이 프로토콜은 감염된 오리에서 기억 T 세포를 분리하여 시험 관 내에서 조류 T 세포를 배양하는 방법을 설명하며, 이를 통해 고도로 정제된 특정 오리 T 세포를 생성할 수 있습니다. 또한 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정확하게 측정하기 위해 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 방법이 확립되었습니다.
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방법 논문
체외(In Vitro ) H5N1 특이적 덕 T 세포 배양 및 세포 내 사이토카인 염색 방법을 사용한 면역 반응 검출
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
T 세포의 체외 배양은 면역 반응, 바이러스 감염 및 잠재적 치료 전략을 연구하는 데 중요한 방법입니다. 그러나 조류 T 세포 를 in vitro 에서 배양하기 위해 확립된 프로토콜은 현재까지 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 고병원성 조류인플루엔자(HPAIV) H5N1 바이러스를 모델로 하여 최초로 프로토콜을 제시하였다. 여기에서 4주 된 오리가 바이러스에 감염되었고, 감염 후 28일 후에 기억 T 림프구를 분리하여 H5N1 특이적 오리 T 림프구를 배양하여 H5N1 바이러스에 대한 특이적 면역 반응을 조사할 수 있었습니다. 프로토콜의 주요 단계에는 감염된 오리로부터 기억 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, 6시간 동안 최적의 감염 다중성(MOI = 5)으로 항원 제시 세포(APC)를 활성화하고, 재조합 IL-2 및 기타 특정 첨가제로 보충된 T 세포 배양 배지를 준비하는 것이 포함됩니다. T 세포 증식, 사이토카인 분비 및 세포 독성 활성은 프로세스 전반에 걸쳐 면밀히 모니터링되었습니다. 또한, 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정량화하기 위해 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립했습니다. 여기에는 duck IFN-γ에 특이적인 IgG3κ 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 생성한 후 성공적인 항체 정제가 포함되었습니다. 정제된 항체를 1:10으로 희석하고 유세포 분석에 적용하여 IFN-γ 분비를 정밀하게 측정했습니다. 이 방법은 오리 T 세포 반응을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공하며 조류 바이러스 면역학에 대한 향후 연구를 위한 토대를 마련합니다.
서론
T 세포의 활성화, 증식, 분화 및 기억 T 세포로의 전환 과정은 항원 특이적 면역 반응의 핵심입니다1. 초기에 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)가 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 항원 제시 세포 (APC) 표면에 제시된 항원 펩타이드를 인식 할 때 활성화됩니다2 , 3. 이 활성화 과정은 TCR이 MHC 분자에 결합하는 것뿐만 아니라 T 세포 기능을 완전히 활성화하는 데 중요한 공동 자극 신호의 조정을 필요로 합니다4. 일단 활성화되면, T 세포는 빠르게 증식 단계로 들어가 원래 T 세포와 동일한 항원 특이성을 공유하는 수많은 클론을 생성합니다. 이 증식 단계에서 T 세포는 기능에 따라 주로 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포로 분화합니다5. 이렇게 분화된 세포는 각각 세포독성 사멸을 매개하고 면역 반응을 지원합니다. 초기 감염 후, 활성화된 T 세포의 일부는 수명이 긴 기억 T 세포로 변형된다6.....
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프로토콜
사용 가능한 모든 조류 인플루엔자 A(H5N1) 바이러스에 대한 모든 실험은 South China Agricultural University(CNAS BL0011)의 프로토콜에 따라 동물 생물 안전성 3등급 실험실 및 동물 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 연구 프로젝트는 화남농업대학교(South China Agriculture University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(식별 코드 2021f154, 2021년 7월 29일)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 본 위원회가 제정한 규정 및 지침과 동물 복지에 대한 국제 표준에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물은 수컷과 암컷을 모두 포함하여 4주 된 국내 청둥오리(Anas platyrhynchos domestica)였으며 체중은 500g에서 600g 사이였습니다.
1. Duck PBMC 격리 및 단일 세포 현탁액의 준비
- 각 오리의 경정맥에서 헤파린화된 혈액 2mL를 수집하고 EDTA 함유 튜브로 옮겨 각 오리의 응고를 방지합니다.
- 제공된 샘플을 사용하여 혈액을 희석합니다.amp림프구 분리 키트 또는 PBS에서 희석제. 파스퇴....
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결과
이 프로토콜은 오리20에서 항원 특이적 T 세포 효과기 반응 검출에 대한 이전 연구를 기반으로 개발되었습니다. 실험의 첫 번째 단계는 바이러스 특이적 T 세포의 체외 배양과 관련이 있으며, 이는 후속 효과기 반응 연구의 기초 역할을 합니다. 초기에 APC는 배양되어 effector 세포와 공동 배양되었습니다. 형태학적 관찰에 따르면 증식 후 세포는 클러스터 성장을 보였습니다(그림 2A). CFSE 라벨링은 세포 분열의 여러 피크를 보여줌으로써 성공적인 증식을 더욱 확인했습니다(그림 2B). 마지막으로, 오리 특이적 세포 마커 CD8/CD4를 사용하여 세포20의 비율과 절대 수를 평가하여 항원 특이적 T 세포의 성공적인 체외 배양을 확인했습니다(그림 2C).......
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토론
이 프로토콜은 오리 항원 특이적 T 세포의 체외 배양을 위한 효율적인 방법을 제공하며, T 세포의 효과기 반응을 평가하는 데 사용할 수 있는 오리를 위한 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립합니다. 현재 오리 T 세포에 대한 체외 배양 프로토콜에 대한 발표된 보고서는 없습니다. 우리는 주로 인간 항원 특이적 T 세포에 대한 프로토콜을 참조했지만 APC의 배양 조건을 최적화하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 우리는 차별화 프로토콜의 추가 최적화를 고려하고 있습니다.
이 프로토콜에는 성공에 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오리 T 세포의 체외 배양은 충분한 T 세포 확장과 기능 보존을 보장하기 위해 항원 용량, APC 활성화 및 배양 기간을 포함한 자극 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 이러한 매개변수의 편차는 차선의 활성화 또는 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 둘째.......
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공개 사항
저자는 공개할 내용이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32473060 및 32461120064) (MD 및 ML)의 지원을 받았습니다. 광저우 기초 및 응용 기초 연구 프로젝트(2025A04J5445) (MD에게); 양쯔강 장학생 교수 프로그램의 젊은 학자(2024, Manman Dai); "광동 특별 지원 계획"의 Young Peal River Scholar(2024, Manman Dai). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL MICRO-원심분리기 튜브 | Biosharp | Cat#BS-15-M | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | Labselect | Cat#CT-002-15A | |
| 2-메르캅토에탄올(55 mM) | Sigma-Aldrich | Cat#M6250-100ML | |
| 48-웰 조직 배양 플레이트(처리되지 않음, 평평한 바닥) | Biofil | Cat#TCP000048 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Labselect | Cat#CT-002-50A | |
| 96웰 언스커트 qPCR 플레이트 | Labselect | Cat#PP-96-NS-0100 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 키트 | BD Bioscience | Cat#BD 554714 | |
| Brefeldin A (BFA) | BD Bioscience | Cat#347688 | |
| 세포 배양 CO2 인큐베이터 | Thermo Fisher | Heracell 150i GP | |
| 원심분리기 | Eppendorf | 5810R | |
| CFSE 라벨링 키트 | Abcam | Cat#ab113853 | |
| ChamQ SYBR qPCR 마스터 믹스 | Vazyme | Cat#Q341-02 | |
| 오리 말초 혈액 림프구 분리 키트 | Tbdscience | Cat#LTS1090D | |
| Evo M-MLV RT 프리믹스 | 정확한 생명공학 | Cat#AG11706 | |
| FastPure 세포/조직 총 RNA 분리 키트 V2 | Vazyme | Cat#RC112-01 | |
| 태아 소 혈청 | Gibco | Cat#10437-028 | |
| 유세포 분석기 | Beckman Coulter | BA43347 | |
| 유동 튜브 | Beyotime | Cat#FFC005 | |
| FlowJo v10.8.1 | Tree Star https://www.flowjo.com | ||
| Goat Anti-Mouse 488, 1:50 희석 | Abbkine | Cat#A23210 | |
| 염소 항마우스 IgG2b, FITC, 1:50 희석 | Southern Biotech | Cat#1091-31 | |
| 염소 항마우스 IgG3, PE, 1:250 희석 | Southern Biotech | Cat#1100-09S | |
| GraphPad 프리즘 8.0.2 | GraphPad 소프트웨어 | https://www.graphpad-prism.cn | |
| H5N1 AIV 균주 DK383 | 인수공통전염병 예방 및 통제 A | /Duck/Guangdong/383/2008 | |
| -글루타민(200mM) | Gibco | Cat#25030081 | |
| 현미경 | Motic | AE2000 | |
| 마우스 Anti-Duck CD4, 1:50 희석 | Bio-Rad | Cat#MCA2478 | |
| Mouse Anti-Duck CD8α, 1:50 희석 | GeneTex | Cat#GTX41834 | |
| 마우스 Anti-Duck IFN-&감마; mAb, 1:10 희석 | 당사 실험실에서 제조 | NA | |
| NanoDrop One 분광 광도계 | Thermo Fisher | AZY1603209 | |
| NEAA (비필수 | Gibco | Cat#11140-050 | |
| PBS | Gibco | Cat#10010023 | |
| PCR 열 순환기 | Biometra | Biometra Tone 96G | |
| 페니실린-스트렙토마이신 용액 | Gibco | Cat#15070063 | |
| Real-Time PCR 시스템 | Applied Biosystems | ABI7500 | |
| 재조합 인간 IL-2(10 & g) | USCNK | Cat#RPA111Ga01 | |
| 적혈구 용해 완충액 | Tbdscience | Cat#NH4CL2009 | |
| RPMI 1640 | Gibco | Cat#11875-119 | |
| 피루브산나트륨(100mM) | Gibco | Cat#11360-070 | |
| 트리판 블루 | 시그마-알드리치 | 고양이#93595 | |
| 2주 된 청둥오리(Sheldrake) | 오리 농장 광저우 | NA |
참고문헌
- Almeida, L., Lochner, M., Berod, L., Sparwasser, T. Metabolic pathways in T cell activation and lineage differentiation. Semin Immunol. 28 (5), 514-524 (2016).
- Weidle, U. H., Georges, G., Tiefenthaler, G. TCR-MHC/peptide interaction: prospects for new anti-tumoral agents....
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