방법 논문

고처리량 스캐폴드 기반 배양 플랫폼으로서의 SPOT의 재현 가능한 제조

DOI:

10.3791/68405

⸱

2025년 7월 29일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, University of Toronto, 3Division of Engineering Science, University of Toronto

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 처리량이 많은 스캐폴드 기반 배양 플랫폼인 SPOT의 제작 및 조립을 96웰 및 384웰 형식으로 문서화합니다. 또한 수동 및 상업적으로 이용 가능한 액체 처리기를 사용하여 SPOT의 파종 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

환자 유래 오가노이드(PDO)는 종양을 모델링하기 위해 암 연구 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그들은 생체 내 모델과 전통적인 시험관 내 모델의 이점을 결합하여 여전히 인간 세포로 구성되면서 조직의 복잡성과 이질성을 요약합니다. 생리학적으로 대표적인 PDO 모델의 등장으로 오가노이드 거동을 간단하게 분석할 수 있는 장치의 필요성이 높아졌습니다. 이 프로토콜은 처리량이 높은 3차원(3D) 오가노이드 배양 장치인 오가노이드 기반 조직용 스캐폴드 지원 플랫폼(SPOT)을 조립하고 사용하는 방법을 설명합니다. 이 플랫폼은 일반적으로 시드 하이드로겔에 의해 형성되는 메니스커스를 제거하여 2차원(2D) 배양의 이미징 프로세스와 유사하게 정확하고 빠른 이미징을 가능하게 합니다. 결과적으로, SPOT에 파종된 오가노이드 및 공동 배양은 고처리량 현미경을 사용하여 쉽게 이미지화할 수 있습니다. 기성품으로 설계된 SPOT은 기본적인 조직 배양 경험이 있는 연구자가 액세스할 수 있으며 수동 및 자동 파종 워크플로우와 모두 호환됩니다. 이 프로토콜은 조립, 시딩, 품질 관리 및 문제 해결에 대한 단계별 지침을 포함하여 96 및 384 웰 형식의 SPOT 제작에 대해 자세히 설명합니다. 유휴 시간을 제외하고 제작에는 3-4시간이 소요되지만 여러 개의 플레이트를 동시에 생산할 수 있어 확장성이 향상됩니다. PDO 배양 및 분석을 간소화함으로써 SPOT은 처리량이 많은 약물 스크리닝 및 중개 암 연구를 위한 강력한 도구를 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

생물의학 연구의 발전에도 불구하고 생리학적으로 관련된 체외 분석을 개발하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이상적인 분석은 다양한 분야의 연구자의 요구를 충족하기 위해 다양한 세포 유형, 치료 제형, 시간 척도, 상용 기기 및 분석 판독값을 수용해야 합니다. 그러나 적절한 도구가 부족하기 때문에 연구자들은 특히 암 연구에서 복잡성과 임상적 관련성을 요약하지 못하는 불멸화된 세포주의 2D 단층과 같은 단순한 모델에 의존하는 경우가 많습니다 1,2. 이 문제를 해결하기 위해 대규모 종양 바이오뱅킹과 임상의 협력을 통해 세포주에 비해 더 많은 환자별 유전 및 치료 프로필을 유지하는 환자 유래 종양 오가노이드(PDO)와 같은 충실도가 높은 시험관 내 모델의 개발이 촉진되었습니다 3,4,5. 한편, 실험실 자동화 및 신약 개발의 발전으로 인해 처리량이 많은 워크플로에 원활하게 통합되는 플랫폼이 필요합니다. 기존 플랫폼은 생물학적 충실도 또는 확장성을 다루지만 두 가지 문제를 동시에 해결할 수 있는 플랫폼은 거의 없습니다 6,7,8. 주요 질병 특징을 복제하는 자동화된 고처리량 모델을 개발하는 것은 생물의학 연구를 발전시키고 중개 애플리케이션을 위한 데이터 생성을 가속화하는 데 매우 중요합니다.

수많은 새로운 모델은 PDO와 같은 특수 세포 유형을 높은 처리량으로 배양하는 것과 관련된 문제를 해결하는 것을 목표로 합니다(그림 1). 오가노이드가 96웰 또는 384웰 플레이트에서 하이드로겔과 혼합되는 표준 플랫폼에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다: (i) 높은 세포-겔 부피는 일관되지 않은 영양소 접근으로 이어지며, (ii) 웰 메니스커스 곡률은 이미징 아티팩트 및 세포 구배를 생성하며, (iii) 하이드로겔 파종은 배치 및 인력 전반에 걸쳐 균일성이 부족합니다., (iv) 자동화된 제조 및 자동화된 현미경과의 비호환성, (v) 일반적으로 부드럽고 깨지기 쉬운 위험 샘플인 세포외 기질(ECM)의 사용 생리학적 조직 밀도에서의 파괴 또는 수축 세포 유형의 혼입 1,9. 현재 플레이트 기반 PDO 연구의 대부분은 세포-겔을 플레이트(10,11)에 수동으로 시딩하거나, 하이드로겔을 덜 점성이 있는 배지로 희석하고 세포를 웰 바닥으로 원심분리하여 적절한 광학 평면(12,13)에 배치하는 겔 오버레이 방법을 사용하여 수행됩니다. 두 접근 방식 모두 장기적인 배양을 위한 기계적 지원을 제공하지 못합니다. 이전 관찰(미공개 데이터)에 따르면, 표준 웰 플레이트의 세포와 혼합된 상업용 하이드로겔은 12일 동안 12개의 웰 중 9개 동안 웰 표면에서 수축하는 반면, 겔 오버레이 방법에는 생리학적 세포-기질 상호 작용이 부족합니다. 또한, 생성된 배양물은 웰 내의 공간 제한으로 인해 장기간 유지될 수 없으며 높은 시약 대 세포-배지 비율을 요구하는 분석과 양립할 수 없습니다 14,15,16. 이러한 실질적인 장벽은 3D 모델의 채택을 방해하고 현장 전반에 걸쳐 실험 재현성을 제한합니다.

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그림 1: 확장성 및 생물학적 관련성을 기반으로 한 배양 모델 평가. 플레이트 처리량과 생물학적 관련성(x축)으로 정의되는 확장성(y축)을 따라 다양한 시험관 내 및 생체 내 배양 시스템의 상대적 위치를 지정하여 처리량 잠재력과 생리학적 충실도 간의 절충안을 강조합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이러한 과제에 동기를 부여하여 얇은 셀룰로오스 스캐폴드의 높은 다공성과 기계적 강화를 활용하여 96웰 및 384웰 형식으로 제공되는 오가노이드 기반 조직용 스캐폴드 지원 플랫폼(SPOT)을 개발했습니다. SPOT은 플레이트 레이아웃과 일치하는 이전에 개발된 침투 방법(17)을 사용하여 폴리머 사전 패턴화된 스캐폴드를 통합하여 정밀한 세포-겔 액적 배치를 가능하게 하고 하이드로겔 상에 대한 구조적 지지를 제공합니다(그림 2A). 스캐폴드로의 모세관 위킹은 세포-겔 용액을 안내하여 기계적으로 강제된 생체 복합재 네트워크를 형성합니다(그림 2B). 스캐폴드의 다공성 구조로 인해 세포-겔이 침투하여 얇은 층(두께 약 70μm)을 형성하여 웰(14)의 바닥을 덮는 데 10배 적은 양의 세포-겔이 필요합니다. SPOT과 파종 췌관 선암종(PDAC) PDO의 호환성은 대사 분석 및 이미지 기반 측정을 사용하여 성장을 평가함으로써 입증되었습니다. 개발 이후 SPOT은 오가노이드 배양에 종사하는 연구자들에게 상당한 다양성과 유용성을 입증했습니다. 또한 SPOT의 설계는 평평하고 반월상연이 없는 마이크로겔 형상을 통해 시약 부피를 줄이고 이미징 기능을 개선하여 사용자 친화적인 확장성을 수용하여 균일한 빛 투과와 정확한 고함량 이미징을 보장합니다14(그림 2C,D). SPOT은 또한 종양 미세 환경을 더 잘 요약하기 위해 섬유아세포와 같은 다른 관련 세포 유형과의 공동 배양을 지원합니다18.

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그림 2: 96-SPOT 장치 및 이미지 분석 워크플로우 개요. (A) SPOT 플레이트 제조의 개략도: 장치는 양면 폴리아크릴 접착제 층(노란색으로 표시됨)을 사용하여 상업용 바닥이 없는 웰 플레이트(상단), PMMA 패턴 스캐폴드(파란색으로 표시) 및 폴리카보네이트 필름(하단)을 대조하여 조립됩니다. (B) 스캐폴드 웰에 세포 파종: 세포를 중합되지 않은 하이드로겔(분홍색으로 표시됨)에 현탁시키고 스캐폴드에 침투하는 각 웰에 피펫팅합니다. 그런 다음 하이드로겔을 겔화하여 스캐폴드 지지 하이드로겔 내에서 세포를 캡슐화합니다. (C) 현미경: 생성된 미세조직은 자동화된 광시야 현미경을 사용하여 이미지화할 수 있습니다. (D) 이미지 기반 분석: 겔에 부유하는 형광 세포(녹색)의 획득 이미지는 표준 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 분석할 수 있습니다. 하나의 96-SPOT 웰에서 GFP 발현 KP4 세포의 대표적인 낙산화 현미경 이미지. 스케일 바는 500μm입니다. 이 수치는14에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

SPOT의 또 다른 장점은 시스템을 오픈 소스 액체 처리기와 통합하여 PDO 배양의 자동화되고 재현 가능한 제조를 용이하게 할 수 있다는 것입니다. 이러한 발전은 사용자 변동성을 줄이고 고처리량 약물 스크리닝 및 맞춤형 의학 접근법을 포함한 복잡한 실험 설계를 지원합니다18. SPOT은 또한 이전에 이질적인 종양 환경에서 세포 표현형의 단일 세포 기반 다중화 특성화 및 분해에 의한 SPOT으로부터 필요에 따라 세포를 회수하는 것으로 나타났습니다18. 이러한 기능은 SPOT을 생리학적으로 관련된 조건에서 약물 효능 및 세포 거동을 평가하는 데 종단적 고해상도 데이터가 필수적인 스크리닝 응용 분야를 위한 다목적 도구로 자리매김합니다14,18. 이러한 기술 혁신을 결합함으로써 SPOT은 기존 3D 배양 시스템의 중요한 한계를 해결합니다.

이 프로토콜은 견고하고 재현 가능한 3D 오가노이드 배양을 위한 SPOT 구성 요소 제작, 플레이트 조립 및 파종 방법에 대한 포괄적인 가이드를 제공합니다. 여기에는 마이크로피펫을 사용한 수동 플레이트 시딩과 96웰 및 384웰 형식을 모두 지원하는 액체 핸들러를 사용한 자동 시딩 워크플로우에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다. 또한 이 프로토콜은 높은 실험 표준을 유지하기 위해 균일한 겔 분포 및 스캐폴드 무결성 확인과 같은 필수 품질 관리 조치를 간략하게 설명합니다. 불완전한 젤 침투, 파종 중 증발, 스캐폴드 분리와 같은 일반적인 문제를 해결하기 위한 문제 해결 전략도 제공되어 연구자에게 작업 흐름을 최적화하고 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있는 실용적인 솔루션을 제공합니다.

SPOT은 겔 무결성을 유지하면서 분석 및 배지 변경 수행과 관련된 문제를 포함하여 전통적인 오가노이드 분석이 직면하는 격차를 메우도록 설계되었습니다 10,11,12,13. 이 방법의 전반적인 목표는 12일 동안 오가노이드 배양을 지원하는 스캐폴드 지원 플랫폼을 제조하는 것입니다. 또한 이 방법은 수동 또는 액체 처리기 지원 시딩을 통해 SPOT에서 조직 어레이를 생성하는 것을 포함하여 사용자가 약물 IC50 분석 및 소분자 스크리닝을 포함한 모든 다운스트림 섭동을 수행할 수 있도록 합니다.

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프로토콜

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이 프로토콜에서는 췌관 선암종(PDAC) 오가노이드를 예로 사용했습니다. 이러한 오가노이드는 토론토 대학 연구 윤리 위원회 지침(프로토콜 #36107)을 준수하는 프로토콜에 따라 프린세스 마가렛 암 센터의 UHN 바이오뱅크(캐나다 대학 보건 네트워크의 PMLB 식별자 PPTO.46)에서 구입한 PDAC 환자로부터 확립되었습니다. 필요한 모든 재료, 시약 및 장비는 재료 표에서 참조하십시오.

1. PMMA-아세톤 용액 만들기 (타이밍: 20분 + ~8-16시간 유휴)

참고: 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA)-아세톤 용액은 SPOT에서 웰을 묘사하고 웰 간 누출을 방지하는 데 사용됩니다. 일반적인 절차는 고체 PMMA를 아세톤에 녹이는 것입니다. 이전에는 PMMA-아세톤 용액을 사용하여 유사한 종이 스캐폴드를 패턴화하여 배지 및 가스 교환을 차단하여 다른 3D 배양 모델에서 저산소증을 달성했습니다17. 여기서, PMMA-아세톤 공식은 SPOT 제조를 위한 PMMA 침투 스캐폴드를 생성하도록 조정됩니다.

  1. 라벨이 붙은 50mL 원추형 원심분리기 튜브에 PMMA 분말 1.75g을 첨가합니다. 그런 다음 흄 후드에 7.84mL의 아세톤을 넣고 용매 증발을 방지하기 위해 튜브를 단단히 닫습니다.
  2. 폴리머 패턴의 시각화가 필요한 경우 매니큐어 5-10방울을 용액에 첨가하십시오. 원심분리기 튜브를 단단히 닫습니다. 튜브를 수동으로 흔들어 광택제와 PMMA-아세톤 용액의 혼합을 시작합니다.
    참고: 여러 플로팅 배치에서 일관성을 유지하려면 알려진 양의 매니큐어를 아세톤으로 희석한 다음 이 용액을 7.84mL의 아세톤으로 피펫팅합니다.
  3. PMMA-아세톤 용액을 와류 혼합기에 밤새 올려 용액이 용해되도록 합니다. PMMA-아세톤 용액을 개봉하지 않은 경우 최대 2주 동안 4°C에서 보관하십시오.

2. PMMA 침투 비계 만들기

(타이밍: 96-SPOT 패터닝의 경우: 15분 설정 + 스캐폴드당 6분, 384-SPOT 패터닝의 경우: 15분 설정 + 스캐폴드당 10분)

참고: 96-/384-SPOT용 PMMA 침투 스캐폴드의 제작은 작업대(비멸균 환경)에서만 수행됩니다. 96/384-SPOT 스캐폴드를 만들려면 해당 그래픽 편집 플로터 소프트웨어 또는 벡터 플로터 제어 라이브러리가 설치되어 있는지 확인하십시오.절차의 일부 하위 섹션은 96-SPOT과 384-SPOT 모두에 적용되는 반면 다른 하위 섹션은 하나의 플레이트 크기에만 적용됩니다. 후자의 경우 옵션 A(96-SPOT의 경우) 및 B(384-SPOT의 경우)가 표시됩니다. (A) 96-SPOT 패턴의 경우 세 개의 레이어가 있습니다. 첫째, 프라이밍 라인은 PMMA-아세톤 용액의 일관된 흐름을 설정합니다. 둘째, 96개의 원 배열; 마지막으로 TSP(Traveling Salesperson) 패턴은 웰 간 공간을 표시합니다. (B) 384-SPOT 패턴의 경우, 제1 모듈은 프라이밍 라인을 포함한다; 둘째, 웰 플레이트를 둘러싼 경계; 마지막으로 384개의 영역이 남아 있도록 그리드가 표시됩니다. 두 패턴 모두에 대해 Li et al.14에서 입증한 것처럼 소스 코드를 변경하여 웰의 크기를 제어할 수 있습니다.

  1. 비계 침투 프로세스 설정
    1. PMMA-아세톤 용액(4°C에서 보관)을 실온에서 10분 동안 흔들도록 합니다. 플로팅이 시작될 때까지 튜브 홀더를 그대로 두십시오.
    2. 전원 케이블을 사용하여 플로터를 전원에 연결합니다. 녹색으로 깜박이는 표시등은 장치가 켜져 있음을 나타냅니다. 플로터의 USB 케이블을 플로팅을 위해 지정된 컴퓨터에 연결합니다.
    3. 클립 이젤을 양피지로 덮습니다. 이젤의 전체 표면이 덮여 있는지 확인하십시오.
      1. 96-/384-SPOT 패턴의 플로팅을 안내하려면 프린터 용지에 96-/384-SPOT 템플릿을 준비합니다. 주사기 대신 펜을 사용하고 양피지와 차 필터 대신 프린터 용지를 사용하여 2.2-2.3단계를 수행합니다. 템플릿이 준비되면 클립 이젤 위에 놓고 양피지로 덮습니다. 2.2단계로 진행하고 프로토콜에 따라 96-/384-SPOT 스캐폴드를 만듭니다.
    4. 고정amp 바인더 클립을 사용하여 양피지를 이젤에 대십시오(그림 3A). 비계 시트(즉, 차 여과지)를 가져다가 두 층이 함께 융합되는 측면을 따라 자릅니다(그림 3B).
    5. 잘라낸 차 필터(이하 종이 비계라고 함)를 매끄러운 면(차 필터의 바깥쪽)이 위로 향하도록 클립 이젤 위에 놓습니다. 세 면을 고정합니다. 종이 비계가 클립 이젤에서 완전히 평평한지 확인하십시오. 플로팅 영역에 주름이 없어야 합니다.
  2. 96/384-SPOT 패턴 플로팅
    1. 플로터 소프트웨어 및 파일을 96-SPOT에 대해 설정하려면 옵션 2.2.2를 따르십시오. 384-SPOT에 대한 소프트웨어 및 파일을 설정하려면 옵션 2.2.3을 따르십시오.
    2. 플로터 소프트웨어 및 96-SPOT 플로팅 파일 설정
      1. 소프트웨어 앱에서 96-SPOT용 SVG 파일(보충 파일 1; 그림 4A). 메뉴 모음에서 확장 > 플로터 제어 로 이동합니다(그림 4B).
      2. 새 창이 나타나면 보충 그림 1과 일치하도록 설정을 조정합니다. 플로터 컨트롤 확장 창의 플롯 탭으로 돌아갑니다. 나중을 위해 열어 두십시오.
    3. 벡터 플로터 제어 라이브러리 API 및 384-SPOT 플로팅 파일 설정
      1. 명령 프롬프트 창(Windows) 또는 터미널(Mac)을 엽니다. 지정된 대화형 컴퓨팅 노트북을 시작하는 명령을 입력합니다. 노트북이 브라우저에서 열리는지 확인합니다.
      2. 384-SPOT 코드 파일(보충 파일 2)을 선택하여 엽니다. 20G 팁(또는 384-SPOT 패턴의 경우 16G 팁)을 사용하여 3mL 플로팅 주사기로 1mL의 PMMA-아세톤 용액을 흡인합니다(그림 3C).
        알림: 10mL 로딩 주사기와 EVA 튜브 사이의 유량 제어 밸브는 열려 있어야 합니다(배럴과 평행). 침투 공정은 중력에 의해 구동되므로 플로팅 중에 일관된 디스펜싱 부피를 유지하기 위해 3mL 플로팅 주사기가 항상 0.5-1.5mL 표시 사이에 채워져 있는지 확인하십시오.
    4. 3mL 플로팅 주사기의 끝이 여전히 PMMA-아세톤 용액 안에 있는 동안 10mL 로딩 주사기와 EVA 튜브 사이의 유량 제어 밸브를 닫습니다(배럴에 수직으로 가져오기).
    5. PMMA-아세톤 용액 튜브를 빠르게 닫습니다. 3mL 주사기를 펜 홀더에 넣습니다. 홀더를 기준으로 주사기의 높이를 조정하여 다음 정렬을 달성합니다(그림 3D).
    6. 3mL 주사기의 끝이 플롯된 패턴의 원점(즉, 템플릿 패턴의 왼쪽 상단에 있는 어두운 점)에 위치하도록 클립 이젤의 위치를 조정합니다. 주사기가 부착된 플로터 펜 홀더를 들어 올려 클립 이젤을 아래로 밀어 넣습니다.
    7. 10mL 주사기를 튜브에서 빠르게 분리하여 대기압이 3mL 플로팅 주사기에 저장된 PMMA-아세톤 용액에 압력을 가할 수 있도록 합니다. 유량 제어 밸브를 엽니다.
    8. 96-SPOT 패턴 플로팅을 시작하려면 2.2.9단계를 따르십시오. 384-SPOT 플롯을 시작하려면 2.2.10단계를 따릅니다.
    9. 아래 설명된 대로 지정된 플로터에서 96-SPOT 플로팅을 시작합니다.
      1. 소프트웨어에서 플로터 제어 확장에서 적용을 클릭합니다. 이제 플로터가 실행되기 시작하여 PMMA 패턴을 플로팅합니다. 플로팅이 완료되고 플로터 펜 홀더가 홈 위치로 돌아갈 때까지 추가 작업이 필요하지 않습니다.
      2. 플로팅 중에 플로터를 일시 중지하려면 플로터 왼쪽에 있는 작은 은색 버튼을 누릅니다. 그런 다음 그래픽 소프트웨어의 플로터 제어 확장 > 재개 탭을 통해 플롯이 중지된 위치에서 플로팅을 재개하거나 펜 홀더를 홈 위치로 되돌릴 수 있습니다(보충 그림 1C(iii)).
    10. 아래 설명된 대로 지정된 컴퓨팅 인터페이스에서 384-SPOT 플로팅을 시작합니다.
      1. 인터페이스에서 커널 다시 시작을 클릭하고 다시 실행 (도구 모음의 이중 화살표)을 클릭합니다. 이제 코드가 실행되기 시작하여 PMMA 패턴을 플로팅합니다. 패턴 플롯이 완료되고 펜 홀더가 홈 위치로 돌아올 때까지 추가 작업이 필요하지 않습니다.
      2. 플로팅 중에 플로터를 일시 중지하려면 플로터 왼쪽에 있는 작은 은색 버튼을 누릅니다. 프린트 헤드를 수동으로 앞뒤로 왼쪽으로 움직여 홈 위치에 도달하도록 합니다. 플로터를 전원에 다시 연결합니다. 96-SPOT 플로팅과 달리 384-SPOT이 일시 중지된 위치에서 플로팅을 재개할 수 있는 방법은 없습니다. 종이 비계를 교체하고 코드를 처음부터 시작합니다.
  3. 주사기 내리기 및 청소
    1. 플로팅이 완료되면 10mL 주사기를 튜브에 다시 부착합니다. 플로터 펜 홀더에서 3mL 주사기를 제거하고 남은 PMMA-아세톤 용액을 스톡 바이알로 다시 옮기거나 이전 단계에서 상당한 증발이 발생한 경우 폐기합니다.
    2. 아세톤에 피펫팅하여 3mL 주사기의 배럴을 세척합니다. 주사기 튜브 시스템을 보관 장소로 되돌리기 전에 자연 건조시키십시오.
    3. 클립 이젤에서 SPOT 비계를 조심스럽게 풉니다.
    4. 플롯된 SPOT 스캐폴드를 검사하여 실험에 사용할 수 있는지 확인합니다(그림 3E,F). 지침은 문제 해결 표 1과 품질 보증 및 제어 표 2 및 표 3을 참조하십시오.
    5. 모든 PMMA 패턴 비계는 서늘하고 건조한 곳에 지퍼백에 넣어 보관하십시오.

3. 96/384웰 테이프 절단

(타이밍: 96-SPOT 패터닝의 경우: 테이프 5개당 15분, 384-SPOT 패터닝의 경우: 테이프 5개당 30분)

참고: 이것은 특히 384웰 테이프 패턴의 경우 테이프를 정확하고 효율적으로 절단하는 가장 효율적인 방법 중 하나입니다. 이 방법은 또한 조립 과정에서 유용성을 향상시키기 위해 테이프(상단 덮개 플라스틱)의 한 층을 레이저로 조각할 수 있는 가능성을 제공합니다. 또는 조각 공정 없이 종이 절단기를 사용하여 더 느린 속도로 테이프를 절단할 수도 있습니다.

  1. 96/384웰 테이프 패턴 레이저 절단 파일(보충 파일 3, 보충 파일 4)을 열고 보충 그림 2A에서 다음 설정으로 플롯을 클릭하여 세 가지 다른 색상으로 코딩된 인쇄 패턴을 레이저 절단 소프트웨어에 로드합니다.
  2. 레이저 절단기 표면에 테이프 조각을 로드하고 테이프가 표면에서 매끄럽게 평평해지는지 확인합니다. 절단하는 동안 종이 테이프나 무거운 추를 사용하여 테이프를 잡으십시오.
    알림: 테이프가 레이저 절단기 표면에 평평한지 확인하십시오. 범프는 절단 테이프, 특히 384웰 테이프의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다.
  3. 레이저 절단기 설명서에 따라 테이프 위치에 맞게 인쇄 패턴의 위치를 조정합니다.
  4. 보충 그림 2B와 같이 동일한 레이저 절단기 설정을 사용하여 96/384웰 테이프를 모두 절단합니다. 특정 색상의 선 순서가 중요합니다. 녹색 선 앞에 빨간색 선을 먼저 자릅니다. 마지막에 파란색을 자릅니다.
    빨간색 선: 45% 레이저 출력, 80% 속도, 1000PPI 및 0.50mm Z축의 Rast/Vest 모드.
    녹색 선: 레이저 출력 7%, 속도 100%, PPI 1000, Z축 0.50mm의 Rast/Vest 모드.
    파란색 선: 레이저 출력 50%, 속도 80%, PPI 1000, Z축 0.50mm의 Rast/Vest 모드.
  5. 패턴 테이프는 SPOT 조립 전까지 올바르게 보관하십시오.

4. 96/384-SPOT 어셈블리(타이밍: 1시간)

알림: 이 섹션에서는 생물 안전 캐비닛(BSC)과 같은 멸균 환경에서 96-/384-SPOT 장치를 조립하는 절차를 자세히 설명합니다. 또는 96-/384-SPOT 장치를 비멸균 환경에서 사전 조립한 다음 에틸렌 가스 멸균 공정을 통해 멸균할 수 있습니다.

  1. 조립을 위한 SPOT 비계 준비
    1. 96 또는 384 SPOT에 대한 PMMA 패턴 스캐폴드를 사용하십시오. 비계의 파란색 영역 주위에 여분의 종이를 자릅니다. 파란색 영역의 둘레에 5mm의 여백을 남겨 둡니다. 결과 시트는 약 760mm x 1300mm입니다.
      알림: 프라이밍 라인을 자르지 마십시오. 비계의 어느 쪽이 거칠거나 매끄러운지 결정하는 데 유용합니다(그림 3E,F).
    2. 조립을 위해 96-SPOT 스캐폴드를 준비하려면 4.1.3단계를 따르십시오. 384-SPOT 스캐폴드를 준비하려면 4.1.4단계를 따르십시오.
    3. 96-SPOT 비계에서 웰 간 공간의 천공을 수행합니다.
      1. 단단한 아크릴 지지대(1000mm x 1500mm) 위에 폴리에틸렌 필름(2700mm x 2700mm) 조각을 놓습니다. 폴리에틸렌 필름으로 덮인 지지대를 작업 표면에 놓고 폴리에틸렌 필름 위에 비계를 놓습니다(그림 5A).
      2. 처음 두 행 사이에 눈금자의 가장자리를 정렬하여 이 가장자리를 따라 추적하는 것이 우물로 추적되지 않도록 합니다.
      3. 비계 바닥의 눈금자에 추적 휠을 놓습니다. 눈금자를 사용하여 블레이드의 경로를 안내하면서 추적 휠을 비계 상단까지 위쪽으로 굴립니다. 스캐폴드의 모든 행 간 공간(즉, 7x)에 대해 이 작업을 반복합니다.
      4. 처음 두 열 사이의 공간부터 시작하여 다른 모든 열 간 공간에 대해 4.1.3.2 및 4.1.3.3단계를 반복합니다.
    4. 아래 단계에 따라 384-SPOT 비계에서 웰 간 공간의 천공을 수행하지 마십시오.
      1. 384-SPOT 비계의 웰 간 공간에 구멍을 뚫지 마십시오. 4.2단계로 바로 진행합니다.
  2. SPOT 재료 및 조립 장비 살균
    1. 인쇄된 스캐폴드, 96웰 테이프 2개(또는 384웰 테이프), 96웰 바닥 없는 플레이트(또는 384웰 바닥 없는 플레이트), 96웰 플레이트 커버(또는 384웰 플레이트 커버), 폴리카보네이트 필름, 폴리디메틸실록산(PDMS) 슬래브, 재밀봉 가능한 비닐 봉지, 핀셋 및 정밀 칼을 BSC에 넣고 한쪽 면에 20분 동안 UV합니다(그림 5B).
    2. 모든 재료와 조립 장비를 반대쪽으로 반집하고 UV를 20분 더 가합니다.
  3. 첫 번째 96/384웰 테이프에 스캐폴드 부착
    1. 열이 수평으로 흐르도록 비계를 거친 면이 위로 향하도록 PDMS 슬래브에 놓습니다(그림 3F). 프라이밍 라인을 사용하여 어느 쪽이 거칠지 확인합니다(오른쪽 정렬 프라이밍 라인은 거친 면이 위로 향함을 나타냅니다).
    2. 비계 위(또는 아래)에 주름이나 기포가 없도록 PDMS 슬래브에 비계를 매끄럽게 만듭니다. 양면 테이프의 새겨지지 않은 면에서 보호층을 제거합니다. 테이프 중간에 약간 버클을 채우고 테이프의 가운데 두 열을 비계에 맞춥니다.
    3. 정렬되면 테이프 중앙을 아래로 누릅니다. 테이프를 비계에 매끄럽게 붙여 가운데에서 시작하여 바깥쪽으로 이동합니다.
      참고: 잘못 정렬된 스캐폴드는 우물 파종 영역에 겹치는 명백한 PMMA 패턴을 갖게 됩니다.
    4. 핀셋을 사용하여 PDMS 슬래브에서 비계를 조심스럽게 제거하고 향후 제작을 위해 슬래브를 보관합니다.
  4. 두 번째 96/384웰 테이프에 비계 부착
    1. 비계를 작업대 위에 놓습니다. 매끄러운 면(테이프가 붙지 않은 면)이 위를 향하도록 비계를 뒤집습니다.
    2. 두 번째 테이프의 새겨진 면에서 중간 보호층을 제거합니다. 테이프의 가운데 두 열이 노출되어 있는지 확인합니다. 새겨지지 않은 테이프 디자인을 사용하는 경우 한쪽에서 보호층을 완전히 제거하십시오.
    3. 테이프 중간에 약간 버클을 채우고 테이프의 가운데 두 열을 비계에 맞춥니다.
    4. 테이프가 비계에 정렬되면 테이프 중앙을 아래로 누릅니다. 새겨진 테이프 디자인을 사용하는 경우 테이프의 노출된 중간 부분에 인접한 다른 두 개의 보호 층을 제거합니다. 테이프를 비계에 매끄럽게 붙여 중간에서 시작하여 바깥쪽으로 이동합니다.
  5. 바닥이 없는 판에 비계 부착
    1. 비계의 거친 면에서 테이프의 보호층을 제거합니다. 새겨진 테이프 디자인을 사용하는 경우 중간 보호층만 제거하십시오.
    2. 비계를 바닥이 없는 판(뚜껑 포함)의 아래쪽에 맞춥니다. 정렬되면 비계 중앙을 플레이트 아래쪽에 누릅니다. 새겨진 디자인을 사용하는 경우 노출된 중간에 인접한 보호층을 제거하십시오. 비계를 가운데에서 바깥쪽으로 접시에 매끄럽게 만듭니다.
  6. 폴리카보네이트 필름에 비계 부착
    1. 핀셋을 사용하여 폴리카보네이트 필름의 보호층을 조심스럽게 풉니다. 느슨해지면 필름에서 보호층을 천천히 벗겨냅니다. 필름에 움푹 들어간 곳은 현미경 이미징을 위한 광학적 특성에 영향을 미치므로 만들지 마십시오.
    2. 폴리카보네이트 필름의 반대쪽에도 4.6.1단계를 반복합니다. 두 보호 층이 모두 제거되면 필름을 작업대에 따로 보관하십시오.
    3. 플레이트 바닥에 부착된 테이프에서 보호층을 제거합니다. 폴리카보네이트 필름을 가운데부터 바깥쪽으로 비계에 누릅니다.
    4. 폴리카보네이트 필름을 플레이트 바닥에 단단히 눌러 모든 우물이 잘 뚜렷한 테두리를 얻도록 합니다.
    5. 정밀 칼을 사용하여 접시 바닥에서 여분의 재료를 조심스럽게 잘라냅니다.
      알림: 접시나 우물을 자르지 않도록 각별히 주의하십시오. 칼이 쉽게 자르지 않으면 접시를 자르고 있는지 확인하십시오.
  7. 조립 후 96/384-SPOT 보관
    1. 96-SPOT을 완전히 조립한 후 재밀봉 가능한 투명한 비닐 봉지에 넣습니다. 가방을 BSC 외부로 가져오십시오.
    2. 접시 밑면에 단단한 아크릴 지지대를 놓습니다. 아크릴 지지대를 반대쪽 모서리의 플레이트에 고정합니다(그림 5C). cl을 유지하십시오.amp사용하기 전에 각 모서리에 최소 30분 동안 있습니다.
    3. 접시를 사용할 때까지 깨끗하고 건조한 공간에 보관하십시오.

5. 96/384-SPOT 시딩 (타이밍: 2시간 45분)

참고: 이 섹션에서는 균일한 3D 미세 조직을 생성하기 위해 96-/384-SPOT 장치를 시드하는 절차를 자세히 설명합니다. 시딩 공정에는 사전 조립된 SPOT 스캐폴드에 정의된 세포-겔 부피(예: 96-SPOT의 경우 5μL 또는 384-SPOT의 경우 2μL)를 조심스럽게 분배하는 과정이 포함됩니다. 균일한 침윤 및 겔 분포를 보장하기 위해 세포-겔 방울은 모세관 위킹을 통해 스캐폴드의 다공성 구조를 따라 안내됩니다. 이 단계는 마이크로피펫을 사용하여 수동으로 수행하거나 액체 처리로 자동화할 수 있습니다. 시딩 후, 플레이트는 겔 중합 및 세포 캡슐화를 가능하게 하기 위해 37°C에서 배양됩니다.

  1. 96/384-SPOT 플레이트 준비
    1. 클램프 풀amp 96-/384-SPOT을 바닥에서 아크릴 지지대를 제거합니다.
    2. BSC에서 비닐 봉지에서 SPOT을 제거합니다. UV를 켜서 플레이트 내부를 살균하고 뚜껑을 덮은 후 뚜껑을 닫고 플레이트 바닥으로 20분 더 UV 처리를 합니다.
    3. 70μL의 PBS를 96-SPOT 플레이트의 각 웰 간 공간에 피펫팅합니다. PBS를 384-SPOT 플레이트에 피펫팅하지 마십시오. 파종하기 전에 플레이트를 4°C에서 최소 30분 동안 식힙니다.
  2. 세포 준비
    1. 권장 취급에 따라 겔 돔에서 배양 플라스크 또는 오가노이드에서 세포를 분리하고 제조업체의 지침에 따라 혈구계를 사용하여 세포 양을 계산합니다. 세포 현탁액의 세포 밀도(즉, mL당 세포 수)를 기록하여 원하는 파종 밀도를 기반으로 5.4.1-5.4.2단계에 필요한 세포 현탁액 부피를 계산합니다.
  3. 젤 준비
    1. 이전에 최적화된 하이드로겔 준비 지침 17,19,20,21에 따라 1mL의 3mg/mL 유형 1 소 콜라겐을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 분배하여 하이드로겔을 만듭니다.
      알림: 성분과 결과 혼합물은 준비 기간 동안 얼음 위에 보관해야 합니다.
    2. 10배 농축 최소 필수 배지(MEM) 125μL를 소 콜라겐에 분배합니다. 혼합물이 분홍색에서 노란색으로 변할 때까지 천천히 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다.
    3. 8μL의 0.8M 중탄산나트륨을 소 콜라겐 혼합물에 분배합니다. 혼합물이 옅은 분홍색이 될 때까지 천천히 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 여러 실험에서 일관된 겔화를 보장하기 위해 준비 후 30분 이내에 혼합 용액을 사용하십시오.
      참고: 혼합물이 노란색으로 남아 있으면 옅은 분홍색이 될 때까지 0.5μL 분취량에 0.8M를 첨가하여 용액을 pH 7로 적정합니다. 선택 사항: 동일한 절차에 따라 더 높은 콜라겐 농도가 필요한 배양을 위해 젤을 준비할 수 있습니다. 오가노이드 배양을 위해 Landon-Brace et al.17에 의해 특징지어지는 하이드로겔 혼합물을 사용하십시오.
  4. 겔에 세포의 현탁액
    1. 표적 세포-겔 밀도에 필요한 세포 현탁액의 부피를 미세 원심분리기 튜브에 분주하고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    2. 상청액을 흡인하고 세포 펠릿을 겔에 재현탁합니다(부피는 목표 농도에 따라 다름).
  5. 96-/384-SPOT 플레이트 수동 시딩
    1. 96-/384-SPOT 플레이트를 얼린 얼음 팩에 놓습니다. 96-SPOT을 시드하려면 5.5.2단계를 따르십시오. 384-SPOT을 시드하려면 5.5.3단계를 따르십시오.
    2. 96-SPOT 수동 시드
      1. 10μL 피펫 팁에 세포-겔 혼합물을 미리 코팅합니다. 20μL 피펫을 사용하여 5μL의 겔을 흡인하고 팁에 물방울이 형성될 때까지 첫 번째 정지까지 배출합니다. 우물 중앙에 물방울을 만지십시오.
        알림: 피펫을 두 번째 정지 지점까지 눌러 젤을 배출하면 기포가 발생할 수 있습니다. 모든 웰은 웰 사이의 일관된 겔화를 위해 5분 이내에 파종되어야 합니다.
      2. 원하는 모든 웰을 시드한 후, 플레이트를 덮고 겔을 중합하기 위한 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 45분 동안 배양합니다. 200μL의 배지를 각 시드 웰에 분배하고 필요한 이미징 또는 섭동 전에 최소 1시간 동안 중단 없이 배양합니다.
    3. 384-SPOT 수동 시드
      1. 10μL 피펫 팁에 세포-겔 혼합물을 미리 코팅합니다. 10μL 피펫을 사용하여 2μL의 겔을 흡인하고 팁에 물방울이 형성될 때까지 첫 번째 정지까지 배출합니다.
        참고: 다중 채널 10μL 피펫을 강력히 권장합니다.
      2. 우물 중앙에 물방울을 만지십시오. 원하는 모든 웰을 시드한 후, 플레이트를 덮고 겔을 중합하기 위한 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
      3. 60μL의 배지를 각 시드 웰에 분배하고 필요한 이미징 또는 섭동 전에 중단 없이 최소 1시간 동안 배양합니다.
    4. 액체 처리기를 사용한 96/384-SPOT 파종
      1. 세포-겔 혼합물을 준비하는 동안 액체 처리기와 HEPA 필터 모듈을 높게 켭니다. 액체 처리기 내부에 70% 에탄올을 조심스럽게 뿌리고 에탄올에 적신 종이 타월로 닦아냅니다.
      2. 피펫 헤드 보정을 수행하기 전에 96-SPOT 또는 384-SPOT 시딩 프로토콜(보충 파일 5 또는 보충 파일 6)을 로드합니다. 슬롯 1 및 4에 온도 모듈을 설치합니다(그림 6A).
      3. 교정을 위해 P20 및 P200 필터 팁의 지정된 상자를 사용하십시오. 각각 슬롯 5와 6에 로드합니다(그림 6B). 소프트웨어에 표시된 프롬프트에 따라 피펫 헤드를 보정합니다. 교정 후 슬롯 20 및 200에 시딩하기 위해 멸균 P5 및 P6 필터 팁 상자로 전환합니다. 70% 에탄올로 표면을 다시 분사하고 파종할 때까지 문을 닫습니다.
        알림: 96-/384-SPOT 플레이트 상단의 팁을 정확하게 보정하는 것이 중요합니다. 플레이트 상단을 기준으로 팁 z축을 시각화하는 데 도움이 되도록 플레이트 밀봉 테이프를 사용하는 것이 좋습니다. 이상적인 위치는 다중 채널 헤드의 팁이 모두 플레이트 밀봉 테이프에 닿아 작은 움푹 들어간 곳을 만들 때입니다.
    5. 두 온도 모듈을 모두 켜고 세포-겔 혼합물 준비 중 세포가 마지막 회전 단계에 있는 동안 4°C로 설정합니다. 5.4단계가 완료된 후, BSC 내부의 8-스트립 0.2mL PCR 튜브의 각 튜브에 원하는 양의 세포-겔 혼합물을 로드합니다.
      참고: 각 튜브에 로드할 세포-겔 혼합물의 최소 부피는 다음과 같습니다: 96-SPOT: 5 μL에 시딩해야 하는 컬럼 수에 데드 부피를 더한 값을 곱한 값; 384-SPOT: 2 곱하기 2 μL에 시드해야 하는 컬럼 수를 곱한 다음 데드 부피를 더한 값. 데드 볼륨은 끝으로 갈수록 기포와 불완전한 컬럼을 방지하기 위해 튜브당 약 10 - 20μL로 권장됩니다.
    6. 세포-겔 혼합물을 얼음 위의 BSC 밖으로 옮기기 전에 8-스트립 플랫 캡을 사용하여 8-스트립 0.2mL PCR 튜브를 닫습니다.
    7. 사전 냉각된 SPOT 플레이트를 평평한 바닥 플레이트 형식 블록이 있는 슬롯 4의 온도 모듈에 로드합니다(그림 6B).
    8. 세포-겔 혼합물이 포함된 8-스트립 0.2mL PCR 튜브를 96웰 포맷 블록이 있는 슬롯 3의 온도 모듈에 로드합니다.
    9. 플랫 캡과 SPOT 플레이트 뚜껑을 열고 액체 처리기 내부에 보관하되 사용한 슬롯에서 멀리 떨어진 곳에 보관하십시오. P20 및 P200 필터 팁 상자의 뚜껑을 엽니다.
    10. 프로토콜을 실행합니다. 원하는 모든 웰을 시드한 후, 플레이트를 덮고 겔을 중합하기 위한 제조업체의 지침에 따라 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
    11. 200 μL 또는 60 μL(96-/384-SPOT)의 배지를 각 시드 웰에 분배하고 필요한 이미징 또는 섭동 전에 중단 없이 최소 1시간 동안 배양합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

종이 비계의 PMMA 패턴화는 웰 간 내용물 교환을 방지하는 물리적 장벽 역할을 합니다. 이 설계는 인접한 웰이 화학적, 생물학적으로 분리된 상태로 유지되도록 하여 배지, 약물, 분비 인자 또는 세포의 의도하지 않은 확산을 방지하는 데 중요합니다14. PMMA의 통합은 정확한 구획화를 가능하게 하여 SPOT을 교차 오염을 최소화해야 하는 고처리량 스크리닝 및 공동 배양 연구를 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼으로 만듭니다14,18. 권장되는 품질 보증 및 품질 관리 실험은 표 3 및 표 4에 설명되어 있습니다. 세포-겔 혼합물 파종 관행 및 장기 오가노이드 배양을 진행하기 전에 수행해야 하는 가장 중요한 품질 보증 실험 중 하나는 조립된 플레이트의 구조적 무결성과 PMMA 장벽의 효능을 보장하기 위한 누출 테스트입니다. 성공적으...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에서는 조립, 수동 및 액체 핸들러 보조 세포-겔 시딩을 다루는 96웰 및 384웰 SPOT의 제작 및 사용에 대한 자세한 가이드가 제공됩니다. 기존의 하이드로겔 플러그 시스템과 달리 SPOT은 메니스커스 관련 인공물을 제거하여 이전에 설명한 바와 같이 오가노이드의 비파괴 현장 이미징을 용이하게 합니다 14,16,22. 또한 스캐폴드는 구조적 지지를 제공하여 장기적인 배양 안정성을 보장합니다. SPOT을 통해 연구자들은 종단 이미징을 통해 인구 역학을 추적하고 종양 오가노이드 및 기타 3D 세포 배양에서 대사 분석을 수행할 수 있으므로 종점 전용 평가에 비해 상당한 이점을 제공합니다14,18

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이미지 획득에 있어 Jennifer Lam의 도움을 인정합니다. 그림 1, 그림 2 및 그림 7A는 BioRender.com 로 작성되었습니다. 이 작업은 캐나다 자연과학 및 공학 연구 위원회(NSERC) APM에 대한 발견 보조금(보조금 #RGPIN-2021-03488)의 지원을 받았습니다. 캐나다 최초 연구 우수성(CFREF) Medicine by Design Grand Questions 프로그램 APM; NSERC 캐나다 대학원 장학금 - RC에 대한 박사 과정; R.C.에 대한 Peterborough KM Hunter Charitable Foundation Award; NTL에 수여된 NRC(National Research Council) CRAFT Fellowship; NSERC CREATE TOeP에서 NTL로; ZK에 대한 NSERC 학부생 연구상; 그리고 토론토 대학교 우수상을 CMT에 수여했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2mL PCR 튜브(8개 스트립) 사르슈테트72.985.002
1.5mL 원심분리기 튜브프로가바이오LMCT1.7B
1000-&무; L 피펫 팁식4-1019-260-000
10mL 혈청학적 피펫프로가바이오394010
10mL 주사기BD, 캐나다302995
10x 최소 필수 배지(MEM 10x)깁코11430030
150mm 접시코 닝430599
루어 잠금 연결 기능이 있는 16게이지 디스펜싱 팁McMaster-Carr, 일리노이, 미국6699A2
20&마이크로; L 필터 팁 랙오픈트론999-00099
200&마이크로; L 필터 팁 랙오픈트론999-00081
200-&무; L 피펫 팁식4-1030-260-000
루어 잠금 연결 기능이 있는 20게이지 디스펜싱 팁McMaster-Carr, 일리노이, 미국6699A4
384-웰 노-바텀 웰 플레이트(검은색)그라이너82051-544
3mL 주사기 BD, 캐나다309657
50mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브VWRCA21008-940
50mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브VWRCA21008-940
96웰 노-바텀 웰 플레이트(검은색)그라이너82050-714
아세톤피셔 사이언티픽답18-1
분석 저울해당 사항 없음해당 사항 없음
Inkscape용 AxiDraw 확장 (https://wiki.evilmadscientist.com/Axidraw_Software_Installation)해당 사항 없음해당 사항 없음
AxiDraw Python API(https://axidraw.com/doc/py_api/#installation) 해당 사항 없음해당 사항 없음
AxiDraw V3 고성능 개인용 필기 및 드로잉 머신Evil Mad Scientists, 미국해당 사항 없음
소 콜라겐 (PureCol 3 mg/ml)고급 바이오매트릭스5005
선택한 세포주해당 사항 없음해당 사항 없음
클립 이젤(AxiDraw V3 패키지에 포함)Evil Mad Scientists, 미국해당 사항 없음
선택한 배양 배지해당 사항 없음해당 사항 없음
먼지 트래핑 보호 테이프3분6851 PN36851
양면 폴리아크릴 접착 테이프(800mm x 1200mm)접착제 연구, ARcare90106NB
소 태아 혈청(FBS)깁코12483-020
Finum 차 필터 XL 리엔쉬 & Held GmbH & Co. KG, 함부르크, 독일420.69.00
0.2mL PCR 튜브용 플랫 캡(8개 스트립)사르슈테트65.989.002
헤비 듀티 플라스틱 스프링 클램프벤치 마크1024-554
HEPA 모듈 – 110-130V 60Hz 모델오픈트론999-00109
아이스 팩 (냉동, 1400mm× 1800mm)해당 사항 없음해당 사항 없음
Inkscape 소프트웨어해당 사항 없음해당 사항 없음
레이저 커터범용 레이저 시스템VLS3.75
외경 0.07인치의 미니어처 에틸 비닐 아세테이트(EVA) 튜브McMaster-Carr, 일리노이, 미국1883T3
다중 채널 전자 피펫 P20 (Gen2)오픈트론999-00005
다중 채널 전자 피펫 P300 (Gen2)오픈트론999-00006
매니큐어샐리 한센SBS-006861옵션, PMMA 잉크의 색소 침착용
오픈트론 OT-2오픈트론999-00111
P1000 피펫길슨FA10006M
P200 8채널 피펫길슨F144072
P200 피펫길슨FA10005M
종이 타월해당 사항 없음해당 사항 없음
파라필름베미스 컴퍼니, Inc.52859-079
양피지   해당 사항 없음해당 사항 없음
파스퇴르 피펫VWR14672-380
페니실린-스트렙토마이신(P/S)시그마-알드리치P4333
폴리(메틸메타크릴레이트)(PMMA)시그마-알드리치182230
폴리카보네이트 필름(760mm x 1300mm)맥마스터-카85585K102
폴리디메틸실록산 단량체 및 가교제(PDMS, 1500mm x 2700mm)엘스워스 접착제4019862
정밀 칼해당 사항 없음해당 사항 없음
견고한 아크릴 지지대(웰 플레이트 바닥에 맞는 크기)맥마스터-카8560K239
견고한 판지 지지대해당 사항 없음해당 사항 없음
통치자해당 사항 없음해당 사항 없음
가위 해당 사항 없음해당 사항 없음
중탄산나트륨(증류수에 0.8M)시그마-알드리치에스6014
알루미늄 블록이 있는 온도 데크(Gen2)오픈트론999-00097
추적 휠 HEEPDD(아마존)B07YQWB284
투명 테이프 해당 사항 없음해당 사항 없음
트리판 블루깁코15250-061
트립신깁코25200-056
핀셋해당 사항 없음해당 사항 없음
와류 믹서 해당 사항 없음해당 사항 없음

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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