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방법 논문

환자 유래 대장직장 종양 오가노이드(Patient-derived Colorectal Tumor Organoids)와 종양 침윤 림프구(TIL)의 공동 배양 시스템 구축

3.2K 조회수

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DOI:

10.3791/68346

⸱

2025년 6월 27일

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory of biomarker high throughput screening and target translation of breast and gastrointestinal tumor, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University, 2Department of General Surgery, Affiliated Zhongshan Hospital of Dalian University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 종양 침윤 림프구(TIL)와 공동 배양된 환자 유래 대장암(CRC) 오가노이드 모델을 만들어 이들의 상호 작용과 치료 잠재력을 연구하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 종양 미세환경에서 면역 반응을 탐색하고 맞춤형 CRC 치료를 위한 TIL 기반 요법의 효능을 예측할 수 있는 전임상 플랫폼을 제공합니다.

초록

대장암(CRC)은 전 세계적으로 세 번째로 흔한 암입니다. 종양 침윤 림프구(TIL)는 CRC에서 중요한 예후 마커로 확인되었습니다. TIL의 치료 적용은 이미 흑색종과 자궁경부암에서 유망한 결과를 보여주었습니다. 그러나 CRC 요법에 대한 사용은 탐색 단계에 머물러 있습니다. TIL 효능을 평가하기 위한 적절한 체외 모델은 현재 사용할 수 없어 이 분야의 추가 발전을 방해하고 있습니다. 원래 종양 조직의 특성을 밀접하게 유지하고 환자 간 이질성을 반영하는 환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 CRC와 TILS 간의 상호 작용을 연구하기 위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 본 연구에서는 갓 절제된 종양 조직으로부터 환자 유래 CRC 오가노이드 모델을 확립한 후 TIL을 분리 및 확장하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 CRC 오가노이드와 TIL의 공동 배양을 가능하게 하여 TIL 매개 세포 독성 및 면역 반응을 평가할 수 있습니다. 오가노이드에 대한 TIL 사멸 효능을 분석함으로써 맞춤형 CRC 치료를 위한 TIL-기반 면역요법의 잠재적 결과를 예측할 수 있습니다. 또한, TIL의 추가 엔지니어링은 항종양 효능을 향상시켜 보다 효과적인 세포 요법을 개발하기 위한 유망한 전략을 제공할 수 있습니다. 이 PDO-TIL 공동 배양 모델은 CRC에서 TIL 요법 및 맞춤형 치료 전략의 전임상 평가를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

대장암(CRC)은 전 세계적으로 가장 흔하고 치명적인 암 중 하나로, 주요 공중 보건 문제를 나타냅니다1. 수술, 화학요법 및 면역요법을 포함한 치료 방식의 발전에도 불구하고, CRC 환자, 특히 전이성 질환이 있는 환자의 예후는 여전히 좋지 않습니다. 종양 미세환경(TME)은 암 진행과 치료 반응을 형성하는 데 중요한 역할을 하며, 종양 침윤 림프구(TIL)는 암에 대한 면역 반응에 영향을 미치는 핵심 구성 요소로 부상하고 있습니다2. 종양 내에서 발견되는 다양한 면역 세포 집단인 TIL은 CRC에서 중요한 예후 마커로 확인되었으며, 높은 수준의 TIL 침윤은 종종 더 나은 임상 결과와 관련이 있습니다3. 최근 연구에서는 TIL(protein based) 면역요법이 유망한 효능을 보인 흑색종(melanoma)4 및 자궁경부암(cervicalcancer5)5과 같은 다른 암에서도 TIL의 치료 잠재력이 강조되고 있습니다.

그러나 일부 암 유형에서 TIL의 성공에도 불구하고 CRC에 대한 적용은 여전히 진행 중인 연구 영역으로 남아 있습니다. CRC의 복잡성 및 이질성은 면역억제 종양 미세환경과 결합되어 효과적인 TIL(TIL) 기반 면역요법에 대한 도전 과제를 제시한다6. CRC 종양은 종종 조절 T 세포(Tregs), 골수성 억제 세포(MDSC) 및 종양 관련 대식세포(TAM)의 존재를 특징으로 하는 고도의 면역억제 TME7을 나타내며, 이들 모두는 TIL 기능을 적극적으로 억제합니다. 더욱이, CRC 세포는 PD-L1과 같은 면역 관문 분자를 자주 발현하는데, 이는 TIL에 의한 사멸을 더욱 방해할 수 있다8. 또한, 면역억제 기질과 결합된 CRC 종양의 유전적 이질성은 종양 세포를 효과적으로 표적으로 삼고 제거하는 TIL의 능력을 복잡하게 만들어 흑색종 및 자궁경부암에서 볼 수 있는 것과 동일한 수준의 성공을 달성하는 것을 더 어렵게 만듭니다9. 현재 연구의 중요한 격차는 CRC와 TIL 간의 상호 작용을 정확하게 시뮬레이션할 수 있는 적절한 체외 모델이 없다는 것입니다. 이러한 모델은 CRC 치료에서 TIL의 잠재력을 평가하고 개인화된 치료 전략을 위해 적용을 최적화하는 데 필수적입니다.

환자 유래 오가노이드(PDO)는 인간 암을 모델링하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다10. 환자의 종양 조직에서 유래한 이러한 3D 배양은 원래 종양의 조직학적 및 유전적 특성을 밀접하게 모방하여 기존 2D 세포주에 비해 종양 생물학을 더 정확하게 표현합니다. PDO 모델은 또한 환자 간 이질성을 유지하므로 개인 맞춤형 의학 접근법에 이상적입니다11. CRC에서 PDO는 약물 스크리닝 및 종양 생물학 연구에 사용되어 왔지만12, 특히 TIL과 관련하여 면역 반응을 평가하는 데 사용되는 것은 여전히 제한적입니다. PDO-면역 세포 공동 배양 모델의 설계는 미세환경의 복잡성과 실험적 제어 가능성의 균형을 맞춰야 합니다. 대식세포 및 수지상 세포와 같은 구성 요소가 생체 모방을 향상시킬 수 있지만, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 접근성으로 인해 주류 선택이 되었습니다. 그러나 PBMC는 종양 특이적 T 세포의 비율이 낮고 단핵구 하위 집단이 미세환경적 안정성을 방해할 수 있습니다13. 대조적으로, TIL은 자연적으로 종양 반응성 클론을 풍부하게 하고 현장 고갈 표현형을 가지고 있어 결장직장암의 면역 회피 메커니즘을 정확하게 분석하기 위한 우수한 모델입니다.

이 연구의 목적은 CRC PDO와 TIL의 공동 배양 시스템을 구축하여 CRC에서 TIL 매개 항종양 반응을 평가하기 위한 새로운 체외 플랫폼을 개발하는 것입니다. 이 모델을 통해 CRC PDO에 대한 TIL 세포 독성을 직접 평가하고 환자별 맥락에서 면역 반응을 분석할 수 있습니다. 이 시스템을 활용하면 CRC에 대한 TIL 기반 면역 요법의 잠재력에 대한 더 깊은 통찰력을 제공하고 엔지니어링 접근 방식을 통해 TIL 효능을 향상시키기 위한 전략 탐색을 지원할 수 있습니다. 이전의 방법은 TIL의 수가 적어제한되었다 14. 대부분의 경우, PBMC는 먼저 2주 동안 PDO와 공동 배양한 후, PBMC에서 종양 특이적 TIL을 확장한 다음 PDO와 추가로 공동 배양하여 세포독성 효과를 관찰할 수 있었습니다15. 그러나 이 접근 방식은 모델링 시간이 길어지고 전체 수율이 낮다는 단점도 있습니다. 대조적으로, 설명된 방법은 더 작은 종양 조직 샘플에서 PDO 및 TIL을 분리 및 확립할 수 있으며, 이를 직접 공동 배양할 수 있습니다. 이 접근 방식은 방법론과 효율성 측면에서 더 큰 편의를 제공할 수 있습니다. 궁극적으로 이 시스템은 TIL 요법의 전임상 평가를 위한 강력한 도구를 제공하여 CRC 환자의 결과를 개선할 수 있는 개인화된 치료 전략을 위한 길을 닦는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

인체 유래 물질과 관련된 모든 실험은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며 다롄 대학교 부속 중산 병원 윤리 위원회의 사전 승인을 받았습니다(승인 번호: KY2023-206-1). 이 연구를 위해 임상 표본을 제공한 모든 환자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

선정 기준에는 병리학적으로 확인된 원발성 대장암 조직, 충분한 표본 크기(≥1cm3), 선행 요법(화학방사선 요법 또는 표적 요법) 병력 없음, 서명된 사전 동의서가 포함되었습니다. 제외 기준은 괴사 또는 섬유증이 50%를 초과하는 낮은 검체 품질, 동시 중증 감염 또는 자가면역 질환의 존재, 다른 악성 종양 병력, 환자의 참여 거부로 구성되었습니다.

1. 세포 배양 시약 준비

  1. CRC PDO를 위한 배양 배지: 표 1에 기재된 조성에 따라 CRC PDOs 완전한 배지를 준비한다.
  2. TIL16용 완전 배지(CM): RPMI1640 배지에 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, HEPES, 2-메르캅토에탄올 및 3000 IU/mL IL-2를 보충합니다.
  3. TIL 팽창 배지(EM): RPMI1640 배지에 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, HEPES 및 600 IU/mL IL-2를 보충합니다.
  4. AdDMEM++++: 고급 DMEM에 페니실린-스트렙토마이신 1%, HEPE 1%, 글루타민 1%, 5mM Y-27632를 보충합니다.
  5. CRC 분해 완충액: AdDMEM++++에 50μL 콜라겐분해효소 IV형 및 10μL 페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 용액을 추가합니다.
  6. 조직 세척 용액: PBS에 2% 페니실린-스트렙토마이신을 첨가합니다.

2. 환자 유래 조직 가공

  1. 원발성 결장직장암 종양 조직을 절제합니다(숙련된 외과의가 집도). 채취 후 조직을 두 부분으로 나눕니다. AdDMEM++++ 의 한 부분을 아이스박스에 넣고 종양세포 해리 및 배양을 위해 실험실로 운반합니다. 조직병리학적 분석을 위해 다른 부분을 4% 파라포름알데히드에 넣으십시오17.
  2. Matrigel을 4°C 냉장고에서 천천히 해동합니다. 적혈구 용해 완충액을 실온으로 예열합니다. 조직 가위, 겸자, AdDMEM++++ 배지 및 CRC 소화 완충액을 준비합니다.
  3. 티슈를 페트리 접시에 옮기고 5mL PBS로 3회 헹굽니다. 새 접시로 교체하고 오염을 최소화하기 위해 5mL 티슈 세척 버퍼로 세 번 헹굽니다.
  4. 가위로 조직을 다져 소화 완충액으로 옮기고 완전히 해리될 때까지 30분 동안 37°C 수조에서 배양합니다.
  5. 조직 가위로 조직을 잘라 조직 소화 용액으로 옮깁니다. 37°C 수조에서 조직을 소화하고 조직 해리가 완료될 때까지 모니터링합니다.
  6. 소화를 중화시키기 위해 동일한 부피의 AdDMEM++++을 첨가하십시오. 380 × g 에서 25 °C에서 5분 동안 원심분리기.
  7. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기합니다. 펠릿에 있는 적혈구의 수를 관찰하십시오. 1-3mL의 적혈구 용해물을 첨가하고 25°C에서 10분 동안 배양합니다.
    1. 동일한 부피의 AdDMEM++++으로 용해를 종료합니다. 약 25°C에서 380×g에서 5 분간 원 심분리기.
  8. 피펫을 사용하여 상등액을 버리고 세포 펠릿을 적절한 부피의 AdDMEM++++에 재현탁합니다.
  9. 종양 조직의 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 trypan blue exclusion을 사용하여 생존 가능한 세포를 정량화합니다.

3. PDO 모델 수립 및 TIL 문화

  1. 종양 조직의 단세포 현탁액을 두 부분으로 나누는데, 하나는 PDO 모델 확립에 사용하고 다른 하나는 TIL 배양에 사용합니다.
  2. 세포 계수 후 PDO 모델 구축을 위해 세포 현탁액의 웰당 80,000개의 세포를 Matrigel과 1:1 비율로 혼합합니다.
  3. TIL 배양을 위해 24웰 플레이트의 CM에 남아 있는 세포 현탁액을 1 × 106 cells/mL의 농도로 재현탁합니다.
  4. 매일 준수하십시오. PDO 및 TIL의 상태를 기록하기 위해 사진을 찍습니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.

4. TIL 정제 및 확장

  1. 정제 전에 10-20일 동안 배양 TIL을 사용합니다.
  2. TIL을 원심분리기 튜브에 모읍니다. 웰 플레이트를 새 배지로 헹구고 웰 플레이트에서 남아 있는 세포를 모두 수집합니다.
  3. 약 25°C에서 125× g 에서 5분간 원심분리기.
  4. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기합니다. 2mL PBS로 세척하고 약 25°C에서 5 분 동안 125×g으로 다시 원심분리합니다.
  5. 세포 계수를 수행합니다.
  6. CD3+T 세포를 분리하기 위해 분류를 위해 CD3+ 마그네틱 비드를 사용합니다18.
  7. 세포 현탁액으로 항체를 4°C에서 10-15분 동안 배양합니다.
  8. 10-15분 동안 4°C에서 항체 세포 현탁액과 함께 마그네틱 비드를 배양합니다.
  9. 정렬 열을 정렬 마그넷에 놓습니다. 세포 현탁액을 컬럼에 추가하고 마그네틱 비드 표지된 positive cells만 분류 컬럼에 유지되도록 합니다.
  10. 자기장에서 분류 열을 제거합니다. 완충 용액을 추가하여 컬럼에 남아 있는 양성 세포를 용리시킵니다. 2mL의 PBS에 세포를 재현탁시키고 195 × g 에서 약 25°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  11. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기합니다. 1 × 106 cells/mL의 농도로 새로운 EM 배지가 있는 12-well plate에 세포를 재현탁합니다. 5 μg/mL CD3 항체를 추가합니다. 3일마다 세포를 새로운 배양 플라스크에 통과시킵니다.

5. PDO의 조직학 및 IHC 특성화

  1. 오가노이드가 50μm 크기로 성장한 후 배양 배지를 흡인합니다.
  2. 오가노이드 구체를 4% 파라포름알데히드로 직접 고정합니다. 오가노이드를 흡인하고 약 25°C에서 5 분 동안 195×g에서 원심분리한 후 2% 아가로스에 삽입하고 경화시킨 다음 4% 파라포름알데히드로 옮겨 하룻밤 동안 고정합니다.
  3. 다음 날에 그라디언트 탈수를 수행합니다. 왁스 블록을 준비하고, 4μm 절편을 절단하고, 그래디언트를 사용하여 재수화하고, CK7, CK20, Ki-67 및 CDX-2 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행합니다.

6. TIL의 IF 특성화

  1. TIL을 정제하고, 적절한 수에 도달할 때까지 배양하고, 특성화를 위한 부분을 추출합니다.
  2. flaking 방법을 사용하여 부유 세포를 특성화합니다. 플레이커의 회전 속도를 약 343°C에서 4분 동안 25 ×g 로 설정합니다.
  3. 슬라이드당 1 × 104 에서 셀을 세고 시드합니다.
  4. 원심분리로 세포를 슬라이드에 단단히 부착합니다.
  5. 4% 파라포름알데히드로 세포를 15분 동안 고정하고 PBS로 3회 세척합니다.
  6. 차단 용액(2% FBS를 함유한 PBS)으로 1시간 동안 배양합니다.
  7. 실온에서 1시간 동안 1차 항체(CD45, CD3, EpCAM)로 배양합니다. PBS로 세 번 씻으십시오.
  8. 2차 항체를 준비하고 실온에서 1시간 동안 제조업체의 권장 농도에 따라 2차 항체로 배양합니다. PBS로 세 번 씻으십시오.
    참고: 항체 상동성에 주의하십시오.
  9. 약 25°C에서 15분 동안 DAPI로 배양합니다.
  10. 형광 현미경으로 염색된 세포를 관찰합니다.

7. PDO 및 TIL 공동 배양 시스템

  1. 오가노이드 배지에 IFN-γ를 추가하여 항원 발현을 향상시킵니다. 37 ° C에서 5 % CO2 24 시간15 분 동안 배양합니다.
  2. 항-CD28 항체를 PBS로 희석한다. 각 웰에 50μL의 항체 용액을 추가하여 96웰 플레이트를 코팅합니다. 밀봉 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  3. 24시간 후, TrypLE를 사용하여 오가노이드를 단일 세포로 해리합니다. 세포를 세고 PBS로 두 번 씻습니다.
  4. 쌍을 이룬 TIL을 수집하고, 세포를 계수하고, PBS로 두 번 세척합니다.
  5. 웰당 1 × 104 개 세포에서 오가노이드를 접종하고 웰당 1 × 105 개 세포에서 TIL을 접종하여 공동 배양을 위해 10:1의 effector-to-target (E:T) 비율을 달성합니다.
  6. 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 3000 U/mL IL-2 및 20 μg/mL 항-PD-1 차단 항체가 보충된 RPMI 1640 배지에서 공동 배양을 수행합니다. 3일 동안 배양하고 관찰 및 문서화를 위해 이미지를 캡처합니다.
    참고: TIL이 없는 오가노이드를 대조군으로 설정합니다.

8. 유세포 분석에 의한 TIL의 기능 분석

  1. 공동 배양 기간이 끝날 때 PDO 및 TIL을 수집합니다.
  2. PBS로 300 × g 에서 5 분 동안 원심 분리로 세포를 두 번 세척합니다. 피펫을 사용하여 상등액을 폐기합니다.
  3. CD3-FITC, CD4-APC/Cyanine7, CD8-APC, CD107a-PE-Cyanine7, CD279-PE 및 7-AAD를 포함하는 항체 칵테일을 준비합니다.
  4. 100 μL의 항체 칵테일에 세포를 재현탁시키고 빛으로부터 보호된 실온에서 20분 동안 배양합니다.
  5. 세포를 씻기 위해 1mL PBS를 첨가하십시오. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리기를 하고 피펫을 사용하여 상층액을 버립니다.
  6. 500μL PBS에서 세포를 재현탁합니다.
  7. 유세포 분석을 수행합니다. 자세한 분석 전략은 보충 그림 1 을 참조하십시오.

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결과

CRC PDO의 확립 및 특성화
종양 표본은 CRC 환자로부터 얻었다. 갓 절제된 CRC 종양 조직을 사용하여 PDO와 TIL을 확립했으며, 이는 이후 PDO-TIL 공동 배양 실험에 사용되었습니다(그림 1).

figure-results-1
그림 1: 전체 실험 워크플로우의 개략도. CRC PDO 확립, TIL 확장 및 공동 배양 분석을 포함한 실험 설계의 순차적 단계를 요약한 다이어그램입니다.

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토론

이 연구는 환자 유래 CRC 조직을 사용하여 PDO가 확립되고 TIL이 확장되는 종양 세포와 TIL을 모두 얻습니다. 그런 다음 이 두 구성 요소 간의 상호 작용은 공동 배양 시스템을 통해 조사됩니다.

이전 연구에서는 복잡한 기기를 사용하여 TIL을 추출하거나(19 ) 종양 조직 현탁액20에서 직접 추출했습니다. 그러나 이러한 방법은 제한된 종양 샘플에서 짧은 시간 내에 충분한 수의 TIL을 생성하지 못하는 경우가 많아 광범위한 적용이 제한됩니다. Young-TIL 배양16 의 개발은 TIL 생산 공정을 크게 단순화했습니다. TIL은 흑색종21, 자궁경부암22 및 기타 종양 유형

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공개 사항

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)[82172822]의 지원을 받았습니다. 다롄 과학기술국 고위급 인재 혁신 지원 프로그램 [2021RD02]; 랴오닝성 과학기술프로그램 공동계획[2024JH2/102600067]; 랴오닝성 국제 과학 기술 협력 프로젝트 [2024JH2/101900006].

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
고급 DMEM/F-12깁코12634028
2-메르캅토에탄올시그마63689
4% 파라포름알데히드비비E672002-0100
7-AAD바이오레전드420403
A83-01토크리스2939
B27 보충깁코17504-44
CD107a-PE-시아닌7바이오레전드328618
CD279-PE바이오레전드329906
CD3 단클론 항체 (OKT3)인비트로젠14-0037-82
CD3-FITC바이오레전드300406
CD45(세포내 도메인)(D9M8I) 중부 표준시13917S
CD4-APC/시아닌7바이오레전드300518
CD8-APC바이오레전드344722
CDX-2MXBRMA-0631
CK20 시리즈MXB키트-0025
CK7MXB키트-0021
Dylight 488, 염소 안티 토끼 IgG아브킨A23220
Dylight 549, 염소 항마우스 IgG아브킨A23310
EGF페프로텍AF-100-15
EpCAM중부 표준시36746T
태아 소 혈청(FBS)셀맥스SA211.02
FGF 10페프로텍100-26
가스트린(인간)토크리스3006
글루타맥스 100배깁코35050-061
헤페스시그마H4034
헴스시그마H4034
인간 CD3+ 세포 분리 키트(RUO)RWDK1201-10
인간 IFN-감마 재조합 단백질페프로테크300-02-20UG
키-67중부 표준시9449초
마트리겔코 닝354234
N-아세틸시스테인시그마A9165
니코틴아미드시그마N0636
니볼루맙(항-PD-1)셀렉A2002 
페니실린/스트렙토마이신시그마V900929
페니실린-스트렙토마이신엔씨엠바이오텍C100C5 시리즈
프리모신인비보젠개미-pm-1
RBC 용해 완충액써모-인비트로겐00-4300-54
재조합 인간 IL-2(보인체 없음)바이오레전드589104
RPMI 1640깁코
SB202190셀렉S1077
트리판 블루 염색 0.4%써모-인비트로겐티10282
Ultra-LEAF Purified anti-human CD28 항체바이오레전드302934
Ultra-LEAF 정제 항인간 CD3 항체바이오레전드317325
Y-27632셀렉S1049

참고문헌

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