연구 논문

CDCA 유발 HepG2 세포 손상에서 젠티오피크로사이드의 보호 효과에 대한 다중 모드 평가

DOI:

10.3791/68320

⸱

2025년 7월 25일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

이 논문에서

요약

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이 연구는 젠티오피크로사이드가 담즙산과 지질의 생성과 대사를 조절하고 산화 스트레스와 염증 반응을 예방함으로써 담즙정체성 간 손상을 치료할 수 있음을 입증했습니다.

초록

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Swertia chirayita의 주요 활성 성분인 젠티오피크로사이드(GPS)는 담즙정체 사례에서 간을 보호하는 것으로 나타났습니다. 담즙정체성 간손상에 대한 GPS의 보호 메커니즘을 밝히기 위해 HepG2 세포를 케노데옥시콜산(CDCA)으로 처리하여 시험관 내에서 담즙정체 환경을 시뮬레이션하고, CCK-8 방법을 사용하여 HepG2 세포에 대한 GPS의 보호 효과를 확인했습니다. 생물학적 키트를 이용하여 세포내 TBA, T-CHO, TG, ALP, ALT, AST, GSH, IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD 및 MDA의 함량을 검출하였다. 공초점 레이저 현미경을 사용하여 ROS 수준을 확인했습니다. HepG2 세포의 SHP-2, Tgr5, CYP7A1 및 NTCP 발현은 면역형광 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 평가되었습니다. 그런 다음 Autodock 소프트웨어를 사용하여 주요 활성 성분의 분자 도킹을 확인했습니다. 연구 결과는 GPS가 CDCA가 HepG2 세포에 끼친 손상을 크게 방지한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 보호 효과는 세포 내 담즙산과 지질의 생성과 대사를 조절하고 산화 스트레스와 염증 반응을 예방함으로써 달성되었을 수 있습니다.

서론

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신체의 소화 시스템의 대사 부위는 간입니다. 담즙 분비는 간담도계의 지방 이화 작용 과정의 핵심 메커니즘입니다. 담즙의 주요 성분인 담즙산은 간 세포에서 방출되며 지방 대사의 균형을 유지하는 데 중요합니다. 건강한 개인과 아픈 경우 모두에게 간의 생리적, 병리학적 과정은 간 내 유리 담즙산과 결합 담즙산의 균형에 따라 달라집니다. 이 균형이 깨지면 담즙산 순환이 정상적으로 기능하지 않아 간내 담즙정체 및 그에 따른 간 손상으로 이어질 수 있습니다1. 이미 수행된 연구에 따르면 담즙정체성 간 손상(CLI)은 대사 장애, 장내 미생물 불균형 및 간 세포 괴사와 관련된 상태입니다2. 이는 담즙 흐름의 방해와 CLI를 위한 간 세포의 담즙산 축적에 의해 발생합니다. CLI의 중증 사례는 간경변증, 간 섬유증 및 간부전으로 진행될 수 있습니다3. 현재 CLI의 기본 메커니즘은 여전히 다소 불분명하고 복잡하며 대부분의 환자는 심각한 부작용5과 함께 약물 요법4에서 낮은 효능을 받습니다. 결과적으로 오늘날 의료계가 직면한 가장 시급한 문제 중 하나는 효과적인 CLI 약물을 찾는 것입니다.

현재 연구는 담즙산의 대사에서 몇 가지 핵 수용체의 중요성을 입증했습니다6. 이 중 담즙산 수용체는 BA에 결합하여 단백질 티로신 포스파타제(SHP)를 활성화할 수 있는 담즙산의 중요한 조절 수용체입니다7. 반면, 담즙정체를 초래하는 간세포에 BA가 과도하게 축적되면 SHP 수용체가 부정적으로 억제되고 CYP7A1(시토크롬 P450 7A1) 수용체가 활성화되어 담즙산8이 생성됩니다. 또한 G-단백질 결합 담즙산 수용체 TGR5가 BA를 분비하는 것을 차단하고 타우로콜레이트나트륨 공수송 폴리펩티드(NTCP) 수용체를 자극하여 BA를 수송했습니다. 간세포에 담즙산이 축적되어 간을 손상시킵니다9. 결과적으로, 이 메커니즘에 대한 추가 연구는 보다 실행 가능한 CLI 치료 옵션을 밝힐 수 있습니다.

의학에서 오랫동안 사용되어 온 Swertia chirayita는 중국 전통 티베트 의학입니다. 최고의 Tida로 간주되며 지역 주민들이 담낭 및 간 질환을 치료하기 위해 자주 사용합니다10. 담석, 담낭염, 간경변증, 간염 및 기타 간 질환을 치료하는 데 자주 사용됩니다11. 최근 연구에 따르면 Swertia의 일부 이리도이드 화학 성분과 그 활성 성분은 간 섬유증 및 급성 간 손상과 같은 간 질환에 좋은 치료 효과가 있는 것으로 나타났습니다 12,13,14. Swertia chirayita의 활성 성분은 염증15 및 항산화 특성16을 낮추어 간 질환을 완화합니다. 우리의 예비 연구에 따르면 Swertia chirayita를 주성분으로 하는 티베트 의학 복합 포뮬러가 CLI에 유리한 치료 효과를 나타내는 것으로 나타났으며, 이는 Swertia chirayita가 CLI17 치료제로서 잠재력을 가지고 있음을 시사합니다. Swertia chirayita에서 추출 및 정제되는 주요 활성 성분은 GPS(Gentiopicroside)18이며, 간 보호19, 포도당 대사 조절20, 장내 미생물 개선21 및 항종양 특성22와 같은 여러 약리학적 작용을 가지고 있습니다. 이전 연구에서는 GPS가 담즙정체상태에서 간 손상을 개선하고 담즙산 수송체의 발현을 상향 조절하여 간내 담즙정체를 감소시킨다는 것을 입증했습니다23,24. 이와 유사하게, 생체 내 및 시험관 내에서 수행된 연구에서는 GPS가 지질 대사를 강화하고 염증을 줄이며 산화 스트레스를 줄여 간 손상을 줄일 수 있음을 입증했습니다25,26.

HepG2 세포는 간세포 대사 효소 활성을 나타내기 때문에 간 질환의 시험관 내 연구에 자주 활용됩니다27. 그 동안 간세포는 CDCA28을 포함하는 4가지 형태의 유리 담즙산 중 하나에 노출될 때 더 많은 담즙을 분비할 수 있습니다. 결과적으로 CDCA를 사용하여 담즙정체성 간 손상의 세포 모델을 만들고 시험관 내에서 담즙정체성 환경을 모방할 수 있습니다. CDCA 유발 간세포 손상이 산화 스트레스 및 염증 경로에 의해 결정적으로 매개된다는 점을 감안할 때, 그리고 다른 간 맥락에서 GPS의 문서화된 항산화 및 항염증 효과를 고려할 때26, 우리는 GPS가 HepG2 세포에서 CDCA 유도 세포독성을 완화함으로써 담즙정체성 간 손상에 대한 보호를 제공할 수 있다는 가설을 세웁니다. 이 연구는 HepG2 세포에 대한 CDCA 유발 손상 모델을 사용하여 CLI에 대한 GPS의 보호 효과와 그 분자 메커니즘을 조사했습니다.

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프로토콜

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세포 배양 및 치료
HepG2 세포 및 MEM 매체는 상업 공급업체로부터 구입했습니다. HepG2 세포는 37°C 및 5% CO2 분위기에서 10% FBS, 1% 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신이 보충된 MEM 배지에서 성장시켰습니다. 세포 접착 후 배양 배지를 변경했습니다. 세포를 2-3일 후 1:3 비율로 배양하고, 세포 배양이 80% 컨플루엔도에 도달하면 실험에 활용하였다.

세포 생존율 분석
1일째에, 세포를 96웰 플레이트에 2 x 104 HepG2 세포(2 x 105 세포/mL, 웰당 100 μL)에 6회 반복으로 파종했습니다29. 2일째, 접종 24시간 후, 세포를 12시간 동안 서로 다른 농도의 CDCA(0, 20, 40, 60, 80, 100μM)로 CDCA로 처리하였다. 세포 생존력은 CCK-8 방법으로 검출되었습니다. 초기 세포 파종 24시간 후, 세포를 24시간 동안 서로 다른 농도의 GPS(0, 25, 50, 100, 200, 400 및 800μM)에서 CDCA로 처리했습니다. 3일째에 CCK-8 방법으로 세포 생존율을 검출하였다. 4일째에 2 x 104 HepG2 세포(2 x 105 세포/mL, 웰당 100μL)를 96웰 플레이트에 24시간 동안 6회 반복하여 파종했습니다. 5일째에 세포를 6개의 그룹으로 분리합니다: 대조군, 모델, 우르소데옥시콜산(UDCA) 및 GPS: 25μM, 50μM 및 100μM. 대조군을 제외하고 60μM CDCA 용액을 12시간 동안 모든 그룹에 첨가하였다. 그런 다음 UDCA 용액(60μM)과 GPS 용액(25μM, 50μM 및 100μM)을 각각 UDCA 및 3개의 GPS 그룹에 24시간 동안 첨가했습니다. 6일째에 CCK-8 방법으로 세포 생존율을 검출하였다.

사이토카인 분석
보고된 문헌에 따르면, TNF-α, IL-6 및 IL-1β 키트를 사용하여 다양한 치료 후 HepG2 세포의 염증 인자 수준을 검출했습니다30. CDCA 또는 CDCA+GPS 개입 24시간 후 배양 배지를 버리고 PBS로 헹굽니다. 세포 현탁액을 69 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 세포 침전물을 취합니다. PBS 용액을 첨가하고 얼음 수조 조건에서 균질화하여 세포 균질화를 준비합니다. 10,005 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리한 후 상청액을 제거하고 BCA 기술을 사용하여 세포 내용물의 총 단백질을 측정했습니다. 제조업체의 지침에 따라 세포 상청액의 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 수치는 ELISA에 의해 측정되었습니다. 흡광도는 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정되었습니다.

TBA, TG 및 T-CHO 검출
TBA, TG 및 T-CHO 테스트는 HepG2 세포의 담즙산 및 지질 대사를 식별하기 위해 키트의 지침에 따라 활용되었습니다31. TBA, TG 및 T-CHO는 상업적으로 구입되었습니다. 세포 침전물을 얼음수조에서 초음파로 분해한 후, 30분 동안 용해물 RIPA를 첨가하여 세포 균질체를 제조하였다. 흡광도는 다기능 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 측정되었습니다. 각 웰에 BCA 작업 용액을 첨가하고 세포를 균질화한 후 효소 용기를 사용하여 562nm에서 흡광도를 측정하고 배양 기간은 30분이었습니다. 표준 제품의 흡광도를 사용하여 표준 곡선을 구축하고 다음 공식을 사용하여 흡광도 값을 얻었습니다.
TBA 함량(μmol/gprot) = (A 샘플-A블랭크)/(A 표준-A블랭크)×C교정/Cpr
T-CHO, TG 함량(mmol/gprot) = (A 샘플-A블랭크)/(A표준-A블랭크)×C표준/Cpr

간 기능 평가
간 기능은 ALT, AST 및 ALP를 사용하여 평가되었습니다. ALT, AST 및 ALP는 상업적으로 구입되었습니다. 수집된 세포에 대해 PBS 완충액을 2회 세척한 후, 세포를 69 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 세포를 침전시키고, PBS 완충액을 첨가하고, 얼음수조에서 초음파 분쇄하여 균질을 생성하였다. 그런 다음 테스트 및 제어 구멍을 설정했습니다. 시약을 첨가하고 홀플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합한 후 실온에서 15분간 방치하면서 수술대를 따랐다. 각 구멍의 OD 값은 파장 505nm의 효소 장치를 사용하여 결정되었습니다. 그런 다음 절대 OD 값을 표준 곡선에 입력하고 공식을 사용하여 추가 정량 분석을 수행했습니다.

SOD, MDA, GSH 활동 결정
SOD 활성, MDA 함량 및 GSH 함량은 각각 제조업체의 지침에 따라 평가되었습니다. SOD, MDA 및 GSH는 상업적으로 구입되었습니다. 간단히 말해서 세포를 접종하기 위해 6웰 플레이트를 사용했습니다. 처리 후, 세포는 키트의 실험 지침에 따라 전처리(수집 및 파열)를 거쳤습니다. 그런 다음 지침의 작동 단계에 따라 빈 구멍, 표준 구멍 및 측정 구멍을 설정한 후 적절한 작업 용액을 세포 검출 플레이트에 부었습니다. 그 후, 세포는 키트 지침에 언급된 온도와 기간에서 배양됩니다. 그런 다음 BCA 검출 키트를 사용하여 단백질 함량을 정량화했습니다. 최종적으로 흡광도를 적절한 파장에서 측정하고 산화 스트레스 지수에 대한 보다 철저한 정량 분석을 수행했습니다.

DCFH-DA 프로브를 이용한 HepG2 세포의 ROS 변화 검출
세포 수를 위한 일상적인 배양이 수행되었습니다. 밀도가 1 x 105 cells/ mL인 HepG2 세포를 각각 1.5 mL씩 유리 바닥 접시에 접종하고, 상기 방법에 따라 배양하였다. 배양 후, 배지를 폐기하고 세포를 PBS로 세척하였다. DCFH-DA를 1:1000의 농도로 희석하고, 웰당 1.5mL 희석액으로 첨가하고, 20분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 MEM 염기성 배양 용액으로 3회 헹구었습니다. 그런 다음 DAPI가 포함된 100μL의 퇴색 방지 마운팅 매체를 각 접시에 첨가했습니다. 형광 공초점 현미경을 사용하여 여기의 경우 488nm, 방출의 경우 525nm에서 보고 사진을 찍었습니다32.

면역형광 이미징
세포를 배양 후 PBS 완충액으로 3회 세척했습니다. 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한 후, 진랭대에서 PBS 완충액을 사용하여 세포를 세척하였다. 희석제를 첨가한 다음 빛에서 4°C에서 하룻밤 동안 냉장 보관했습니다. 그 후, 세포를 형광 희석제로 코팅하고 37°C에서 1시간 동안 빛을 피해 배양했습니다. 배양 후, 세포를 PBS 완충액으로 세 번 세척했습니다. 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정한 후, 세포를 회전식 셰이커에서 PBS 완충액으로 헹구었습니다. 이어서, 150μL의 1차 항체 희석제를 첨가하고 빛 보호 조건에서 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 1차 항체 희석제를 회수한 후 적절한 부피의 PBS 완충액을 첨가하고 5분 동안 진탕하였다. 이 세척 절차를 세 번 반복했습니다. 그런 다음 각 접시에 150μL의 형광 2차 항체 희석제를 투여하고 빛 보호 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 적절한 양의 PBS 완충액을 각 접시에 첨가하고 회전식 셰이커에서 8분 동안 세척하고 3주기 동안 반복했습니다. 마지막으로, 세포를 충분한 DAPI 염색 용액으로 10분 동안 덮고, 퇴색 방지 마운팅 매체로 마운트하고, 초고해상도 이미징 시스템(33)을 사용하여 이미징했습니다.

웨스턴 블롯 분석
다양한 처리 후 RIPA 용해물을 사용하여 HepG2 세포의 전체 단백질을 추출하고 BCA 기술을 사용하여 단백질 농도를 확인했습니다. 10% SDS-PAGE를 사용하여 표적 단백질을 분리한 후 0.45μm PVDF 멤브레인으로 옮겼습니다. 그 후, 멤브레인을 5% BSA를 사용하여 25°C에서 1.5시간 동안 밀봉했습니다. SHP-2 (1:1000), CYP7A1 (1:1000), Tgr5 (1:1000), NTCP (1:1000) 및 β-액틴 (1:1000)에 대한 1차 항체를 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음으로, 멤브레인을 양 고추냉이 과산화효소와 접합한 염소 항토끼 면역글로불린 G 2차 항체(1:10000)와 함께 25°C에서 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음 과산화효소 코팅된 밴드를 초고감도 ECL 화학발광 용액을 사용하여 관찰하고, 이미징 시스템(34)을 사용하여 사진을 촬영하였다.

분자 도킹
보고된 바와 같이, 분자 도킹 공정은 다음과 같은 절차(35)에 따라 수행되었다. 약물 소분자.mol2 구조는 ChemicalBook 플랫폼에서 다운로드되었고 리간드 단백질 .sdf 구조는 Uniprot 및 RCSBPDB 플랫폼에서 다운로드되었습니다. 리간드와 물 분자는 Pymol 소프트웨어로 제거되었고 리간드 단백질은 수소화 및 검출을 위해 AutoDock 소프트웨어로 가져왔습니다. 최종 출력은 .pdbqt 형식입니다. 도킹 박스, RunAutoGrid, RunAutoDock 및 AutoDock 도구 분석을 AutoDock 소프트웨어에서 수행했으며 각 도킹 결과 그룹의 최소 결합 에너지를 저장했습니다. 각 그룹의 자유 결합 에너지가 가장 낮은 형태를 선택하고, 리간드-수용체 형태를 Pymol 소프트웨어로 시각화했습니다.

통계 분석
앞서 언급한 데이터는 GraphPad Prism 9.2를 사용하여 통계적으로 정렬되었으며 모든 실험 결과는 평균 ± SD로 보고되었습니다. 그룹 간 데이터를 통계적으로 비교하기 위해 일원 분산 분석을 사용했습니다. 두 그룹 간의 차이는p가 0.05일 때 유의한 것으로 간주<.

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결과

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실험을 위해 CDCA의 농도를 0 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM 및 100 μM 농도 구배로 설정하였다. CDCA의 농도가 60μM일 때 세포 활성은 대조군과 유의하게 달랐고, 최종적으로 CDCA의 농도로 60μM을 사용하였다(그림 1A). 그 결과, 약물 투여 후 24시간 동안 배양한 후, 각 군과 대조군 사이에 세포 활성에 유의한 차이가 없었음을 보여주었으며(그림 1B), 이는 GPS가 800μM의 농도 내에서 세포 활성에 대한 억제 효과가 없음을 나타냈다. 마지막으로, 25μM, 50μM, 100μM의 세 가지 농도를 선택하여 관련 문헌20에 따라 후속 실험을 완료하였다. HepG2 세포를 60μM CDCA로 12시간 동안 유도한 후 UDCA와 다른 용량의 GPS로 24시간 동안 배양하고 HepG2 세포 생존력의 변화를 측정하였다(

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토론

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CLI는 담즙 형성, 분비 또는 배설의 방해로 인해 발생하는 간 질환입니다. 임상적으로 가려움증, 골다공증으로 나타나며 심지어 간 섬유증, 간경변증 및 기타 질병으로 발전하여 생명과 건강을 심각하게 위협합니다 36,37,38. UDCA는 CLI39 치료에 가장 일반적으로 사용되는 약물로 인식됩니다. 그러나 임상에서 UDCA에 대한 반응이 좋지 않은 환자가 많기 때문에 최근 몇 년 동안 FXR 수용체 작용제(오베티콜산40, 실로펙서41), FGF19 유사체(알다페르민)42 및 TGR5 작용제(INT-767)

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 쓰촨성 자연과학재단(2024NSFSC0697), 청두 중의학대학교(LH202402015)의 공동 혁신 기금 프로젝트의 지원을 받습니다.

저자 기여:
Caitong Wu: 방법론, 형식 분석, 데이터 큐레이션, 원고 작성, 작성 및 편집. Yang Xiao: 개념화, 조사, 시각화 및 검증. 푸한 팬: 검증 및 편집. Zhangli Lei, Xianhua Zhou 및 Xianli Meng: 편집 및 번역. Yong Zeng, Hou Ya 및 Peng Shen: 개념화, 방법론, 검증, 조사, 초안 검토 및 수정, 감독.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ALP난징 젠청 생명공학 연구소A059-2-2
ALT난징 젠청 생명공학 연구소C009-2-1
AST난징 젠청 생명공학 연구소C010-2-1
BCABoster 생물 공학 연구소 Co., LtdAR0146
CDCA청두 Medesheng 기술 유한 회사474-25-9
세포 계수 키트-8Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
시토크롬 P450 7A1 항체Abmart Shanghai Co., Ltd.TD2612S
DAPIBeyotime BiotechnologyC1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
염소 항토끼 IgG(H& L)청두 Zen-Bioscience Co., Ltd.511202
염소 안티 토끼 IgG AF488Abmart Shanghai Co., Ltd.M21012M
GPS청두 Medesheng Technology Co., LtdRP210717
GSH난징 Jiancheng 생명공학 연구소A006-2-1
HepG2 세포Procell 생명 과학 및 기술 유한 회사CL-0103
HRP 염소 안티 토끼 IgG우한  AB클론  생명공학(주) AS014
IL-1&베타;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDA난징 젠청 생명공학 연구소A003-1-2
MEM 베이스 배지Procell 생명 과학 및 Technology Co., LtdPM150410
PBSBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
급속 이송 완충액(20×)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROSBeyotime BiotechnologyS0033S
SHP2 토끼pAb 우한  AB클론  생명공학(주) A12486
SLC10A1 항체Abmart Shanghai Co.,Ltd.PU276166S
SOD난징 젠청 생명공학 연구소A001-3-1
TBA난징 젠청 생명공학 연구소E003-2-1
T-CHO난징 젠청 생명공학 연구소A111-1-1
TG난징 젠청 생명공학 연구소A110-1-1
TGR5 다클론 항체ImmunoWay 생명 공학 회사YT4636
TNF-&알파;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
트립신 용액(0.25%)Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCAChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDX007601
β-Actin Rabbit mAbWuhan  AB클론  생명공학(주) AC026

참고문헌

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