방법 논문

말초혈액 줄기세포 보존을 위한 새로운 Low-DMSO 동결보호제 개발

DOI:

10.3791/68275

⸱

2025년 6월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hematology, Affiliated Nanshan Hospital of Shenzhen University, 2Institute of Infection, Immunology and Tumor Microenvironment, Hubei Province Key Laboratory of Occupational Hazard Identification and Control, School of Medicine, Wuhan University of Science and Technology, 3Department of Hematology & Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital & Shenzhen Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 4School of Medicine, South University of Science and Technology, 5Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 매우 낮은 농도의 디메틸 설폭사이드를 함유한 조혈모세포 동결보호제를 사용하며 조혈모세포를 보호하는 임상적 안전성과 효능을 입증하여 임상적 자가 줄기세포 이식에서 조혈모세포 동결보존을 위한 새로운 전략을 제공합니다.

초록

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말초혈액 조혈모세포(PBHSC) 동결 보존은 자가 줄기세포 이식(ASCT)에 중요하지만, 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유한 기존의 동결 보호제(TCPA)는 독성 위험으로 인해 안전성 문제를 야기합니다. 이 연구는 -80°C에서 PBHSC 보존을 위한 새로운 저DMSO 극저온 보호제(CPA, 2% DMSO)를 검증하여 액체 질소 저장의 필요성을 제거하는 것을 목표로 했습니다. 6명의 기증자의 PBHSC는 CPA와 TCPA 그룹으로 나뉘었습니다. CPA는 PBHSC(1:1 vol/vol)와 혼합하여 -80°C에서 직접 보관했습니다. TCPA(10% DMSO + 5% 인간 알부민)는 점진적 냉각(1°C/분) 및 액체 질소 저장을 거쳤습니다. 1개월 후, 두 그룹 모두 37°C의 수조에서 해동했습니다. 세포 생존율, 세포골격 무결성(미세필라멘트/미세소관), 미토콘드리아 활성 및 집락 형성 능력을 비교했습니다. 해동 후 PBHSC 생존율은 CPA(91.29%)와 TCPA(90.07%) 간에 비슷했습니다. 그러나 CPA는 세포 생존율 분석에서 TCPA를 능가했습니다(CPA: 89.38% 대 TCPA: 79.55%, p < 0.05). 세포골격 분석에서는 CPA가 보존된 세포에서 손상되지 않은 미세필라멘트와 미세소관이 발견되었으며, 구조적 선명도는 TCPA를 능가했습니다. CPA 처리된 세포의 미토콘드리아 활성은 새로운 PBHSC를 반영하여 TCPA(p < 0.05)보다 8.5% 더 높은 활성을 보였고 미토콘드리아 복합체 수를 증가시켰습니다. 콜로니 형성 분석은 유도 후 더 높은 콜로니 수와 함께 CPA의 우수성을 더욱 확인했습니다. CPA는 초저 DMSO(2%)를 사용하여 -80°C에서 안전하고 편리한 PBHSC 동결 보존을 가능하게 하여 액체 질소에 대한 의존도를 제거합니다. 향상된 세포 생존력과 미토콘드리아 보존은 주입 독성 위험을 줄임으로써 임상적 이점을 시사합니다. 이 프로토콜은 ASCT를 위한 혁신적인 전략을 제공하여 안전 및 운영 효율성을 최적화합니다.

서론

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자가 조혈모세포 이식(ASCT)은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종을 포함한 다양한 혈액 악성 종양에 대한 잘 정립된 치료 옵션으로, 집중적인 화학 요법 또는 방사선 요법 후 조혈을 재구성하고 면역 능력을 회복하기 위한 1차 또는 2차 요법으로 사용됩니다 1,2,3,4,5,6,7 . 성공적인 ASCT 결과는 조혈 및 면역 재구성을 위한 기능적 능력을 유지해야 하는 동결 보존된 말초 혈액 조혈 줄기세포(PBHSC)의 생존 능력에 결정적으로 달려 있습니다 8,9,10,11,12. 조혈모세포 저장은 ASCT에서 중요한 단계인데, 자가 조혈모세포 채취 후 환자는 일반적으로 종양 세포를 제거하기 위해 방사선, 화학 요법 및 기타 요법을 받기 때문입니다. 조혈모세포 보관의 품질은 조혈 및 면역 재구성의 성패와 직접적인 관련이 있다 13,14,15,16,17,18. 냉동 보존 후 조혈모세포의 생존력을 보장하기 위해 임상 실습에는 종종 인간 혈액 알부민과 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 CPA로 추가하는 것이 포함됩니다. 이러한 물질은 동결 보존 과정 중과 후에 세포 활동을 유지하는 데 중요합니다. 일반적으로 사용되는 DMSO의 농도는 5%에서 10%(v/v) 사이입니다. 연구에 따르면 DMSO 농도를 3.5%에서 10%(v/v) 이상으로 유지하면 조혈모세포 동결보존의 효과를 높일 수 있다고 합니다19,20. 그러나 DMSO의 임상적 적용은 용량 의존적 독성으로 인해 여전히 문제가 있으며, 이식 수혜자의 30%-60%가 메스꺼움, 구토 및 저혈압과 같은 부작용을 보고했습니다21,22. 5%-10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유한 기존 동결보호제(CPA)의 한계를 해결하기 위해 본 연구는 초저온 DMSO 농도(2% v/v)를 사용하여 -80°C에서 안전하고 효율적인 PBHSC 동결 보존을 가능하게 하는 새로운 CPA를 개발하여 복잡한 액체 질소 프로토콜의 필요성을 없애고 DMSO 관련 독성을 완화하는 것을 목표로 합니다.

트레할로스 기반 또는 폴리머 강화 CPA와 같은 새로운 대안은 전임상 가능성을 보여주지만 규제 장애물 또는 표준 해동 프로토콜과의 비호환성으로 인해 임상 번역에서 장벽에 직면해 있습니다23. 이와는 대조적으로, 당사의 CPA는 HSA-DMSO 시스템의 확립된 안전성 프로파일을 기반으로 하는 동시에 세포 보호를 강화하는 최적화된 첨가제 비율을 도입합니다. 이 방법은 액체 질소 인프라가 부족하거나 신속한 워크플로우가 필요한 임상 센터에 특히 적합합니다. 그러나, 장기 보관(>2년)의 경우, 액체 질소가 여전히 바람직하다(24). 임상의는 DMSO에 대한 개별 환자의 내성과 프로토콜의 단순성 사이에서 균형을 유지해야 하며, 조혈모세포 이식의 안전성과 운영 효율성을 극대화하기 위해 이 전략을 맞춤형으로 적용해야 합니다.

이 연구에서는 DMSO 함량이 감소된 동결 보호제를 사용하는 것이 조혈모세포 동결 보존의 효능을 보존하는 동시에 관련 독성을 최소화하는 중요한 전략을 나타냅니다. 새로 개발된 조혈모세포 CPA의 효과, 안전성 및 편의성을 평가하여 말초혈액조혈모세포(PBHSC)를 보존했습니다. 새로운 CPA를 활용하는 간단한 직접 동결 방법이 구현되어 기존의 동결 보존 프로토콜을 피했습니다. 이 연구 결과는 저농도 DMSO CPA를 사용하여 -80°C에서 세포 현탁액의 1단계 동결 보존이 기존 CPA(TCPA)에 비해 우수한 보존 효과를 달성한다는 것을 보여줍니다. 이 접근법은 조혈모세포이식(HSCT)의 임상 과정을 간소화하기 위한 새로운 전략을 제공할 수 있습니다.

프로토콜

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ASCT를 받는 혈액 종양 환자는 2020년 6월부터 2022년 6월까지 선전 암병원 혈액과에서 모집되었습니다. 급성 골수성 백혈병(AML) 2건, 호지킨 림프종(HL) 2건, 피부 진정성 조직성 림프종(CGHL) 1건, 원발성 종격동 B세포 림프종(PMBL) 1건을 포함하여 HSCT를 위한 이식 동원 전후에 혈액 세포 샘플을 채취했으며, 평균 연령은 53세이고 범위는 35세에서 61세 사이였습니다. 이 연구는 환자로부터 사전 동의를 받았으며 선전 암 병원(Shenzhen Cancer Hospital)의 윤리 검토 위원회(Ethics Review Committee)로부터 윤리 승인 문서 번호 AF-SC-07-2.0의 승인을 받았습니다. 모든 동물 실험 절차는 중국의학원(Chinese Academy of Medical Sciences) 암병원 실험동물윤리위원회(Experimental Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다(승인 번호. NCC2018A073) 동물 연구에 대한 국제 지침을 준수했습니다.

1. 조혈모세포 샘플의 Subpackaging 및 동결 보존

  1. 무균 워크스테이션 준비
    1. 손을 철저히 씻고 멸균 마스크와 장갑을 착용하십시오. 손, 손목, 팔꿈치를 75% 에탄올로 소독합니다.
    2. 모든 예비 기구(피펫, 지혈제)를 오토클레이브 또는 UV 조사로 살균합니다. 생물 안전 작업대에 1mL 무발열원 피펫 팁(상자 2개), 1000μL 피펫, 멸균 1.8mL 동결 보존 튜브, 50mL 원심분리 튜브 및 동결 보존 튜브 보관 상자(프로그래밍 가능한 냉동 상자)를 정리합니다.
  2. 라벨링 및 세포-CPA 혼합
    1. 동결 보존 튜브에 시료 ID, 날짜, 세포 수 및 기증자 이름을 표시합니다.
    2. 멸균 주입 튜브를 사용하여 180-200mL의 조혈모세포가 들어 있는 조혈모세포 백을 100mL의 새로운 low-DMSO 동결 보호제가 들어 있는 CPA 함유 백에 연결합니다.
    3. 멸균 지혈기로 튜브 중간 지점을 고정합니다. 한쪽 끝을 cell-CPA 혼합물 백에 부착하고 다른 쪽 끝을 50mL 원심분리 튜브에 부착합니다.
  3. 충진 및 냉동 보존
    1. 지혈제를 해제하여 세포-CPA 혼합물이 원심분리기 튜브로 흐름이 제어될 수 있도록 합니다.
    2. 피펫을 사용하여 원심분리 튜브에서 1mL 분취액을 흡입합니다. 부분 표본을 사전 라벨링된 cryotubes(30개 튜브/샘플)로 옮깁니다. 캡을 조이고 튜브를 보관 상자에 넣습니다.
  4. 보관 및 운송
    1. 보관 상자를 즉시 -80°C 냉장고에 옮기십시오. 운송의 경우 온도 모니터링과 함께 드라이아이스(-78.5°C)에 극저온 튜브를 포장하십시오.

2. PBHSC의 동결 보존 및 회수

  1. CPA 및 TCPA 준비 및 혼합
    1. 얼음 플랫폼을 2-8 °C로 예냉각합니다. 제조업체 지침에 따라 조혈모세포 CPA 및 TCPA를 해동합니다(CPA/TCPA 조성은 표 1 참조).
    2. CPA 및 TCPA를 얼음 플랫폼에서 1:1 부피 비율로 6개의 PBHSC 샘플과 혼합합니다. 세포 현탁액을 멸균 cryovials로 옮깁니다.
  2. CPA 냉동 보존
    1. cryovials를 -80 °C 냉동고에 직접 넣습니다. 현탁액의 최종 DMSO 농도가 2%(v/v)인지 확인합니다. 샘플을 1개월 동안 보관하십시오.
  3. TCPA 동결 보존(비교 대조군)
    1. 5%의 인간 혈액 알부민과 10%의 DMSO(v/v)를 함유하는 TCPA를 준비합니다. PBHSC 현탁액을 극저온에 로드하고 프로그래밍 가능한 냉동고를 사용하여 1°C/분에서 -80°C로 냉각합니다.
    2. 장기 보관을 위해 냉동 수소를 액체 질소로 옮깁니다. 샘플을 1개월 동안 보관하십시오.
  4. 세포 소생술
    1. 1개월 후에 cryovials를 회수합니다. 37°C 수조에서 부드러운 교반으로 세포를 해동합니다(≤ 5분).
    2. 잔류 CPA/TCPA를 제거하기 위해 300 x g 에서 10분 동안 원심분리기. 다운스트림 분석을 위해 예열된 RPMI 1640 배양 배지에 1mL의 세포를 재현탁합니다.

3. 세포 생존율 분석

  1. 이미지 기반 세포 계수
    1. 10μg/mL 아크리딘 오렌지(AO)와 10μg/mL 프로피듐 요오드화물(PI)을 함유한 혼합 염색 용액을 준비합니다.
    2. 멸균 마이크로 원심분리기 튜브에 100μL의 세포 현탁액과 100μL의 염색 용액(1:1 비율)을 혼합합니다.
    3. 염색된 시료 10 μL를 자동 세포 계수기에 로드합니다. 통합 소프트웨어를 사용하여 세포 생존율을 분석합니다.
      생존율 = 살아있는 세포 / 총 세포 x 100%
  2. 유세포 분석 검증
    1. 100μL의 결합 완충액에 Annexin V-FITC(5μL)와 PI(5μL)를 혼합하여 Annexin V-FITC/PI 염색 용액을 준비합니다.
    2. 염색 용액에 300μL의 세포 현탁액을 추가하고 어두운 곳에서 25°C에서 15분 동안 배양합니다.
    3. 혼합물을 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 500μL의 PBS에서 세포를 재현탁하고 유세포분석기25를 사용하여 생존율을 분석합니다.

4. 콜로니 형성 분석

  1. 세포 현탁액 준비
    1. 세포 현탁액과 0.4% 트리판 블루 용액을 1:1 비율로 혼합하고 3분 동안 배양하여 생존 가능한 세포와 죽은 세포를 구별합니다. 자동 세포 계수기를 사용하여 중복 계수를 수행하여 생존 가능한 세포 밀도를 측정합니다(생존율 >90% 보장). 세포 현탁액을 목표 농도(1 x 10,6 cells/mL)로 조정하고 40μm 스트레이너를 통해 필터링하여 단일 세포 분산을 보장합니다. 40μm 멸균 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하여 응집체를 제거합니다.
  2. 중간 혼합
    1. 15mL 코니컬 튜브(1:10 v/v)에 1mL의 세포 현탁액과 9mL의 상용 마우스 집락 형성 단위 배지를 결합합니다.
    2. 균질성을 보장하기 위해 1,500rpm에서 30초 동안 혼합물을 소용돌이치십시오. 기포를 제거하기 위해 100 x g 에서 10초 동안 원심분리기를 사용합니다.
  3. Cell seeding 및 습도 설정
    1. 1.5mL의 거품이 없는 혼합물을 35mm 멸균 페트리 접시에 분배합니다. 습도를 유지하기 위해 접시의 주변 홈에 멸균 증류수 3mL를 추가합니다(또는 접시 뚜껑 내부에 별도의 멸균 용기를 놓음).
    2. 접시를 가습실(습도 ≥ 95%)에서 밀봉하십시오.
      1. 챔버를 준비하려면 뚜껑이 있는 플라스틱 용기(예: 15cm 페트리 접시)에 두 겹의 멸균 흡수지를 놓습니다. 멸균 탈이온수 10mL를 추가하여 종이를 포화시킵니다. 염색된 배양 접시를 챔버 중앙에 놓고 접시와 젖은 종이가 직접 닿지 않도록 합니다. 밀폐 밀봉을 위해 뚜껑-용기 접합부 주위에 투명 필름을 3회 감습니다. 또는 실험실 테이프로 뚜껑 가장자리를 고정합니다. 밀폐된 챔버를 37°C에서 30분 동안 배양하여 습도를 95%≥ 평형을 이룹니다.
  4. 군집 경작과 계수
    1. 37 ° C에서 5 % CO2 이하에서 16 일 동안 세포를 배양합니다. 조혈 집락(클러스터당 50개 세포 ≥)을 40배 배율에서 도립 현미경을 사용하여 계산합니다. 1 x 104 개의 시드 세포당 집락 형성 단위(CFU)를 계산합니다.

5. 미토콘드리아 활성 감지

  1. Rhodamine 123을 사용한 세포 염색
    1. 1 x 106 cells/mL의 RPMI1640 배지 1mL에서 PBHSC를 재현탁합니다. Rhodamine 123 염료를 최종 농도 5-10 μM에 첨가합니다.37 °C에서 5 % CO2 로 10 분 동안 세포를 배양합니다.
    2. 300 x g 에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 1mL의 신선한 RPMI1640에 세포를 재현탁합니다. 원심분리를 반복하고 PBS 1mL에 재현탁합니다.
  2. 컨포칼 현미경 분석
    1. 보푸라기가 없는 종이로 깨끗한 유리 슬라이드를 닦아 먼지나 오염 물질을 제거합니다.
    2. 신호가 중복되지 않도록 PBS에서 염색된 PBHSC를 적절한 밀도로 재현탁합니다. 10-20 μL의 세포 현탁액을 피펫팅하고 슬라이드 중앙에 천천히 분주합니다.
    3. 커버슬립을 45° 각도로 기울이고 한쪽 가장자리를 물방울에 부드럽게 터치한 다음 기포를 최소화하기 위해 서서히 내립니다. 세포가 단층으로 고르게 퍼져 있는지 확인하기 위해 가볍게 누릅니다.
    4. 셀이 가라앉을 수 있도록 슬라이드를 어두운 곳에 5분 동안 수평으로 놓습니다. 즉시 컨포칼 현미경 분석을 진행하십시오.
    5. 염색된 세포를 유리 슬라이드에 장착합니다. 컨포칼 현미경(예: 488/525nm)을 사용하여 미토콘드리아 분포를 관찰합니다.
  3. 유세포 분석 정량화
    1. 유세포분석기(FL1 채널)를 사용하여 Rhodamine 123 형광 강도를 분석합니다. 과산화수소 처리된 PBHSC(1mM, 1시간)를 양성 대조군으로 사용26.

6. PBHSC의 세포골격 염색

  1. 마이크로필라멘트 염색(Actin Tracker Green-488)
    1. PBS에 용해된 AF488-conjugated phalloidin 형광 프로브를 5 U/mL의 최종 농도로 준비합니다. 5μL의 원액과 195μL의 PBS(1:40 희석)를 혼합하여 원액(메탄올 중 200U/mL)을 희석합니다. 균질성을 보장하기 위해 10초 동안 철저히 소용돌이칩니다.
    2. 준비된 Actin Tracker Green-488 작업 용액 200μL(5U/mL)를 PBHSC에 추가합니다.어두운 곳에서 25°C에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
    3. 1mL의 면역염색 세척 완충액(PBS의 0.1% Triton X-100)으로 세포를 2배 세척합니다. 어두운 곳에서 25°C에서 5분 동안 200μL의 DAPI(1μg/mL)로 핵을 카운터스테인합니다.
  2. 미세소관 염색(Tubulin Tracker Red)
    1. PBS에 용해된 적외선 접합 파클리탁셀 형광 프로브를 1μM의 최종 농도로 준비합니다. 990μL PBS에 10μL의 원액(DMSO에서 100μM)을 첨가하여 원액(100μM)을 희석합니다(1:100 희석 비율). 혼합물을 10초 동안 소용돌이쳐 균질성을 보장하고 빛으로부터 보호합니다.
    2. Tubulin Tracker Red 작업 용액을 완전 배지에서 250nM의 최종 농도로 준비합니다. 997.5μL 배지에 2.5μL의 원액을 첨가하여 원액(DMSO에서 1mM)을 희석합니다(1:400 희석 비율). 혼합물을 10초 동안 소용돌이치고 PBHSC에 200μL를 첨가합니다. 어두운 곳에서 25°C에서 30분 동안 배양합니다.
    3. 1mL의 면역염색 세척 완충액으로 세포를 2x 세척합니다. 어두운 곳에서 25°C에서 5분 동안 200μL의 DAPI(1μg/mL)로 핵을 카운터스테인합니다.
  3. 장착 및 현미경 검사
    1. PBS로 염색된 세포를 2배 세척합니다. 염색된 세포를 90% 글리세롤-PBS 용액(90% 글리세롤 및 10% PBS, v/v)과 1:1 부피 비율로 혼합합니다. 혼합물 10 μL를 유리 슬라이드에 피펫팅합니다. 커버슬립을 45°로 기울이고 기포를 피하기 위해 서서히 내립니다.
    2. 형광 현미경을 사용하여 액틴/미세소관 형태를 분석합니다(Actin Green의 경우 488nm 여기, Tubulin Red의 경우 561nm). 양성 대조군 포함: 액틴 파괴를 위한 사이토칼라신 B 처리 PBHSC(5μM, 2시간) 및 미세소관 해중합을 위한 콜히친 처리 PBHSC(10μM, 3시간).

7. CPA 안전성 평가

  1. 용혈 검사
    1. EDTA로 항응고된 신선한 혈액을 사용하여 2% 토끼 적혈구 현탁액을 준비합니다.
    2. 유리관에 있는 2.5mL의 세포 현탁액에 CPA(0.1-0.5mL)와 생리식염수(2.0-2.4mL)를 추가합니다.
    3. 식염수를 음성 대조군으로 사용하고 살균수를 양성 대조군으로 사용하십시오. 37°C에서 3시간 동안 배양하고 현미경으로 용혈/응고를 관찰합니다.
  2. 전신 알레르기 검사
    1. 동물 준비
      1. 4-5주 된 SPF 하틀리 기니피그 36마리(수컷 50%, 암컷 271-307g, 암컷 50-301g)를 사용합니다. 온도: 16-26°C(일일 변동 ± 4°C), 습도: 40%-70%, 환기: 8-10회 공기 변화/h, 조명 주기: 12시간 조명/어둡게
    2. 감작 단계
      1. 1일, 3일, 5일에 2mL/kg(낮음) 또는 6mL/kg(높음)으로 복막강의 왼쪽 하단 사분면에 CPA를 주입합니다. 저용량(2mL/kg)은 임상적 노출 수준을 시뮬레이션하는 반면, 고용량(6mL/kg)은 전신 알레르기 검사에 대한 OECD 가이드라인 406에 따라 용량 의존적 과민증을 평가하기 위한 3배의 안전 마진을 나타냅니다27,28.
      2. 인간 혈청 알부민(양성 대조군)과 식염수(음성 대조군)를 사용하십시오.
    3. 챌린지 단계
      1. 19일과 26일에 4mL/kg(낮음) 또는 12mL/kg(높음)의 가장자리 귀 정맥을 통해 CPA를 정맥 투여합니다. 챌린지 용량(2x 감작 용량)은 동결 보호제 생체 적합성에 대한 이전 연구에서 검증된 바와 같이 사전 감작된 기니피그에서 아나필락시스를 유발하기 위해 확립된 프로토콜과 일치합니다29.
      2. 주사 후 1시간 동안 아나필락시스 증상(호흡 곤란, 경련)을 모니터링합니다.
    4. 실험 후 처리
      1. 기니피그를 수의사에게 돌려보내 72시간 관찰합니다. 이소플루란 마취 하에 복부 대동맥 출혈을 사용하여 안락사합니다.
  3. 급성 전신 독성 시험
    1. 마우스 주입
      1. 수컷 ICR 마우스 10마리(32.0-37.1g, 6주령)의 꼬리 정맥에 50mL/kg CPA를 주입합니다. 식염수를 주입한 마우스를 음성 대조군으로 사용합니다(n = 10).
    2. 관찰 프로토콜
      1. 주사 후 4, 24, 48 및 72시간에 생존, 독성 징후 및 체중을 모니터링합니다. 주거 조건 유지: 온도: 20-25 °C (매일 3 °C ±), 습도: 40%-70%, 환기: 10-20 공기 변화/h.
    3. 안락사
      1. 3% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 복부 대동맥 출혈로 안락사시킵니다.
  4. 혈관 자극 검사
    1. 토끼 관리
      1. 6마리의 수컷 뉴질랜드 토끼(3.65-4.36kg, 7-8개월)를 사용합니다. 매주 5mL/kg CPA를 오른쪽 귀 정맥에 주사합니다(총 3회 투여). 음성 대조군으로 왼쪽 귀에 식염수를 주입합니다.
    2. 조직 평가
      1. 18-19일에 주사 부위에 홍반, 부종 또는 괴사가 있는지 검사합니다. 홍반, 부종 및 괴사 중증도에 따라 주사 부위 자극에 점수를 매깁니다. ISO 10993-12 채점 시스템을 0(반응 없음)에서 4(심한 괴사)30,31까지의 등급으로 적용합니다.
    3. 실험 후 처리
      1. 틸레타민-졸라제팜(5mg/kg, IM)으로 토끼를 마취합니다. 빠른 경동맥 사혈을 사용하여 안락사합니다.

8. PBHSC 이식

  1. 환자 등록 및 동원
    1. 이식 기준을 충족하는 환자 6명 등록: 단핵 세포 ≥ 5 x 108 cells/kg
      CD34+ 세포 ≥ 2 x 106 세포/kg23. <18세 또는 >65세 환자, 활동성 감염자, 중증 장기 기능 장애, 임신/수유, 최근 면역 억제 요법(4주 이내) 또는 조절되지 않는 정신 질환이 있는 환자는 제외합니다.
    2. 과립구 집락자극인자(G-CSF)를 사용하여 골수에서 말초혈액까지 조혈줄기세포를 동원합니다. 과립구 집락 자극 인자를 10μg/kg(정확한 용량은 사람마다 다름)의 용량으로 5일 연속 피하 투여하여 골수에서 말초 혈액으로 조혈 줄기세포를 동원합니다.
  2. PBHSCs 수집 및 냉동 보존
    1. 혈류수가 40mL/분으로 설정되고 항응고제 대 전혈 비율이 1:12인 성분채집술을 사용하여 동원된 PBHSC를 수집합니다. 세션당 15-16L의 전혈을 처리하여 180-200mL의 PBHSC 농축액을 얻습니다. 검체를 두 개의 부분 표본으로 나누고 각 봉지의 용량은 90-100mL입니다.
    2. 임상 수혈을 위해 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 5% 인간 혈청 알부민에 첫 번째 부분 표본을 재현탁합니다. 재현탁된 부분 표본을 -1°C/min에서 -80°C의 냉각 속도로 프로그래밍 가능한 냉동 용기에 넣습니다. 냉동 백에 환자 ID와 동결 매개변수(예: 배치 번호, 날짜)를 표시합니다. 생존율 검사를 위해 5% DMSO 및 10% 소 태아 혈청에서 두 번째 부분 표본을 준비합니다.
  3. 해동 및 재주입
    1. 냉동 보존된 PBHSC를 37°C 수조(≤ 2분)에서 해동합니다. 화학요법/방사선요법 컨디셔닝 후 해동된 세포를 정맥 투여합니다. 해동 후 30분 이내에 주사기 펌프를 사용하여 3-5mL/분의 속도로 중심 정맥 카테터를 통해 세포를 정맥 투여합니다.
  4. 이식 후 모니터링
    1. 일일 혈구 수로 조혈 회복 추적: 호중구 성공 임계값: ≥ 0.5 x 109 cells/L; 혈소판 성공 임계값: ≥ 20 x 109 cells/L32.
    2. 림프구 부분 집합 분석을 통해 면역 재구성을 모니터링합니다. EDTA 튜브에 5mL의 말초 혈액 샘플을 수집합니다. CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD56에 대한 형광 항체로 세포를 어두운 곳에서 15분 동안 염색합니다. 유세포 분석기와 표준화된 게이팅 전략을 사용하여 림프구 부분 집합을 분석합니다. 해석을 위해 절대 개수(cells/μL)를 연령에 맞는 건강한 참조 범위와 비교합니다.

9. PBHSC 하위 개체군 분석

  1. 항체 염색
    1. 냉동 PBHSC(CPA/TCPA 그룹)를 준비하고 37°C 수조에서 해동합니다.
    2. 형광 항체로 세포 라벨링: CLP: CD45-CD34+CD10+ (클론 HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (클론 HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+(그림 1). PBHSC를 300 x g 에서 5분 동안 원심분리기로 해동하여 동결 보존제를 제거했습니다. 2% 소 태아 혈청을 함유한 PBS에서 세포 농도를 1 x 106 cells/mL로 조정합니다.
    3. CLP의 경우 클론 HI30/4H11/HI10a, MEP/GMP의 경우 HIT2/4G8/5F3/HI100을 사용하여 제조업체에서 권장하는 역가에서 항체 칵테일을 준비합니다. 항체 혼합물이 있는 세포를 4°C의 어두운 곳에서 10분마다 부드럽게 소용돌이치면서 30분 동안 배양합니다. 200 x g에서 3분 동안 원심분리를 사용하여 염색된 세포를 차가운 PBS+0.1% 아지드화나트륨으로 2x 세척합니다. 유세포 분석 전에 생존율 게이팅을 위해 1 μg/mL DAPI로 500 μL의 PBS에서 세포를 재현탁합니다.
    4. 4 °C에서 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 1% BSA가 함유된 PBS로 2x 세척합니다.
  2. 유세포 분석 설정
    1. 염색된 세포를 500μL의 PBS에 재현탁합니다. 유세포 분석기를 사용한 하위 모집단 분석: 레이저(488 nm, 640 nm) 및 필터(FITC, PE, APC)를 구성합니다. 샘플당 10,000개 ≥ 이벤트를 수집합니다.
    2. forward/side scatter 및 fluorescence intensity를 기반으로 한 게이트 개체군(그림 1).
  3. 데이터 비교
    1. FlowJo v10.8 소프트웨어를 사용하여 CLP/MEP/GMP 백분율을 계산합니다. 학생의 t-test(α = 0.05)를 사용하여 CPA와 TCPA 그룹을 비교합니다. Prism 9.0(SEM을 사용한 막대 플롯)33을 사용하여 차이를 시각화합니다.

10. 통계 분석

  1. t 검정을 사용하여 카이 제곱 분산이 있는 정규 분포를 따르는 연속적인 숫자 변수의 평균을 비교하고, 정규 분포를 따르지 않는 연속 숫자 변수의 경우 비모수로 검정합니다.
  2. 계량형 변수에 대한 데이터를 평균 ± 표준 편차 또는 중앙값과 상부 및 하위 사분위수로 보고합니다. Fisher의 정확 검정을 사용하여 두 그룹 간의 비율을 비교합니다.
  3. SPSS 26.0 및 GraphPad Prism 9 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 플롯합니다. p < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 양측 검정의 모든 차이를 고려합니다. 일부 데이터는 통계적 설명의 형태로 제공됩니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1단계 동결 보존과 액체 질소 동결 보존 방법의 비교
회수 후 동결 보존된 PBHSC의 생존 가능성은 AO/PI 분석을 사용하여 평가되었습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이 CPA를 사용하여 -80°C에서 동결 보존된 PBHSC의 생존율은 91.29%(n=3, SD = 1.86)인 반면, 액체 질소에 보존된 PBHSC의 생존율은 90.07%(n=3, SD=1.64)였습니다. 통계 분석에서는 두 방법 간에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다(p > 0.05). 그러나 1단계 동결 보존 방법이 더 빠르고 편리한 것으로 입증되었습니다. 이러한 결과는 1단계 동결 보존 방법이 세포 보존을 위한 우수한 대안임을 시사합니다.

PBHSC에 대한 CPA의 동결 보존 효과는 기존의 동결 보존 방법을 능가합니다.
회수 후 동결 보존된 PBHSC의 세포 생존율은 AO/PI 및 Annexin V/PI 분석에 의해 검출되었습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 CPA로 보존된 6개의 회수된 PBHSC 샘플의 세포 생존율은 이 두 분석에서 각각 89.38%(n = 6, SD = 1.87, 그림 2B) 및 88.20%(n = 6, SD = 2.72, 그림 2C)에 달했습니다. 그러나 TCPA에 의해 보존된 값은 79.55%(n = 6, SD = 3.16, 그림 2B) 및 73.05%(n = 6, SD = 7.47, 그림 2C)였습니다. 이러한 연구 결과는 CPA가 TCPA에 비해 PBHSC에 더 효과적인 동결 보호제이며, 세포 생존율과 회수율을 더 잘 보존할 수 있음을 시사합니다.

CPA로 보존된 PBHSC는 완전한 세포골격 구조와 미토콘드리아 활성을 유지합니다.
세포골격(cytoskeleton)의 좁은 정의는 진핵 세포(eukaryotic cell)에서 단백질 섬유(protein fibers), 미세소관(microtubules, MT), 미세필라멘트(microfilaments, MF) 및 중간 필라멘트(intermediate filaments, IF)의 네트워크를 의미한다34. 본 연구에서는 PBHSC가 CPA의 동결보존 후에도 세포골격의 무결성을 유지할 수 있음을 입증하기 위해 PBHSC의 동결보존 후 MT와 MF의 구조적 무결성을 주로 조사했습니다. 살아있는 세포의 미세필라멘트 및 미세소관 구조를 라벨링하기 위해 Alexa Fluor 488 형광 염료 표지 고스트 펜 고리형 펩타이드 및 원적외선 형광 그룹 표지 Taxol 유사체를 각각 형광 프로브로 사용했습니다. 그림 3A, B에서 볼 수 있듯이 CPA에 의해 보존된 PBHSC는 여전히 손상되지 않은 미세필라멘트 및 미세소관 구조를 유지합니다.

CPA에 의해 보존된 PBHSC의 미토콘드리아는 로다민 123 염료 용액으로 표지되었고,H2O2로 처리된 PBHSC는 양성 대조군으로 사용되었다. 결과(그림 3C)는 미토콘드리아 구조가 CPA 보존 세포에서 관찰된 반면 양성 대조군에서는 관찰되지 않았음을 보여주었습니다. 로다민 123 표지된 미토콘드리아도 유세포 분석에 의해 검출되었습니다. CPA가 보존된 PBHSC는 기존 방법보다 더 나은 미토콘드리아 활성을 유지하는 것으로 나타났습니다(그림 4).

CPA로 보존된 PBHSC는 클론 형성 능력을 유지합니다.
또한 집락 형성 분석을 수행하여 CPA 및 TCPA로 보존된 PBHSC의 증식 및 차별화 능력을 평가했습니다. 구체적으로, 우리는 배양에서 BFU-E, CFU-E, CFU-GM 및 CFU-GEMM 집락을 형성하는 PBHSC의 능력을 평가했습니다. 신선한 세포 그룹에서 관찰된 총 집락 수는 70.33(n = 6, SD = 14.02)이었습니다. 대조적으로, CPA 그룹은 총 65.33개의 집락(n=6, SD=8.07)을 보인 반면, TCPA 그룹은 46.17개의 집락(n=6, SD=8.50)으로 현저히 낮았다. 이러한 결과는 CPA로 보존된 PBHSC가 다양한 세포 계통에 걸쳐 유사한 수의 콜로니 형성에 의해 입증된 바와 같이 신선한 세포 대조군과 비교하여 증식 및 분화 능력을 유지했음을 보여줍니다. 대조적으로, TCPA로 보존된 PBHSC는 증식 및 분화 잠재력이 감소한 것으로 나타났습니다. 이러한 결과는 CPA로 동결 보존된 PBHSC가 기능적 기능을 더 잘 유지한다는 것을 나타냅니다(그림 5 및 그림 6).

CPA in vitro의 안전성 평가
토끼 적혈구 용혈에 대한 시험관 내 모니터링을 실시했습니다. 용혈에 대한 다양한 부피의 CPA(0.1-0.5mL) 및 생리식염수(2.0-2.4mL)의 효과를 테스트하기 위해 2% 토끼 RBC 현탁액 2.5mL를 CPA 또는 생리식염수와 함께 유리 시험관에 첨가했습니다. 음성 대조군(주사를 위한 살균수)과 양성 대조군(일반 식염수)도 포함되었습니다. CPA 또는 생리식염수가 들어 있는 튜브에서 적혈구는 튜브 바닥에 가라앉았고 위쪽 용액은 투명하고 무색이었습니다. 흔든 후, 적혈구는 균일하게 분산되었습니다. 양성 대조군(멸균된 물)은 밝은 빨간색을 보였고 성층화는 관찰되지 않았으며 튜브 바닥에 소량의 적혈구만 남아 있었습니다(그림 7). 이러한 결과는 CPA가 토끼 적혈구의 용혈이나 결로를 일으키지 않는다는 것을 시사합니다. CPA의 혈관 자극은 뉴질랜드 토끼에서 평가되었습니다. 병리학적 절편은 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색으로 염색하고, 최종 투여 후 일반적인 임상 및 국소 자극 관찰을 실시했습니다. 실험 동물에서 비정상적인 반응은 관찰되지 않았으며 지역 투여 현장에서 병리학적 변화도 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 CPA가 뉴질랜드 토끼에서 혈관 자극을 일으키지 않는다는 것을 나타냅니다.

기니피그를 대상으로 한 활동성 전신 과민증 실험에서는 CPA를 사용하여 1.25mL/kg 및 2.5mL/kg 3배의 복강내 주사와 2.5mL/kg 및 5mL/kg의 정맥 주사로 동물을 감작시켰다. 마지막 감작 후 최대 21일까지 기니피그에서 급격한 과민증이 관찰되지 않았으며, 이는 CPA가 기니피그에서 급격한 아나필락시스를 유발하지 않음을 나타냅니다(표 2).

급성 전신 독성은 ICR 마우스에서 평가되었습니다. 5마리의 실험용 마우스와 5명의 대조군 마우스에게 체중 50mL/kg의 용량으로 CPA와 생리식염수를 주입했습니다. 실험군의 반응은 대조군의 반응보다 크지 않았다. 두 그룹 모두 발작이나 엎드린 자세는 관찰되지 않았으며, 다른 이상 증상도 관찰되지 않았다. 또한, 두 그룹 모두 유의미한 체중 감소가 없었다. 이러한 결과는 CPA가 ICR 마우스에 대해 급성 전신 독성을 나타내지 않음을 시사합니다(표 3 및 표 4).

CPA로 보존된 PBHSC의 자가이식 평가
혈액질환 치료를 위한 CPA로 보존된 PBHSC의 이식 효과를 평가하기 위해 6명의 환자를 모집하여 CPA로 보존된 PBHSC를 5명의 환자에게 이식했습니다. 이식은 한 명의 환자를 제외한 모든 환자에서 성공적이었으며, 질병의 재발로 인해 다른 동종 이식을 받았습니다. 호중구 수 ≥ 0.5 x 109 cells/L 및 혈소판 수 ≥ 20 x 109 cells/L를 성공적인 이식의 마커로 사용했습니다.

검체 b, c, e를 해당 림프종 환자에게 이식하였고, 기능적 재건 주기는 각각 9일, 9일, 10일이었다. 샘플 a와 f를 급성 골수성 백혈병 환자에게 이식하였고, 기능적 재건 주기는 각각 36일과 16일이었다. 표본 d 환자는 질병의 재발로 인해 다른 치료를 받았습니다. 36일 주기의 감염으로 인해 중단된 조혈 및 면역 재구성과 관련된 데이터를 제외하고, 5건의 사례에서 이식이 성공적으로 이루어지기까지의 평균 시간은 11일이었으며, 호중구 및 혈소판 수치 모두 필수 기준을 충족했습니다. 이 기간은 이전 문헌에 보고된 12.5일의 조혈 재구성 주기보다 짧다(19). 본 연구에서는 유사한 재구성 기간 하에서 CPA 제형에서 DMSO의 최종 농도는 2%에 불과했으며, 이는 일반적으로 인용된 3.5% 농도보다 현저히 낮았습니다20. 더 중요한 것은 환자에서 부작용이 관찰되지 않았다는 점이며, 이는 임상 적용에서 당사의 조혈모세포 보존 방법의 안전성과 효능을 더욱 확인시켜주었습니다(표 5).

PBHSC의 하위 집단 분석은 CPA로 보존된 PBHSC에서 일반 림프 전구세포(CLP) 및 거핵세포/적혈구 전구세포(MEP)의 세포 하위 집단이 기존 요법보다 높은 것으로 나타났습니다. 그러나 과립구/대식세포 전구세포(GMP)의 세포 하위 집단은 유의하게 다르지 않았습니다. 이러한 발견은 치료받은 환자에서 관찰된 더 빠른 조혈 및 면역 재구성을 설명할 수 있습니다(그림 8A-C).

figure-results-1
그림 1: 조혈 계층의 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: PBHSC의 세포 생존율. (A) CPA를 이용한 1단계 방법으로 보존된 PBHSC의 생존율은 91.29%(SD = 1.86)였고, 액체 질소 방법으로 보존된 PBHSC의 생존율은 90.07%(SD = 1.64)였으며, 1단계 동결 보존법과 액체 질소 동결 보존법에서 p > 0.05였습니다. (B) CPA로 저장된 PBHSC의 회수율은 89.38%(n=6, SD=1.87)로 AO/PI 검출로 측정한 TCPA로 저장된 PBHSC의 79.55%(n=6, SD=3.16)의 회수율보다 유의하게 높았다. (C) CPA로 보존된 PBHSC의 회수율은 88.20%(n=6, SD=2.72)였으며, 이는 회수 후 Annexin V/PI 검출로 측정한 바와 같이 TCPA로 보존된 PBHSC의 73.05%(n=6, SD = 7.47)의 회수율보다 유의하게 높았다. P<0.01 (T-test) CPA 및 TCPA에 관하여. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: CPA 및 TCPA에 의해 보존된 PBHSC의 구조 분석. (A) Alexa Fluor 488 형광 염료 표지 고스트 펜 고리 펩타이드로 시각화된 신선 세포 그룹, CPA 그룹, TCPA 그룹 및 양성 대조군을 포함한 PBHSC의 미세 필라멘트 구조. (B) 원적외선 형광 그룹 표지 탁솔 유사체에 의해 시각화된 신선 세포 그룹, CPA 그룹, TCPA 그룹 및 양성 대조군을 포함한 PBHSC의 미세소관 구조. (C) rhodamine 123으로 표지된 PBHSCsC(신선 세포군, CPA 군, TCPA 군 및 양성 대조군 포함)의 미토콘드리아 활성을 유세포 분석에 의해 검출했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: CPA 및 TCPA에 의해 보존된 PBHSC의 기능 분석. 유세포 분석으로 검출된 신선 세포 그룹, CPA 그룹, TCPA 그룹 및 양성 대조군을 포함한 PBHSC의 미토콘드리아 활성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 집락 형성 전위 테스트. 새로운 PBHSC와 비교하여 CFU-E, BFU-E, CFU-GM 및 CFU-GEMM을 포함한 CPA, TCPA로 보존된 PBHSC의 집락 형성 가능성. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: 총 콜로니 수. 신선 세포 그룹의 총 집락 수는 70.33(n=6, SD=14.02)이었고, CPA 그룹의 총 집락 수는 65.33(n=6, SD = 8.07)이었고, TCPA 그룹의 총 집락 수는 46.17(n=6, SD = 8.50)이었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-7
그림 7: 동물 실험에 의한 CPA의 안전성 평가. 10x 해상도로 촬영한 대표 이미지는 A1-B2에 나와 있습니다. (가, 나) 뉴질랜드 토끼에서 CPA의 혈관 자극 평가. A1 및 B1은 각각 마지막 투여 후 72시간 및 14일 후에 작성된 음성 대조군의 병리학적 조직 절편 다이어그램입니다. A2 및 B2는 각각 마지막 투여 후 72시간 및 14일 후에 작성된 CPA 그룹의 병리학적 조직 절편 다이어그램입니다. (C) 토끼 적혈구 용혈의 체외 모니터링. a-e로 표시된 튜브는 CPA 그룹을, f로 표시된 튜브는 음성 대조군을, g로 표시된 튜브는 양성 대조군을 나타냅니다. CPA 그룹과 음성 대조군에서는 용혈이 발생하지 않은 반면, 양성 대조군에서는 용혈이 발생했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 8: PBHSC 하위 모집단 분석. CPA 및 TCPA로 보존된 6명의 환자로부터 (A) CLP, (B) MEP 및 (C). (A) CPA와 TCPA의 평균 CLP 비율은 16.38%(n=6, SD=13.53)와 8.97%(n=6, SD=7.88)였으며, CPA에서 동결된 PBHSC의 CLP 하위 모집단은 TCPA보다 높았다. p > CPA 및 TCPA에 대해 0.05(T-test). (B) CPA 및 TCPA의 평균 MEP 비율은 61.07%(n = 6, SD = 12.85) 및 55.4%(n = 6, SD = 11.37)였으며, CPA에서 동결된 PBHSC의 MEP 하위 모집단은 TCPA보다 높았습니다. p > CPA 및 TCPA에 대해 0.05(T-test). (C) CPA와 TCPA의 평균 GMP 비율은 62.68%(n=6, SD=8.20)와 64.70%(n=6, SD=11.66)였으며, CPA에서 동결된 PBHSC의 GMP 하위 모집단은 TCPA보다 높았다. p > CPA 및 TCPA에 대해 0.05(T-test). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CPA의 구성 요소농도 비율TCPA의 구성 요소농도 비율
디메틸 설폭사이드4%(V/V)디메틸 설폭사이드10%(V/V)
인간 알부민5% (m/v)인간 알부민5% (m/v)
포도당2% (m/v)--
덱스트란 402% (m/v)--
글리세로인산나트륨0.5% (m/v)--

표 1: CPA와 TCPA의 성분 및 농도 비율.

그룹동물 번호다양한 정도의 과민성을 가진 동물의 수
마이너스약하게 긍정적플러스스트롱 포지티브매우 강한 긍정
네거티브 컨트롤880000
포지티브 컨트롤800053
CPA 낮은 복용량880000
CPA 고용량880000

표 2: CPA 처리 후 기니피그의 과민 반응. 음성 대조군, CPA 저용량 그룹, CPA 고용량 그룹은 모두 음성 과민 반응을 보였다. 대조적으로, 양성 대조군의 모든 기니피그는 강한 양성 과민 반응을 보였으며, 3마리의 기니피그는 아나필락시스를 경험했습니다.

그룹번호 매기기투여 용량(mL)무게 (g)
0시간24시간48시간72시간
네거티브 컨트롤11011.121.4522.0822.8423.14
1102120.1720.9821.4922.29
1103119.5420.4221.3621.81
1104118.6719.3820.2521.21
11050.917.6718.3419.4220.28
실험군21061.121.4221.9722.3523.02
2107120.6721.3221.8422.44
2108119.1220.2221.2422.55
2109118.6219.3120.0221.24
21100.917.5718.8319.4120.28

표 3: 급성 독성 실험에서 마우스 체중 요약. 음성 대조군과 실험군은 약물 투여 후 유의미한 체중 감소를 보이지 않았다. 모든 실험 동물의 체중은 투여 후 24시간, 48시간 및 72시간 동안 기존 사료 공급 후 합리적인 범위 내에서 점차적으로 증가했습니다.

그룹번호 매기기투여 용량(mL)관찰 시간
4시간24시간48시간72시간
네거티브 컨트롤11011.1----
11021----
11031----
11041----
11050.9----
실험군21061.1----
21071----
21081----
21091----
21100.9----

표 4: 마우스의 급성 전신 독성 관찰. 표에서 -는 급성 전신 독성 반응이 없음을 의미합니다. 음성 대조군과 실험군은 투여 후 4시간, 24시간, 48시간 및 72시간 동안 투여 후 급성 전신 독성 반응을 보이지 않았습니다.

환자 특성우리의 연구문헌에 보고됨
N652
연령53 (35-61)55 (21-66)
밀리미터024
헥토리터223
자금익(AML)20
CGHL/NHL10
PMBL/NHL10
다른 질병 유형05
방사선 요법 기반234
화학 요법 기반318
아니요. 이식된 CD34+ 세포(106 /kg)4.1 (2.9-5.4)6.5 (1.5-24.7)
ANC >0.5×109 /L 회복 (중앙일, 범위, 비정상 데이터는 제외됨)10 (8-11)11 (10-13)
PLT >20×109 /L 회복 (중앙일, 범위, 비정상 데이터는 제외)11 (9-16)12.5 (0-19)
구역질이 납니다015
구 토04
어지럽습니다01
모든 합병증020

표 5: HSCT 데이터 통계. ASCT 후 환자의 특성과 조혈 회복.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구에서는 PBHSC의 동결 보존을 위한 새로운 CPA를 평가했습니다. 결과는 CPA가 TCPA에 비해 PBHSC의 보존 생존력을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, CPA로 보존된 PBHSC의 회수율은 TCPA의 회수율을 10% 이상 초과했습니다. 줄기세포에서 세포골격(cytoskeleton)의 무결성은 줄기세포의 활성과 분화 기능을 유지하기 위한 기본 요건이다35,36. 세포 수준에서, CPA로 보존된 PBHSC의 미세필라멘트와 미세소관 구조가 모두 TCPA 그룹보다 더 온전하며, 미세소관 구조가 현저히 더 명확하다는 것을 관찰했습니다. 미토콘드리아는 세포의 에너지 공장입니다. 미토콘드리아는 세포 호흡, 신진대사 및 기타 생명 활동에 직접 관여하며, 이는 세포 활동을 유지하는 데 필수적인 세포 기관입니다37. 미토콘드리아 활성은 냉동 보존 및 회복 후 조혈 줄기 세포 기능의 중요한 지표입니다. 미토콘드리아 활동 측면에서 CPA 그룹은 새로운 PBHSC와 유사성을 보였습니다. 미토콘드리아 복합체를 직접 관찰한 결과, CPA 그룹의 수가 TCPA 그룹의 수를 능가하는 것으로 나타났습니다. 또한, 각 그룹에서 보존된 미토콘드리아 활성을 정량적으로 평가하기 위해 유세포 분석을 활용했습니다. 그 결과 CPA와 신선 세포 그룹 간에 유의한 차이는 없었지만, 활성은 TCPA 그룹에 비해 CPA 그룹에서 8.5% 더 높았습니다. 미토콘드리아 활성 데이터의 이러한 비교는 세포 회복 생존 가능성 발견을 확증합니다. 또한 집락 형성 분석은 CPA로 보존된 PBHSC가 분화 잠재력을 유지한다는 것을 보여주었습니다. CPA 그룹은 유도 후 더 많은 수의 콜로니를 보였으며, 이는 CPA의 우수한 보존 효능을 더욱 입증했습니다.

본 연구의 목적은 CPA를 임상혈구에 적용하여 보존 후 PBHSC의 활성을 개선하고 이식 성공률을 확보하는 것이었습니다. CPA를 임상시험에 적용하기 전에 실험동물에 대한 안전성 평가를 수행하여 임상 적용에서 CPA의 안전성에 대한 데이터 지원을 제공했습니다. 이전 연구에 따르면 일부 새로운 CPA는 내피 세포(MHECT-5) 및 배아에 대한 최고의 동결 보존 기술로 확인되었습니다38,39. PBHSC의 보존을 위한 CPA의 임상적 적용에서, 우리는 HSCT를 위해 6명의 환자로부터 PBHSC를 성공적으로 동결보존했습니다. 특히 CPA를 사용한 1단계 동결 보존 방법은 시료 보존 프로세스를 크게 간소화했습니다. 이 방법은 이전에 보고된 조혈 줄기세포에 대한 1단계 동결 보존 기술과 비교하여 더 낮은 농도의 DMSO를 활용했으며, 이는 임상 응용 분야에서 상당한 발전입니다. 6명의 환자 중 5명은 이식 수술을 성공적으로 받았습니다. 나머지 환자는 질병의 재발로 인해 대체 치료를 받았습니다. 이식을 완료한 5명의 환자에 대한 기능적 재건 주기에 대한 통계적 평가를 실시했습니다. 감염으로 인해 재건 주기가 연장된 1건의 사례를 제외하고, 조혈 및 면역 기능의 재구성에 걸리는 평균 시간은 11일로 이전 문헌에 인용된 12.5일보다 빨랐습니다. 결정적으로, 이식 과정에서 독성은 관찰되지 않았습니다. 이 결과는 TCPA 방법에서 사용된 10%(v/v) 농도에 비해 CPA 방법에서 DMSO의 최종 농도가 2%에 불과했다는 점을 고려할 때 특히 주목할 만합니다. 부작용을 최소화하기 위해 CPA에서 더 낮은 DMSO 농도를 성공적으로 사용한 것은 우리의 전략을 입증하고 임상 효능에 필수적입니다.

본 연구에서 관찰된 신속한 기능 재구성에 비추어, 우리는 수혈된 CD34+ 세포의 수에서 잠재적인 차이를 추가로 조사했습니다. 통계적 분석에 의하면 수혈된 CD34+ 세포의 수는 평균 2.4 x 106 cells/kg으로 이전 문헌40에 보고된 수치보다 낮았다. 이를 통해 CPA가 조혈 및 면역 재구성에 중요한 PBHSC 내의 특정 하위 집단에 대해 우수한 보호를 제공할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 이 가설을 탐구하기 위해 CPA와 TCPA로 보존된 PBHSC에서 CLP, GMP 및 MEP의 하위 모집단에 대한 자세한 분석을 수행했습니다. 그 결과, CPA로 보존된 PBHSC에서 CLP 및 MEP의 하위 집단은 TCPA로 보존된 하위 집단에 비해 증가한 반면, GMP의 하위 집단에서는 유의한 차이가 없는 것으로 나타났습니다. CLP는 인체에서 T 세포, B 세포 및 NK 세포로 분화 할 수 있습니다. CLP의 용량을 늘리면 면역 재구성을 촉진할 수 있다33. MEP는 적혈구와 혈소판으로 분화할 수 있다41. CPA의 글리세로인산나트륨은 글리세로인산염 셔틀을 통해 미토콘드리아 ATP 합성을 향상시켜 냉동 보존으로 인한 에너지 결핍을 해결합니다. 이는 림프구 분화를 위해 해당과정에 의존하는 CLP 세포에 매우 중요합니다42. 또한 TCPA 생존율의 높은 표준 편차가 CPA보다 높았으며(7.47 대 2.72, 그림 3) 이는 불안정한 동결 조건으로 인한 TCPA 결과의 변동성을 나타냅니다. 따라서 CLP와 MEP의 향상된 보존이 조혈 및 면역 기능의 회복 시간을 단축하는 데 중요한 요소가 될 수 있다고 제안합니다. CLP 및 MEP 하위 그룹에 대한 CPA의 우수한 보호 효과는 임상 수혈 요법 중 더 빠른 기능 재건을 촉진하는 것으로 보입니다. 이는 치료 결과를 개선할 뿐만 아니라 이식 수술을 받는 환자의 치료 기간과 비용을 줄여줍니다. 본질적으로, 우리의 방법은 HSCT에 대한 보다 경제적인 접근 방식을 제공하여 환자 치료의 임상 및 경제적 측면을 모두 최적화합니다.

DMSO를 대체할 수 있는 물질을 식별하기 위한 지속적인 연구 노력에도 불구하고 대안을 찾는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이 분야에서 새로운 기술과 물질이 등장한다는 보고가 있었지만43,44, 이러한 새로운 화합물에 대한 엄격한 체외 안전성 입증은 여전히 부족합니다. 마찬가지로, 특히 불순물 연구와 관련하여 임상적 사용에 대한 안전성과 효능을 확인할 수 있는 증거가 충분하지 않습니다. 따라서 이러한 새로운 물질은 임상 환경에 적용하기 전에 광범위한 검증이 필요합니다. 이러한 맥락에서 우리는 효과적인 세포 보존을 보장하면서 DMSO의 사용을 최적화하는 것이 임상 적용에서 가장 실행 가능한 전략이라고 믿습니다. 이전 연구에서는 세포 내 ATP 생산 및 미토콘드리아 활성 조절에서 글리세로인산염 셔틀의 역할을 강조했습니다45,46. 이러한 이해를 바탕으로 우리는 글리세로인산나트륨을 CPA에 통합하는 것이 전통적으로 TCPA에서 삼투압 보호제로 사용되는 DMSO의 상당 부분을 대체하는 효과적인 전략이 될 수 있다고 제안합니다. 저 디메틸 설폭 시드 대안에 대한 최근 연구에 대한 언급이 없는데,이 방법의 일부 참신함을 시사합니다.

전반적으로 당사의 냉동 보존 프로토콜의 핵심 단계에는 (i) 2%(v/v)에서 정밀한 DMSO 농도 제어, (ii) -1°C/min의 제어된 냉각 속도 및 (iii) 37°C 수조에서 급속 해동이 포함됩니다. 이러한 단계는 최소한의 삼투압 스트레스와 얼음 결정 형성을 보장합니다. 특히, 감소된 DMSO 농도는 기존의 10% DMSO 용액과 관련된 세포 독성 문제를 직접 해결합니다47. 제어된 냉각은 중간엽 줄기세포 동결보존(mesenchymal stem cell cryopreservation)48에서 검증된 바와 같이 세포 내 얼음 손상을 방지하며, 빠른 해동은 해동 후 생존력에 중요한 요소인 미토콘드리아 기능을 보존합니다49. 우리는 세 가지 측면을 최적화했습니다: (i) 혼합 방법: 초기 시험에서 CPA 추가 중 세포 응집이 밝혀졌습니다. 500rpm에서 볼텍싱을 사용한 적하 혼합으로 전환하여 응집이 제거되었습니다. (ii) 염색 프로토콜: 0.05% Tween-20을 함유한 PBS로 세포를 사전 세척하면 항체 침투 효율이 18% 향상되었습니다. (iii) 해동 일관성: 표준화된 120초 해동 기간을 구현하면 회수율의 변동성을 방지할 수 있었습니다(파일럿 연구의 ± 7%에 비해 ± 2%). 낮은 콜로니 수와 같은 일반적인 문제의 경우, MethoCult 매체 부피를 접시당 2mL로 늘리고 습도 조절(>95%)을 통해 이 문제를 해결하여 조혈전구배양 표준물질50에 부합했습니다. 두 가지 제한 사항에 주의해야 합니다: (i) 하위 모집단 편향: CPA는 CLP 및 MEP 하위 집합을 효과적으로 보존하지만, CD34+CD38-CD90+ 장기 HSC와 같은 희귀 모집단은 새로운 대조군에 비해 12% 낮은 회복율을 보입니다(p = 0.03). (ii) 정성적 이미지를 기반으로 하는 세포골격 무결성 평가를 위해 일부 정량적 지표(예: 형광 강도, 구조 점수)를 보다 신뢰할 수 있는 분석에 통합해야 합니다. 당사의 CPA 방법은 다음을 통해 현재 관행을 발전시킵니다: (i) 안전성 향상: 용혈률이 해동 후 24시간 후에 8.2%(TCPA)에서 1.5%(CPA)로 감소했습니다(p < 0.001). (ii) 기능적 우월성: CPA 보존 세포는 TCPA에 비해 CFU-GEMM 집락 형성이 23% 더 높았으며, 이는 다계통 생착에 매우 중요했습니다51. (iii) 임상적 효율성: 2.4 x 106 CD34+ cells/kg의 이식 성공률(문헌 표준 ≥ 4 x 106)은 효능이 향상되었음을 시사합니다. 이 기술은 (i) 유전자 변형 HSC 저장: CPA의 미토콘드리아 보호는 동결 보존 중에 CRISPR 편집 세포를 안정화할 수 있습니다52. (ii) 오가노이드 뱅킹(Organoid banking): 예비 데이터에 따르면 CPA가 보존된 장 오가노이드에서 89%의 생존율이 있는 반면 TCPA에서는 54%의 생존율이 나타났습니다(n=3). (iii) 글로벌 유통 네트워크: DMSO 함량이 낮으면 상변화 물질을 사용하여 주변 온도 수송 시험을 수행할 수 있습니다53.

공개 사항

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모든 저자는 잠재적인 이해 상충으로 해석될 수 있는 상업적 또는 재정적 관계가 없는 상태에서 연구가 수행되었음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 Nanshan District Medical Key Discipline Construction Financial Support Project, Shenzhen Nanshan District Health System Science and Technology Major Project(No. NSZD2023018), NHC 원자력 기술 의료 변혁 핵심 연구소(Mianyang Central Hospital; 보조금 No.2023HYX033).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
35 - mm 세포 배양 접시LABSELECT12111
아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드CountstarGMS10139.10
Actin-Tracker Green-488 BeyotimeC1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)BeyotimeA0423
Annexin V-FITCBD556420
벤치탑 자동 이미지 세포분석기CountstarRigel-S2
세포 보존 솔루션 XBBC-02Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
ColchicineBeijing Biolab Technology Co., Ltd. (콜히친 베이징 바이오랩 테크놀로지 유한회사)BP0857
컨포칼 레이저 스캐닝 현미경ZeissLSM880
Cytochalasin BShanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.K0006
DAPI 염색 키트Beijing Biolab Technology Co., Ltd.HR0453
DMSOPanreacapplichemA3672
FBSGibco10099-141
플로우 사이토미터BDFACSLSR포르테사
글리세롤   AMRESCO854
인간 알부민SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.SBJ-DB2044
과산화수소Sigma-AldrichH1009
면역염색 세척 완충액Beijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1124
도립 현미경Nikon CorporationECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Deep RedThermo Fisher ScientificT34077
MethoCult MediumSTEMCELL technologies4531
PBSGibco10010023
Phalloidin-iFluor 488Xian Biolite Biotech Co., Ltd.23115
생리식염수Beijing Biolab Technology Co., Ltd.GL1735
프로피듐 요오드화물BDBDB556463
로다민 123시그마-알드리치R8004
RPMI1640Gibco11875093
Thermo Scientific Forma Steri-Cycle CO2 인큐베이터Thermo Fisher Scientific371
볼텍스 믹서Nanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.DMT-201ZT
YB020050 YB020100

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