자동 샘플 교환 로봇을 이용한 고처리량 직렬 단층촬영

Summary

다이아몬드 광원(DLS) I13-2 이미징 빔라인에서 자동 샘플 교환 로봇을 이용한 싱크로트론 기반 X선 단층촬영의 구현 세부사항과 데이터 수집 절차가 여기서 제시되고 논의됩니다. 이로 인해 빔라인의 처리량과 데이터 수집 효율이 크게 향상됩니다.

Abstract

이 원고는 로봇 팔을 이용한 샘플 교환을 통해 데이터 수집 효율성을 크게 향상시키는 자동화된 데이터 수집 워크플로우를 설명합니다. 이 장치는 다이아몬드 광원(DLS) I13-2 이미징 빔라인에서 싱크로트론 X선 영상을 위해 구현되었으며, 로봇을 이용해 고처리량 직렬 단층촬영(3D) 또는 영상(2D)을 구현합니다. 현재 많은 실험에서 수동 샘플 교환 및 정렬에 소요되는 시간은 단층촬영 자체와 비슷하거나 심지어 그 이상입니다. 사용 가능한 빔 시간을 최대한 효율적으로 사용하고 실험 처리량을 높이기 위해서는 샘플 교환 및 정렬 자동화가 필수적입니다. 로봇을 샘플 변환기로 사용하면 수동 절차에 비해 최소 4-10배 이상 처리량을 증가시킬 수 있으며, 이는 픽셀 크기를 선택하는 방식에 따라 다릅니다. 다이아몬드 II 기계와 I13L 빔라인 Operando Coherent TO모그래피 및 P타이코그래픽 I매깅(OCTOPI) 업그레이드를 통해 증가한 X선 플럭스는 실험 스캔 시간을 더욱 단축시켜 시스템의 효율성을 더욱 높일 것입니다. 더 나아가, 이 자동화는 원격 데이터 수집을 가능하게 하며, 사용자에게 선택적으로 우편 전달 서비스를 제공합니다. 자동 샘플 센터링은 완전 무인 스캔을 가능하게 하며, 원격으로 수행할 수 있습니다. 이는 시스템의 독특하고 혁신적인 특징입니다. 이 원고는 샘플 준비, 특수 홀더에 장착, 빔라인으로의 운반, 로봇 샘플 교환을 위한 전용 트레이에 배치하는 등 전체 절차를 설명합니다. 자동 샘플 센터링 절차와 이후 단층촬영 재구성 파이프라인을 제시합니다.

Introduction

자동화는 수십 년간 중공업에서 널리 사용되어^{왔습니다.} 하지만 로봇 하드웨어와 소프트웨어 개발은 유전체 시퀀싱, 병원 내 의료 수술, 화학 실험 수행 지원과 같은 매우 섬세한 작업도 수행할 만큼 충분히 성숙해^{졌습니다.} 자동화는 인간의 실수를 없애는 것뿐만 아니라 처리량과 효율성도 향상시킵니다^.

싱크로트론 X선 광원은 적외선부터 단색 X선까지 광범위한 스펙트럼 범위에서 매우 밝고 고도로 일관된 전자기 복사를 생성합니다. 이 소스들은 매우 짧은 스캔 시간과 높은 통계로 고처리량과 고해상도 영상 실험을 가능하게 합니다. 부분 코히어런스는 실험실 기반 X선 소스와 비교해 고분자나^{조직 샘플과} 같은 약하게 흡수되는 연질 물질에서 더 나은 대비를 얻는 데 활용될 수 있습니다. 실제 3D에서 물체를 시각화할 수 있는 완전한 X선 단층촬영 데이터 세트는 다양한 각도에서 샘플의 투영을 획득해야 합니다. 소스 밝기, 실험 하드웨어, 제어 장치의 발전으로 데이터 수집 시간은 수십 초에서⁸분 범위에 이릅니다. 그 결과, 샘플 로딩과 정렬은 단층촬영 자체보다 더 많은 시간이 소요됩니다^11,12. 싱크로트론 단층촬영 실험에서 샘플을 수동으로 교체하는 데는 스캔 시간에 비해 상당한 시간이 걸릴 수 있다는 점을 유의해야 합니다. 이는 실험 허치에 들어오고 닫을 때 방사선 안전 절차를 따라야 하기 때문입니다. 이 절차는 보통 몇 분이 소요됩니다. 또한 샘플 정렬에도 몇 분이 소요될 수 있습니다.

이 샘플 교체와 샘플 정렬 과정을 자동화하면 상당한 시간을 절약할 수 있습니다. 따라서 DLS 싱크로트론 시설의 I13-2 이미징 빔라인에 샘플 체인저 로봇이 구현되었습니다. 이 원고는 I13-2 이미징 빔라인^11,12에서 샘플 체인저 로봇을 이용해 다중 샘플을 대상으로 싱크로트론 X선 미세단층촬영 실험을 수행하는 전체 프로토콜을 설명합니다. 이 구현은 실험 시간의 효율성을 높일 뿐만 아니라 원격으로도 실험을 수행할 수 있게 합니다. 대안은 수동 또는 반자동 조작으로, 두 가지 모두 훨씬 느립니다. 여기서 반자동화란 샘플 정렬 없이 로봇을 샘플 교환에만 사용하는 것을 의미합니다.

자동화의 중요성은 다른 싱크로트론 이미징 빔라인에서의 자동화 프로젝트들에서 강조되며, 가장 유사한 프로젝트는 APS¹³의 2BM 빔라인, SLS TOMCAT 빔라인¹⁴, PETRA^{III 15}의 EMBL P14 빔라인, 그리고 카를스루에 공과대학교(KIT) 광원¹⁶의 IMAGE 빔라인에서 이루어졌습니다. 2-BM APS에서는 로봇으로 스캔해야 하는 시료를 표준 운동학적 마운트에 장착하며, 이 마운트는 한 번에 최대 60개 시료를 수용할 수 있는 시료 교환기 트레이에 배치됩니다. 그리퍼 암이 샘플을 채취해 회전 단계에 장착합니다. 하지만 샘플 정렬은 오프라인에서 입체경을 사용해 수행됩니다. 유사한 시스템이 SLS의 TOMCAT 빔라인에도 설치되었으나, 여기서는 완전 자동화되어 샘플 하중 하하 하역, 정렬, 관심 영역 스캔, 재구성 등이 가능합니다. 한 번에 스캔할 수 있는 샘플 수는 총 60개입니다. 최근 PETRA III¹⁵ 의 P14 빔라인에는 약 1mm 크기의 부드러운 생물 샘플을 처리할 수 있는 샘플 교환 시스템이 설치되었습니다. 위치 조정과 중심 맞추는 세 번의 클릭 중심 절차로 수행됩니다. KIT 내 IMAGE 빔라인에는 고처리량 영상/단층촬영 종단 기지가 있어^{2일 이내에} 최대 1,500개의 표본을 측정할 수 있습니다. 앞서 언급한 로봇 시스템과 달리, I13-2 이미징 빔라인 시스템은 현재 최대 8mm 직경의 샘플을 처리하고, 8시간 교대 근무 동안 최대 112개의 샘플을 인간의 개입 없이 자동 샘플 중심 조정 없이 측정할 수 있습니다.

현재 I13-2의 단층촬영 장비인 다이아몬드-맨체스터 이미징 빔라인은 언급된¹⁷호 출판물에 보고되었습니다. 완전성을 위해, 단층촬영 실험의 주요 측면을 여기에 요약하겠다; 그림 1도 참고하시기 바랍니다. 단층촬영 단계 스택은 샘플 조작과 회전축 기울기 정렬을 위한 육각대(PI miCos)로 구성됩니다. 육각대 상단에는 공기 베어링 회전 단계가 장착되어 있습니다. 회전 단계는 우수한 흔들림(<2.4 μrad)과 <100 nm) 축 오차를 가지고 있습니다. 단층촬영 검출기 시스템은 네 가지 다른 배율(또는 시야각)을 갖추고 있습니다. 이번 연구에서는 1.25×(유효 픽셀 크기 2.6 μm, 시각 6.7 mm x 5.6 mm)와 4×(유효 픽셀 크기 0.81 μm, 2.1 mm x 1.8 mm 시야각) 대물렌즈가 사용되었습니다. 1.25× 대물렌즈는 500 μm LuAg:Ce 섬광체를 사용했고, 4배 대물렌즈는 100 μm LuAg:Ce 섬광체(Crytur)를 사용했습니다. sCMOS 검출기(pco.edge 5.5)는 추가로 2배 사진 접안렌즈(모든 현미경 광학 장비는 올림푸스에서 제작)를 통해 확대된 섬광 스크린 이미지를 기록합니다. 유효 픽셀 크기는 2.6 μm에서 0.33 μm 사이이며, 최대 배율에서는 약 1 μm 해상도를 가집니다. 검출기 칩은 2560 x 2160 크기, 6.5 μm 픽셀 크기로 구성되어 있으며, 픽셀 배열의 최대 읽기 속도는 100 Hz입니다.

Protocol

참고: 이 연구는 런던 자연사 박물관(NHM)의 곤충 표본을 사용하여 비교 표현형 분석을 수행합니다. 표본은 자연사 박물관에서 표준 수집 절차를 따라 수집되어 합법적으로 수집되고 기증되었는지 확인했습니다.

1. 실험 계획

1. I13-2 빔라인에서 관심 샘플을 대상으로 단층촬영 또는 영상 실험을 수행하는 것이 가능한지 확인하려면 다음 링크를 통해 빔라인 스태프에 연락하세요: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. 다음 링크를 통해 계획된 실험을 수행할 시간대를 얻기 위해 제안서를 제출하세요: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. 제안이 승인되고 실험이 일정이 잡히면 빔라인 직원과 샘플 준비 및 샘플 측정 과정에 대해 논의하세요. 로봇을 이용한 실험에는 다음 섹션(2절)에서 제공하는 특정 요구사항이 있습니다.
4. 빔라인 스태프와 샘플 치수와 조성을 논의하여 빔라인에서 실험이 성공적으로 수행될 수 있는지 검증하세요.
5. 웹사이트(https://www.diamond.ac.uk/Users.html)의 안내를 따라 미리 실험 방문 준비를 시작하세요.
6. 실험 세션 전에 안전 교육을 완료하세요.

2. 샘플 준비 (로봇 실험용)

1. SPINE-호환 샘플 베이스¹⁸ 을 샘플 장착을 준비하세요. 각 샘플을 SPINE 스타일의 표준 샘플 베이스에 장착하고, 데이터 매트릭스 바코드가 장착되어 자동 샘플 추적을 가능하게 합니다.
2. 샘플을 베이스에 두 가지 구성 중 하나로 부착합니다. 핀 장착: 샘플을 SPINE 스타일 샘플 핀에 고정하세요(그림 1C, 인셋 참조). 용기 또는 직접 장착: 샘플을 마이크로 원심분리관/폴리이미드 튜브와 같은 호환 용기 안에 넣거나 샘플 베이스 위에 직접 넣습니다.
3. 로봇 그리퍼와의 치수 호환성을 확인하기 위해 장착된 샘플이 허용된 크기 범위 내에 있는지 확인하여 안전한 로봇 취급을 보장합니다( 그림 2 참조).
   옵션 A: 직경 8mm, 높이 20mm의 원통 안에 들어갑니다.
   옵션 B: 직경 3.5mm, 높이 33mm의 원통 안에 들어갑니다.
4. 두 구성 모두 샘플 베이스를 중심으로 하도록 하세요. 전체 높이(샘플 + 마운트 + 베이스)가 27mm 또는 40mm를 넘지 않도록 주의하세요.
5. SPINE 샘플 핀에 시료를 장착할 때는 시료가 핀 위에 위치하도록 하고, 핀 샤프트에 의해 어떤 부분도 가려지지 않도록 주의하세요. 샘플은 로봇 그리퍼와의 접촉을 방지하기 위해 핀 베이스에 수직 중앙에 장착되어야 합니다. 이는 프로토콜 2.3절에 설명된 옵션 B 마운팅과 샘플 핀 위에 장착되는 길게 늘어진 시료에 특히 중요합니다.
6. 용기나 튜브 안에 장착할 때는 샘플을 단단히 고정하여 운송이나 로봇 작업 중에 이동하지 않도록 해야 합니다. 용기 자체가 샘플 베이스 위에 수직으로 정렬되어 있는지 확인하세요.
7. 선택한 장착 요소(핀 또는 용기)를 시료 바닥에 고정하여 실험 내내 위치 안정성을 보장합니다.
8. 운송 중 분리를 방지하기 위해 신뢰할 수 있는 접착제나 고정 방법을 사용하고, 자동 조작 시 기계적 응력을 유발할 수 있습니다.
   참고: 일반적인 접착제로는 시아노아크릴레이트(순간접착제), 파라핀 왁스, 핫멜트 글루가 있습니다. 재료 호환성이 확실하지 않으면 빔라인 직원과 상담하세요.
9. 모든 샘플이 용기 상단 가장자리나 샘플 핀에서 일정한 높이에 위치해 있는지 확인하세요. 용기 안에 장착된 샘플의 경우, 모든 샘플에서 용기 벽과의 횡거리가 동일한지 확인하세요.
   참고: 일관된 위치 선정은 신뢰할 수 있는 자동 정렬을 위해 필수적입니다. 시야에 비해 샘플이 작을수록 허용 오차가 더 커집니다.
10. 각 샘플과 연관된 데이터 매트릭스 코드를 문서화하여 데이터 분석 시 정확한 샘플 식별을 보장합니다.
11. 각 샘플 이름을 샘플 베이스 데이터 매트릭스 코드와 연관시키고, 단층촬영 스캔 실행에 관련된 매개변수를 전달하는 samples.csv 파일을 생성하세요.

3. 샘플 포장 및 배송

1. 실험 세션 15영업일 이내에 실험 위험 평가(ERA)를 제출하고 모든 샘플을 그곳에 신고하십시오. 이 ERA는 샘플을 현장으로 운송하거나 반입하기 전에 DLS 보건안전(HSE) 그룹의 승인을 받아야 합니다.
2. 범용 샘플 베이스를 샘플 핀에 장착한 조합 저장 및/또는 운송 컨테이너(Uni-puck라고도 함)를 사용하세요. 우편으로 보낼 때 이 점이 매우 중요합니다.
3. 샘플이 3.2단계에서 언급된 저장 용기의 슬롯에 맞지 않는 경우, 샘플 베이스에 맞는 자기 보호 캡을 사용하고 샘플을 직접 측정을 위해 가져가는 등 대체 장착 방식을 사용해 주세요.

4. 실험 장치

1. 샘플의 대비를 최대화하도록 X선 소스 매개변수를 조정하세요. 이를 위해 전체 스펙트럼을 이동시키거나 X선 스펙트럼을 필터링하세요.
2. X선 스펙트럼과 주어진 샘플에 대해 원하는 위상 대비 정도를 바탕으로 카메라와 샘플 거리를 최적화하세요.
3. 샘플 크기와 필요한 시야각을 기준으로 현미경 배율을 선택하고 해당 현미경 대물렌즈를 선택하세요.
4. 카메라를 X선 빔에 대해 수평 위치(실험실 내 x축)로 정렬하세요.

5. 시료 하중 및 정렬

1. 각 실험 세션 시작 시 샘플과 샘플 마운팅 상태를 꼼꼼히 확인하여 손상되었거나 느슨하게 장착된 샘플이 있는지 확인하세요. 이러한 샘플이 있다면 사용자에게 알려주세요.
   참고: 현재 빔라인에는 최대 7개의 퍽을 장착할 수 있는 마운트가 설치되어 있으며, 각 퍽은 최대 16개의 샘플을 수용할 수 있습니다. 한 번의 로봇 가동 동안 총 112개의 샘플을 측정할 수 있습니다. 퍽 슬롯(핀) 위치를 식별하는 방법을 보여주는 보조 그림 2를 참고하시기 바랍니다.
2. 샘플은 samples.csv 파일에 표시된 퍽과 퍽 슬롯(핀)에 마운트합니다. 로봇 샘플 교환 절차를 몇 개 샘플에 대해 시행 연습을 수행하여 로봇의 작동 상태를 테스트하고 샘플이 요구되는 사양 내에 있는지 확인합니다.
3. 샘플 베이스와 샘플 핀(샘플 없음)을 사용해 회전 단계의 회전축을 검출기 중심에 수평 방향으로 정렬하세요.
4. 핀의 상단을 X선 카메라 중앙으로 옮기세요(그림 3A). 사진(그림 3)에서 보인 것처럼 빔과 90°로 세팅된 망원경 카메라(TC)를 시야각(FOV) 중앙에 맞추세요. 이 위치의 좌표를 TC 픽셀 좌표로 구합니다.
5. 샘플 정렬을 처리하는 스크립트에서 샘플 타겟 위치를 업데이트하세요.
6. 대표적인 샘플을 장착하세요. 자동 샘플 정렬 스크립트를 실행하여 샘플을 TC의 회전 중심에 배치하세요. 스크립트 링크는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.
7. 관심 시료 영역(ROI)이 X선 카메라의 시야각(FOV) 중앙에 있는지 확인하세요.
8. ROI가 FOV 중심에 있지 않다면, 5.5부터 5.7까지 단계를 반복하고 목표 위치의 좌표를 변경하여 샘플 정렬을 정교하게 조정합니다.
   참고: 4항과 5항은 4.2절을 제외한 지역 담당자가 수행합니다.

6. 데이터 수집 설정

1. DLS 파일 시스템에 필요한 파일/폴더 구조가 생성되어 원시 데이터, 메타데이터 파일, 분석 결과를 저장하는지 확인하세요.
2. samples.csv 파일을 6.1단계에서 언급한 폴더로 복사하세요.
3. 샘플 구조와 원하는 대비를 바탕으로 카메라 노출 시간과 samples.csv 내에서 획득할 투사 수를 업데이트합니다.
4. 모터 위치를 두 그룹으로 정의하는데, 이는 로딩 위치(LP)와 스캐닝 위치(SP)입니다. LP는 샘플 로딩을 위해 단계가 최적화된 세트이며, SP는 샘플의 단층촬영 스캐닝을 담당합니다.
   참고: 섹션 6은 로컬 연락처에 의해 수행되거나 DLS 시스템에 의해 자동으로 생성됩니다.

7. 데이터 수집 수행

1. samples.csv 파일에 지시된 대로 모든 샘플을 올바른 퍽과 핀 위치에 장착하세요.
2. 데이터 수집을 위해서는 DLS(https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html)에서 개발한 오픈소스 소프트웨어인 Generic Data Acquisition(GDA) 워크벤치를 사용하세요. 이 시스템은 DLS에서 실험을 제어하고 데이터를 수집하는 데 사용되는 Java 기반 시스템입니다. 보조 그림 1에 스크린샷이 제공되어 있습니다.
3. GDA에서 토모매틱이라는 객체를 사용해 자동 샘플 교환, 샘플 정렬, 단층촬영 측정을 수행합니다.
4. tomomatic.load 명령어를 발송하세요 (/dls/i13/data/year/... samples.csv) 파일을 불러오기 위해 GDA 터미널에서 진행합니다. 그 다음에 단단성 검사를 발행하세요. 명령을 실행하기 위해 스캔()
5. 로봇은 먼저 적재 트레이에서 샘플을 집어 레이저 바코드 리더기로 가져갑니다. 바코드를 읽으면 샘플을 단층촬영 단계로 옮겨 장착합니다. 전체 과정이 원활하게 진행되도록 하세요.
   참고: 여기서는 사내에서 개발한 플렉서 그리퍼를 장착한 야스카와 로봇을 사용하고 있습니다.
6. 시료 적재가 완료되면 단계들은 SP 위치로 이동합니다. 그 후 토모마틱 스크립트 내에서 autoCentrePin 함수가 실행되어 샘플을 회전 중심(COR)에 배치합니다. 로봇 샘플 교환기를 이용한 X선 단층촬영 측정이 이제 수행 준비가 완료되었습니다.
   참고: 토모마틱 문자의 의사 코드는 보충 파일 1 을 확인해 주세요.
7. 단층촬영 측정을 위한 TomoFlyscan 함수 실행을 수행합니다. 이 함수는 먼저 X선 빔이 없는 40개의 투영 이미지를 다크 이미지(DI)라고 하며, 샘플이 없는 X선 빔을 가진 40개의 이미지를 평평장 이미지(FI)라고 합니다. 이 이미지들은 데이터 재구성 시 이미지 정규화에 사용됩니다.
8. samples.csv 파일에 표시된 대로 샘플이 빔 내에 있는 시료를 대상으로 시료 회전 각도 간격으로 투영 이미지(PI)를 수집합니다. 현재 경우에는 3001개의 PI 이미지가 있습니다.
   참고: 7.5부터 7.8까지의 모든 단계는 인간의 개입 없이 차례로 진행됩니다.

8. 데이터 접근 및 분석

1. 적절한 파일 시스템과 폴더를 탐색하여 저장된 데이터에 접근하세요. 앞서 언급한 스캔 데이터는 두 개의 다른 파일에 저장되는데, 하나는 *.nxs, 하나는 *.hdf 파일(*은 숫자)입니다. 예를 들어 123456.nxs와 123456.hdf가 있습니다. NXS는 스캔을 위한 메타데이터를 포함하고, HDF는 모든 투영 이미지 데이터(NXS에서 연결된 데이터)를 포함합니다.
2. Savu 재구성 파이프라인¹⁹ 를 사용해 투사 이미지에서 2D 슬라이스를 생성하세요.
3. AVIZO/ImageJ와 같은 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 재구성된 이미지를 접근하고 시각화합니다.
   참고: 7조와 8절 완료는 사용자와 지역 연락처 모두의 협력 행동이 필요하며, 각자가 개별 하위 단계를 수행합니다.

Results

그림 1 은 다이아몬드 I13-2 이미징 빔라인에 설치된 야스카와 GP7 샘플 체인저 로봇을 보여줍니다. 그림 1A 는 로봇(1)과 사내 설계한 플렉서 그리퍼(2)를 보여줍니다. 이 그리퍼는 직경 ≤ 8mm의 샘플을 담을 수 있습니다. 그림 1B 는 단층촬영 데이터를 수집하는 데 사용되는 로봇(1)과 광학 및 X선 카메라 시스템(4), (6)을 보여줍니다. 로봇 그리퍼는 샘플 트레이(3)에서 샘플을 집으며, 이 트레이는 7개의 유니-퍽을 수용할 수 있고, 각 퍽에는 16개의 샘플이 있습니다. 그림 1C에 나와 있습니다. 샘플은 알루미늄 막대에 장착되며(5), 단층촬영 데이터 수집은 검출기 시스템(6)으로 수행됩니다. (5)와 (6)의 세부 내용은 서론 마지막 단락에 제공되어 있습니다. 그림 1B 의 빨간 끊어진 선은 X선 빔 방향을 나타냅니다.

샘플 장착 방식과 플렉처 그리퍼 설계에 대한 세부 사항은 그림 2에 나와 있습니다. 그림 2A 는 3D 프린팅으로 제작된 원통형 플라스틱 샘플을 샘플 베이스에 접착한 모습입니다. 시료의 경계는 최대 시료 높이와 직경의 외피를 나타냅니다. 빨간 화살표는 플렉셔 그리퍼가 샘플 베이스를 고정하여 샘플 트레이에서 단층촬영 단계로, 또는 그 반대로 이동시키는 위치를 나타냅니다. 플렉서 그리퍼의 3D 설계는 그림 2B에 나와 있습니다. 그리퍼의 핑거는 공압식 구동관에 의해 작동됩니다(그림 1B, 항목 2). 그리퍼 중앙 공간의 직경은 8.9mm이며, 그림 2C에 나타난 대로 최대 샘플 크기는 8mm이고 여유는 ~1mm입니다. 그림 2D 는 단층촬영 단계 상단 사진을 보여줍니다. 알루미늄 도웰이 두 개의 직교 단계 위에 장착되어 있고, 샘플 베이스 하단의 홈이 들어갈 수 있도록 정확한 직경의 자기 디스크가 장착되어 있습니다. 이 디스크는 자성적이기 때문에 단층촬영 측정 시 장착된 샘플 베이스를 단단히 고정합니다.

이 대표 실험을 위해 런던 자연사 박물관(NHM)에서 제공한 64점의 곤충 샘플이 선정되었습니다. 표본은 그리퍼의 크기 제약 내에서 다양한 절지동물 표현형을 대표하도록 선정되었습니다. 절지동물, 특히 곤충이 알려진 종 다양성의 대다수를 차지하며, 100만 종이 넘는 이름 붙여진 종이 있기 때문에, 표현형 비교 연구를 위해 표본을 채취하는 것이 특히 어렵습니다. 따라서 본 표본은 세 가지 절지동물 분류군인 아라크니다, 엔토그나타, 곤충 내에서 더 정밀하게 샘플링하여 오늘날 가장 종이 풍부한 네 개의 목을 포함해 7개 목의 변이를 포착함으로써 이 접근법의 잠재력을 보여줍니다. 표본은 접착제로 카드에 고정되었습니다. 그 후 카드는 샘플 핀에 장착되었습니다. 샘플(곤충)을 샘플 핀에 직접 장착하는 것은 피하는 것인데, 흡수율이 낮은 빔 내 구조가 재구성 시 줄무늬 인공물을 만들 수 있고, 샘플 핀에 안전하게 장착하는 것도 어렵기 때문입니다. 표 1은 사용자가 단층촬영에 필요한 매개변수(열: A, B, C, E, F, G, H, K)를 입력할 템플릿 samples.csv 파일을 보여줍니다. 각 열의 설명은 표에 제공되어 있습니다. input_file의 D, I, J, L 열은 빔라인에서 단층촬영 매개변수의 정렬과 최적화 후 채워집니다. 64개 샘플 모두 처음에는 1.25배 대물렌즈(시야구 6.7mm x 5.6 mm)를 기준으로 최적화된 X선 전파 거리(샘플에서 검출기까지)에서 측정했으며, 이후 동일한 샘플을 4배 대물렌즈로 자체 최적화된 매개변수로 측정했습니다. 샘플이 샘플 트레이에 적재되고 실험용 허치가 고정되면, GDA로 스캔이 시작됩니다.

샘플의 자동 정렬은 파이썬으로 작성된 스크립트(GitHub 내 파일 위치: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc)로 수행되었습니다. 처음에는 샘플 베이스와 샘플 핀 조합을 사용하여 샘플 정렬을 설정합니다. 그림 3은 측면 망원경 카메라(X선 빔에 90° 위치)에서 본 샘플 핀을 보여주며, 표준 정렬 샘플로 사용됩니다. 망원경 카메라 이미지는 이분법되어 배경에서 샘플을 탐지할 수 있습니다. 샘플의 가장자리는 그림 3에 나타난 흰색 경계로 표시되어 표시됩니다. 샘플의 기준 좌표 위치는 그림 3A의 삽입 부분에 흰색 원으로 표시된 핀의 상단입니다. X선 이미지를 보면, 시료의 ROI가 COR에 위치하고, 필요한 목표 좌표 위치는 파란색 쌍두 화살표 십자선과 빨간 점(그림 3B)으로 측면 카메라에 표시됩니다. 이 목표 위치 설정은 샘플을 COR뿐만 아니라 필요시 몇 mm 높게, 아래, 또는 약간 중심에서 벗어나게 배치할 수 있게 해줍니다. 샘플이 단층촬영 단계에 적재된 후, 자동 중심 조정 기능이 실행됩니다. 스크립트는 먼저 샘플을 목표 위치(그림 3B)로 이동시키고 0°로 이동합니다. 다음으로 시료를 90°로 이동시키고(그림 3C), 시료를 회전 중심(COR)에 넣기 위해 얼마나 이동해야 하는지 결정합니다. 이 과정은 보통 15-20초 정도 걸립니다. 샘플은 이제 COR에 위치해 있으며(그림 2D), COR은 이미 카메라 중심과 정렬되어 있습니다. 시스템은 이제 단층촬영 촬영이 가능하다.

이 NHM 곤충 연구에서는 인간의 개입 없이 128회의 단층촬영 스캔이 수행되었습니다. 측정은 총 17시간이 걸렸습니다. 각 스캔 시간은 약 8분 정도였어요. 로봇 없이 이런 실험은 단층촬영 한 번 한 번 약 20분에서 25분 정도 걸렸을 것입니다. 이는 로봇을 이용한 단층촬영이 현재 경우에 수동 스캔보다 3-4배 빠르다는 것을 의미합니다. 표 2는 로봇 배치 스캔 종료 시 생성된 일반적인 로그 파일을 보여주며, 각 스캔 번호를 해당 샘플과 연결하는 데 필요한 매개변수를 포함합니다. 추가 세부사항은 표 2 범례에 제공되어 있습니다.

그림 4는 앞서 언급한 단층촬영 실험 중 1.25배와 4배 배율로 촬영된 샘플 중 하나인 곤충(곤충류, 딱정수리목)의 정규화된 투사 이미지를 보여줍니다. 맨 위 행인 그림 4A-C는 1.25배로 촬영된 샘플을 보여주고, 같은 샘플이 4배로 촬영된 그림 4D-F를 보여줍니다. 그림 4 A–F는 0°, 90°, 180°에서 획득한 투사 이미지를 보여줍니다. 노란색 직사각형은 4배 대물렌즈로 촬영된 확대된 투사 이미지의 FOV를 보여줍니다. 샘플이 그림 1C에 표시된 트레이에 적재된 후 모든 과정은 어떠한 인적 개입 없이 진행되었다는 점도 중요합니다. 이 두 스캔은 ~8.5시간 간격으로 촬영되었다는 점을 참고해 주세요. 이는 설정의 안정성과 재현성을 나타냅니다.

그림 5 는 그림 4에 언급된 샘플의 단층촬영 재구성 단면 집합에서 수평 또는 횡단 단면을 보여줍니다. 1.25배(그림 5A) 와 4배(그림 5B) 슬라이스는 모두 이미지를 자르지 않고 플롯되었으며 2510 x 2510 픽셀을 가집니다. 슬라이스는 FOV 내에서 잘 중심에 위치해 있어, 물리적 개입 없이도 더 높은 배율로 영역을 확대할 수 있음을 보여줍니다.

여기 제시된 결과는 동기 마이크로 단층촬영 실험에서 샘플 교환을 위한 로봇 시스템을 구현하는 것이 여러 가지 중요한 이점을 제공함을 보여줍니다. 여기에는 처리량 증가, 운영 효율성 향상, 그리고 인간의 개입 없이도 다중 배율(줌인)으로 스캔을 수행할 수 있는 능력이 포함됩니다. 여기 제시된 NHM 연구처럼 스캔해야 할 샘플 수를 고려할 때, 수동 스캔만으로는 통계적으로 견고하고 일관된 결론을 얻는 것은 불가능합니다.

그림 1: 로봇과 I13-2 빔라인에 설치된 단층촬영 실험 장치의 사진. (A) 자체 설계 플렉슈어 그리퍼가 장착된 로봇 (1) (B) 샘플 로딩 트레이(3)와 단층촬영 단계(5). 광학 카메라(망원경 카메라), (4)로 표시됨, 시료를 COR에 정렬하는 데 사용됩니다. 측정에 사용되는 검출기 시스템(6)은 시야각을 자동으로 변경할 수 있는 여러 개의 모터 구동 대물렌즈와 pco.edge 5.5 검출기를 포함하고 있습니다. 빨간색 점선 화살표는 X선 빔 방향을 나타냅니다. (C) 7개의 팩이 있는 샘플 로딩 트레이 사진으로, 각 팩은 샘플 베이스와 샘플 핀을 조합해 최대 16개의 샘플을 장착할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 샘플 장착 방식과 플렉서 그리퍼 설계에 대한 세부 사항. (A) 플렉처 그리퍼가 처리할 수 있는 최대 샘플 외피를 나타내는 3D 프린팅 플라스틱 더미 샘플의 사진. 빨간 화살표는 그리퍼가 샘플 베이스를 잡는 위치를 나타냅니다. (B) 플렉처 그리퍼의 3D 설계. 그리퍼의 손가락은 샘플 베이스를 잡거나 놓기 위해 작동됩니다. (C) 치수가 표시된 그리퍼 수직 단면 도면. 중앙의 최대 개구부는 8.9mm이며; 따라서 최대 허용 샘플 크기는 ≤ 8mm입니다. (D) 단층촬영 단계 상단 사진. 알루미늄 막대(파란색 화살표로 표시)는 두 개의 직교 단계 상단에 장착되어 있습니다. 자기 디스크가 막대 상단에 고정되어 있으며, 샘플 베이스(샘플과 함께)는 그리퍼에 의해 위치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: 측면 망원경 카메라를 사용한 COR 정렬 절차 비디오 그래프에서 캡처한 스냅샷. (A) 정렬 루틴 시작 직전 정렬 핀 사진. 파란색 이중 십자가와 중앙에 빨간 점이 목표 위치이며, 이는 단층촬영 회전 단계의 COR과 일치합니다. 삽입 이미지는 핀 상단의 확대 이미지로, 검출된 샘플 중심을 높이와 너비 모두에서 보여줍니다. (B) 핀이 0° 목표 위치에 정렬됨. (C) 핀이 90°로 회전했는데, 목표에서 벗어난 위치입니다. (D) 핀이 목표 위치에 90°로 정렬됨. 이제 핀은 두 방향 모두 직교 방향으로 정렬됩니다; 따라서 시료는 카메라 중심에서 회전하게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 1.25배와 4배 대물렌즈로 수집한 곤충의 정규화 투영 이미지. 이 곤충은 박쥐목(Coleoptera)에 속했습니다. 이는 128건의 단층촬영 중 두 건을 의미합니다. 곤충은 종이에 붙여져 샘플 핀에 부착되었습니다. 1.25배 대물렌즈 투영 이미지는 (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, 4x 영상은 (D) 0°, (E) 90°, (F) 180°에서 투영됩니다. 1.25배 및 4배 단층촬영 촬영 세트는 인간의 개입 없이 단일 세션에서 수집되었습니다. 1.25배 이미지 세트는 샘플의 전체 뷰를 제공하며, 4배 이미지 세트는 줌 기능을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 5. 서로 다른 두 시야를 사용해 얻은 동일한 단층 촬영 단층 단면의 비교. 그림 4에 표시된 투사 이미지의 단층촬영 단층 단면으로, (A) 1.25배 및 (B) 4배 배율로 표현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 사용자가 제공하는 일반적인 samples.csv 파일 중 단층촬영 매개변수를 포함합니다. 이 파일은 데이터 수집에 사용되는 토모마틱 Python 스크립트로 읽힙니다. A열(샘플 설명), B(퍽 ID), C(퍽 내 슬롯), E(단층촬영 회전 단계), F(FI 수), G(DI 수), H(사용할 배율), K(슬롯 우선순위) 열을 사용자가 입력합니다. D열(노출 시간), I열(샘플과 카메라 간 X선 전파 거리), J열(카메라 빔을 가로질러 COR을 카메라 중심에 배치하는 이동), L열(샘플 베이스의 바코드)은 정렬 및 예비 최적화 후에 채워집니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 모든 샘플이 스캔된 후 Output_file.txt 상태로 저장되는 일반적인 출력 로그 파일. 이 파일은 모든 입력 매개변수를 보고하며, 추가로 스캔된 샘플의 바코드(열, 열, 그리고 광산을 수집하는 데 사용되는 모터의 위치(열)를 제공합니다. 기본적으로 이 출력 파일은 데이터 재구성 및 분석에 필요한 정보를 제공합니다. 입력 파일의 A 열에는 입력이 없었기 때문에, 이 열에는 현재 스캔 개수와 퍽 및 핀 번호가 채워집니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 샘플 체인저로서 로봇을 조작하는 스크립트를 설명하는 의사코드. 이 파일에는 자동 샘플 마운팅, 데이터 매트릭스 코드 읽기, 자동 샘플 정렬, 단층촬영 실행의 루틴이 설명되어 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

보조 그림 1: 일반 데이터 수집 GUI 스크린샷. 이 인터페이스는 기본 카메라 파라미터 조정, 샘플의 실시간 시각화, 단층촬영 획득 시작을 가능하게 합니다. 스캔은 화면 버튼(수동 스캔 전용)이나 스크린샷 하단 중앙의 노란색 사각형으로 표시된 커맨드라인 인터페이스를 통해 시작할 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: SPINE 표준 퍽(왼쪽)과 퍽 캡(오른쪽) 사진. 샘플 베이스가 장착되는 핀 위치는 빨간색으로 표시되어 있으며, 중앙 홀딩 포스트의 노치 맞은편 위치부터 번호가 매겨집니다. 숫자 7267(흰색으로 표시됨)은 퍽 식별 번호입니다. 퍽 캡은 운송 또는 보관 중 샘플을 보호하기 위해 퍽에 장착할 수 있습니다. 캡을 장착하기 전에 샘플 크기가 호환되는지 꼭 확인하세요. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

샘플 준비와 샘플 정렬은 자동 샘플 교환 로봇이 올바르^{고 효과적으로 작동}하기 위한 두 가지 중요한 단계입니다. 샘플 크기와 장착 요구사항은 2절(프로토콜)에 명시되어 있습니다. 기본적으로 시료 직경은 8mm 이하여야 하며, 시료^{베이스 12}에 잘 중심에 맞춰져 있어야 합니다. 이 제약은 그리퍼 치수에 의해 설정됩니다. 또한, 단일 측정에서 모든 샘플이 동일한 높이에 있어야 하며, 그래야 모든 샘플이 회전 중심에 위치해 일관됩니다. 로봇이 실험을 위해 정렬된 경우, 샘플 체인저 로봇으로 또 다른 실험을 실행하는 것은 샘플의 관심 영역 설정을 제외하고는 완전히 자동화됩니다. 이는 대표성 결과 섹션( 그림 3)에서 설명되어 있습니다. 또한, 이는 빔라인 스태프(로컬 컨택트)가 수행하는 정렬 과정의 일부임을 유념해야 합니다. 이 설정이 완료되면 모든 샘플 측정은 인간의 개입 없이 수행됩니다. 사용자 입장에서는 측정이 완전히 자동화되어 있습니다. 현재까지 Molecular Dimensions Ltd의 샘플 베이스와 샘플 핀만 사용되고 있으며; 하지만 MiTeGen과 Hampton Research와 같은 다른 공급업체들이 SPINE 스타일의 샘플 베이스와 샘플 핀을 생산합니다.

최대 직경 12mm의 샘플을 고정할 수 있도록 설계된 더 큰 샘플 그리퍼가 현재 개발 및 시험 중에 있습니다. 이를 통해 로봇은 마이크로 원심분리기 튜브 안에 넣어 샘플 베이스에 장착하는 등 더 큰 샘플을 처리할 수 있습니다. 개선된 그리퍼 설계는 샘플에 측면에서 접근하는 메커니즘을 포함할 수 있어, 현재 샘플 크기에 대한 제한을 제거할 수 있습니다. 더 나아가, 빔라인을 업그레이드하면 처리량이 한 자릿수 배 증가하여 하루 3,000개 이상의 샘플을 스캔할 수 있게 됩니다. 이를 통해 빔타임 10일 이내에 약 30,000개의 샘플로 구성된 통계적으로 유의미한 데이터셋을 수집할 수 있습니다. 가까운 미래에 HTTomo라는 새로운 단층촬영 재건 파이프라인을 도입할 예정입니다.

빔 전파 거리(샘플에서 검출기 거리), 노출 시간, 투사 수 등과 같은 매개변수는 다른 모든 싱크로트론 X선 단층촬영 실험과 마찬가지로 사전에 최적화되어야 한다는 점을 유념해야 합니다. 또 다른 제약 조건은 6축 샘플 조작, 단층촬영 단계, 카메라 조작 단계와 같은 실험에 관련된 단계들이 샘플 적재 및 하역 시 특정 위치에 있어야 한다는 점입니다. 이는 시료 적재 및 하역 시 단계를 앞뒤로 이동해야 함을 의미합니다.

결론적으로, 고처리량 단층촬영은 시료 교환 로봇의 도움으로 수행할 수 있어 수동 조작에 비해 최소 4-10배 더 빠르게 진행되고 데드 타임을 줄이거나 없앨 수 있습니다. 로봇을 이용한 실험적 자동화는 측정을 수행하는 데 필요한 인원이 줄어들어 인력을 더 효율적으로 배치할 수 있게 해줍니다. 통계적으로 유의미한 데이터 세트 측정은 신뢰할 수 있고 충분한 양의 데이터가 필요한 많은 과학 분야에서 중요합니다. 로봇을 사용하면 이런 작업에 큰 도움이 됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
에어 베어링 회전 스테이지	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	단층 촬영 회전 스테이지
AVIZO	ThermoFisher scientific		상용 데이터 시각화 및 분석 소프트웨어
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	대체 CryoCap 공급업체
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	대체 CryoCap 공급업체
Cryocaps( MD7-401) 및 Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	샘플 장착에 사용
검출기 광학	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	목적 및 사진 눈
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	일반 데이터 수집 소프트웨어
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	단층 촬영 정렬 및 샘플 조작을 위한 6축 스테이지
ImageJ	국립 보건원, 위스콘신 대학에서 개발됨	https://imagej.net/ij/	오픈 소스 이미지 처리 및 시각화 소프트웨어
pco.edge 5.5 sCMOS 카메라	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	단층 촬영 이미지에 사용되는 X-ray 카메라
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	단층 촬영 재구성 파이프라인
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	신틸레이터 광학
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	샘플은 로봇이 픽업할 수 있도록 Uni-puck에 장착됨