 수 있으므로 냉동 보관해서는 안 됩니다.
    1. 액체 매체에 존재하는 샘플을 -70 °C에서 5 년 이상 보관하지 마십시오.
    2. 모든 샘플을 2-8 °C에서 2 개월 이상 보관하지 마십시오.
  3. 샘플 운송
    1. 테스트 분리 샘플을 운송할 때는 규정에서 허용하는 조건 하에서 생물 안전 요구 사항을 충족하는 밀폐된 용기를 사용해야 합니다.

2. 실험 준비

  1. Chip Washing Solutions의 준비
    알림: 칩 수에 따라 Chip Washing Solution I과 Chip Washing Solution II를 준비합니다. 부피는 세탁하는 동안 칩이 완전히 잠길 수 있는 것이어야 합니다. 골고루 섞고 실온(10-30 °C)으로 평형을 이룹니다. SSC의 최종 농도는 2배이고 SDS의 최종 농도는 0.2%입니다.
    1. 칩 세척 용액 I을 준비하려면 20x SSC, 증류수(또는 정제수) 및 10% SDS를 10:88:2의 비율로 순서대로 혼합하여 칩 세척 용액 I을 준비합니다. 예를 들어, 총 600mL를 준비할 때 먼저 60mL의 20x SSC와 528mL의 증류수(또는 정제수)를 측정하여 1L 비커에 넣고 교반 막대로 균일하게 혼합합니다. 그런 다음 10% SDS 12mL를 넣고 다시 골고루 섞습니다.
    2. 칩 세척 용액 II를 준비하려면: SSC의 최종 농도는 0.2배입니다. 20x SSC와 증류수(또는 정제수)를 1:99의 비율로 혼합하여 Chip Washing Solution II를 얻습니다. 총 부피 600mL를 예로 들어 20x SSC 6mL와 증류수(또는 정제수) 594mL를 측정하고 1L 비커에 넣고 균일하게 혼합합니다.
      참고: 10% SDS 용액에서 백색 응집제 침전물이 발생하면 50°C에서 가열하고 철저히 혼합한 다음 마이크로어레이 세척 버퍼를 준비합니다. Washing Buffer I에서 백색 응집제 침전물이 발생하면 50°C에서 가열하고 철저히 혼합한 후 실온과 평형을 이룬 후 사용하십시오.
  2. 얼음-물 혼합물 350mL를 준비합니다.
  3. 증류수(또는 정제수)를 준비하십시오.

3. 기구 및 재료 준비

  1. 기기 선택 및 설정
    1. 마이크로어레이 칩 스캐너를 식별하고 준비하여 보정되고 사용할 준비가 되었는지 확인합니다.
    2. 핵산 추출 기기를 설정하고 기능을 점검하고 필요한 시약을 로드합니다.
    3. 교잡 상자 유전자 마이크로어레이 칩 교잡 상자를 적절한 위치에 놓고 적절한 작동 조건을 확인합니다.
  2. 피펫팅 도구 준비
    1. 0.1-10 μL, 2-20 μL 및 20-200 μL 사양의 마이크로피펫과 해당 세척 및 멸균 피펫 팁을 수집합니다. 마이크로피펫이 정확하게 보정되고 팁이 제대로 장착되었는지 확인합니다.
  3. 보조 장비 배치
    1. 항온 수조를 준비하고 필요한 온도(50°C)로 설정하십시오.
    2. 1.5mL 원심분리 튜브를 원심분리할 수 있는 마이크로 원심분리기를 배치하고 저울 및 속도 설정을 확인합니다.
    3. 원심분리기 랙 선반에 깨끗하고 멸균된 원심분리 튜브(200 μL 및 1.5 mL)와 깨끗하고 멸균된 8웰 스트립(200 μL)을 정리할 수 있습니다.
  4. 시료 취급 장비 준비 상태
    1. 일정한 온도의 쉐이커를 편리한 위치에 놓고 적절한 쉐이킹 매개변수를 설정합니다.
    2. 칩을 세척하기 위한 두 개의 용기를 따로 놓고 깨끗하고 건조한지 확인하십시오.
    3. 슬라이드 랙과 원심분리기를 배치하고 칩을 원심분리하고 건조할 수 있는 용기를 준비하십시오.
  5. PCR 증폭기 준비
    1. PCR 증폭기를 켜고 실험 프로토콜에 따라 프로그래밍하여 증폭 반응을 수행할 준비가 되었는지 확인합니다.

4. 핵산 추출

알림: 시편 준비 영역에서 작업을 수행하고 다음 단계를 따르십시오.

  1. 준비
    1. 핵산 추출 튜브에 80μL의 핵산 추출 용액을 넣고 0.9% NaCl 1mL를 추가합니다.
  2. 분리 시료 채취
    1. 샘플 채취를 시작하려면 샘플이 고체 매체 또는 액체 매체에서 왔는지 여부에 관계없이 샘플의 출처를 검사하십시오.
    2. 고체 배지 샘플을 수집하려면 멸균 접종 루프를 사용하여 적절한 고체 배지에서 보이는 콜로니를 선택합니다. 박테리아가 전체 매체를 덮을 정도로 성장한 경우 해당 양의 박테리아 잔디를 선택하십시오. 핵산 추출 용액이 들어 있는 핵산 추출 튜브에 조심스럽게 넣고 가능한 한 고체 매체를 선택하지 않도록 주의하십시오.
    3. 액체 매체 샘플의 경우 탁도가 1 McFarland 표준물질 이상인 박테리아 현탁액 10-20μL를 흡인합니다. 핵산 추출 용액이 들어 있는 핵산 추출 튜브에 주입합니다.
      참고: 고체 또는 액체 매체에서 샘플을 채취한 후 샘플은 후속 핵산 추출 작업을 수행할 준비가 됩니다.
  3. 핵산 추출
    1. 위에서 언급한 1.1단계에서 전처리된 검체를 추가하거나 샘플을 분리한 후 핵산 신속 추출 기기를 사용하여 핵산을 추출합니다. 추출된 핵산을 임시 보관을 위해 -20°C에 놓습니다.
      참고: 추출 효율의 지표로, 자동 추출기는 바이러스 핵산 부하가 100 copies/mL 이상인 샘플을 추출할 수 있습니다. 임시 보관 시간은 2개월을 초과할 수 없습니다.

5. PCR 증폭

  1. PCR 반응 시스템의 준비
    1. 시약 보관 및 준비 영역에서 테스트할 샘플 수에 따라 200μL 원심분리 튜브 또는 8웰 스트립을 준비하고 미리 샘플 번호를 표시합니다. 키트에서 PCR 증폭 시약을 꺼내 자연적으로 해동 및 녹인 다음 부드럽게 흔들어 균일하게 혼합한 다음 신속하게 원심분리하여 시약이 튜브 바닥에 모이도록 합니다.
    2. 샘플 수에 따라 PCR 증폭 시약을 튜브당 18μL 부피의 200μL 원심분리 튜브 또는 8웰 스트립으로 분취합니다. 튜브 캡을 단단히 닫은 다음 증폭 반응 혼합물 준비 및 증폭 영역으로 옮깁니다.
    3. 검체 준비 영역에 2 μL의 template DNA(테스트할 샘플의 DNA(즉, 핵산 추출 튜브의 상등액), positive control 산물 또는 negative control 산물)을 추가합니다. 각 PCR 반응 시스템의 총 부피가 20μL에 도달하는지 확인합니다.
      알림: 증폭하는 동안 매번 양성 대조군 제품과 음성 대조군 제품을 사용하십시오. 양성 대조 생성물은 PCR 증폭 및 혼성화 공정에서 품질 관리에 사용할 수 있으며 음성 대조 제품은 환경 및 작동 프로세스를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
  2. 증폭
    1. 시약이 들어 있는 원심분리 튜브 또는 8웰 스트립을 PCR 증폭 기기에 놓습니다. 기기가 필요한 온도로 예열되었는지 확인하십시오. 다음 열 순환 프로그램에 따라 PCR 증폭 반응을 수행합니다 : 94 ° C에서 600 초 (1 사이클) 동안 초기 변성; 30 초 동안 94 °C에서 변성 35 사이클, 30 초 동안 60 °C에서 어닐링, 40 초 동안 72 °C에서 확장; 72°C에서 420초(1사이클) 동안 최종 확장; 4°C에서 무기한 유지(1사이클).

6. 칩 혼성화

참고: PCR 증폭 반응이 끝나기 전에 다음 작업을 수행하십시오.

  1. 항온 수조의 온도를 50°C로 설정하고 예열합니다.
  2. 칩의 준비
    1. 200μL의 증류수(또는 그림 2A와 같이 정제수)를 유전자 마이크로어레이 칩 혼성화 상자 바닥에 추가합니다. 상자 내부의 두 위치 지정 열 사이에 브래킷을 놓습니다.
    2. 앞면이 위로 향하도록 칩을 브래킷에 조심스럽게 놓고 4개의 보스가 아래를 향하도록 커버 슬립으로 칩을 덮습니다( 그림 2B 참조).
      알림: 덮개 슬립의 끝이 칩 끝에 있는 레이블과 정렬되도록 덮개 슬립의 올바른 배치 방향을 확인하십시오.
  3. 혼성화 반응 혼합물의 준비, 변성 및 냉각
    1. 시료 수에 따라 200μL 원심분리 튜브 또는 8웰 스트립을 준비하고 적절하게 라벨을 부착합니다.
    2. 키트에서 혼성화 버퍼를 꺼내고 완전히 녹을 때까지 50°C에서 가열합니다. 철저한 혼합 후 마이크로 원심분리기에서 빠르게 원심분리하십시오. 9 μL의 혼성화 완충액을 준비된 각 200 μL 원심분리 튜브 또는 8웰 스트립에 분취합니다. 그런 다음 각 튜브에 해당 PCR 산물 6μL를 첨가하여 혼성화 반응 혼합물당 총 부피 15μL를 생성합니다.
    3. 혼성화 반응 혼합물(혼성화 완충액 및 PCR 산물 포함)을 95°C(PCR 기기 또는 수조에서)로 가열하고 5분 동안 변성시킵니다. 이전 단계에서 변성 처리를 거친 혼성화 반응 혼합물을 꺼내 즉시 얼음-물 혼합물에 3분 동안 침지시킵니다.
  4. 혼성화 반응
    1. 얼음 수조에서 혼성화 반응 혼합물을 꺼내 마이크로피펫으로 위아래로 2배 피펫팅하여 균일하게 혼합합니다. 백색 응집제 침전물(있는 경우)이 사라진 후, 커버 슬립의 로딩 구멍을 통해 혼성화 반응 혼합물 13.5μL를 추가하고( 그림 2C 참조), 혼성화 상자를 빠르게 덮고 밀봉합니다( 그림 2D 참조). 칩 번호, 마이크로어레이의 위치 및 해당 샘플 번호를 기록합니다.
      참고: 각 마이크로어레이에 하나의 샘플만 추가할 수 있습니다.
    2. 즉시 밀봉된 혼성화 상자를 50°C로 예열된 항온 수조에 수평으로 놓습니다. 모든 하이브리드화 상자를 넣은 후 120분 동안 타이머를 시작합니다.
      알림: 적재 과정에서 기포가 유입되지 않도록 하십시오. 로딩 시작부터 칩이 건조될 때까지의 모든 단계에서 칩 마이크로어레이의 액체가 장시간 공기에 직접 노출되는 것을 방지하여 건조로 인해 칩 배경이 너무 높아지고 결과 해석을 방해하는 것을 방지합니다.
  5. 칩의 세척 및 건조
    1. 혼성화 반응이 완료된 후 혼성화 박스를 수평으로 꺼내 분해하고 칩을 꺼내 세척합니다. 즉시 실온(10-30°C)으로 평형을 이룬 Chip Washing Solution I으로 채워진 용기(예: 비커)의 슬라이드 랙에 칩을 놓습니다. 상온에서 80분 동안 항온 셰이커에서 100-3rpm의 속도로 세척하십시오.
    2. 상온에서 80분 동안 일정한 온도 셰이커에서 100-3rpm의 속도로 실온과 평형을 이룬 Chip Washing Solution II로 칩을 세척합니다.
    3. 칩을 원심분리기에 넣고 100× g 의 실온에서 5분간 원심분리기를 굽습니다. 건조 후 스캔하십시오.
      알림: 칩이 서로 충돌하거나 마찰하지 않도록 하십시오.

7. 칩 스캐닝 및 결과 해석

알림: 마이크로어레이 칩 스캐너와 해당 소프트웨어를 사용하여 신호를 읽고 결과를 해석합니다. 또한 비정상적인 결과 및 문제 해결에 대해서는 표 1 을 참조하십시오. 작동하려면 다음 단계를 따르십시오(스캐너 및 소프트웨어의 사용 설명서 참조).

  1. 스캐너와 해당 소프트웨어를 켠 다음 레이저 제어 버튼을 클릭하여 10분 동안 예열합니다.
  2. Sample Number와 같은 샘플과 관련된 다양한 유형의 정보를 입력합니다.
  3. 스캐너 예열이 완료되면 Eject 버튼을 클릭하고 칩을 작은 브래킷 조각에 꾸준히 놓습니다. 칩을 스캐너 구획의 구멍에 부드럽게 수평으로 밀어 넣고 로드 버튼을 클릭합니다.
  4. 칩 번호를 입력하고 클릭하여 검출 영역 (마이크로어레이 1-4)을 선택한 다음 샘플 선택을 클릭하여 각 마이크로어레이에 해당하는 샘플을 선택합니다. 그런 다음 감지 시작 버튼을 클릭하여 칩 스캔을 수행합니다. 스캔 결과가 화면에 표시되고 자동으로 저장됩니다.
  5. 한 칩을 스캔한 후 7.3단계와 7.4단계를 반복하여 다음 칩을 스캔합니다. 모든 칩이 스캔될 때까지 이 절차를 따르십시오.
  6. 데이터 쿼리 페이지를 사용하여 데이터 쿼리 및 인쇄 작업을 수행할 수 있습니다.
  7. 모든 작업을 완료한 후 먼저 레이저를 끈 다음 소프트웨어를 종료하고 마지막으로 스캐너를 끕니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

긍정적인 결과
Mycobacterium 속(내부 대조군, IC) 및 Mycobacterium tuberculosis의 프로브의 경우 양성 결과 값은 ROC(Receiver Operating Characteristic) 방법에 의해 결정됩니다. 다른 16개의 NTM을 감지하는 데 사용되는 프로브의 경우 양수 결과 값은 백분위수 방법에 의해 결정됩니다.

실험적인 품질 관리
양성 대조군 산물의 검출 결과는 "Mycobacteriumtuberculosis complex"여야 합니다( 그림 3A 참조). 음성 대조군 산물의 검출 결과는 " 마이코박테리움 없음"이어야 합니다( 그림 3B 참조). 대조 제품 중 하나라도 결과가 정확하지 않은 경우 동일한...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 논문에서 소개한 DNA 마이크로어레이 칩법은 결핵 및 비결핵균증이 의심되는 환자의 임상시험 검체(객담, 고름, 기관지폐포 세척액, 뇌척수액, 천자액 등)에서 핵산을 직접 검출할 수 있으며, 확진 판정에 이르는 시간을 획기적으로 단축할 수 있다. 이 연구에서 제시된 DNA 마이크로어레이 칩 방법은 Mycobacterium 종의 식별에 상당한 진전을 나타냅니다. 이는 기존 분자 진단 방법 및 일부 기존 분자 진단 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다12.

이 접근법의 주요 강점 중 하나는 17개의 일반적인 마이코박테리아를 동시에 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 이러한 광범위한 검출 능력은 결핵과 비결핵성 마이코박테리아증을 감별 진단하는 것이 어려운 경우가 많은 임상 환경에서 매우 중요합니다. 비대칭 PCR에서 특정 PCR 프라...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작업은 푸젠성 자연과학재단 프로젝트(2024J011521)와 취안저우 과학기술계획프로젝트(2024NY006)의 지원을 받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.9% 염화나트륨 주사(NaCl)푸저우 하이왕푸야오H35020289
Applied Biosystems 증폭 장치써모 피셔 사이언티픽Veriti 96웰 열 순환기
캐피탈바이오 럭스스캔10K/B캐피탈바이오럭스스캔10K/B
CapitalBio 슬라이드 와셔 24 캐피탈바이오슬라이드 와셔 24 
  원심분리기 에펜도르프5424 RMaX.speed 15000 min-1
혼성화 버퍼
HybSet 유전자 마이크로어레이 칩 및 커버
마이코박테리움 종 식별 키트캐피탈바이오301030
음성 대조군, 양성 대조군
핵산 추출기톈룽제네로텍스 96
PCR 증폭 시약
pH 6.8 인산염 완충액상하이 yuanye 생명 기술R20029-10
피펫터 및 팁써모 사이언티픽0.1 - 10 & 엘, 2 - 20 & L, 및 20 - 200 & L, 100-1000 & L
qEx-DNA/RNA 핵산 추출 또는 정제 키트톈룽qEx-DNA/RNA
SDS캐피탈바이오441060
수산화나트륨(NaOH)시롱스  과학적인XK13-011-00027
SSC캐피탈바이오441050
온도 조절 수조스루이HH-W600 시리즈

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
  4. Liu, S., et al. DNA microarray-based detection of drug-resistant Mycobacterium strains: a single-center experience. Clin Microbiol Infect. 26 (10), 1400-1407 (2020).
  5. Li, J., et al. Comparative evaluation of DNA microarray and next-generation sequencing for Mycobacterium identification. Int J Infect Dis. 118, 250-258 (2022).
  6. Chen, K., et al. Optimizing probe design for DNA microarray-based Mycobacterium identification: a computational biology approach. BMC Microbiol. 19 (2), 120-129 (2019).
  7. Michelet, L., Boschiroli, M. L. Mycobacterium uberis. Microorganisms. 8 (11), 1701(2020).
  8. Imran, M., et al. DNA microarray technology for the detection and identification of Mycobacterium species: a review. J Microbiol Biotechnol Res. 6 (2), 275-285 (2020).
  9. Garcia-Sanchez, L., et al. Advances in DNA microarray technology for Mycobacterium detection and characterization. J Mol Diagn. 24 (5), 650-662 (2022).
  10. Wang, L., et al. Machine learning analysis of SERS fingerprinting for the rapid determination of Mycobacterium tuberculosis infection and drug resistance. Comput Struct Biotechnol J. 26 (20), 5364-5377 (2022).
  11. Wang, X., et al. Integration of DNA microarray data with clinical outcomes in tuberculosis patients: implications for personalized medicine. Mol Diagn. 16 (3), 150-160 (2024).
  12. Wang, X., et al. Rapid identification of Mycobacterium tuberculosis complex and common non-tuberculous Mycobacteria by DNA microarray chip. BMC Microbiol. 21 (1), 242(2021).
  13. Smith, J. D., et al. DNA microarray insights into Mycobacterium epidemiology and control strategies. J Clin Microbiol. 60, e02033-e02121 (2022).
  14. Garcia, L. M., et al. Tracking Mycobacterial spread via DNA microarray: a community-based study. PLoS One. 18 (3), e0282123(2023).
  15. Li, H., et al. Economic evaluation of DNA microarray chip technology in Mycobacterium diagnosis. Diagnostics. 11 (12), 2235(2021).
  16. Wang, Z., et al. Cost-benefit analysis of implementing DNA microarray chip for Mycobacterium detection in clinical settings. J Med Econ. 25 (1), 113-122 (2022).
  17. Liu, Y., et al. False positives and false negatives in DNA microarray chip detection of Mycobacteria: a comprehensive analysis. Microb Pathog. 149, 104671(2020).
  18. Chen, L., et al. Validation and improvement of DNA microarray chip for Mycobacterium identification: coping with genetic variants. Front Cell Infect Microbiol. 11, 627923(2021).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

PCR

관련 논문