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방법 논문

체외(In Vitro ) H5N1 특이적 덕 T 세포 배양 및 세포 내 사이토카인 염색 방법을 사용한 면역 반응 검출

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68291

⸱

2025년 5월 30일

 ,  ,  ,  , 
1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 감염된 오리에서 기억 T 세포를 분리하여 시험 관 내에서 조류 T 세포를 배양하는 방법을 설명하며, 이를 통해 고도로 정제된 특정 오리 T 세포를 생성할 수 있습니다. 또한 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정확하게 측정하기 위해 세포 내 사이토카인 염색(ICS) 방법이 확립되었습니다.

초록

T 세포의 체외 배양은 면역 반응, 바이러스 감염 및 잠재적 치료 전략을 연구하는 데 중요한 방법입니다. 그러나 조류 T 세포 를 in vitro 에서 배양하기 위해 확립된 프로토콜은 현재까지 보고되지 않았습니다. 본 연구에서는 고병원성 조류인플루엔자(HPAIV) H5N1 바이러스를 모델로 하여 최초로 프로토콜을 제시하였다. 여기에서 4주 된 오리가 바이러스에 감염되었고, 감염 후 28일 후에 기억 T 림프구를 분리하여 H5N1 특이적 오리 T 림프구를 배양하여 H5N1 바이러스에 대한 특이적 면역 반응을 조사할 수 있었습니다. 프로토콜의 주요 단계에는 감염된 오리로부터 기억 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고, 6시간 동안 최적의 감염 다중성(MOI = 5)으로 항원 제시 세포(APC)를 활성화하고, 재조합 IL-2 및 기타 특정 첨가제로 보충된 T 세포 배양 배지를 준비하는 것이 포함됩니다. T 세포 증식, 사이토카인 분비 및 세포 독성 활성은 프로세스 전반에 걸쳐 면밀히 모니터링되었습니다. 또한, 오리 T 세포에서 IFN-γ 분비를 정량화하기 위해 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립했습니다. 여기에는 duck IFN-γ에 특이적인 IgG3κ 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 생성한 후 성공적인 항체 정제가 포함되었습니다. 정제된 항체를 1:10으로 희석하고 유세포 분석에 적용하여 IFN-γ 분비를 정밀하게 측정했습니다. 이 방법은 오리 T 세포 반응을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공하며 조류 바이러스 면역학에 대한 향후 연구를 위한 토대를 마련합니다.

서론

T 세포의 활성화, 증식, 분화 및 기억 T 세포로의 전환 과정은 항원 특이적 면역 반응의 핵심입니다1. 초기에 T 세포는 T 세포 수용체 (TCR)가 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 분자에 의해 항원 제시 세포 (APC) 표면에 제시된 항원 펩타이드를 인식 할 때 활성화됩니다2 , 3. 이 활성화 과정은 TCR이 MHC 분자에 결합하는 것뿐만 아니라 T 세포 기능을 완전히 활성화하는 데 중요한 공동 자극 신호의 조정을 필요로 합니다4. 일단 활성화되면, T 세포는 빠르게 증식 단계로 들어가 원래 T 세포와 동일한 항원 특이성을 공유하는 수많은 클론을 생성합니다. 이 증식 단계에서 T 세포는 기능에 따라 주로 CD8+ T 세포와 CD4+ T 세포로 분화합니다5. 이렇게 분화된 세포는 각각 세포독성 사멸을 매개하고 면역 반응을 지원합니다. 초기 감염 후, 활성화된 T 세포의 일부는 수명이 긴 기억 T 세포로 변형된다6. 이러한 기억 T 세포는 면역 체계에 장기간 남아 있을 수 있으며, 재노출 시 동일한 병원체에 빠르게 반응할 수 있습니다. 그 결과, 이들은 더 강력하고 효율적인 면역 반응을 일으켜 숙주에 장기적인 면역 보호를 제공한다7. 이 전체 과정은 백신의 효능과 내구성을 개선하는 데 도움이 되기 때문에 T세포 백신 설계에 매우 중요합니다8.

이러한 맥락에서 항원 특이적 T 세포를 in vitro에서 배양하는 것이 필수적입니다. 이 프로토콜은 조류 면역 체계에 필요한 적응과 함께 인간 T 세포의 체외 배양을 위해 확립된 방법을 기반으로 개발되었습니다9. 연구자들은 이러한 세포를 체외로 성장시킴으로써 활성화, 증식, 분화, 기억 형성 등 다양한 면역 상태에서 T세포 반응을 연구할 수 있다10. 이 체외 접근법은 면역 반응에서 T 세포가 수행하는 역할을 이해하는 데 매우 중요합니다. 또한, 체외 배양 조건 하에서 T 세포에 의한 사이토카인(예: IFN-γ)의 분비를 모니터링할 수 있습니다11,12. 이 모니터링은 면역 반응의 품질, 강도 및 지속성을 평가하고 T 세포와 다른 면역 세포 간의 상호 작용을 연구하는 데 중요합니다. 또한, 항원 특이적 T 세포의 체외 증식은 대규모 농축을 가능하게 하고, 검출 민감도를 증가시키며, T 세포 반응 수준의 평가를 향상시킵니다13. 따라서 항원 특이적 T 세포의 체외 배양은 면역 반응에서 가금류 T 세포의 역할을 더 잘 이해할 수 있는 강력한 도구 역할을 하며, 이는 검출 민감도를 높이고 T 세포 반응 수준의 평가를 향상시킵니다. 유사한 체외 방법이 포유류 시스템에서 잘 확립되어 있지만 조류 종에 이러한 기술을 적용하는 것은 여전히 제한적입니다. 이는 T 세포 반응을 분석하기 위한 도구가 개발되지 않은 가금류 면역학과 특히 관련이 있습니다. 특히 오리는 여러 조류 인플루엔자 바이러스의 자연 저장소로 작용하지만, 항원 특이적 T 세포 면역에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 따라서 조류 시스템에 맞춘 표준화된 체외 T 세포 배양 프로토콜을 개발하는 것은 가금류의 기초 연구와 응용 면역학을 모두 발전시키는 데 필수적입니다.

이러한 과정에 관여하는 핵심 사이토카인은 주로 CD8+ T 세포, 1형 CD4+ T 세포 및NK 세포 14에서 생성되는 II형 인터페론인 IFN-γ입니다. IFN-γ는 바이러스 복제를 억제하고 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다15. IFN-γ의 발현 수준은 면역 상태를 반영하고 T 세포 활성화에 대한 마커 역할을 하여 연구자가 발현을 통해 T 세포 반응 수준을 평가할 수 있도록 합니다16,17. 면역 세포에서 사이토카인 발현을 감지하는 일반적인 방법 중 하나는 세포 내 사이토카인 염색(ICS)18,19입니다. 그러나 실험 재료와 기술의 한계로 인해 오리에 대한 연구는 포유류에 비해 뒤쳐져 있다5. 현재 많은 연구자들이 IFN-γ 발현 수준을 측정하기 위해 qPCR에 의존하고 있지만, 이 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다11. 우리 연구실에서는 유세포 분석과 호환되는 duck IFN-γ에 대한 항체를 성공적으로 개발했습니다. 이러한 성공을 바탕으로 이 연구에서는 오리 T 세포에서 IFN-γ 단백질 발현을 검출하는 ICS 방법을 확립하여 오리 T 세포 반응에 대한 추가 연구를 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공했습니다.

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프로토콜

사용 가능한 모든 조류 인플루엔자 A(H5N1) 바이러스에 대한 모든 실험은 South China Agricultural University(CNAS BL0011)의 프로토콜에 따라 동물 생물 안전성 3등급 실험실 및 동물 시설에서 수행되었습니다. 모든 동물 연구 프로젝트는 화남농업대학교(South China Agriculture University)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(식별 코드 2021f154, 2021년 7월 29일)의 승인을 받았습니다. 모든 동물 절차는 본 위원회가 제정한 규정 및 지침과 동물 복지에 대한 국제 표준에 따라 수행되었습니다. 이 연구에 사용된 동물은 수컷과 암컷을 모두 포함하여 4주 된 국내 청둥오리(Anas platyrhynchos domestica)였으며 체중은 500g에서 600g 사이였습니다.

1. Duck PBMC 격리 및 단일 세포 현탁액의 준비

  1. 각 오리의 경정맥에서 헤파린화된 혈액 2mL를 수집하고 EDTA 함유 튜브로 옮겨 각 오리의 응고를 방지합니다.
  2. 제공된 샘플을 사용하여 혈액을 희석합니다.amp림프구 분리 키트 또는 PBS에서 희석제. 파스퇴르 피펫으로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다. 일반적인 희석 비율은 혈액과 희석제의 1:1입니다.
  3. 희석된 혈액과 동일한 부피의 림프구 분리 용액을 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 림프구 분리 용액 위에 혈액 현탁액을 조심스럽게 겹쳐 놓습니다. 혼합물을 400 x g, 25°C에서 15분 동안 원심분리하고 하강 가속도를 1로 설정합니다.
    참고: 림프구 분리 용액의 양은 4mL 이상이어야 합니다. 림프구 분리 솔루션 키트의 구성 요소는 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다.
  4. 원심분리 후 원심분리기 튜브의 4개의 뚜렷한 층을 위에서 아래로 관찰합니다. 최상층은 샘플 희석제, 환형 유백색 림프구층, 분리 용액, 하단층은 적혈구로 구성됩니다.
  5. 피펫을 조심스럽게 사용하여 두 번째 층인 환형 유백색 림프구 층을 수집하고 새 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세척액 10mL를 넣어 세포와 섞습니다.
  6. 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 샘플을 원심분리합니다. 상등액을 폐기한 다음 세포 계수를 위해 10mL의 RPMI 1640 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  7. 선택 사항) 샘플을 추가로 정제하려면 440 x g 에서 5분 동안 원심분리한 후 적혈구 용해 버퍼를 사용하여 남아 있는 혼합 혈액 세포를 제거합니다.

2. 체외 H5N1 AIV 특이적 T 세포 배양

  1. 오리 농장에서 2주 된 건강한 청둥오리(Sheldrake)를 구입하여 음압 아이솔레이터에 보관합니다. 실험 전에 HI(hemagglutination inhibition) 분석을 사용하여 오리가 AIV에 대해 음성인지 확인합니다. 4주 된 오리를 H5N1 AIV 1 x 106, 50% 알 감염 선량[EID50]/0.2mL으로 비강 내 감염시킵니다.
  2. 1단계에서 설명한 방법에 따라 감염 후 28일이 지나면 H5N1에 감염된 오리로부터 기억 PBMC를 분리합니다. 혈구계를 사용하여 세포를 계산합니다. 세포 현탁액을 0.08% 트리판 블루로 1:1 비율로 희석하고 광학 현미경에서 생존 가능한(염색되지 않은) 세포를 수동으로 계수합니다.
    참고: 이전에 발표된 연구20에서 뒷받침된 바와 같이, 감염 후 28일에 분리된 말초혈액 단핵세포(PBMC)는 기억 T 세포가 풍부한 것으로 간주됩니다. 이 단계에서는 효과기 단계가 가라앉고 기억 세포 집단이 우세합니다.
  3. 농도를 3 x 106 cells/mL로 설정하고 48웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 배지를 추가합니다.
  4. 분리된 PBMC를 H5N1 조류 인플루엔자 바이러스(AIV)와 동시 감염시켜 APC 역할을 합니다. 바이러스 용량은 MOI = 5입니다. 37°C에서 1시간 동안 PBMC를 바이러스와 함께 배양합니다. 15분마다 손으로 부드럽게 흔듭니다.
  5. 감염 1시간 후 PBS로 세포를 2회 세척하여 결합되지 않은 바이러스 입자를 제거합니다. 세척된 PBMC를 1mL의 T 세포 배양 배지에 재현탁시키고 부유 세포를 37°C에서 5시간 동안 추가로 배양합니다.
  6. 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 셀을 원심분리합니다. 그 후, 배양된 항원제시세포(APC)를 100μL의 T세포 배양배지에 재현탁시키고 이펙터 세포에 첨가합니다. 항원제시세포(antigen-presenting cell)와 효과세포(effector cell)의 비율은 1:5가 되어야 한다.
  7. 37°C의 5%CO2 분위기에서 14일 동안 세포를 배양합니다. 2일마다 세포 배양 상등액의 절반을 조심스럽게 피펫팅하여 새로운 T 세포 배지로 교체하여 균일한 분포를 보장합니다. 세포를 포함하는 배지의 절반을 버리고 동일한 부피의 새 배지를 추가합니다.
  8. 7일째에는 광학 현미경으로 세포를 100배 관찰합니다.
  9. PBS 처리된 메모리 PBMC를 자극되지 않은 대조군으로 사용합니다.

3. T 세포 증식을 모니터링하기 위한 Carboxy fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE)

  1. 세포 밀도를 0.5-1 x 107 cells/mL로 조정하고 440 x g 에서 5분 동안 원심분리 후 5mL의 PBS로 세포를 재현탁합니다.
  2. 10mM 스톡을 5mL의 사전 냉각된 PBS로 1μM CFSE로 희석합니다. 어둠 속에서 작동하십시오.
  3. 두 개의 원심분리 튜브를 45°로 기울이고 파스퇴르 피펫으로 세포 현탁액에 CFSE 희석액을 첨가하고 잘 섞은 다음 37°C 수조에 넣어 어둠 속에서 15분 동안 둡니다.
  4. 5% FBS를 함유한 예냉각된 PBS 10량에 세포를 희석하여 세포를 세척하고, 440 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 침전한 후 상등액을 폐기합니다. 세척을 2회 반복합니다.
  5. 2단계에 따라 체외에서 CFSE로 표지된 세포를 자극합니다. 증식 분석이 완료되면 세포를 수확하고 유세포 분석으로 분석합니다.

4. CD8+ T 및 CD4+ T 세포의 증식을 위한 유세포 분석

  1. 7일간의 배양 후 각 웰에서 모든 세포를 수집하고 분석을 위해 두 개의 유동 튜브로 나눕니다.
  2. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  3. 100μL의 항체 칵테일(마우스 안티 덕 CD8, 1:50 또는 마우스 안티 덕 CD4, 1:50)을 추가하고 4°C의 어둠 속에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
  4. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  5. 100μL의 항체 칵테일(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50)을 추가하고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 세포를 배양합니다.
  6. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1mL로 세포를 한 번 세척합니다. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 게이팅 전략은 보충 그림 1에 나와 있습니다.

5. qPCR을 이용한 시그니처 유전자 발현 분석에 의한 T-세포 반응

  1. T 세포 배양이 끝나면 세포 수를 세고 1.5mL 원심분리 튜브에 모은 다음 400 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상등액은 조심스럽게 버리십시오.
  2. RNA 추출
    참고: RNA 오염을 방지하기 위해 흄 후드 또는 매우 깨끗한 벤치에서 추출을 수행할 수 있습니다.
    1. 제조업체의 지침에 따라 키트에 제공된 용해 버퍼를 사용하여 세포를 용해합니다. 용해된 샘플을 gDNA-Filter Column(수집 튜브에 미리 배치됨)으로 옮기고, 30초 동안 13,400 x g 에서 원심분리하고, 컬럼을 버리고, 여과액을 수집합니다. 여과액에 0.5부피의 절대 에탄올을 첨가합니다. 철저히 섞는다.
      알림: 에탄올 첨가 후 용액이 흐리거나 침전되는 것은 정상입니다. 흔들고 다음 단계로 진행합니다.
    2. 혼합물을 RNA 컬럼으로 옮기고 13,400 x g 에서 30초 동안 원심분리합니다. 여과액을 버리고 700μL의 Buffer RW1을 추가한 후 다시 원심분리합니다.
    3. 여과액을 버리고 700μL의 Buffer RW2(앱솔루트 에탄올 포함)를 첨가한 후 원심분리합니다. 여과액을 버리고 500μL의 Buffer RW2(절대 에탄올 포함)를 첨가한 후 2분 동안 원심분리합니다. 여과액으로 인한 오염을 방지하기 위해 튜브에서 컬럼을 조심스럽게 제거합니다. 다운스트림 반응의 간섭을 방지하기 위해 모든 헹굼 용액이 제거되었는지 확인하십시오.
    4. 컬럼을 새로운 RNase-free 수집 튜브로 옮기고, 50-200 μL의 RNase-free ddH2O를 추가하고, 실온에서 1분 동안 방치한 다음 13,400 x g 에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용리합니다. RNA 순도와 농도를 측정합니다.
      참고: 수율 증가를 위해 RNase-free ddH2O를 65 °C로 예열하고 필요한 경우 두 번째 용리를 수행합니다.
  3. 키트 지침에 따라 cDNA를 합성합니다. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 가닥을 합성하여 역전사 효소의 양을 5배 추가합니다. 37°C에서 15분 동안 역 전사한 다음 85°C에서 5초 동안 전사하고 4°C로 냉각합니다.
  4. 제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 반응을 설정합니다.
    1. qPCR 튜브에 2x PCR 반응 효소 혼합물 10 μL, 프라이머 1 0.4 μL, 프라이머 2 0.4 μL, cDNA 템플릿 1 μL, ddH2O 8.2 μL를 결합하여 20 μL 혼합물을 만듭니다.
    2. 다음 프로그램을 사용하여 Real-Time Quantitative PCR 기기에서 PCR을 실행합니다.
      Stage 1: 95°C에서 30초, Rep x 1
      2단계: 95°C에서 3초, 60°C에서 30초, Rep x 35
      스테이지 3: 95°C에서 15초, 60°C에서 60초, 95°C에서 15초, 반복 x 1

6. 세포 내 사이토카인 염색(ICS)

참고: 이 프로토콜은 오리에서 세포 내 IFN-γ 분비를 감지하여 H5N1 특이적 CD8+ T 세포의 효과기 반응을 평가하기 위해 개발되었습니다.

  1. 2단계에서 설명한 절차에 따라 H5N1 특이적 T 세포를 in vitro 에서 배양합니다. 배양 시작 후 7일 후에 모든 세포(각 웰에서)를 수확합니다.
  2. 2단계에서 설명한 대로 항원제시세포(APC)를 배양합니다. 배양된 APC와 Brefeldin A(1:1,000)를 effector 세포에 추가하고 39°C incubator에서 6시간 동안 함께 배양합니다.
  3. 세포를 새 원심분리기 튜브로 옮기고 실온에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  4. 100 μL의 항체 칵테일(마우스 안티 덕 CD8, 1:50)을 세포에 첨가하고 4 °C의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하여 세포를 세척하고 1mL의 PBS에 재현탁합니다. 항체 칵테일(FITC-conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50)을 넣고 4°C의 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
  6. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 다시 세척합니다. 상층액을 버리고 100μL의 고정 완충액에 세포를 재현탁시킨 후 4°C의 어둠 속에서 20-25분 동안 배양합니다.
  7. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 한 번 더 세척합니다. 1 mL의 1x 투과화 완충액을 추가하고 4 °C에서 5분 동안 440 x g 에서 원심분리로 셀을 2x 세척합니다.
  8. 상층액을 버리고 100μL의 투과화 완충액에 세포를 재현탁시킨 후 항체(Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10)를 세포에 추가합니다. 고정 및 멤브레인 투과화 후 세포-항체 혼합물을 어두운 곳에서 30분 동안 배양하고 4°C에서 배양하는 동안 때때로 흔들립니다.
    참고: Permeabilization/Wash 용액은 10x 스톡 용액이며 사용하기 전에 PBS로 희석해야 합니다.
  9. 400 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리하여 PBS 1mL로 세포를 한 번 더 세척합니다. 100μL의 항체 칵테일(PE 결합 Goat Anti-Mouse IgG3, 1:250)을 추가하고 4°C의 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다.
  10. FlowJo 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석합니다. 게이팅 전략은 그림 1에 나와 있습니다.

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결과

이 프로토콜은 오리20에서 항원 특이적 T 세포 효과기 반응 검출에 대한 이전 연구를 기반으로 개발되었습니다. 실험의 첫 번째 단계는 바이러스 특이적 T 세포의 체외 배양과 관련이 있으며, 이는 후속 효과기 반응 연구의 기초 역할을 합니다. 초기에 APC는 배양되어 effector 세포와 공동 배양되었습니다. 형태학적 관찰에 따르면 증식 후 세포는 클러스터 성장을 보였습니다(그림 2A). CFSE 라벨링은 세포 분열의 여러 피크를 보여줌으로써 성공적인 증식을 더욱 확인했습니다(그림 2B). 마지막으로, 오리 특이적 세포 마커 CD8/CD4를 사용하여 세포20의 비율과 절대 수를 평가하여 항원 특이적 T 세포의 성공적인 체외 배양을 확인했습니다(그림 2C)...

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토론

이 프로토콜은 오리 항원 특이적 T 세포의 체외 배양을 위한 효율적인 방법을 제공하며, T 세포의 효과기 반응을 평가하는 데 사용할 수 있는 오리를 위한 세포 내 사이토카인 염색 프로토콜을 수립합니다. 현재 오리 T 세포에 대한 체외 배양 프로토콜에 대한 발표된 보고서는 없습니다. 우리는 주로 인간 항원 특이적 T 세포에 대한 프로토콜을 참조했지만 APC의 배양 조건을 최적화하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 우리는 차별화 프로토콜의 추가 최적화를 고려하고 있습니다.

이 프로토콜에는 성공에 필수적인 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오리 T 세포의 체외 배양은 충분한 T 세포 확장과 기능 보존을 보장하기 위해 항원 용량, APC 활성화 및 배양 기간을 포함한 자극 조건의 신중한 최적화가 필요합니다. 이러한 매개변수의 편차는 차선의 활성화 또는 세포 사멸로 이어질 수 있습니다. 둘째...

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (32473060 및 32461120064) (MD 및 ML)의 지원을 받았습니다. 광저우 기초 및 응용 기초 연구 프로젝트(2025A04J5445) (MD에게); 양쯔강 장학생 교수 프로그램의 젊은 학자(2024, Manman Dai); "광동 특별 지원 계획"의 Young Peal River Scholar(2024, Manman Dai). 자금 제공자는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL MICRO-원심분리기 튜브BiosharpCat#BS-15-M
15 mL 원심분리기 튜브LabselectCat#CT-002-15A
2-메르캅토에탄올(55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
48-웰 조직 배양 플레이트(처리되지 않음, 평평한 바닥)BiofilCat#TCP000048
50 mL 원심분리기 튜브LabselectCat#CT-002-50A
96웰 언스커트 qPCR 플레이트LabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Cytofix/Cytoperm 키트BD BioscienceCat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
세포 배양 CO2 인큐베이터Thermo FisherHeracell 150i GP
원심분리기Eppendorf5810R
CFSE 라벨링 키트AbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR 마스터 믹스VazymeCat#Q341-02
오리 말초 혈액 림프구 분리 키트TbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT 프리믹스정확한 생명공학Cat#AG11706
FastPure 세포/조직 총 RNA 분리 키트 V2VazymeCat#RC112-01
태아 소 혈청GibcoCat#10437-028
유세포 분석기Beckman CoulterBA43347
유동 튜브BeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Star https://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488, 1:50 희석AbbkineCat#A23210
염소 항마우스 IgG2b, FITC, 1:50 희석Southern BiotechCat#1091-31
염소 항마우스 IgG3, PE, 1:250 희석Southern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad 프리즘 8.0.2GraphPad 소프트웨어https://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV 균주 DK383인수공통전염병 예방 및 통제 A/Duck/Guangdong/383/2008
-글루타민(200mM)GibcoCat#25030081
현미경MoticAE2000
마우스 Anti-Duck CD4, 1:50 희석Bio-RadCat#MCA2478
Mouse Anti-Duck CD8α, 1:50 희석GeneTex Cat#GTX41834
마우스 Anti-Duck IFN-&감마; mAb, 1:10 희석당사 실험실에서 제조 NA
NanoDrop One 분광 광도계Thermo FisherAZY1603209
NEAA (비필수GibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR 열 순환기BiometraBiometra Tone 96G
페니실린-스트렙토마이신 용액GibcoCat#15070063
Real-Time PCR 시스템Applied BiosystemsABI7500
재조합 인간 IL-2(10 & g)USCNKCat#RPA111Ga01
적혈구 용해 완충액TbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
피루브산나트륨(100mM)GibcoCat#11360-070
트리판 블루시그마-알드리치고양이#93595
2주 된 청둥오리(Sheldrake)오리 농장 광저우NA
L

참고문헌

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