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방법 논문

대동맥 질환의 혈관 복구를 위한 정밀 초음파 유도 줄기세포 전달

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/68433

⸱

2025년 6월 20일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 2Laboratory for Clinical Medicine, Capital Medical University, 3Core Facilities Centre, Capital Medical University, 4Department of Radiology, The Second Medical Center & National Clinical Research Center for Geriatric Diseases, Chinese PLA General Hospital, 5Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 6School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, 7College of Basic Medicine, Inner Mongolia Medical University, 8State Key Laboratory of Neurology and Oncology Drug Development, 9Chinese Institute for Brain Research

이 논문에서

요약

이 논문은 혈관 줄기세포를 대동맥 혈관 벽으로 정밀하게 초음파 유도하여 전달하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 혈관 벽을 효과적으로 표적으로 삼고 대동맥류 및 박리에서 혈관 복구를 촉진합니다.

초록

대동맥류 및 박리 파열은 생명을 위협하는 심혈관 응급 상황입니다. 질병 진행을 조기에 예방하고 통제하는 것은 환자 결과를 개선하는 데 필수적입니다. 혈관 줄기 세포는 다양한 혈관 질환에서 혈관 손상을 복구하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 혈관 내 줄기 세포 주사 요법은 혈관 벽 내에서 외인성 줄기 세포의 효율적인 생착을 보장하는 데 어려움이 있습니다.

대동맥 질환에서 줄기세포를 전달하기 위한 보다 효과적이고 최소 침습적 접근법을 모색하기 위해 당사는 초음파 유도 정밀 표적 줄기세포 전달 기술을 개발했습니다. 특히, 이 기술은 초고해상도 소형 동물 컬러 도플러 초음파 이미징 시스템을 활용하여 대동맥 질환 마우스 모델에서 상행 대동맥의 혈관 벽을 정확하게 찾았습니다. 그 후, 25 μL의 Matrigel 내에 혼합된 1 × 106 mCherry 표지된 혈관 줄기세포를 29 G 바늘을 사용하여 주입하였다. 질병의 진행은 소동물 초음파로 모니터링되었습니다. 마지막으로, 주입된 혈관 줄기 세포를 추적하기 위해 광시트 현미경을 사용한 3D 이미징을 사용하여 대동맥을 채취하고 분석했습니다.

위와 같은 결과는 주입된 혈관 줄기세포가 최소한의 침습성으로 상행 대동맥의 혈관 벽으로 정확하게 전달되어 대동맥류 및 박리에서 혈관 복구를 효과적으로 촉진했음을 보여줍니다. 이 초음파 유도 줄기세포 전달 기술은 줄기세포 이식을 위한 유망한 최소 침습적 방법을 제공하며, 향후 클리닉에서 대동맥류 및 박리 및 기타 관련 심혈관 질환의 진행을 잠재적으로 제어할 수 있습니다.

서론

대동맥류 및 박리병(AAD)은 흔하고 치명적인 심혈관 질환으로, 일반적으로 잠복성 발병과 빠른 진행이 특징입니다. AAD의 발병률은 1.3%에서 8% 사이이며, 매년 전 세계적으로 150,000명에서 200,000명이 사망하는 것으로 추정됩니다 1,2. 급성 발병과 미묘한 임상 증상으로 인해 많은 환자들이 진단 시점까지 위독한 상태에 빠져 최적의 치료 기간을 놓치고 있습니다. β-아드레날린성 차단제 및 안지오텐신 수용체 차단제와 같은 약물 치료는 동맥류 확장을 어느 정도 늦출 수 있지만, 이러한 치료법은 주로 증상을 완화하며 AAD의 발병이나 진행을 효과적으로 예방하는 것으로 나타나지 않았습니다3.

현재 임상관리는 주로 대동맥근 재건술, 상행 대동맥 치환술, 벤탈 수술, 대동맥류의 혈관내 복원술을 포함한 외과적 중재에 의존하고 있다 4,5. 그러나 유전적 AAD를 가진 환자, 특히 아직 수술 적응증에 도달하지 않은 환자의 경우 효과적인 병인학적 치료가 부족하고 약리학적 접근이 장기적인 질병 진행을 통제하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 마르판 증후군(Marfan syndrome, MFS) 환자의 경우, 의학적 치료가 대동맥 확장을 지연시킬 수 있지만, 연구에 따르면 일부 환자는 대동맥 확장 속도가 빨라지고 대동맥 박리의 위험이 더 높다고 한다5. 따라서 아직 수술 기준을 충족하지 못하는 이러한 환자에게 효과적인 중재를 제공하는 것은 중요한 임상적 과제로 남아 있습니다. 보다 표적화된 치료 전략을 개발하는 것은 대동맥 질환 치료에서 해결해야 할 핵심 문제가 되었습니다.

AAD의 발병기전은 주로 평활근 세포(SMC)의 광범위한 세포사멸과 매체의 얇아짐을 수반하여 대동맥 벽의 구조적 취약성을 유발합니다. 구체적으로, 대동맥 SMC의 점진적인 소실은 AAD의 특징이며, SMC의 세포사멸, 세포외 기질(ECM) 분해, 면역 세포 침투 및 산화 스트레스 증가로 나타납니다2. 혈관 줄기 세포는 혈관 벽에 상주하는 성체 줄기 세포의 일종으로, SMC 또는 내피 세포로 분화할 수 있습니다. 정상적인 생리학적 조건에서는 줄기세포가 정지 상태를 유지하지만, 병리학적 조건에서는 활성화되고 자가 재생과 분화를 거쳐 조직 복구에 기여합니다6. 최근 연구에서는 혈관 손상, 특히 정맥 이식편의 리모델링, 죽상 경화증, 재협착, 고혈압 및 AAD 7,8,9,10,11,12,13 과 같은 질병 또는 병리학적 상태에서 혈관 벽 줄기 세포의 중요한 역할을 강조했습니다.

조직 특이적 국소 주사 및 전신 정맥 주입과 같은 줄기세포 전달을 위한 기존 기술은 상대적으로 발전되어 있지만, 줄기세포를 대동맥 벽으로 전달하는 것은 상당한 도전 과제를 제시합니다14,15. 대동맥의 빠른 혈류와 혈관벽의 역동적인 수축 및 이완은 효율적인 세포 전달을 달성하고 혈관 조직에 이식된 세포의 장기 생존을 보장하는 것을 어렵게 만듭니다.

이 연구에서는 초음파 유도 하에 혈관 벽 줄기세포를 최소한으로 침습적이고 정밀하게 표적 전달할 수 있는 새로운 폐쇄 혈관 벽 에피막 주입 기술에 대해 설명합니다. 이 접근법은 개흉술이나 개복술이 필요 없이 쉽게 수행할 수 있고 관련 합병증을 피할 수 있다는 장점이 있습니다. 또한 주입 과정에서 더 큰 유연성을 허용하여 면역 반응 및 기타 부작용을 최소화하면서 원하는 부위에 줄기 세포를 목표적으로 농축할 수 있습니다. 또한, 조직 광학 투명화 기술의 발전으로 이제 생쥐 전신의 세포 내 해상도 이미징이 가능해짐에 따라 조직 구조의 고해상도 3차원 재구성, 병리학적 메커니즘 조사, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 광범위하게 응용할 수 있게 되었습니다. 광시트 현미경과 결합하면 이 기술은 높은 공간 해상도16의 3D 이미징을 제공합니다. 이 접근법을 사용하면 주입된 혈관 줄기세포를 추적하고 이동 능력을 관찰할 수 있습니다. 따라서 초음파 유도 줄기세포 전달은 줄기세포 이식을 위한 유망한 최소 침습적 방법입니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 Capital Medical University의 동물 연구 위원회의 규정에 따라 수행되며 Capital Medical University의 동물 복지 및 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 주입된 혈관 줄기세포의 제조

참고: 주입 후 상태와 혈관 줄기세포의 효과를 확인하기 위해 앞서 설명한 대로 면역자기 비드 선택을 사용하여 Sca1+ 세포를 분리하고(17,18,19), mCherry 리포터를 운반하는 렌티바이러스로 transfection한 후 세포 위치 및 분포를 관찰한 다음 배양합니다. 양호한 성장 조건과 mCherry-labeled Sca1+ 발현을 가진 5 또는 그 이전 지문의 세포를 후속 실험에 사용합니다20.

  1. 6-8주 된 C57BL/6J 마우스에서 대동맥을 채취하고 현미경으로 외래 조직을 분리한 다음 약 0.5mm로 다집니다. 5% CO2 인큐베이터에서 37°C의 배양 플라스크 바닥에 0.04% 젤라틴을 바르면 세포 부착 및 증식을 촉진합니다. 20분 후 젤라틴을 흡인하고 다진 조직을 배양 플라스크17,21의 바닥에 놓고 바닥이 위를 향하도록 2-3시간 동안 놓습니다. 조직이 배양 플라스크 바닥에 단단히 부착 된 후 배양 플라스크의 바닥을 아래쪽으로 놓고 플라스크에 배양 배지를 첨가 한 다음 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양합니다.
  2. 3시간 후 배양 플라스크를 제거하고 20% 소 태아 혈청, 10ng/mL LIF, 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM 배지를 첨가합니다.
  3. 3일 후, 세포가 조직에서 이동하여 80%-90% 합류점에 도달하면 0.05% 트립신을 첨가하고 1:3 비율로 하대배양합니다.
  4. 통로 3의 경우, 배지를 15% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM으로 교체하십시오. 5번 통과시의 경우, 배지를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM으로 교체합니다(다른 성분은 변경되지 않음).
  5. 외래 혈관 세포를 소화하고 항-Sca1+ 마이크로비즈로 얼음 위에서 배양합니다. 자기 세포 분류 시스템이 장착된 컬럼에 세포 현탁액을 추가하고 수집합니다18. 후속 실험을 위해 5 또는 이전 계대에서 양호한 성장 조건을 가진 세포를 사용하십시오.
    참고: 세포의 활력을 보장하기 위해 생체 내 주입을 위한 세포는 Trypan blue 염색에 의해 결정된 바와 같이 ≥90%의 생존율을 갖는 것이 좋습니다.
  6. 주입 1시간 전에 세포에 0.05% 트립신을 첨가하고 혈구계를 사용하여 계수한 후 200× g 의 실온에서 5분간 원심분리하여 상층액을 제거합니다.
  7. 줄기세포 이식을 위한 담체로서 4 × 107 cells/mL의 농도로 Matrigel(4°C에서 사전 해동)의 세포를 재현탁하여 in vivo 성장 환경을 모방합니다. 혼합물을 부드럽게 와류로 만들고 주입할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.

2. 마우스의 수술 전 준비

  1. 물을 제한하지 않고 주사 12시간 전에 쥐를 금식시키십시오.
  2. 마취 유도 챔버와 초음파 플랫폼을 75% 에탄올로 철저히 닦습니다.
  3. 안연고를 바르고 산소 흐름을 1L/min으로 설정하고 이소플루란 농도를 2-3%로 조정한 상태에서 마우스를 마취 유도실에 넣습니다. 통증 반사가 사라져 성공적인 마취를 나타낼 때까지 기다렸다가 챔버에서 마우스를 조심스럽게 제거하십시오.
  4. 마우스의 코와 입을 마취 마스크 아래에 놓고 이소플루란 농도를 1.5-2%로 조정합니다. 복부 노출을 최대화하기 위해 37°C 플랫폼에서 마우스를 등쪽으로 배치합니다.
  5. 플랫폼의 4개 전극에 전도성 젤을 바르고 의료용 테이프를 사용하여 마우스의 4개의 발을 전극에 고정하여 생리학적 상태를 모니터링합니다.
    알림: 작업자는 멸균 장갑, 마스크, 수술 모자 및 멸균 수술 가운을 착용합니다.
  6. 멸균 면봉을 사용하여 주사 부위에 제모 크림을 바르고 1분 동안 그대로 두었다가 새 면봉으로 부드럽게 닦아냅니다. 요오드 팅크 3x를 사용하여 주사 부위를 소독합니다.
  7. 수술 부위를 드레이프하고, 멸균 주사기를 무균 상태로 준비하고, 멸균 영역을 유지합니다.

3. 혈관 벽 세포의 초음파 유도 주입

알림: 모든 초음파 절차는 초음파 이미징 시스템 및 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다( 재료표 참조). 중심 주파수 가 40MHz 이고 29G 바늘 이 사용되는 프로브를 사용하십시오.

  1. 초음파 플랫폼을 바닥에 대해 약 30° 각도로 조정합니다. 작업자가 동물의 머리를 왼쪽으로 향하게 하여 동물의 오른쪽을 향하게 합니다. 탈모 및 소독된 부위에 초음파 젤을 바르십시오.
  2. 흉골의 오른쪽에 프로브를 배치하여 대동맥궁의 장축을 표시합니다.
  3. Matrigel의 1 × 106 혈관 벽 줄기 세포의 현탁액 25 μL를 29 G 바늘에 로드합니다. 줄기세포의 이소성 이식을 최소화하기 위해 주입하기 전에 멸균 알코올로 바늘 끝을 닦습니다.
  4. 세포 현탁액이 들어 있는 주사기를 초음파 유도 주사 장치에 고정하고 바늘 방향이 프로브와 정렬되고 흉벽을 기준으로 45° 각도가 되도록 합니다.
  5. 주사 바늘을 초음파 시야로 천천히 안내하고 초점면에 맞게 조정한 다음 주사 경로의 표시 선에 맞춥니다.
  6. 바늘이 피부 가장자리에 접근하면 뭉툭한 집게를 사용하여 피부와 복벽을 잡고 흉벽을 통해 바늘을 빠르게 전진시킵니다.
  7. 초음파 안내에 따라 바늘을 무소음 동맥과 대동맥궁 사이의 외막 부위로 향하게 합니다. 주사기를 위아래로 부드럽게 제거하여 바늘 위치를 확인합니다.
  8. 주사기를 눌러 세포 현탁액을 목표 부위에 주입합니다.
  9. 주삿바늘을 천천히 빼내고 표준 절차에 따라 천자 부위를 소독합니다.
    참고: 수술 후 마우스는 완전히 의식이 있고 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 때까지 37°C 가열 패드에 놓아야 하며 가열 패드에 있는 동안 지속적으로 모니터링해야 합니다. 그런 다음 동물을 신선한 침구가 있는 깨끗한 우리로 옮깁니다. 구부정한 자세 및 활동 감소를 포함한 잠재적인 수술 후 합병증을 평가하기 위해 24시간 동안 매시간 지속적인 모니터링을 수행해야 합니다.

4. 혈관 조직 정화

  1. mCherry-labeled Sca1+ 줄기세포를 innominate artery와 aortic arch의 접합부에 있는 외측 부위에 주입합니다. 4주 후, CO2를 사용하여 마우스를 안락사시킨 다음 관류 후 대동맥 조직을 수집합니다.
  2. 대동맥 조직을 실온에서 4시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정한 다음 3 x 1시간 동안 PBS 세척을 합니다. 조직을 조직 투명화 용액으로 옮기고 37°C의 진탕 플랫폼에서 2일 동안 배양하여 투명도를 얻습니다.
    참고 : 언급 된 조직 세척 용액은 ddH2O11에 용해 된 10 % N- 부틸 디에탄올 아민과 10 % 트리톤 -X-100의 혼합물입니다.
  3. 실온에서 PBS로 3 x 2시간 동안 조직을 세척합니다. 조직을 CD31 1차 항체(1:100)를 함유한 PBS로 옮기고 4°C에서 24시간 동안 배양합니다.
  4. PBS로 3 x 1 h 동안 세척 한 후, 당나귀 안티 염소 (1 : 800)로 조직을 실온에서 3-4 시간 동안 배양 한 다음 3 x 1 시간 동안 PBS 세척합니다.
  5. 조직을 굴절률 일치 용액으로 옮기고 지속적인 투명성을 위해 최소 2일 동안 더 배양합니다.
    참고 : 참조 된 굴절률 정합 용액은 ddH2O 11에 용해 된 45 % 안티 피린, 30 % 니코틴 아미드 및 0.5 % N- 부틸 디에탄올 아민의 혼합물입니다.
  6. 2% 아가로스 젤을 준비해 가열해 녹인 후 투명 조직을 아가로스 젤에 끼워 식혀 직경 5mm의 원통 형태를 유지한다. 광시트 현미경의 무대에 고정하고 3D 스캔합니다. 다음 사양에 따라: 조명 대물렌즈: 10x 0.3 NA(Numerical Aperture) 수침 렌즈 2개; 감지 목표: 10x 0.5 NA 다중 침수 렌즈 1개; 배율 변경제: 1x/0.75x, 이미징을 수행했습니다.

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결과

초음파 유도 혈관 줄기 세포 전달
이 연구에서는 소동물 컬러 도플러 초음파 이미징 시스템을 사용하여 초음파 유도 주사를 수행했습니다(그림 1A, B). 시술 중에 마우스는 가열된 초음파 플랫폼에 고정되었으며 필요에 따라 플랫폼과 초음파 프로브를 조정했습니다(그림 1C).

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그림 1: 초음파 유도 주입 장치 및 동물 플랫폼에서 마우스의 최적 위치. (A) 통합 철도 시스템의 ...

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토론

유전적 돌연변이에 의해 유발되는 AAD는 유전성 AAD로 분류되며, 그 중 MFS가 가장 흔합니다. AAD는 MFS22의 가장 생명을 위협하는 합병증입니다. 이 상태를 조사하기 위해 우리는 대동맥류가 자발적으로 발생하는 MFS(Fbn1C1041G/+ 마우스)의 잘 정립된 마우스 모델을 사용하여 조기 개입 연구에 이상적입니다. 이 모델은 또한 다른 모델링 접근 방식과 관련된 추가 조직 손상 및 실험 가변성을 우회합니다. 이 연구에서는 mCherry 표지된 Sca1+ 혈관 줄기세포를 초음파 유도 하에 Fbn1C1041G/+ 마우스의 상행 대동맥 벽에 정확하게 전달했습니다. 질병 진행은 소동물 초음파 영상을 사용하여 모니터링했습니다. 또한, 주입된 줄기세포의 이동을 추적하기 위해 대동맥의 3D 이미징 및 분석에 광시트 현미경을 활용했습니다. ...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 국가과학기술전공프로젝트(2023ZD0503304), 중국국가자연과학재단(32271231), 중국국가핵심연구개발프로그램(2023YFC3606500)의 보조금으로 지원되었다. 3D 이미징 기술 지원을 해주신 Chao Zheng 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.1% 젤라틴 용액오리셀     GLT-11301
1.5mL 마이크로튜브액시젠MCT-150-C
10 & 뮤; L 피펫 팁랩셀렉트티-001-10
1000 & 무; L 피펫 팁랩셀렉트티-001-1000
15 mL 원심분리기 튜브랩셀렉트CT-002-15A
200 & 무; L 피펫 팁랩셀렉트티-001-200
5 mL 마이크로 원심분리기 튜브바이오샤프BS-50-M
50mL 원심분리기 튜브랩셀렉트CT-002-50A
안티피린맥클린A800873
안티 스카-1 마이크로비드 키트   밀테니 바이오텍     130-123-124
Bruker Luxendo MuVi -SPIM 시스템
CD31R& DAF3628희석 비율 1:100
큐빅-L조직 투명 솔루션
큐빅-RA굴절률 - 매칭 솔루션
DMEMATCC30-2002
당나귀 항염소 2차 항체, Alexa Fluor 488인비트로젠A11055희석 비율 1:800
FBS코 닝35-076-CV
HBLV-mcherry-PURO     한바이오
균질화기 튜브랩셀렉트HGT-003-200
영상유도 바늘 주입 장치  비주얼소닉
인슐린 주사기BD328421
이소플루란아메이신위도-YFW
라이트 시트 현미경브루커 룩센도       뮤비-SPIM
마트리겔코 닝356234
마이크로스캔 MS400 변환기       비주얼소닉
마우스 취급 및 생리학적 모니터링 플랫폼비주얼소닉
N-부틸디에탄올아민       맥클린     N802391
니코틴아미드맥클린N814605
PBS바이오샤프BL302A
Puralube 안과 연고에쿨1703321138
트리톤 X-100 시그마-알드리치T9284
트리판 블루 스테인 솔루션솔라바이오C0040
트립신-EDTA깁코25200-072
Vevo 2100 lmaging 시스템이스웰소닉스
Vevo 통합 레일 시스템 II이스웰산학

참고문헌

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