이것은 포괄적인 Xenopus 샘플링 프로토콜의 첫 번째 부분입니다. 표본 조직은 심실, 동맥 줄기, 왼쪽 간엽, 담낭, 폐, 췌장, 비장, 후두, 식도, 위, 장, 고환, 지방체, 난관, 쌍을 이루는 신장, 좌골신경총, 피부, 흉선 및 눈 전체입니다.
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이 논문에서
요약
초록
Xenopus 는 오랫동안 척추동물의 발달과 질병을 조사하기 위한 중추적인 모델 유기체였으며, 세포 과정과 유전자 기능에 대한 깊은 통찰력을 제공해 왔습니다. 배아 제노푸스(Xenopus)에 대한 풍부한 정보에도 불구하고, 성체 조직 샘플링을 위한 표준화된 방법, 특히 정량적 단백질체학(quantitative proteomics)과 같은 현대적인 접근법에 대한 표준화된 방법에는 상당한 격차가 남아 있습니다. 이 연구는 성인 Xenopus의 여러 조직을 빠르고 정확하며 효율적으로 샘플링하기 위한 포괄적인 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 다른 항아리와 비교하여 미묘한 해부학적 차이와 관련된 문제를 해결하여 개구리 해부에 대한 경험이 부족한 사람들에게도 재현성을 보장합니다. 이 프로토콜은 시료의 신선도를 우선시하여 고품질 생화학 분석에 최적화되어 있습니다. 우리는 한 시간 이내에 최대 18개의 조직을 신속하게 수집할 수 있도록 촉진하고 있습니다. 또한 이 방법은 관류 및 비관류 조건에 적용되어 다양한 실험 요구 사항에 대한 유연성을 제공합니다. 이 연구는 Xenopus laevis 와 tropicalis 에 대한 중요한 방법론적 격차를 메울 뿐만 아니라 유사한 양서류 모델에 기술을 적용하는 연구자들에게 귀중한 자원으로 작용하여 비교 생물학 및 진화 연구의 범위와 신뢰성을 향상시킵니다.
서론
Xenopus 는 특히 발달 및 진화적 맥락에서 인간 질병을 연구하기 위해 마우스, 제브라피시 및 기타 모델 유기체에 비해 고유한 이점을 제공합니다. 외부 배아 발달과 크고 쉽게 조작할 수 있는 배아는 내부적으로 발달하고 침습적 절차가 필요한 마우스에서 어려운 실시간 관찰 및 실험적 개입(예: 조직 이식, 유전자 편집)을 가능하게 합니다. 또한, Xenopus의 3개의 방이 있는 심장과 사지동물의 팔다리는 선천적 결함1, 사지 재생2 및 심장 발달3 연구를 위한 보다 직접적인 진화적 다리를 제공합니다. 생쥐와 달리 제노푸스 올챙이는 포유류에는 없는 재생 과정을 모델링하여 팔다리와 장기를 재생할 수 있으며, 수생 생활 단계에서는 환경 또는 독소 영향에 대한 비침습적 연구를 수행할 수 있습니다. 더 빠른 육종, 더 낮은 비용 및 더 적은 윤리적 제약과 결합된 Xenopus 는 포유류 시스템에서 복제하기 어려운 기관 발생 및 스트레스 반응에 대한 고처리량, 기계론적 연구에 탁월합니다.
이 논문은 Xenopus 올챙이4에 사용할 수 있는 성인 Xenopus 조직의 정확하고 재현 가능한 장기 샘플링에 대한 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 성체 Xenopus의 "디지털 해부"5 및 "마이크로 CT 영상"6을 사용할 수 있지만, 마우스와 같은 다른 성체 모델에 대해 제공되는 자세한 지침 없이는 성체 Xenopus에서 일관된 장기 및 조직 샘플링을 달성하는 것은 어렵습니다 7,8,9.
6가지 중요한 조직에 대한 샘플 가이드를 사용할 수 있지만10 Xenopus 에 대한 구체적이고 광범위한 해부 및 샘플링 가이드는 현재 사용할 수 없습니다. Rana sp.11 에 대한 포괄적인 해부 가이드가 존재하며 다른 아누란12에 대한 다양한 교실 해부 매뉴얼을 사용할 수 있지만, 표본 채취 기술이나 양서류 해부학에 경험이 없는 개인의 경우 Xenopus 와 다른 아누란 간의 미묘한 차이로 인해 기존 자원이 일관되고 반복 가능한 조직 샘플링에 적합하지 않습니다.
이 가이드는 단백질체학 및 면역화학을 위해 조직 신선도를 우선시하기 위해 개발되었습니다. 숙련된 사용자는 한 시간 이내에 한 개인으로부터 모든 조직을 수집할 수 있습니다. 사용자가 경험이 부족한 경우, 대체하기 더 어려운 동물을 희생하기 전에 다른 이유로 안락사된 표본에 대해 이 프로토콜을 시도하는 것이 좋습니다.
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프로토콜
모든 실험은 하버드 의과대학 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee IS 00001365_3)의 규칙 및 규정에 따라 승인되고 수행되었습니다. 샘플링 전에 관류 프로토콜13 을 따르는 경우 2.3단계로 건너뜁니다.
1. 준비(관류 없음)
- 연구 기관이 이 프로토콜에 설명된 안락사 기술을 승인했는지 확인하십시오.
- 5g/L MS-222(트리카인 메탄설포네이트) 및 5g/L 중탄산나트륨 용액을 준비합니다( 재료표 참조). pH가 ≥7인지 확인하십시오.
참고: 부피는 안락사되는 동물을 완전히 덮는 데 필요한 부피보다 커야 합니다. - Xenopus를 MS-222 용액에 넣고(1.2단계부터) 총 1시간14분 동안 동물을 물에 담그는 방식으로 1차 안락사를 수행합니다.
- 해부 표면(트레이 또는 폼 시트)을 보조 용기 내의 비스듬한 곳에 놓거나 혈액 배출을 용이하게 하도록 배치하십시오.
- 개구리가 용액에 1시간 동안 들어가면 1차 안락사가 완료된 것입니다. 개구리를 제거하고 발 꼬집기를 수행하여 통증 상실 반응을 확인합니다.
- 표본 추출되는 동물의 나이(알고 있는 경우), 성별 및 건강 상태와 관류 여부를 기록합니다. Xenopus 의 무게를 측정하고 샘플링 전에 필요한 추가 측정을 수행합니다.
- 개구리를 등에 눕히고 몸에 가까운 앞다리를 고정합니다(그림 1A).
- 해부 가위를 사용하여 피부를 자르고 정중선을 따라 올라간 다음 옆으로 두 개의 덮개를 만듭니다.
- linea alba를 식별합니다(그림 1B). 겸자를 사용하여 linea alba를 잡고 coelomic cavity에서 당겨 빼냅니다. 조심스럽게 가위를 사용하여 근육 조직을 통해 머리 쪽으로 자릅니다. 캐비티 벽에서 두 개의 플랩을 만들고 모든 플랩을 자르거나 고정합니다.
- 아직 박동하고 있어야 하는 심장을 식별합니다. 심장에 쉽게 접근할 수 없는 경우 해부 가위를 사용하여 코라코이드 뼈를 줄입니다(그림 1B).
참고: 샘플링 전에 심장 박동이 멈춘 경우 샘플 신선도가 손상된 것입니다. - 원하는 경우 빠른 관류 프로토콜9를 완료합니다.
2. 샘플링
참고: 동물이 관류된 경우 2.3단계로 건너뜁니다. 모든 여백은 약 25mm여야 합니다. 집게와 가위는 깨끗이 닦거나 샘플 사이에 교체해야 합니다. 모든 조직은 안락사 후 1시간 이내에 샘플링하여 신선도를 극대화해야 합니다.
- 전사 피펫을 사용하여 냉각된 PBS 또는 0.7x PBS15 로 콜로믹 캐비티를 헹구어 혈액을 제거하고 가시성을 유지합니다.
- 얇은 심낭(그림 2A)을 식별하고 조직 집게로 팽팽하게 당깁니다. 홍채 절제술 가위의 끝을 사용하여 밑에 있는 조직을 자르지 않도록 주의하면서 부드럽게 구멍을 뚫습니다. 심장의 세 방에서 심낭을 위로 떼어냅니다(그림 2B).
- 귓바퀴가 심실과 동맥 줄기와 만나는 곳을 잘라 귓바퀴를 잘라냅니다.
- 겸자를 사용하여 심실의 정점을 잡고 동맥 줄기와 만나는 부분 아래로 잘라 여백을 남깁니다(그림 2C).
- 원치 않는 조직이 부착되어 있지 않은지 확인하기 위해 확대 상태에서 심실을 육안으로 검사합니다.
참고: 심실의 중심에는 밝은 색의 나선형 판막 조직이 포함될 수 있습니다. 이것은 유지될 수 있습니다. 관류되지 않은 동물의 경우, 심실 제거는 2차 안락사(말기 마취라고도 함)에 해당할 수 있습니다. - 시료 채취 직후, 실험의 필요에 따라 조직 시료를 냉장 PBS 또는 0.7x PBS로 헹굽니다15.
참고: 관류된 동물에서는 간을 제외한 모든 조직이 깨끗하게 헹궈질 것으로 예상됩니다. 그렇지 않은 경우 메모를 작성해야 합니다. 관류되지 않은 조직에서는 모든 헹굼 매체가 혈액으로 포화됩니다. 각 조직을 샘플링한 후 2.5–2.6단계를 따라야 합니다. - 동맥 줄기(arterial trunk)가 두 개의 대동맥 줄기(lateral aortae라고도 함)로 나뉘고 각 대동맥 줄기가 세 개의 동맥궁으로 나뉘는 것을 관찰하십시오(그림 2D). 동맥 줄기를 팽팽하게 당기고 이 아치가 갈라진 직후 대동맥 줄기를 자릅니다.
- 간의 세 엽을 관찰합니다(그림 3A). 왼쪽 엽(관찰자의 오른쪽)의 입술을 잡고 간관과 낭포성이 보이도록 부드럽게 들어 올립니다. 이러한 부착물 아래에 있는 엽의 아래쪽 2/3를 샘플링합니다(그림 3B).
- 색이 크게 다를 수 있는 담낭을 식별합니다. 담낭을 잡고 간의 우엽에서 담낭을 분리한 다음 담낭의 부착을 절단합니다(그림 3C). 파열되지 않으면 홍채 절제술 가위로 파열하십시오.
- 폐의 정점을 잡고 팽팽하게 당깁니다. 폐포의 질감을 기록하고 그 질감이 끝나는 위치와 기관지가 시작되는 위치를 결정합니다. 이 여백에서 자릅니다(그림 3D). 폐가 복막에 융합되어 있으면 조심스럽게 분리하십시오.
- 생식 상피(germinal epithelium)라고 하는 내장 복막층으로 둘러싸인 난소를 확인합니다. 부착 영역이 보이도록 각각의 측면에 올 때까지 엽을 부드럽게 이동합니다(그림 4A). 이러한 부착물은 쌍을 이루는 신장의 직접 복부에 있습니다. 가위를 사용하여 난소를 손상시키지 않고 가능한 한 신장에 가깝게 제거합니다(그림 4B). 이 과정에서 난모세포가 누출되면 샘플을 채취한 다음 헹굽니다.
참고: 난소를 제거하면 암컷 개구리의 조직에 더 잘 접근하는 데 도움이 됩니다. - 간의 전엽(정중엽이라고도 함)을 검사하고 장간막을 통해 위와 십이지장에 어떻게 연결되어 있는지 확인합니다(그림 3A 및 그림 4C). 홍채 절제술 가위를 사용하여 장간막과 간십이지장 인대를 절단합니다. 나머지 다육질 덩어리는 췌장과 총담관입니다.
- 췌장과 총담관과 간의 전엽의 연결을 끊고 여백을 남깁니다. 톱니가 있는 집게로 배를 잡고 조직 집게로 췌장의 한쪽 끝을 잡습니다. 확대하여 위에서 췌장을 부드럽게 떼어냅니다(그림 4D).
- 췌장이 깨끗하게 떨어져 나가지 않으면 남아 있는 췌장 조직을 제거합니다. 또는 홍채 절제술 가위와 조직 집게를 사용하여 췌장을 체계적으로 분리합니다.
참고: 총담관 외에도 일부 장간막과 췌관이 이 샘플에 포함될 것으로 예상됩니다.
- 췌장이 깨끗하게 떨어져 나가지 않으면 남아 있는 췌장 조직을 제거합니다. 또는 홍채 절제술 가위와 조직 집게를 사용하여 췌장을 체계적으로 분리합니다.
- 비장을 확인하고 복막에 부착된 비장을 절단하여 샘플을 채취합니다(그림 4E).
- 남은 간 조직을 제거하고 폐기합니다.
- 다른 쪽 폐와 후두에 붙어 있는 나머지 기관지를 제거합니다. 후두의 아래쪽 끝을 잡고 후두를 구멍 밖으로 들어 올리기 시작하여 뚜렷한 부착물을 절단합니다.
- 후두를 들어 올리면 식도에 대한 부착이 눈에 띄게 됩니다. 구부러진 홍채 절제술 가위를 사용하여 후두에서 식도 조직을 조심스럽게 벗기고 잘라냅니다(그림 5A). 그런 다음 후두를 아래로 당겨 입강에서 잘라냅니다. 눈에 띄는 명확한 첨부 파일을 잘라냅니다.
- 식도와 구별되는 위의 만곡률과 위와 장을 구별하는 유문 제한에 주목하십시오(그림 5B). 위의 곡률 바로 앞에 있는 소화관을 잘라 식도와 분리합니다.
- 입을 벌리고 지붕에 있는 유스타키오관의 공유 개구부를 확인한다16. 입을 벌린 상태에서 식도를 잡아당겨 식도가 붙어있는지 확인합니다(그림 5C). 식도를 강에서 들어 올려 도중에 깨끗한 부착물을 절단합니다. 유스타키오 개구부 바로 아래에 있는 협측강에서 식도를 절단합니다.
- 위를 잡고 유문 제한에서 십이지장과 만나는 부분을 자릅니다(그림 5A, B).
- 결장을 팽팽하게 당겨 배설물에 최대한 가깝게 자릅니다(그림 5D). 장을 당겨 깨끗한 복막 부착물을 절단합니다.
- 개구리가 수컷인 경우, 홍채 절제술 가위를 사용하여 고환을 제거하되 밑에 있는 신장이 손상되지 않도록 주의합니다(그림 6A).
- 뚱뚱한 몸체를 분리하여 각각의 측면에 있도록 합니다. 지방체가 복막과 연결되는 신장 위 영역이 보입니다. 뚱뚱한 몸체의 바닥을 잡고 가위를 사용하여 복막에서 잘라내어 여백을 남깁니다(그림 6B).
- 방광을 확인하고 제거하여 배설물에 최대한 가깝게 자릅니다(그림 6C).
- 개구리가 암컷이거나 뚜렷한 흔적이 있는 난관이 있는 경우 난관의 아래쪽 끝을 잡고 배설물에서 당겨 배설물에 최대한 가깝게 자릅니다(그림 6D). coelomic cavity에서 난관을 당겨 빼내고, 복막 부착물이 드러나면 모두 절단합니다(그림 6E).
- 남은 지방체와 고환 또는 산관을 제거하고 폐기하십시오.
- 겸자를 사용하여 신장의 아래쪽 기저부를 잡고 투명한 복막(후복막)으로 덮여 있는지 확인합니다.17. 신장 기저부의 복막을 절단한 다음(그림 7A) 필요에 따라 가위를 사용하여 복막을 절단하여 신장을 결강강에서 들어 올립니다(그림 7B).
- 확대하여 과도한 복막과 남아 있는 지방체, 난소 또는 고환 조직을 잘라냅니다.
- 척추의 말단을 각 다리에 연결하는 말초 신경 다발을 관찰하십시오. 이것이 좌골신경총(sciatic plexus)입니다. 겸자로 신경 다발을 잡고 결강강을 빠져나가는 곳에서 절단합니다(그림 7C). 다발을 구멍에서 들어 올려 신경이 척추를 떠나는 부분을 자릅니다(그림 7D).
- 동물에서 핀을 제거하고 복부로 뒤집은 다음 동물의 팔다리를 다시 고정합니다. 샘플링할 뒷다리 중 하나를 선택하고 해당 팔다리의 발을 고정합니다.
- 비복근/경골 비골 위에서 아몬드 모양의 피부 덮개를 제거합니다(그림 8A, B).
- 등쪽의 피부를 잡고 옆으로 잘라 동물의 중간 부분 주위를 연속적으로 절단합니다(그림 8C).
- 핀을 제거하고 한 손으로 다리를 고정한 다음 톱니 집게로 앞쪽 등쪽 피부를 잡습니다. 힘을 사용하여 머리와 팔 위로 등쪽 피부를 당겨 동물의 가죽을 벗깁니다(그림 8D).
- 턱관절을 덮고 있는 지방 덩어리를 확인하고, 턱관절이 분홍색 근육 조직으로 융합되는 부분의 뒤쪽 가장자리를 절단한 다음, 홍채 절제술 가위를 사용하여 밑에 있는 뼈에서 지방을 잘라냅니다(그림 9A). 동물의 나이와 성숙도에 따라 멜라노포어(melanophores) 무리가 뚜렷해집니다(그림 9B). 근육 부착물이나 연골이 부착되지 않도록 덩어리를 잘라냅니다.
- 동물을 다시 고정하고 눈을 선택합니다. 구부러진 홍채 절제술 가위를 눈의 곡률 주위의 안와에 삽입합니다(그림 9C). 눈 주위를 부드럽게 잘라 근육 부착을 절단합니다.
- 가위를 안와 깊숙이 밀어 넣고 눈 뒤의 시신경을 분리합니다. 이 가위를 사용하여 안구를 안와에서 빼낸 다음 근육 부착물을 더욱 줄이십시오.
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결과
이 프로토콜의 모든 단계를 따름으로써, 심장실, 동맥 줄기, 좌측 간엽, 담낭, 폐, 췌장, 비장, 후두, 식도, 위, 장, 고환, 지방체, 난관, 쌍을 이루는 신장, 좌골신경총, 피부, 흉선 및 눈 전체를 안락사 후 한 시간 이내에 깨끗하게 절제했습니다(그림 1, 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5, 그림 6 참조, 그림 7, 그림 8
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토론
여기에 제시된 프로토콜은 다양한 경험 수준의 사용자에게 유연성을 제공하는 동시에 적시에 효율적인 방식으로 필수 조직을 수집할 수 있도록 설계되었습니다. 신규 사용자는 체계적인 조직 수집을 보장하기 위해 설명된 대로 프로토콜의 각 단계를 따르는 것이 좋습니다. 그러나 경험이 많은 사용자는 특정 단계를 건너뛰고 필요한 조직만 샘플링할 수 있습니다. 예를 들어, 장간막 뒤에 위치한 비장에 접근하는 것은 췌장을 샘플링하지 않고도 단순히 위를 이동시키는 것만으로 달성할 수 있습니다. 이러한 적응성을 통해 특정 연구 요구 사항에 따라 샘플링 프로세스를 맞춤화할 수 있습니다. 조직 분해 속도와 대사 활성은 장기에 따라 다르지만, 신속하게 작업하고 냉각 완충액을 사용하면 결과 샘플에 미치는 영향을 최소화할 수 있습니다.
이 프로토콜은 효율성을 위해 설계되어 한 시간 이내에 최대 18개의 조직을 수집할 수 있습니다. 이 방법의 한계는 ...
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공개 사항
저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NIH의 OD R24 보조금 ODO31956의 지원을 받았습니다. 또한 Samantha Jalbert와 Jill Ralston의 도움과 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| LED 조명이 있는 5x 돋보기 및 스탠 | amazon.com | B08QJ6J8P1 | 조명은 열을 발생시키지 않아야 합니다 |
| 일회용 이송 피펫 | VWR | 414004-036 | |
| 해부 미세한 집게 | Fisher Scientific | 08-875 | |
| 해부 가위 날카로운 파이온트, 스트레이트 6.5" | VWR | 76457-374 | |
| 해부 트레이 | Fisher Scientific | 14-370-284 | 스티로폼 시트는 허용되는 대안입니다 |
| 락사 용기 | 미국 플라스틱 | 항목 2860 | 대체 불투명 용기 허용 |
| 락사 용기 뚜껑 | 미국 플라스틱 | 항목 3047 | |
| 홍채 절제술 가위 6" | VWR | 470018-938 | 홍채 가위는 허용되는 대안입니다 |
| MS-222: Syncaine(이전 트리카인) | Pentair AES | TRS1 | |
| 쥐 치아 조직 겸자 5.5인치, 스테인레스 스틸 | Fisher Scientific | S08100 | |
| 중탄산나트륨, 분말, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| 표본 겸자, 톱니 모양 VWR | 82027-442 | ||
| 해부용 T-핀 | Fisher Scinetific | S99385 |
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