방법 논문

대장균 BL21 균주의 특정 외인성 DNA에 대한 블루라이트 유도성 반무작위 돌연변이 유발

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DOI:

10.3791/68283

⸱

2025년 6월 20일

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

이 논문에서

요약

요약된 프로토콜은 대장균의 외인성 DNA에서만 돌연변이를 생성하면서 모든 외인성 DNA를 인식하는 간소화된 방법을 설명합니다.

초록

돌연변이 유발 기술은 변이 육종(variant breeding), 유도 진화(directed evolution) 및 단백질 공학(protein engineering)에 널리 사용되어 왔습니다. 그러나 대부분의 방법은 제어할 수 없는 무작위 게놈 DNA 돌연변이만 유도하여 기형이나 치명적인 영향을 유발할 수 있습니다. 여기에서 시토신 염기 편집기(CBE), 청색광 유도성 p-Mag/n-Mag 요소 및 분할 T7 RNA 중합효소의 세 가지 시스템을 융합함으로써 이 개략적인 방법은 청색광 제어 가능, DNA 영역 특이적, 반무작위 돌연변이 유발 시스템을 통합합니다.

이 시스템은 T7 promoter에서 시작하여 T7 terminator에서 끝나는 DNA의 cytosine을 thymine으로 돌연변이시킬 수 있습니다. T7 프로모터의 다운스트림에 있는 모든 외인성 유전자는 잠재적으로 돌연변이가 발생할 수 있습니다. 이러한 도구는 또한 시스템을 청색광으로 제어할 수 있도록 두 부분으로 설계되었습니다. 첫 번째 부분은 CBE와 n-Mag 및 N-terminal-T7 RNA 중합효소 유전자를 융합하여 만들어졌습니다. 두 번째 부분은 p-Mag와 C-terminal-T7 RNA 중합효소를 융합하는 것이었습니다. 청색광 아래에서, 이 두 부분은 T7 promoter와 T7 terminator 사이의 DNA에서 돌연변이 생성기로 기능하도록 조립되었습니다. 청색광이 없으면 p-Mag가 n-Mag에서 분리되어 CBE가 DNA를 편집하지 못하게 됩니다.

이 프로토콜의 목적은 청색광 제어로 Escherichia coli 에서 지역 특이적 무작위 돌연변이를 생성하고 돌연변이된 플라스미드를 추가로 검증하는 것입니다. 이 시스템은 관심 유전자의 기능을 선택할 수 있는 생체 내 진화 시스템에 적용할 수 있으며, 추가 연구를 위해 원하는 돌연변이를 수집할 수 있습니다.

서론

무작위 돌연변이와 자연선택은 진화를 이끄는 핵심 동력이며, 이는 종 전반에 걸쳐 큰 유전적 변이를 생성했습니다. 진화 과정은 최적화되거나 새로운 기능을 가진 단백질을 엔지니어링하는 강력한 도구로 활용되어 왔습니다1. DNA 복제로 인한 자연 돌연변이 비율은 여러 원핵생물과 진핵생물에서 세포 분열 당 약 109 염기 중 하나로 추정됩니다2. 낮은 자연 돌연변이 비율은 실험실에서 큰 유전적 다양성을 생성하는 것을 비현실적으로 만듭니다. 연구는 합리적인 시간 내에 주어진 유전자에서 가능한 한 많은 부위를 커버하기 위해 돌연변이 속도를 증가시키는 방법을 개발하는 데 중점을 두었습니다.

실험실 진화 연구에서 더 높은 돌연변이 비율을 달성하기 위해 여러 시스템이 개발되었습니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 체외 진화 시스템은 오류가 발생하기 쉬운 PCR, 부위 지정 포화 돌연변이 유발 또는 컴퓨터 라이브러리 설계를 활용하여 관심 유전자에 돌연변이를 도입합니다1. DNA 라이브러리는 단백질 산물이 스크리닝되거나 선택되는 숙주 세포로 변환됩니다. 체외 진화(in vitro evolution)에서 돌연변이 유발(mutagenesis)과 선택 단계(selection stage)는 연결되어 있지 않기 때문에 생성될 수 있는 개체군의 효율성과 규모가 제한됩니다11. In vivo evolution system은 세포에 돌연변이 시스템을 도입하고 돌연변이 유발 및 선택 단계를 결합하여 지속적인 진화를 가능하게 함으로써 한계를 극복했습니다. 초기의 생체 내 돌연변이 유발 방법은 화학적 돌연변이 유발 물질3,4 및 돌 연변이 균주 5,6 를 사용했습니다. 그러나 이러한 방법은 낮은 돌연변이 비율, 제어 부족, 좁거나 고르지 않은 돌연변이 스펙트럼12 등의 단점이 있습니다. 최근 연구에서는 직교 오류가 발생하기 쉬운 DNA 복제 시스템인 OrthoRep으로 대표되는 새롭고 개선된 생체 내 진화 시스템을 개발했습니다 7,8; MutaT7, 시티딘 데아미나제와 T7 RNA 중합효소의 융합9; 및 EvolvR, nickase Cas9와 오류가 발생하기 쉬운 DNA 중합효소10의 융합. 이러한 방법은 숙주 셀, 대상 컨텍스트 및 구현 용이성이 다릅니다.

MutaT7 시스템의 핵심 구성 요소인 T7 RNA 중합효소(T7 RNAP)는 합성 생물학 분야에서 광범위하게 연구되고 엔지니어링되었습니다. T7 RNAP의 단편은 자원 할당자(resource allocator)(13)를 구축하기 위해 서로 다른 시점의 서로 다른 레벨에서 함께 발현되었다. 프로모터 특이성이 다른 C-말단 단편이 있는 분할 T7 RNAP가 구축되어 AND logic gate14를 생성했습니다. T7 RNAP 단편이 조립되어 기능적 중합효소를 재구성하는 능력은 T7 RNAP의 각 N- 및 C 말단에 융합된 상호 작용 파트너의 이합체화가 전사 출력을 생성하는 광 및 소분자 활성화 바이오센서의 개발로 이어졌습니다15. 또한 분할된 T7 RNAP는 대장균16에서 광 유도 유전자 발현 제어를 구축하기 위해 n-Mag 및 p-Mag 도메인과 융합되었습니다. 청색광이 활성화되면 자석 도메인이 이합체화되어 split T7 RNAP의 두 영역이 공간적으로 가까워져 중합효소 기능을 수행합니다. 이 시스템은 낮은 기저 발현과 넓은 동적 범위로 유전자 발현의 정밀한 시공간 제어를 가능하게 합니다.

이 논문은 청색광 제어 가능한 생체 내 반무작위 돌연변이 유발 시스템을 구축하기 위한 프로토콜을 제시합니다(그림 1). n-Mag-N-T7 RNAP에 융합된 rAPOBEC1 데아미나제를 기반으로 합니다. 동일한 플라스미드에서 p-Mag-C-T7 RNAP의 동시 발현은 중합효소 및 염기 편집 활성의 청색광 제어를 가능하게 합니다. 이 시스템은 rAPOBEC1의 기본 편집 용량과 광 제어 분할 T7 RNAP을 결합합니다. 녹색 형광 단백질(GFP)을 표적 유전자로 사용하여 E. coli 에서 검증되었으며, 그 강도는 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 선택됩니다. 원래의 MutaT7 시스템과 비교했을 때, 당사의 청색광 제어 시스템은 빛의 간격을 조절하여 표적 유전자에 반무작위 돌연변이를 도입합니다. 표적 유전자의 모든 시토신을 우라실 염기로 전환하는 대신, 광 제어를 통해 뉴클레오티드의 하위 집합을 편집하여 더 큰 돌연변이 프로파일을 생성합니다. 이 시스템은 GFP가 다른 관심 유전자로 대체될 수 있고 세포 적합성 또는 생존에 의해 기능을 선택할 수 있는 생체 내 진화 시스템에 쉽게 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

다음 프로토콜은 CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 유발 시스템을 사용하여 외인성 DNA 돌연변이 유발 설계를 수행하는 방법을 간략하게 설명합니다(1단계). 외인성 DNA 플라스미드가 구축되면 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 E. coli BL21 균주에서 CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 유발을 발현하기 위한 두 플라스미드의 형질전환 단계를 설명한 다음 돌연변이 유발을 시작하는 청색광을 조사합니다(단계 2-9.2). GFP 또는 외인성 DNA에서 얼마나 많은 돌연변이가 생성되었는지 평가하기 위한 품질 관리 단계는 Sanger 염기서열분석(단계 9.3-11.2)을 사용하여 수행되었습니다.

1. 외인성 DNA를 설계하고 CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 유발 시스템을 구축합니다.

  1. 온라인 도구(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene 또는 https://www.uniprot.org/)를 사용하여 외인성 DNA 또는 cDNA 염기서열분석을 찾습니다.
    참고: 여기에서는 GFP 염기서열을 시토신 돌연변이 유발을 위한 외인성 DNA로 사용했습니다.
  2. 적절한 클로닝 키트를 사용하여 gfp DNA를 관심 DNA로 교체합니다.
    참고: DNA 콜로니 어셈블리 키트의 원래 플라스미드에서 gfp DNA를 제거하기 위해 NheI를 사용합니다. 대안은 DNA 합성을 위해 회사와 협력하는 것입니다. 플라스미드 염기서열에 대해서는 Supplemental File 1 을 참조하십시오.
  3. CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 유발 시스템과 함께 모든 유전자를 합성하고 암피실린 내성이 있는 pET-11a 골격에 통합합니다.
    참고: 우리는 이 플라스미드를 만들기 위해 DNA 합성 회사와 협력했으며, 표적 플라스미드를 포함하는 글리세롤 원균을 얻었습니다.

2. 세균 균주 활성화

  1. 100μg/mL 암피실린이 함유된 LB 한천 플레이트의 가장자리에 글리세롤 스톡 박테리아 10μL를 피펫팅합니다. 멸균 루프를 사용하여 플레이트를 가로질러 이 지점의 박테리아를 줄무늬로 만듭니다.
  2. 박테리아 배양기에서 37°C의 플레이트를 하룻밤 동안 거꾸로 배양합니다.

3. 플라스미드 증폭

  1. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 100μg/mL 암피실린이 함유된 15mL LB 배지가 있는 50mL 원뿔형 튜브에 접종합니다.
  2. 배양물을 37°C, 180rpm에서 14-16시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣습니다.

4. 플라스미드 추출

  1. 하룻밤 동안 배양한 박테리아 5-15mL를 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 18,894 × g 에서 1분 동안 원심분리기
  2. 박테리아 펠릿을 수집하고 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 볼텍싱(vortexing) 또는 피펫팅(pipetting)을 통해 500μL의 부유 완충액에 박테리아 펠릿을 재현탁시킵니다.
  3. 튜브에 500μL의 용해 완충액을 추가하고 튜브를 8-10x 반전시켜 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 방치하여 세포를 용해합니다.
    알림: 눈에 보이는 흰색 응집 물질이 남아 있지 않은지 확인하여 완전한 용해를 확인합니다.
  4. 200μL의 평형 완충액을 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼에 추가합니다. 18,894 ×g에서 2 분 동안 원 심분리기를 사용하고 플로우스루를 버립니다. 컬럼을 수집 튜브에 다시 놓습니다.
  5. 박테리아 용해물에 500μL의 중화 완충액을 추가하고 흰색 침전물이 나타날 때까지 튜브를 8-10x 뒤집어 부드럽게 혼합한 다음 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다.
  6. 18,894 × g 에서 5분 동안 원심분리기를 가열하고 상층액을 필터 컬럼으로 옮깁니다. 18,894 × g 에서 1분 동안 원심분리기를 사용하여 용액을 여과합니다.
  7. 여과 된 용액에 이소프로판올 부피의 0.3 배를 추가하고 반전하여 혼합합니다. 혼합물을 평형화된 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
  8. 18,894 ×g에서 1 분 동안 원 심분리기를 진행한 후 플로우스루를 버리고 컬럼을 다시 수집 튜브에 넣습니다.
  9. 750μL의 세척 버퍼로 컬럼을 세척하고 18,894× g 에서 1분 동안 원심분리한 다음 플로우스루를 버립니다.
  10. 18,894 ×g에서 1 분 동안 컬럼 을 다시 원심분리하여 잔류 세척 버퍼를 제거합니다.
  11. 스핀 컬럼을 새 원심분리기 튜브에 놓습니다. 100-200μL의 용리 완충액을 컬럼 멤브레인 중앙에 추가합니다. 실온에서 2-5분 동안 그대로 두고 18,894× g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 플라스미드 DNA를 -20 °C에서 보관하십시오.

5. 플라스미드 형질전환(E. coli BL21 화학적 수용 세포)

  1. 얼음에서 해동된 BL21 화학적 수용 세포 50μL를 취합니다. 4.11 단계의 플라스미드 DNA 2 μL를 넣고 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  2. 42°C에서 45초 동안 열 충격을 가한 다음 즉시 튜브를 다시 얼음으로 2분 동안 옮깁니다.
  3. 각 튜브에 500μL의 멸균 LB 배지를 추가합니다. 회복을 위해 37 ° C, 180 rpm에서 1 시간 동안 배양합니다.
  4. 1,000 × g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 과도한 상등액을 버리고 약 100 μL를 남깁니다. 100 μg/mL 암피실린이 함유된 LB 한천에 세포와 플레이트를 재현탁합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 거꾸로 배양합니다.

6. CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 발생 Generator (비활성 형태) 발현

  1. 5.1-5.4단계를 수행합니다. 세포를 퍼뜨리기 전에 암피실린으로 LB 한천 표면에 1mM IPTG를 균일하게 도포합니다. 탈이온수를 대조군으로 사용하여 IPTG 처리 그룹과 비교합니다.
  2. 모든 콜로니를 성장시킨 후 10-20개의 콜로니를 선택하여 페놀 스크류 캡과 고무 라이너가 있는 100mL 둥근 바닥 유리관에 1mM IPTG를 포함하는 5mL의 LB 배지에서 16°C, 180rpm 동안 8시간 동안 배양합니다.
    참고: 모든 콜로니는 7단계를 진행하기 전에 단기 보관을 위해 4°C에서 보관할 수 있습니다.

7. CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 발생기 활성화

  1. 페놀 나사 캡과 고무 라이너가 있는 100mL 둥근 바닥 유리관에 박테리아를 넣고 18,894×g에서 2 분 동안 원 심분리기를 사용합니다.
  2. IPTG 없이 매체를 LB 매체로 변경합니다.
    참고: 이 단계는 CBE-Mag-T7 중합효소 돌연변이 발생기가 스스로 편집할 수 없도록 하는 데 중요합니다. 당사는 CBE-Mag-T7 중합효소 유전자 클러스터를 보호하기 위해 lacI/O 시스템을 설계했습니다.
  3. 1개의 청색광 조사기(470nm, 4mW/cm2)를 플레이트에 조사하면서 미리 정해진 시간 동안 37°C에서 배양합니다. Sanger 염기서열분석을 수행하여 돌연변이를 확인하고 더 오래 노출되면 돌연변이 빈도가 증가하는지 확인합니다.
    참고: 여기서는 블루라이트 노출을 0, 8, 16, 24시간으로 설정합니다.

8. 단백질 기능 증가 및 지속적인 돌연변이 유발을 위한 돌연변이 선택

참고: 여기에서는 gfp 유전자를 돌연변이 유발을 위한 외인성 DNA로 사용하며 GFP 단백질의 형광 강도를 향상시킬 수 있는 돌연변이를 찾고 있습니다.

  1. 콜로니를 선택하고, 플레이트의 위치를 표시하고, 수집된 콜로니를 100μL의 ddH2O에 접종합니다.
  2. 100μL의 박테리아 현탁액을 96웰 플레이트로 옮기고 Ex/Em = 488/510nm에서 GFP 강도를 판독합니다.
  3. 몇 가지 명백한 군체를 식별할 수 있을 때까지 6.3-9.2단계를 반복합니다.

9. 돌연변이 유발을 중지하고 돌연변이를 확인합니다.

  1. 몇 시간 동안 청색광 조사를 수행한 후 모든 박테리아를 4°C의 어두운 곳으로 다시 15분 동안 이동합니다.
  2. 4단계에서 설명한 것과 동일한 플라스미드 추출 단계를 따릅니다.
  3. Sanger 염기서열분석을 위한 정방향 및 역방향 프라이머를 설계합니다.
    참고: 여기에서는 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT를 순방향 프라이머로 사용하고 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG를 Sanger 염기서열분석을 위한 역방향 프라이머로 사용합니다.

10. 데이터 분석 및 돌연변이 빈도 계산

  1. .ab1 파일을 열어 변형을 보고 피크를 수동으로 확인합니다.
  2. 온라인 도구(예: Mutation Surveyor 도구)를 사용하여 돌연변이 빈도를 분석합니다.
  3. Sanger 데이터 파일을 온라인 도구에 업로드하고 돌연변이 속도 분석을 시작합니다.

11. 세균성 글리세롤 스톡 준비

  1. 100μg/mL 암피실린이 함유된 5mL의 LB 배지가 들어 있는 튜브에 단일 콜로니를 접종합니다. 37 ° C, 180 rpm에서 12-16 시간 동안 배양하십시오.
  2. 박테리아 배양액과 50% 글리세롤을 1:1 비율로 혼합합니다. 1.5mL 원심분리 튜브에 부분 표본을 넣습니다. -80 °C에서 보관하십시오.

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결과

이 프로토콜에 설명된 방법은 분할 CBE-Mag-T7 RNA 중합효소 돌연변이 생성기를 사용하여 외인성 DNA에서 돌연변이를 생성하는 것입니다. CBE-Mag-T7 RNA 중합효소 돌연변이 시스템을 구축하기 위한 유전자와 돌연변이 유발을 위한 표적 유전자는 모두 pET-11a 플라스미드 골격에 통합되어 있습니다. LB-한천의 정상 및 비교 가능한 콜로니 수를 통해 알 수 있는 박테리아 게놈 DNA의 손상 없이 성공적인 형질전환과 청색광 조사가 수행되었습니다(그림 2).

외인성 DNA의 돌연변이는 Sanger 염기서열분석을 사용하여 검출되었습니다. 그림 3에서 볼 수 있듯이, 크로마토그램은 80bp 부위에서 빨간색 피크를 보여주며, 이는 청색광 조사 후 CBE-Mag-T7 RNA 중합효소 돌연변이 시스템의 시토신 염기 편집기에 의해 성공적인 돌연변이가 생성되었음을 나타냅니다....

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토론

중합효소 유도 염기 편집 도구는 2021년 Cravens 등이 단백질 융합 전략을 사용하여 처음 만들었습니다17. 4개의 DNA 뉴클레오티드에 대한 돌연변이는 bp당 10-4 개 이상의 돌연변이보다 더 큰 비율로 성공적으로 통합되었습니다. 그러나, 연구자들에 의한 추가적인 통제 없이 T7 promotor와 terminator 사이에 돌연변이가 지속적으로 발생했기 때문에, "양호한" 돌연변이는 지속적인 편집으로부터 보존될 수 없었다18. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 두 가지 핵심 구성 요소를 기반으로 하는 분할 시스템을 통합합니다. 첫 번째 구성 요소는 여러 연구에서 널리 사용된 p-Mag 및 n-Mag 시스템입니다19. 두 번째 구성 요소는 p-Mag 및 n-Mag20으로 ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
50 mL 원추형 원심분리기 튜브송골매CLS352070
암피실린Thermo Scientific ChemicalsJ60977.14
블루라이트 조사기토랩스LIU470A
DNA 조립 복제 키트 NEBE5520S
DNA/프머스 합성BGI 유전체학
엔도프리 플라스미드 미디 키트 CWBIOCW2106S완충액 P1: 재현탁 완충액, 완충액 P2: 용해 완충액, 완충액 E3: 평형 완충액, 완충액 PS: 중화 완충액, 완충액 PW: 세척 완충액, Endo-Free 완충액 EB: DNA 정제 완충액, RNase A Endo-Remover FM: 내독소 제거 완충액, 수집 튜브가 있는 스핀 컬럼 DM
글리세롤피셔 케미칼지33-4
인큐베이티드 셰이커써모 사이언티픽SK2001CPKG
IPTG(이소프로필티오-&베타;-갈락토사이드)인비트로젠15529019
마이크로플레이트 리더써모 사이언티픽바리오스칸 LUX
현미경 라이카DMI 4000B
멀티스칸 FCThermo Scientific Chemicals
원샷 BL21(DE3) 화학적으로 유능한 대장균인비트로젠C600003
PureLink 고속 저내독소 미디 플라스미드 정제 키트인비트로젠A36227
파이렉스  페놀 스크류 캡 및 고무 라이너가 있는 견고한 둥근 바닥 원심분리기 튜브코닝  8422CLS8422100

참고문헌

  1. Packer, M. S., Liu, D. R. Methods for the directed evolution of proteins. Nat Rev Genet. 16 (7), 379-394 (2015).
  2. Lynch, M. Evolution of the mutation rate. Trends Genet. 26 (8), 345-352 (2010).
  3. Myers, R. M., Lerman, L. S., Maniatis, T. A general method for saturation mutagenesis of cloned DNA fragments. Science. 229 (4710), 242-247 (1985).
  4. Lai, Y. P., Huang, J., Wang, L. F., Li, J., Wu, Z. R. A new approach to random mutagenesis in vitro. Biotechnol Bioeng. 86 (6), 622-627 (2004).
  5. Greener, A., Callahan, M., Jerpseth, B. An efficient random mutagenesis technique using an e. Coli mutator strain. Methods Mol Biol. 57, 375-385 (1996).
  6. Esvelt, K. M., Carlson, J. C., Liu, D. R. A system for the continuous directed evolution of biomolecules. Nature. 472 (7344), 499-503 (2011).
  7. Ravikumar, A., Arrieta, A., Liu, C. C. An orthogonal DNA replication system in yeast. Nat Chem Biol. 10 (3), 175-177 (2014).
  8. Ravikumar, A., Arzumanyan, G. A., Obadi, M. K. A., Javanpour, A. A., Liu, C. C. Scalable, continuous evolution of genes at mutation rates above genomic error thresholds. Cell. 175 (7), 1946-1957.e13 (2018).
  9. Moore, C. L., Papa, L. J. 3rd, Shoulders, M. D. A processive protein chimera introduces mutations across defined DNA regions in vivo. J Am Chem Soc. 140 (37), 11560-11564 (2018).
  10. Halperin, S. O., et al. Crispr-guided DNA polymerases enable diversification of all nucleotides in a tunable window. Nature. 560 (7717), 248-252 (2018).
  11. Molina, R. S., et al. In vivo hypermutation and continuous evolution. Nat Rev Methods Primers. 2, 37(2022).
  12. Badran, A. H., Liu, D. R. Development of potent in vivo mutagenesis plasmids with broad mutational spectra. Nat Commun. 6, 8425(2015).
  13. Segall-Shapiro, T. H., Meyer, A. J., Ellington, A. D., Sontag, E. D., Voigt, C. A. A 'resource allocator' for transcription based on a highly fragmented T7 RNA polymerase. Mol Syst Biol. 10 (7), 742(2014).
  14. Shis, D. L., Bennett, M. R. Library of synthetic transcriptional and gates built with split T7 RNA polymerase mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (13), 5028-5033 (2013).
  15. Pu, J., Zinkus-Boltz, J., Dickinson, B. C. Evolution of a split RNA polymerase as a versatile biosensor platform. Nat Chem Biol. 13 (4), 432-438 (2017).
  16. Baumschlager, A., Aoki, S. K., Khammash, M. Dynamic blue light-inducible T7 RNA polymerases (Opto-T7RNAPS) for precise spatiotemporal gene expression control. ACS Synth Biol. 6 (11), 2157-2167 (2017).
  17. Cravens, A., Jamil, O. K., Kong, D., Sockolosky, J. T., Smolke, C. D. Polymerase-guided base editing enables in vivo mutagenesis and rapid protein engineering. Nat Commun. 12 (1), 1579(2021).
  18. Nayak, D., Siller, S., Guo, Q., Sousa, R. Mechanism of T7 RNAP pausing and termination at the T7 concatemer junction: A local change in transcription bubble structure drives a large change in transcription complex architecture. J Mol Biol. 376 (2), 541-553 (2008).
  19. Furuya, A., Kawano, F., Nakajima, T., Ueda, Y., Sato, M. Assembly domain-based optogenetic system for the efficient control of cellular signaling. ACS Synth Biol. 6 (6), 1086-1095 (2017).
  20. Dionisi, S., Piera, K., Baumschlager, A., Khammash, M. Implementation of a novel optogenetic tool in mammalian cells based on a split T7 RNA polymerase. ACS Synth Biol. 11 (8), 2650-2661 (2022).

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