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방법 논문

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)

1.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68274

⸱

2025년 7월 3일

 ,  , 
1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

이 논문에서

요약

이 기사에서는 내부, 환형 및 외부 영역에서 맞춤형 전기 전도성을 가진 소포 내 소포 구조를 가진 화합물 cGUV(Giant Unilamellar Vesicles)를 준비하는 방법을 제시합니다. 전기형성은 삼투압 충격을 통해 구강세포와 cGUV로 변형되는 간단한 GUV를 합성하여 핵이 있는 세포의 생물물리학을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다.

초록

단순 거대 단층 소포(sGUV)는 미크론 크기의 구형 소포로, 내부에 수용액을 둘러싸고 다른 수성 매질에 부유하는 지질 이중층으로 구성됩니다. 생물학적 세포의 생체 모방 모델인 sGUV는 생물물리학 연구를 위한 잘 정립된 시스템입니다. 그러나 sGUV는 주로 무핵 세포를 모방하여 비핵 세포에 대한 모델로서의 적용을 제한합니다. 우리는 핵이 있는 세포에 대한 보다 적절한 생체 모방 모델로 복합 Giant Unilamellar vesicles(cGUV)를 제안합니다. cGUV는 소포 내 소포 구조로, 외부 및 내부 소포 이중층은 각각 세포와 세포의 핵막을 나타내는 것으로 가정할 수 있습니다.

이 연구에서는 cGUV를 합성하는 간단한 방법을 설명합니다. 간단히 말해서, sGUV는 전기 형성 방법을 통해 자당 매질에서 37-43 mol% 범위 내의 DMPC와 콜레스테롤의 지질 조성을 사용하여 생성되었습니다. 그런 다음 이러한 sGUV는 긴장성 포도당 용액을 도입하여 삼투압 쇼크를 가하여 즉시 체성 세포 모양으로의 전환을 유발했습니다. 이 과정은 외부 소포와 내부 소포가 목을 통해 연결된 상태로 유지되는 중간 상태의 형성으로 이어졌으며, 궁극적으로 cGUV라고 하는 소포 내 소포 구조의 발달을 초래했습니다.

또한, 이중층에서 더 높은 콜레스테롤 수치로 제조된 GUV는 이온 투과성이 감소하는 것으로 알려져 있습니다. 이 특성은 수화 매체의 전도도, 고긴장성 포도당을 통한 내부 용액 및 전도성 매체의 첨가를 조정하여 희석 또는 전도성 매체의 첨가를 조정하여 외부 용액의 전도도를 조정하여 cGUV의 환형 용액에서 전도도를 조정할 수 있도록 하여 결과적인 cGUV를 외부, 환형 및 내부 영역에서 제어된 전도도를 갖는 결과 cGUV를 만듭니다. 전기장 연구와 관련이 있습니다. 우리는 진핵생물, 핵이 있는 세포의 생체 모방 모델로 사용할 수 있는 복합 소포를 합성하기 위한 효율적이고 간단한 접근 방식을 제안하여 생물물리학 연구에서의 응용을 발전시킵니다.

서론

생체 모방 모델은 세포막의 복잡한 생물물리학적 현상을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 이러한 가장 간단한 생체 모방 모델은 생물학적 세포에 존재하는 수많은 변수의 간섭을 최소화함으로써 귀중한 통찰력을 제공합니다. 거대 단층소포(GUV)는 막 생물물리학 1,2을 연구하는 데 사용되는 기초 생체 모방 시스템입니다. GUV는 세포막의 대표적인 모델로 잘 확립되어 있습니다. 이들은 직경이 10-30μm 인 단일 구형 지질 이중층으로 구성되며 수용액에 캡슐화되어 현탁됩니다. 이 문서에서는 이러한 sGUV라고 합니다. 이러한 시스템은 상향식(bottom-up) 접근법을 사용하여 구성되며, 지질, 단백질 및 촉매와 같은 필수 세포 구성 요소가 결합되어 생물학적 막의 구조와 기능을 모방합니다 3,4.

내부에 수핵만 있는 단순한 sGUV가 일반적으로 사용되지만, 생물학적 세포의 특정 기능을 복제하기 위해 더 발전된 모델이 개발되었습니다. 예를 들어, 액틴이 지지되는 구조를 가진 GUV는 세포골격 5,6,7을 모방하는 반면, 고염 환경은 생리학적 조건을 모방하는 데 사용됩니다. 더 높은 염 환경은 생리학적 조건을 모방하지만 전기 형성 8,9와 같은 전통적인 방법은 종종 이러한 조건에서 미크론 크기의 GUV를 합성하는 데 적합하지 않기 때문에 GUV에서 이를 얻기가 어렵습니다. 수화 중 이중층 팽창을 돕기 위해 고분자 또는 전분 젤을 사용하는 겔 보조 방법과 같은 새로운 방법은 이러한 한계를 해결합니다10,11. 마찬가지로, sGUV의 형태학적 변화는 연구되었다12. 캡슐화된 액틴(encapsulated actin), 미세소관(microtubules) 및 기타 세포골격 성분(cytoskeletal components)과 같은 다양한 강성의 닫힌 필라멘트와 열린 필라멘트의 추가와 그 내부의 삼투압 응력 조건은 이러한 삼투압적으로 수축되었지만 초기에는 준구형 소포의 형태학적 전이에 영향을 미칩니다. 이론적 분석은 관형, 구형, 라켓형, 체리형, 물방울 구조를 포함한 다양한 형태학적 변형을 보여주며, 이는 실험적 관찰12와 잘 일치한다. 이러한 발견은 세포와 소포 내의 필라멘트, 미세소관 및 나노고리의 조직을 이해하는 데 중요한 의미를 갖습니다. 다른 연구에서는 단백질 캡슐화 방법을 검토하고 캡슐화된 액틴, 미세소관 및 세포골격 성분이 삼투압 수축된 소포의 모양을 조절하는 방법을 탐구합니다12,13.

또한, 진핵 세포 구조에서 영감을 받아 복잡한 GUV 기반 모델을 개발하여 핵분열 및 세포 분열, 진핵 세포의 번식 및 다구획 특징, 자가 증식 세포 14,15,16,17 및 다구획 세포를 유사한 인공 모델의 개발을 위해 개발됩니다. 구조적 응용 외에도 GUV는 적용된 전기장이 Maxwell 응력으로 인해 지질막에 기공 형성을 유도하는 과정인 세포 전기천공을 이해하기 위해 선택된 모델이기도 합니다. 생물학적 세포와 비슷한 치수를 가진 GUV는 전기장 하에서 전극 형성 및 electroporation을 나타냅니다. GUV에 대한 이러한 연구는 멤브레인 커패시턴스 및 굽힘 강성18 과 같은 전기 기계적 특성과 전기 천공법 메커니즘 2,19,20에 대한 통찰력을 제공합니다. 그러나 실질적으로 이러한 연구는 적혈구(RBC)와 같은 핵 세포를 가장 잘 대표합니다.

이 간극을 메우기 위해 우리는 핵 진핵 세포에 대한 새로운 생체 모방 모델로 복합 거대 단층 소포(cGUV)를 제안합니다21,22. 이 소포는 소포 내 소포 구조를 가지고 있으며, 내부 이중층은 핵막을 모방하고 외부 이중층은 원형질막을 나타냅니다. 또한, 내부, 환형 및 외부 영역의 전기 전도성이 마이크로 매니퓰레이터 또는 마이크로 주사기와 같은 고급 기기 없이 어떻게 변조될 수 있는지 보여줍니다. cGUVs 합성에 대한 이러한 단순화된 접근 방식은 핵이 있는 세포에 대한 생물물리학 연구를 발전시키기 위한 유망한 플랫폼을 제공합니다.

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프로토콜

1. 지질 혼합물 용액의 제조

  1. DMPC와 콜레스테롤의 1mL 용액을 5mg/mL의 최종 농도에서 63:37 몰비로 준비합니다. 이를 위해 DMPC 149μL(클로로포름에 용해된 상태로 받은 25mg/mL 스톡), 252μL의 콜레스테롤(클로로포름에 용해된 5mg/mL 콜레스테롤) 및 599μL의 클로로포름을 추가합니다.
  2. DMPC의 또 다른 1mL 용액을 준비합니다: 5mg/mL에서 57:43 몰비의 콜레스테롤, 139.8μL의 DMPC(클로로포름에 용해된 25mg/mL 스톡), 301μL의 콜레스테롤(5mg/mL, 클로로포름에 용해된 분말로 준비) 및 559.2μL의 클로로포름을 혼합합니다.
  3. 지질 이중층을 염색하려면 100μL의 나일 레드(5mM 원액에서 추출)를 DMPC와 콜레스테롤을 함유하는 지질 혼합물 1mL에 63:37 몰비로 추가합니다(단계 1.1 및 1.2에 설명). 또는 30μL의 Liss Rhod-PE(Liss Rhod-PE 스톡 1mg/mL)를 준비된 지질 혼합물 1mL에 추가합니다(단계 1.1 및 1.2에 설명).
    참고: 용매(클로로포름)는 휘발성이 높기 때문에 원액(DMPC 25mg/mL)을 사용하기 위해 바이알을 반복해서 개봉하면 농축되어 조성이 변경될 수 있습니다.

2. 단순 거대 단층 소포(sGUV)를 합성하기 위한 전기형성 프로토콜

  1. ITO(Indium Tin Oxide) 코팅된 슬라이드를 주방 세제 용액으로 철저히 세척하고 탈이온수(0.055μS/cm)로 헹굽니다. 100% 에탄올 용액으로 슬라이드를 청소하고 탈이온수로 헹구고 85°C의 오븐에서 건조시킵니다.
  2. Clampmeter를 사용하여 ITO 코팅 슬라이드의 전도성을 식별합니다. 세척된 ITO 코팅 슬라이드를 스핀 코터 스테이지에 전도성 면이 위를 향하도록 진공 청소기를 사용하여 고정합니다.
  3. 25μL의 지질 용액(1.1단계에서 준비)을 ITO 슬라이드의 전도성 면에 용액 4방울을 주조하여 적용합니다. 그런 다음 다른 ITO 슬라이드를 가져와서 ITO 슬라이드의 전도성 면에 용액 4방울을 주조하여 25μL의 지질 용액(1.2단계에서 준비)을 적용합니다.
  4. 지질로 코팅된 두 슬라이드를 모두 최소 2시간 동안 어두운 곳에 보관하는 데시케이터에서 진공 건조합니다.
    알림: 빛으로부터 보호하면 가능한 화학적 변화로부터 지질을 보호할 수 있습니다.
  5. 지질로 코팅된 ITO 슬라이드(1.1단계에서 준비한 지질로 코팅됨)를 전도성이 있는 면이 서로 마주보고 그 사이에 3mm 두께의 실리콘 고무 스페이서를 사이에 두고 다른 깨끗한 ITO 슬라이드와 병렬로 배열합니다. 클램프로 어셈블리를 밀봉하여 안전한 전기 형성 챔버를 만듭니다.
  6. 1.2단계에서 준비한 지질 용액이 함유된 ITO 코팅 슬라이드에 대해 2.5단계에서 설명한 것과 동일한 절차를 수행하여 전기형성 챔버를 형성합니다.
  7. 38-40 ° C로 유지되는 인큐베이터에 두 챔버를 모두 놓고 2 mL 주사기를 사용하여 100mM의 자당 용액으로 챔버를 채 웁니다. 듀얼 채널 함수 발생기를 사용하여 4시간 동안 10Hz 주파수에서 5Vpp의 AC 전기장을 적용합니다.
    알림: ITO 슬라이드의 전도성 면이 올바르게 clamp함수 발생기와 연결하는 악어 클립에 ed.
  8. 함수 발생기에서 전기형성 챔버를 분리합니다. 인큐베이터에서 챔버를 제거하고 실온으로 식히십시오. 주사기를 사용하여 두 챔버에서 합성된 sGUV를 채취하여 각각 2mL 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 삼투압 충격을 가하기 전에 실온(25-27°C)에서 1시간 동안 배양합니다.

3. 삼투압 충격(sGUV-to-Stomatocyte-to-cGUV)의 형태 전이

  1. 100mM 자당 용액이 포함된 수화 매체에 부유하는 200μL의 sGUV를 관찰 챔버로 옮깁니다.
  2. 관찰 챔버 내에 200μL의 100mM 자당을 포함하는 이 sGUV 현탁액에 125μL의 포도당 용액(300mM)을 도입하여 sGUV의 형상 전이를 시작하는 삼투압 충격을 유도합니다.
    참고: 삼투압 충격에 의한 형상 전이를 위해 1.1단계 및 1.2단계에서 제공된 지질 조성물로부터 sGUV 합성을 위해 동일한 절차(3단계에서 제공)를 따릅니다.
  3. 삼투압 충격으로 인한 sGUV를 현미경 스테이지에 배치된 관찰 챔버에서 1시간 동안 휴지시킵니다.
  4. sGUVS의 형태 전이를 수행하고 관찰하려면 관찰 챔버(전기 융합 챔버, 페트리 접시, 오목한 슬라이드 또는 현미경 관찰에 사용할 수 있는 기타 챔버)를 도립 현미경의 스테이지에 놓고 소포가 가라앉도록 합니다.
  5. 챔버 내에서 발생하는 형상 전이를 모니터링합니다. Plan fluor, ELWD 20x/0.45 및 Plan fluor, ELWD 40x/0.60 대물렌즈 렌즈와 함께 DIC(Differential Interference Contrast) 및 epifluorescence microscopy를 사용하여 sGUV의 형태 전이를 관찰합니다.
  6. 전이 중 구강 소포의 형성을 관찰합니다. 시간이 지남에 따라 더 큰 소포가 바닥에 가라앉고 더 작은 소포의 수가 증가함에 따라 챔버를 모니터링합니다.

4. cGUV의 내부, 환형 및 외부 영역에서 전도도 수정

  1. sGUV에 삼투압 충격을 주기 전에 적절한 양(μL)의 7.5mM 원염 용액을 추가하여 cGUV의 다른 영역(내부, 환형 및 외부)에 있는 용액의 전도도를 조정합니다.
    1. 예를 들어, 환형 영역과 비교하여 외부 및 내부 영역에서 더 높은 전도성을 생성하려면 200μL의 자당 용액을 전기 융합 챔버로 전달합니다. 챔버에 20μL의 7.5mM 염 용액을 추가합니다. 125μL의 300mM 포도당 용액을 첨가하여 삼투압 쇼크를 유도합니다.
    2. 삼투압 충격을 받은 sGUV를 3-4시간 동안 그대로 둡니다. 이 경우, cGUV는 끝의 환형 영역보다 외부 및 내부 영역에서 더 높은 전도성으로 얻어집니다.
  2. 500μm 간격의 와이어 전극이 포함된 전기 융합 챔버에서 함수 발생기를 사용하여 100kHz에서 7.5Vpp의 AC 전위를 적용하여 cGUV의 전극 형성을 수행합니다.
  3. AC 전기장을 가한 후 10프레임/초로 비디오를 캡처하고 외부 소포의 편평 형상 변형과 내부 소포의 돌출 형상 변형을 관찰하여 cGUV 영역의 환형 영역보다 외부 및 내부 영역에서 더 높은 전도성을 확인했습니다.

5. cGUV의 현미경 분석

  1. 도립 현미경 이미징: 도립 현미경을 사용하고 단색 카메라와 결합하여 미분 간섭 대비(DIC) 및 에피 형광 현미경 검사를 수행합니다. Plan fluor, ELWD 20x/0.45 및 Plan fluor, ELWD 40x/0.60 대물렌즈와 함께 DIC 및 epifluorescence 현미경을 사용하여 sGUV의 형태 전이를 관찰합니다. 에피 형광 연구를 위해 나일 레드 염색 이중층에 녹색 필터(EX 510-560, DM 575, BA 590)를 사용합니다.
    참고: DIC 이미지는 연결된 넥의 상태에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 넥이 손상되지 않은 상태로 유지되는지 아니면 cGUV를 형성하기 위해 융합을 거치는지 확인합니다.
  2. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 축척 막대를 삽입하고 현미경 이미지를 자릅니다. 축척 막대를 추가하려면 Analyze(분석) | Scale을 설정하여 이미지를 보정한 다음 Analyze | 도구 | 축척 막대 를 클릭하여 축척 막대를 삽입합니다.
  3. 형태학을 위한 컨포칼 현미경: cGUV 형태학을 보다 명확하게 이해하기 위해 1μm의 스텝 크기로 z축 스캔에 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용합니다. 컨포칼 현미경을 사용한 이미징: Plan-Apochromat 40x/1.3 oil DIC 대물 렌즈와 함께 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 cGUV를 이미징합니다. 이미지: 여기 파장이 561nm이고 방출 범위가 561-695nm인 적색 단일 채널 모드를 사용하는 나일 레드 또는 로다민-PE 염색 cGUVs.
  4. 현미경 연결 소프트웨어에서 이미지의 .czi 파일을 수정하고 추출하려면 눈금 막대와 같은 그래픽을 삽입하고 2D, 3D 보기를 활성화한 다음 Processing | 방법 | 매개 변수를 클릭하고 적용을 클릭하여 JPG 형식의 이미지를 가져옵니다.
  5. 컨포칼 현미경 검사(Confocal Microscopy) 준비: 컨포칼 이미징을 위해 수정된 맞춤형 챔버(하단 유리를 커버슬립 유리로 대체)에 cGUV가 포함된 수용액을 채웁니다. cGUV가 컨포칼 이미징에 정착할 수 있도록 10-15분 동안 샘플을 방해하지 않고 그대로 둡니다. 캐비티 슬라이드에 cGUV 혼합물을 로드하고 커버슬립으로 밀봉하여 cGUV의 움직임을 정지시킵니다. 그런 다음 컨포칼 현미경 검사와 1μm 간격으로 z-스캔을 통해 cGUV를 분석합니다.

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결과

sGUV는 전기형성법( 그림 1 참조)을 사용하여 합성하고 주사기를 사용하여 챔버에서 수확했습니다. 채취된 sGUV는 처음에 도립 현미경으로 시각화하고 삼투압 충격을 가하여 구강 세포 모양으로 변형되도록 유도했습니다. 추가적인 막 리모델링 후, 이 구강세포는 cGUV(Giant Unilamellar Vesicle) 화합물이라고 하는 소포 내 소포 구조로 변형됩니다(그림 1). cGUV는 컨포칼 현미경(그림 2)을 사용하여 추가로 분석되었으며, 여기서 DIC(Differential Interference Contrast) 및 형광 이미징이 사용되었습니다. cGUV의 3D 재구성은 1μm 간격으로 z-스캔을 통해 생성되었습니다. 3D 이미지는 내부 소포가 외부 소포와 완전히 분리되어 높은 z-평면에 위치한다는 것을...

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토론

지질의 조성과 유형은 주로 GUV를 구성하는 이중층의 기계적 특성을 결정합니다. DMPC/Chol로 구성된 이중층은 삼투압 충격을 받을 때 독특한 형태 변화를 나타냅니다. 강한 긴장성 삼투압 충격이 가해지면 sGUV 내부의 수용액이 배출되어 GUV 이중층이 변형됩니다. 관찰된 형상 전이는 주로 물의 바깥쪽 흐름과 이중층의 굽힘 강성에 의해 영향을 받습니다. 이러한 변형은 삼투압 충격의 강도와 이중층의 지질 조성에 따라 불가사리 모양과 덤벨을 포함한 다양한 형태로 나타납니다.

흥미롭게도, DMPC-콜레스테롤 이중층의 고유한 특성은 실온에서 sGUV가 구강세포 형태로 전이되도록 유도하는 데 유리합니다. 이 전이 과정에서 목 부위가 좁아지면 VIV(vesicle-in-vesicle)가 형성됩니다. 최종 VIV 구조에서 내부 소포는 외부 소포와 완전히 분리됩니다. 이전 연구에서는 70:30 몰 비율의 DMPC/Chol의 이중층...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

Rupesh Kumar는 PMRF 펠로우십 및 비상 보조금에 대해 인도 정부 인적 자원 개발부(MHRD)에 감사드립니다. 우리는 중앙 시설, IRCC, IIT 봄베이의 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경에 감사드립니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜레스테롤 (시그마 등급, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667sGUV 합성용
클로로포름Merck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602지질 스톡 용액 준비용 용매
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345CsGUV 합성용
에탄올HaymanF204325ITO 슬라이드 세척용
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994cGUV 내부 소낭의 봉입용
글루코스Sigma-AldrichG-7021글루코스 용액 준비용, 자당 용액에 현탁된 sGUV에 삼투압 충격 주기 위해 사용
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MG지질 분자 염색용
나일 레드Sigma-Aldrich72485cGUV 및 sGUV 막 염색용
소듐 클로라이드 (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521소금 스톡 용액 준비용, cGUV 칸막이의 전도도 변화
자당Sigma-AldrichS9378전기형성 챔버의 수화 매체로서의 자당 용액
장비
카비틀리 슬라이드Blue star현미경 관찰용 cGUV 현탁액 배치
cMOS pco.edge 4.2 카메라Excelitas61009524형광 단색 이미지 및 DIC 이미징용
커버 슬립 (22 x 60 mm)Blue star캐비티 슬라이드 덮기용
Eppendrof 전기융합 챔버Sigma-AldrichsGUV 현탁액을 챔버에 넣고 삼투압 및 현미경 관찰, 다른 간단한 챔버도 사용할 수 있음
함수 발생기 (이중 채널)TektronixAFG3022C전기형성 챔버에 AC 전기장을 전달하는 데 사용되는 함수 발생기
인큐베이터로컬 사용자 정의전기형성 챔버를 40°에 배치
ITO 슬라이드Sigma-Aldrich576352-10PAK전기형성 방법에 사용되는 ITO 슬라이드
Nikon Eclipse 거꾸로 현미경NikonTE2000-UsGUV 및 cGUV 시각화용
실리콘 시트 (두께 3mm)Sigma-AldrichGF49463141전기형성 챔버의 간격용
주사기 (2mL)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844수화 매체 주입 및 전기형성 챔버에서 sGUV 수확용
Zeiss 공초점 현미경 설치IIT 봄베이 중앙 시설
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참고문헌

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Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells(복합 거대 단층소포의 합성: 핵세포의 생체 모방 모델)
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