실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

Summary

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

Abstract

유전적으로 인코딩된 바이오센서는 처리량이 많은 정보 처리를 위한 강력한 도구로, 환경 또는 화학적 입력 신호를 다양한 출력으로 변환할 수 있습니다. 이를 통해 효소 최적화, 균주 개발, 미생물 공정 제어 등 광범위한 생명공학 응용 분야에서 유전자 발현의 동적 감지, 직접 제어 및 미세 조정 조절이 가능합니다. 목적에 맞게 만들기 위해 바이오센서 회로 구성 요소(예: 수송체, 입력 및 출력 모듈)의 화학량론을 수정하거나 관련 호스트-바이오센서 분자간 상호 작용(예: DNA-단백질, 단백질-단백질)을 조정하여 바이오센서 성능을 개선할 수 있습니다. 그러나 여기서 가능한 수많은 바이오센서 순열은 복잡한 조합 설계 공간을 생성하므로 원하는 표현형 성능을 제공하는 구성을 식별하기 위해 스크리닝 전략을 신중하게 최적화해야 합니다. 이러한 복잡성은 단클론 스크리닝 조건에서 이펙터 적정 분석이 필요한 조정 가능성과 같은 바이오센서 성능 특성으로 인해 더욱 복잡해집니다. 결과적으로, 다양한 시퀀스와 실험 공간을 탐색해야 할 필요성으로 인해 분수 샘플링 방법이 이러한 목적에 특히 적합합니다. 이 워크플로를 뒷받침하는 것은 실험 설계법(DoE) 알고리즘으로, 이 조합 실험 설계 공간의 효율적인 통계 기반 구조화 매핑 및 분수 샘플링을 허용할 수 있는 좋은 위치에 있습니다.

디지털 및 아날로그 용량-반응 곡선을 모두 갖춘 고유한 구성을 제공하기 위해 알로스테릭 전사 인자 기반 바이오센서의 설계 공간을 효율적으로 샘플링하기 위한 결합된 고처리량 자동화 및 계산 접근 방식이 보고되었습니다. 프로토콜은 프로모터 및 리보솜 결합 부위 라이브러리의 생성 및 자동 선택으로 시작됩니다. 이러한 라이브러리와 해당 표현식 데이터는 구조화된 무차원 입력으로 변환되어 전체 실험 설계 공간의 계산 매핑을 허용합니다. 그런 다음 DoE 알고리즘을 사용하여 분수 샘플링을 수행하고 처리량이 많은 자동화 플랫폼을 사용하여 이펙터 적정 분석과 결합합니다. 이 워크플로는 미래 바이오센서 시스템 및 유전자 회로의 개발 및 최적화를 위한 불가지론적 프레임워크를 제공하여 합성 생물학 커뮤니티를 위한 규제 툴킷을 제공합니다.

Introduction

유전자 발현을 조절하는 능력은 모든 형태의 생명체에서 필수적인 기능으로, 화학적 이펙터에서 생물물리학적 자극에 이르기까지 내부 및 외부 영향 모두에 대한 역동적이고 실시간 반응을 촉진합니다¹. 자연 전체에서 발견되는 무수한 수의 전사 조절 시스템은 합성 생물학을 통해 가능해진 대사 공학 및 생명공학 연구의 증강 및 가속화에 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 원핵생물에서 발생하는 조절의 대부분은 알로스테릭 전사 인자(aTF)와 다수의 소분자 이^펙터2의 상호 작용에 의해 구동되는 1성분 조절 메커니즘을 통해 제어됩니다. 일반적으로 이펙터 결합 도메인(EBD)과 DNA 결합 도메인(DBD)으로 구성된 aTF는 특정 소분자 이펙터에 결합할 때 분자 스위치 역할을 하여 게놈의 프로모터 영역에 위치한 특정 DNA 연산자 서열에 대한 DBD의 친화도를 조절하여 전사의 활성화 또는 억제를 초래합니다³. 이 믿을 수 없을 정도로 단순한 메커니즘은 억제/탈억제 시스템에서 엄청난 수의 소분자 이펙터 또는 환경 자극을 감지하고 반응할 수 있는 활성화제에 이르기까지 다양한 규제 전략을 탄생시켰습니다⁴. 결과적으로, 합성 생물학은 과다한 입력 신호를 맞춤형 출력, 즉 형광 리포터 단백질 생산 및 합성 경로 조절로 결합할 수 있는 유전적으로 인코딩된 바이오센서를 구축하기 위해 이러한 다양성을 활용했습니다. 생명공학 워크플로에 적용될 때 이러한 시스템은 대사산물의 세포내 농도를 실시간으로 모니터링하고, 경로를 동적으로 조절하며, 보다 효율적인 경로, 균주 및 생물공정의 개발을 돕는 쉬운 판독값을 가능하게 합니다5,6,7,8.

기본적으로 바이오센서는 특이성, 작동 범위, 동적 범위, 민감도 및 기울기를 포함한 여러 매개변수에 따라 특성화되며, 바이오센서의 선량 반응 곡선은 출력 신호를 통해 이러한 매개변수를 리간드 농도의 함수로 설명합니다(그림 1)9,10,11,12 . Hill 방정식은 바이오센서의 성능 특성을 맞추는 데 사용할 수 있으며, 위에서 설명한 각 매개변수에 대한 반경험적 증거를 제공하므로 바이오센서 시스템을 특성화하는 수단을 제공하는 동시에 애플리케이션을 중심 결과로 조정하는 데 필요한 노력을 평가할 수 있습니다. 특이성은 다른 잠재적 이펙터 분자 배열과 비교하여 하나의 이펙터에 의해 유도된 신호 출력의 상대적 차이로 정의될 수 있으며 일반적으로 aTF의 EBD 수준에서 변조됩니다. 작동 범위는 바이오센서가 감지할 수 있는 리간드 농도 범위로 정의되며, 바이오센서가 반응할 수 있는 농도 범위를 나타냅니다. 대조적으로, 동적 범위는 가장 높은 측정 가능한 활성화(ON) 상태와 비활성화(OFF) 상태의 비율을 설명하며 바이오센서가 배경 자동 형광¹⁰ 이상의 이펙터 농도를 안정적으로 보고하도록 하는 중요한 매개변수입니다. 이펙터 분자에 대한 민감도는 이펙터⁽¹³)의 절반 최대 농도(EC₅₀)에 의해 측정되는 특정 출력 신호를 유도하는 데 필요한 농도로 설명된다. 마지막으로, 곡선의 기울기는 프로모터의 연산자 부위에 대한 aTF의 협력성(n_H)으로 표시되며 더 많은 디지털 또는 아날로그 응답 출력 프로파일을 생성합니다. 협력성은 조작자 부위에 대한 친화력을 강화하는 다량체 복합체를 형성하는 리간드 결합 aTF 사이의 단백질-단백질 상호 작용에서 발생하며, 그 결과 포화 리간드 농도와 보다 디지털 반응 프로파일로 회로의 반응성이 급격히 증가합니다¹⁴.

바이오센서의 선량 반응 특성은 응용 분야의 적합성에 큰 영향을 미칠 수 있으며 종종 모든 개념적 응용 분야의 '성패' 지점이 됩니다. 바이오센서 성능은 시스템마다 크게 다를 수 있으며, 작동 범위는 일반적으로 0.1nM-10mM¹³ 다양하지만 동적 범위는 1.4-2000 배¹⁵ 일 수 있습니다. 또한 aTF에 대해 보고된 이펙터 화합물의 수는 광범위하지만(대사 산물, 아미노산, 금속, 항생제, 쿼럼 감지 등)¹¹, 이는 모든 것을 포괄하는 것이 아니며 이펙터에 적합한 바이오센서가 문헌에 아직 존재하지 않을 때 연구자에게 어려움을 제시합니다. 합성 생물학은 이러한 문제를 해결하는 바이오센서의 엔지니어링을 가능하게 하여 이펙터 범위 및 용량 반응 특성을 조정하여 응용 프로그램의 연구 결과와 보다 밀접하게 일치할 수 있도록 했으며 앞서 언급한 두 가지 문제를 각각 해결하는 데 사용되었습니다^16,17. 엔지니어링의 두 가지 핵심 영역은 합성 생물학, 바이오센서의 프로모터 영역 및 aTF 자체를 통해 표적으로 삼을 수 있으며 전사 및 단백질 수준에서 효과를 매개합니다. 프로모터 수준에서 성능을 조절하기 위해 바이오센서의 유전적 요소에 초점을 맞춘 접근 방식에는 감도, 작동 및 동적 범위를 조정하기 위한 RBS, 운영자 부위 및 -35, -10(헥스박스)의 엔지니어링이 포함되며 이 원고에 설명된 방법론의 초점입니다(그림 1). 대안적으로, 이펙터 결합 도메인의 분석 및 이펙터 배위에 관여하는 잔기의 돌연변이(서열 상동성 및/또는 구조 생물학 사용)를 통해 바이오센서의 선택성 및 민감도를 수정하면 동족 이펙터에 대한 반응을 조절할 수 있습니다 18,19,20 또는 관심 있는 비동족 이 펙터 16,17,21로 완전히 변경할 수 있습니다. 이러한 튜닝 노력은 바이오센서를 특정 응용 분야로 향하게 할 수 있으며, 일반적으로 대사 컨트롤러(피드백 루프, 제어 회로), 1차 스크리닝 도구(효소 또는 균주 발견), 2차 스크리닝 도구(효소 변이 스크리닝, 대사 공학) 및 수송체 생물 탐사 22,23,24. 그러한 예 중 하나는 동적 및 작동 범위를 개선하기 위해 엔지니어링된 프로모터 서열과 결합된 뮤콘산 반응성 aTF, CatM을 사용하는 것입니다. 이 시스템은 적응 실험실 진화²⁵에 따른 GFP 형광을 기반으로 가장 효과적인 뮤콘산 생산 균주를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류와 통합되었습니다.

위에서 설명한 엔지니어링 전략의 성공은 자명하지만, 합성 생물학자가 바이오센서를 조정하기 위해 사용할 수 있는 레버의 상호 의존성은 설계 프로세스를 복잡하게 만들고 바이오센서 개발에 소요되는 기간을 연장할 수 있으며, 이로 인해 일부 연구자는 바이오센서를 자체 워크플로에 구현하는 것을 단념할 수 있습니다. 그림 1에 설명된 바와 같이, 헥스박스를 수정하여 특정 결과에 대해 바이오센서를 조정하려는 시도는 의도치 않게 다른 매개변수를 감쇠시킬 수 있으며, 이러한 상호 의존성은 바이오센서 공학에서 인식되는 과제입니다¹². 바이오센서 튜닝의 일반적인 접근 방식은 합리적인 설계와 지향성 진화 공학으로 구성되며, 전자는 시스템의 구조적 및 기계론적 특징에 대한 선험적 이해에 의존하여 성공 가능성이 높은 구성 요소에 실험을 집중합니다. 반면, 후자는 최적화된 특성을 나타내는 변이체를 선택하기 위해 높은 처리량 스크린과 결합된 무작위 돌연변이 유발 및 자연 진화에 의존합니다 26,27,28,29,30. 효과적이기는 하지만 두 기술 모두 몇 가지 단점도 있습니다: 예를 들어, 특정 구조적 또는 기능적 요소에 초점을 맞춘 표적 엔지니어링은 전체 실험 공간에 대한 제한된 탐색에 취약하고 알로스테릭 또는 2차 효과를 무시할 수 있습니다³⁰. 비표적 라이브러리 생성 및 스크리닝은 안내되지 않은 방식으로 설계를 최적화하는 데 이상적이지만 사전 설계 작업(즉, 라이브러리 설계 및 생성)이 거의 필요하지 않지만 유용한 돌연변이에 대한 편향이 필요합니다. 이러한 편향이 없으면 훨씬 더 많은 비율의 돌연변이가 해로울 수 있으며 더 많은 스크리닝이 필요할 것으로 예상됩니다³¹. 따라서 바이오센서의 구성 요소(aTF, RBS, 작업자 부위 및 헥스박스)의 주요 효과뿐만 아니라 이러한 구성 요소가 서로 상호 작용하여 바이오센서 매개변수에 영향을 미치는 방법도 고려하는 전체적인 접근 방식은 매우 매력적입니다.

구조화된 다변량 실험 및 통계 모델링 방법론은 가능한 최소한의 실험 횟수를 사용하여 다차원 실험 공간을 조사하기 위해 프로세스 엔지니어링 워크플로에 널리 채택되었습니다. 실험 설계법(DoE)라고 하는 실험과 모델링을 결합한 이 접근 방식은 결정적으로 연구자가 광범위한 선험적 지식을 요구하지 않으면서 정의된 결과를 향해 복잡한 다변수 프로세스를 최적화할 수 있도록 합니다^23,30. 일반적으로 구조화된 실험 탐색이 더 쉬운 연속 변수의 최적화에 적용되는 반면, DoE는 유전적 수준에서 대사 경로의 최적화에도 사용되었습니다 31,32,33. 여기에는 원하는 결과에 가장 중요하다고 생각되는 요인이 선택되는 초기 스크리닝 단계가 포함되며, 그 다음에는 선택한 요인을 조정하여 원하는 출력을 얻는 최적화 단계가 포함되며, 이 경우 적용 범위를 늘리기 위해 특정 바이오센서 매개변수를 최적화합니다. 결정적으로, 이 기술은 자동화된 액체 처리기 플랫폼과 결합되어 스크리닝 처리량을 최대 10³ - 10⁴의 중간 규모 라이브러리로 증가시켜 데이터 기반 기반으로 바이오센서 성능을 전 세계적으로 최적화할 수 있습니다²³. 아래에서는 바이오센서 감도의 글로벌 최적화를 위한 라이브러리 생성, 스크리닝 및 데이터 수집을 간소화하기 위해 액체 취급 로봇 공학을 지원하는 바이오센서 최적화에 대한 DoE 기반 접근 방식을 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Protocol

1. RBS/프로모터 부품 설계

1. DoE 프로세스에서 연속 변수로 체계적으로 조정할 수 있는 바이오센서별 조절 요소를 식별합니다. 이러한 규제 요소를 별개의 모듈로 그룹화합니다. 여기에는 이펙터 수송, 전사 인자 발현 및/또는 출력 유전자 발현을 조절하는 모듈이 포함될 수 있습니다. 각 모듈이 프로모터 또는 RBS(예: 각각 RBS_trans, P_reg, RBS_out 및 P_out)에 의해 전사 및/또는 번역 수준에서 조정 가능한지 확인하십시오.
2. 선택한 프로모터 및 RBS 영역 내에서 헥스 박스, 운영자 부위 및 RBS 서열과 같은 주요 기능 부위를 결정합니다.
   참고:^34,35,36에서 라이브러리를 만들기 위해 문헌에 많은 특성화된 프로모터와 RBS가 존재합니다. 그러나 특성화되지 않은 프로모터 서열(일반적으로 P_reg 프로모터)의 경우, 문헌에서 사용할 수 있는 유전자 서열 요소가 없는 경우 조정 가능한 유전자 서열 요소를 찾기 위한 추가 단계는 아래를 참조하십시오.
   1. 원하는 감지 입력이 있는 aTF의 BlastP 검색 을 통해 관심 있는 바이오센서 서열을 포함하는 다른 오페론을 찾습니다. aTF의 유전자간 영역과 그 조절된 유전자를 추출하여 프로모터 서열을 얻습니다.
      참고: 프로모터 서열의 위치와 수는 사용되는 aTF의 종류에 따라 다릅니다.
3. 다중 서열 정렬 도구 및 기타 모티프 소프트웨어를 사용하여 헥스박스 및 연산자 부위와 같은 보존된 모티프에 대한 추정 프로모터를 검색합니다. 프로모터 서열 분석을 기반으로 퇴화 염기(예: N = 모든 것, R = 모든 퓨린, Y = 모든 피리미딘 등)를 사용하여 무작위화할 뉴클레오티드 서열을 선택합니다.
   참고: 독자는 프로모터 분석 및 염기 무작위화에 대한 자세한 내용을 보려면 소스 간행물로 이동됩니다²³.

2. 부품 라이브러리 조립 및 검증

1. 형광 마커(예: GFP)의 업스트림에 프로모터/RBS 서열 변이체를 삽입할 수 있도록 원하는 발현 벡터를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 설계하고 주문합니다. 멸균 탈이온화 H₂O에서 최종 농도 100μM로 도착하면 동결건조 프라이머를 희석합니다.
   1. 특정 중합효소의 매개변수에 따라 PCR 튜브의 얼음 위에 PCR 반응 혼합물을 조립합니다. 발현 벡터의 백본으로 돌연변이가 이월되는 것을 방지하기 위해 충실도가 높은 중합효소를 사용해야 합니다. 프라이머의 필요와 원하는 PCR 산물의 길이에 따라 어닐링 온도와 연장 시간을 조정합니다.
   2. 겔 전기영동 을 통해 PCR 산물을 분석하고 PCR 정제 또는 겔 추출 키트를 사용하여 선형화된 벡터를 정제합니다. 선형화된 벡터 DNA의 농도를 측정하고 -20°C에서 보관합니다.
2. 발현 벡터로의 표적 상동 재조합을 위해 5' 및 3' 말단 모두에 30bp 플라스미드 상동성 암을 갖는 단일 가닥 퇴행성 올리고뉴클레오티드로 선형화 벡터에 삽입하기 위해 설계된 변이체 라이브러리(RBS 또는 프로모터)를 주문합니다.
   1. 도착하면 동결건조된 올리고뉴클레오티드를 멸균 탈이온화 H₂O에서 최종 농도 100ng/μl로 재현탁합니다.
3. 온라인 계산기를 사용하여 선형화된 벡터 및 변형 라이브러리의 등몰 양에 대한 부피를 결정합니다. 반응의 최종 부피가 20μL에 달하고 인서트 대 벡터의 몰 비율이 2:1인지 확인합니다.
   1. 상업용 Gibson 어셈블리 마스터 믹스(X2)의 분취량을 얼음 위에 해동하고 선택한 계산기에서 제공하는 부피에 따라 PCR 튜브에서 반응을 조립합니다.
      참고: Gibson 마스터 믹스는 실험실^37,38에서도 만들 수 있습니다.
   2. DNA 단편에 2x Gibson 마스터 믹스 10μL를 첨가하고 열순환기 또는 이와 유사한 것에서 50°C에서 1시간 동안 배양합니다.
   3. 20μL의 모든 결찰 산물을 미세 원심분리기 튜브에서 200μL의 유능한 대장균 에 도포합니다. 얼음 위에서 30분 동안 배양한 후 42°C에서 45초 동안 열 충격을 가합니다.
   4. 세포를 2분 동안 얼음에 되돌리고, 이화작용물 억제(SOC) 배지가 포함된 800μL의 초최적 국물을 튜브에 첨가하고, 쉐이킹 인큐베이터에서 37°C에서 1시간 동안 세포가 회복되도록 합니다.
   5. 형질전환된 세포 50μL를 관련 항생제 선택과 함께 여러 개의 60mm Luria-Bertani(LB) 한천 페트리 플레이트에 퍼뜨립니다. 플레이트를 37°C에서 18시간 동안 배양합니다.
4. 형질전환체가 있는지 플레이트를 확인하고 이론적 라이브러리 다양성의 3배를 나타내는 콜로니 수를 계산하여 각 변이체의 충분한 표현을 캡처합니다. 콜로니 수가 적거나 0인 경우 등온 어셈블리를 최적화합니다.
   참고: 충실도가 높은 시약 또는 합성에서 생성된 이상적인 라이브러리를 고려할 때 오버샘플링이 필요합니다. 이는 일반적으로 라이브러리의 총 크기보다 3배 더 큽니다. 예를 들어, 4개의 퇴화 위치(NNNN) = 4⁴ = 256개의 고유한 서열입니다. 따라서 ~768개의 콜로니를 긁어냅니다.
   1. 적절한 항생제가 보충된 25mL의 LB 배지가 들어 있는 단일 멸균 125mL 플라스크에 필요한 수의 콜로니를 긁어냅니다. 플라스크를 37°C에서 18시간 동안 쉐이킹 인큐베이터(180rpm)에서 배양하고, 이 시간이 경과한 후 배양액이 눈에 띄게 조밀해지도록 합니다.
   2. 플라스미드 midi-prep 정제 키트를 사용하여 준비된 형질전환체 배양에서 변이체 라이브러리를 정제합니다. 플라스미드 라이브러리 DNA의 농도를 결정합니다. 다운스트림 단계에는 1-10μg이 필요합니다. 라이브러리 DNA가 멸균 탈이온화 H₂O를 사용하여 용출되었는지 확인합니다.
      참고: 이 시점 이후의 단계는 Pseudomonas putida (P. putida) 발현 숙주에서 변이 라이브러리의 복제 및 검증에 중점을 둘 것입니다. 프로토콜을 다른 숙주에 적용하려면 배양 시간, 배양 온도 및 형질전환 방법의 수정이 필요할 수 있습니다.
5. 글리세롤 스톡에서 줄무늬를 제거하고 플레이트를 30°C에서 18시간 동안 배양하여 원하는 발현 숙주 P. putida 의 LB 한천 플레이트를 준비합니다.
   1. LB 한천 플레이트에서 P. putida 의 단일 콜로니를 선택하고 10mL의 LB 배지를 접종하고 30°C에서 18시간 동안 180rpm 쉐이킹으로 성장시킵니다.
   2. 성장한 배양물을 18°C에서 4000 x g 로 2분 동안 원심분리하여 전기 능력을 위해 세포를 준비합니다. 상청액을 붓고 멸균 탈이온화 H₂O 1mL에 재현탁한 다음 재현탁된 세포를 멸균 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      참고: P. putida 세포는 펠릿화될 때 분홍빛을 띠게 되어야 합니다.
   3. 미세 원심분리기에서 4 x g 에서 1분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 붓고 멸균 탈이온화 H₂O 1mL에 재현탁합니다. 원심분리 및 재현탁 단계를 4회 더 반복합니다.
      참고: 세척 중에 상청액을 부을 때 세포 손실이 발생할 수 있습니다. 이는 정상이며 수율에 영향을 미치지 않습니다.
   4. 세척된 세포 100μL를 0.2cm 전기천공 큐벳에 옮기고 1-10μg의 플라스미드 라이브러리 DNA를 큐벳에 첨가하고 혼합합니다.
   5. 전기천공기를 켜고 0.2cm 큐벳의 전압이 2.5kV로 설정되어 있는지 확인하고 큐벳을 전기천공 챔버에 삽입하고 펄스를 가합니다.
   6. 900μL의 SOC 배지를 큐벳에 넣고 혼합한 다음 세포를 멸균 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 세포가 30°C에서 2시간 동안 회수되도록 진탕 인큐베이터에서 합니다.
6. 형질전환된 세포 50μL를 관련 항생제가 보충된 LB 한천의 큰 정사각형 페트리 플레이트(230mm)에 펴고 30°C에서 18시간 동안 배양합니다.
   참고: 라이브러리 플레이트(2-3 CFU/^cm2)에서 적당한 콜로니 밀도를 보장합니다. 이것은 박테리아 능력과 도금량에 따라 달라집니다. 너무 낮으면 변환 최적화 또는 연속적인 변환 라운드를 사용하여 식민지 수를 늘릴 수 있습니다.
7. 서열 검증을 위해 모든 형질전환 플레이트에서 25-50개의 콜로니 중에서 선택합니다. 퇴화 서열 전반에 걸쳐 증폭되는 프라이머를 사용하고, PCR로 영역을 증폭하고, Sanger 시퀀싱을 위해 보내 서열 다양성과 다클론성을 평가합니다.
   참고: 다클론성이 문제가 되는 경우 1μg의 DNA가 있는 큐벳의 여러 배치에 형질전환을 분산시키면 이러한 효과를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 파트 라이브러리 클론 스크리닝 - 자동화

1. 액체 처리기 설정
   1. 액체 처리기 플랫폼에서 7개의 프로그램을 만들어 피펫팅 집약적인 단계를 간단히 만듭니다.
   2. "MTP 액체 이송" 프로그램을 생성하고 액체 처리기가 준비된 저장소에서 레이아웃의 빈 마이크로타이터 플레이트(MTP)로 조정 가능한 부피를 피펫팅하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
   3. "MTP에 글리세롤 추가" 프로그램을 생성하고, 액체 처리기가 100μL 부피의 50% 글리세롤을 플레이트에 피펫팅하도록 프로그래밍되어 있는지 확인하고, 분배 및 흡인 속도가 5-20μL/s인지 확인합니다.
      참고: 50% 글리세롤의 더 높은 점도를 설명하기 위해 별도의 프로그램이 만들어지며, 이는 제어하지 않으면 튀김으로 인해 기포 형성, 불완전한 흡인 또는 인접 우물의 교차 오염으로 이어질 수 있습니다.
   4. "DWB 액체 이송" 프로그램을 만들고, 용량 설정을 조절할 수 있는 깊은 우물 블록(DWB)으로 피펫팅하도록 액체 처리기를 설정하고, 액체 처리기가 미리 채워진 저장소에서 피펫팅되도록 합니다.
   5. "해동된 MTP에서 접종" 프로그램을 생성하고, 액체 처리기가 선택한 콜로니를 포함하는 해동된 MTP에서 5μL를 흡인하도록 프로그래밍되어 있는지 확인하고 이를 레이아웃의 해당 DWB 플레이트로 옮깁니다.
      알림: 레이아웃의 MTP 및 DWB 배열에 세심한 주의를 기울여 우발적인 이중 접종이나 플레이트 누락을 방지하기 위해 이벤트의 논리적 순서를 보장하십시오.
   6. "Transfer to Assay DWB" 프로그램을 생성하고 액체 처리기가 한 DWB 플레이트 위치에서 다른 DWB 플레이트 위치로 5μL의 세포를 이송하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 프로그램은 각 이송이 다른 플레이트 위치(예: P1 -> P2, P1 -> P3 등)를 접종할 때마다 이 작업을 4회 반복해야 합니다.
      참고: 이 프로그램은 96개의 변이를 서로 다른 분석 농도로 원활하게 계대배양할 수 있도록 합니다.
   7. "분석 설정 - PBS 재현탁액(DWB)" 프로그램을 생성하고, 액체 처리기가 500μL의 PBS로 레이아웃의 각 DWB를 피펫팅하도록 하고, 세포 펠릿이 적절하게 재현탁되도록 하는 혼합 단계도 포함해야 합니다.
   8. "분석 설정 - 세포 및 PBS 첨가(MTP)" 프로그램을 생성하고, 이 프로그램에 재현탁된 세포 200μL를 하나의 DWB 플레이트 위치에서 빈 MTP 위치로 옮기는 단계가 포함되어 있는지 확인합니다.
      참고: 3.1의 모든 단계에서 프로그래밍 및 액체 처리기 레이아웃은 다릅니다. 연구자는 특정 상업용 액체 처리기의 매뉴얼을 참조하여 실험의 용량과 필요에 맞게 위의 프로그램을 수정해야 합니다.
2. 변형 라이브러리 배양 및 바코드
   1. 이론적 라이브러리 크기를 결정하고 개별 변이체의 수를 계산하여 95%의 라이브러리 커버리지(라이브러리 크기 3배 권장)를 보장>합니다(2.5단계에 대한 참고 사항 참조).
   2. 스크리닝할 콜로니의 수에 따라 항생제 보충 LB 배지의 필요한 부피를 계산합니다(콜로니당 200μL + 10% 초과).
   3. 액체 처리기 소프트웨어를 열고 MTP 액체 이송 프로그램 옆에 있는 실행을 클릭합니다(보충 파일 1 참조). 준비된 매체를 해당 저장소 위치에 놓고 레이아웃에 따라 빈 MTP로 데크를 채웁니다. 200μL의 배지를 분배하도록 프로그램을 설정합니다. 딸깍 하는 소리 OK 프로그램 시작을 확인합니다.
      알림: 중단을 방지하기 위해 프로그램 시작을 확인하기 전에 항상 저장소와 팁이 액체 처리기 플랫폼에 적절하게 공급되었는지 확인하십시오.
   4. 필요한 만큼 프로그램을 반복하고 채워진 MTP를 통기성 멤브레인으로 밀봉하여 멸균 상태를 유지합니다.
   5. 채워진 MTP 플레이트를 콜로니 피커 플랫폼으로 옮기고 밀봉을 풀고 플라스미드 변이 라이브러리 DNA로 형질전환된 P. putida 의 사각 플레이트도 콜로니 피커 플랫폼으로 옮깁니다. 콜로니 피커를 사용하여 미리 채워진 각 마이크로타이터 플레이트 웰에 형질전환 라이브러리 플레이트의 단일 콜로니를 접종합니다.
      참고: 콜로니 피커 헤드가 손상되지 않도록 한천의 최소 깊이가 25mL인지 확인하십시오.
   6. 접종된 플레이트를 다시 밀봉하고 30°C(800rpm)에서 진탕하는 오프라인 인큐베이터로 옮기고, 배양 증발을 방지하기 위해 75%에서 습도 제어가 활성화되도록 합니다. 16시간 동안 성장하도록 그대로 두십시오.
      참고: 배양 후 배양은 눈에 눈에 띄게 조밀하게 보일 수 있으며, 그렇지 않은 경우 배지 및 항생제 요구 사항을 다시 확인하십시오.
   7. 16시간 동안 성장한 후, 성장한 플레이트를 액체 처리기 플랫폼으로 되돌리고 밀봉을 풉니다. MTP에 글리세롤 추가 프로토콜(보충 파일 1 참조) 옆에 있는 실행을 클릭하고 화면의 플레이트 레이아웃이 액체 처리기 도크의 플레이트 레이아웃과 일치하는지 확인합니다. 확인을 클릭하고 프로토콜이 실행되도록 허용합니다.
   8. 완료되면 플레이트를 다시 밀봉하고 오프라인 진과 인큐베이터(800rpm)에서 5분 동안 잠시 혼합한 후 바코드를 적용하고 -80°C에서 보관합니다.
   9. 3.2.7단계를 반복합니다. 및 3.2.8. 모든 MTP에 글리세롤이 첨가될 때까지, 혼합, 바코드 및 -80°C에서 보관됩니다.
      참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하여 아래의 특성화 단계를 준비할 수 있습니다. 또한 사용 중인 액체 처리기 플랫폼의 용량에 맞게 플레이트를 다른 실험 실행으로 차단하거나 한 번에 작업량을 줄일 수 있습니다.
3. 변이 라이브러리 스크리닝
   1. 채울 DWB 수에 필요한 항생제 보충 배지의 부피를 계산합니다(웰당 ~495 μL + 10% 초과).
   2. DWB 액체 이송 프로그램 옆에 있는 실행(Run)(보충 파일 1 참조)을 클릭하고 미디어 가 프로그램 레이아웃의 올바른 저장소에 추가되었는지 확인합니다. 빈 DWB가 해당 레이아웃 위치에 추가되고 적절한 팁 공급을 사용할 수 있는지 확인합니다. 495μL의 배지를 분배하도록 프로그램을 설정합니다. 준비가 되면 확인을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
   3. 채워진 DWB를 통기성 멤브레인으로 밀봉하고 4°C에서 임시 보관소로 옮기고 3.3.2단계를 반복합니다. 필요한 수의 DWB가 미디어로 채워질 때까지.
   4. 해동된 MTP에서 분리 프로그램 옆에 있는 실행(보충 파일 1 참조)을 클릭하고 MTP 극저온 스톡과 채워진 DWB가 레이아웃에 따라 액체 처리기 플랫폼으로 전송되는지 확인합니다. 팁이 충분히 공급되는지 확인하십시오. 확인을 클릭하여 프로그램을 초기화합니다.
      참고: 세포의 최적 생존력을 보장하기 위해 전제 조건 프로그램과 플레이트가 준비된 경우에만 얼음 위에서 30분 동안 스톡 플레이트를 해동합니다.
   5. 프로그램이 완료되면 통기성 멤브레인으로 하룻밤 접종된 DWB를 밀봉하고 75% 습도 조절이 가능한 오프라인 플레이트 셰이커 인큐베이터로 옮기고 30°C(180rpm)에서 16시간 동안 밤새 성장시킵니다.
   6. 3.2.8단계에 따라 cryostock MTP를 다시 밀봉, 혼합 및 -80°C 냉동고로 되돌립니다.
   7. 3.3.4단계를 반복합니다. 3.3.6으로 변경됩니다. 필요한 수의 야간 DWB가 접종되고 인큐베이터로 옮겨질 때까지 많은 횟수가 필요합니다.
      참고: 접종 중 실행 사이의 시간 지연을 설명하고 다운스트림 단계에 동일한 순서를 사용하기 위해 플레이트의 각 배치가 인큐베이터에 추가되는 시기를 기록하는 것이 좋습니다.
   8. 스크리닝할 하룻밤 DWB의 수에 따라 다양한 농도의 이펙터 및 항생제가 보충된 배지의 필요한 양을 계산합니다(웰당 495μL + 10% 이상). 각 이펙터 농도에는 액체 처리기에 별도의 저장소가 필요합니다.
      참고: ON/OFF 스크리닝과 같은 초기 특성화의 경우 두 가지 이펙터 농도(예: 0 및 1000μM 최종 농도)로 충분합니다. 보다 강력한 특성화를 위한 용량-반응 데이터를 생성하기 위해 이 범위는 최소 4가지 농도(예: 0, 1, 25 및 1000μM 최종 농도)로 증가합니다. 억제 시스템은 기능을 확인하기 위해 이펙터를 추가할 필요가 없는 반면, 설명된 시스템과 같은 활성화제의 경우 이펙터가 필요합니다.
   9. DWB Liquid Transfer 프로그램 옆에 있는 Run(실행)을 클릭합니다(보충 파일 1 참조). 이펙터 보충 배지가 포함된 저장소가 레이아웃에 따라 올바른 위치에 있는지 확인하십시오. 빈 DWB를 액체 처리기 플랫폼에 추가합니다. 플랫폼에서 충분한 팁을 사용할 수 있는지 확인합니다. 준비가 되면 확인을 클릭하여 프로토콜을 시작하여 분석 DWB를 생성합니다.
   10. 충전 후 분석 DWB를 통기성 멤브레인으로 밀봉하고 4°C의 임시 보관소로 옮기고 액체 처리기 플랫폼을 더 많은 빈 플레이트로 다시 채웁니다.
   11. 필요한 수의 DWB가 채워질 때까지 필요한 만큼 3.3.9 및 3.3.10단계를 반복합니다.
   12. Transfer to Assay DWB 프로그램 옆에 있는 Run(실행)을 클릭합니다(보충 파일 1 참조). 이펙터 보충 배지를 포함하는 밀봉되지 않은 분석 DWB가 액체 처리기 레이아웃의 올바른 위치에 추가되었는지 확인합니다.
   13. 3.3.4단계에서 접종된 성장한 P. putida 를 포함하는 하룻밤 DWB를 옮기고 밀봉을 풉니다. 액체 처리기 플랫폼에 배치하여 레이아웃이 엄격하게 준수되도록 합니다. 플랫폼에서 충분한 팁을 사용할 수 있는지 확인합니다. 준비가 되면 확인 을 클릭하여 프로토콜을 시작합니다.
       참고: 아계 배양을 분석 플레이트로 옮기고 배열하는 것은 일반적으로 액체 처리기 플랫폼의 크기에 따라 일괄적으로 수행되어야 합니다.
   14. 프로그램이 완료된 후 씰을 부착하고 분석 플레이트를 30°C, 습도 75%에서 16시간(180rpm) 동안 오프라인 인큐베이터로 옮기면 이 단계에서 최종 분석 부피는 500μL가 됩니다.
   15. 접종 후 하룻밤 DWB를 폐기하고 필요한 모든 분석 DWB가 접종되고 오프라인 인큐베이터에서 성장할 때까지 필요에 따라 3.3.12 - 3.3.14 단계를 반복합니다.
   16. 인큐베이터에서 DWB를 제거하고 원심분리기로 옮기고 4000 x g, 18°C에서 5분 동안 펠릿 세포를 투여합니다. 상층액을 붓고 원심분리된 DWB를 액체 처리기 플랫폼에 놓습니다.
       참고: 세포 펠릿 부피는 이펙터 농도 또는 변이에 따라 달라질 수 있으며, 또한 일부 펠릿은 다른 펠릿보다 눈에 더 눈에 띄게 형광을 발할 수 있습니다.
   17. 스크리닝할 DWB의 수(웰당 500μL + 10% 이상)를 기준으로 필요한 1x PBS의 부피를 계산합니다.
   18. Assay Setup - PBS Resuspension(DWB) 프로그램 옆에 있는 Run(실행)을 클릭하고(보충 파일 1 참조), 디스펜스 부피를 500μL로 설정하고, 1x PBS가 올바른 저장소에 추가되었는지 확인한 다음, 액체 처리기의 레이아웃에 따라 원심분리된 플레이트를 배열합니다. 충분한 팁을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 확인을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
       참고: 세포의 세척은 약간의 자가형광을 생성할 수 있는 잔류 성장 배지를 제거하기 위해 수행됩니다.
   19. 액체 처리기에서 재현탁된 플레이트를 다시 밀봉하고 제거합니다. 플레이트 밑면을 확인하여 펠릿이 완전히 재현탁되었는지 확인하십시오. 펠릿 DWB를 액체 처리기로 계속 옮기고 3.3.18단계를 반복합니다. 모든 플레이트가 다시 매달릴 때까지.
   20. Assay Setup - Cells and PBS addition(MTP) 프로그램 옆에 있는 Run(실행)을 클릭합니다(보충 파일 1 참조). 3.3.18단계에서 재일시 중단된 DWB를 전송합니다. 제안된 레이아웃에 따라 액체 처리기로. 레이아웃에 따라 빈 MTP를 액체 처리기로 옮깁니다. 디스펜싱 부피가 200μL로 설정되어 있고 충분한 팁을 사용할 수 있는지 확인하십시오. 확인을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
   21. 채워진 MTP(최종 분석 부피 200μL)를 오프라인 다중 모드 플레이트 리더기로 옮기고, 플레이트의 각 웰에 대해 적절한 여기 방출 파장(예: sfGFP lEx/lEm = 488/520) 및 OD₆₀₀ 에서 상대 형광을 측정합니다.
       참고: 여기 방출 파장 설정은 발현 벡터에 암호화된 형광 유전자의 선택에 따라 달라집니다. 플레이트 리더의 게인 설정이 전체적으로 일관되게 유지되도록 하고 검출기를 포화시키지 않고 낮은 변형과 높은 변형을 구별할 수 있습니다.
   22. 3.3.20단계를 반복합니다. 및 3.3.21. 모든 분석 DWP가 MTP로 전송되고 측정될 때까지.

4. 데이터 처리/변환 및 차등 순위

1. 기록된 GFP 형광(RFU)을 평가된 각 이펙터 농도(0 및 1000μM)에 대한 각 변이에 대해 기록된 OD₆₀₀ 측정값으로 나누어 수집된 데이터의 정규화를 수행합니다.
   참고: 대부분의 플레이트 리더는 데이터 수집 중에 OD₆₀₀ 으로 형광을 자동으로 정규화하도록 프로그래밍할 수 있습니다.
2. ON/OFF를 계산하여 1000μM(ON)의 RFU/OD₆₀₀ 을 0μM(OFF)의 RFU/OD₆₀₀ 으로 나누어 각 변형의 동적 범위를 얻습니다. 기본 바이오센서 구조의 ON/OFF를 사용하여 모든 변이체 ON/OFF 값을 산점도로 플로팅하여 기본 수준 이상의 활성을 나타내는 변이를 결정합니다.
   참고: 프로토콜에 사용된 초기 바이오센서 구조의 ON/OFF는 야생형 서열²³의 초기 특성화에 기초하여 3.6배로 결정되었습니다.
3. 심층적인 특성화를 위해 분석 소프트웨어를 사용하여 EC50 및/또는 Hill 기울기 값을 추출하기 위해 가변 기울기가 있는 Hill 함수를 사용하여 선량-반응 데이터를 적합시킵니다.
   참고: 민감도 및 EC₅₀을 추정하려면 반응이 낮은 활성화에서 높은 활성화로 전환되는 범위(일반적으로 곡선의 가장 가파른 부분)에 걸쳐 최소 4개의 데이터 포인트를 수집합니다. 데이터 포인트가 많을수록 해상도와 정확도가 향상되지만 감도 순위를 추정하려면 4포인트면 충분합니다.
4. 전체 변형 세트에서 원하는 순위(이 경우 EC₅₀)의 균형 잡힌 적용 범위를 보장하는 변형의 하위 집합(예: N = 100)을 선택합니다. 이를 위해 EC₅₀에서 광범위한 범위에 걸쳐 있는 변종을 식별하여 순위가 높은 변종과 순위가 낮은 변종이 비례적으로 대표되도록 합니다. 중복된 변형(예: 순위가 비슷하고 배포 범위에 미치는 영향이 최소화된 변형)을 제거합니다.
5. 최종 변형 샘플 라이브러리(예: N = 100)를 선택한 후 다음 선형 로그(lin-log) 변환 방정식(식 1)을 사용하여 데이터를 변환합니다.
   방정식 1:
   
   어디
   
   
   
6. EC50 값의 경우 가장 높은(가장 민감도가 낮음) 값에 +1을 할당하고 가장 낮음(가장 민감함)에 -1을 할당합니다. 기하학적 평균인 0은 중간 발현 수준에 해당합니다.

5. 최종 스크리닝 설계 생성/DoE

1. 바이오센서 설계 공간을 체계적으로 탐색하려면 DSD(Definitive Screening Design)를 사용하십시오. 이 설계는 특정 시스템 요구 사항에 맞게 연구를 조정하면서 설계 공간을 효율적으로 탐색할 수 있는 능력 때문에 선호됩니다.
2. DOE 범주를 클릭한 다음 통계 소프트웨어에서 최종 스크리닝 설계 버튼을 선택합니다(보충 파일 2 참조).
3. 실험 요인(예: RBS_trans , P_reg , RBS_out 및 P_out)을 연속 변수로 정의하고 연 속 버튼을 클릭하고 이름을 지정하고 값을 +1 및 -1로 설정하도록 합니다( 보충 파일 3 참조).
4. 응답 추가 버튼을 클릭하고 이름을 사용자 정의하여 원하는 응답(예: ON , OFF , ON/OFF , EC50 , Slope)을 정의합니다(보충 파일 4 참조).
   참고: 목표 드롭다운을 클릭하고 설계 목표(예: 탐색 대 최적화)에 따라 없음 또는 최대화 를 선택하여 응답의 목표를 설정합니다.
5. 요인과 반응이 정의되면 계속 을 클릭하여 설계 옵션 탭을 엽니다. 블록 필요 없음을 선택한 다음 디자인 만들기 버튼을 클릭합니다( 보충 파일 5 참조).
   참고: 성가신 요소(주요 관심사가 아닌 요소)로부터 디자인을 격리하기 위해 블록을 추가할 수 있습니다. 이로 인해 실험이 복잡해질 수 있습니다. 그러나 연구자의 재량에 따라 사용됩니다.
6. 소프트웨어는 테스트할 요소의 특정 조합을 설명하는 실험 설계 테이블을 생성합니다. 해당 lin-log 변환된 라이브러리의 유전적 부분은 해당 17개의 구성을 생성하는 데 사용됩니다. 테이블 만들기 를 클릭하여 설계 테이블을 저장하고 내보냅니다( 보충 파일 6 참조).

6. 2단계 반복 - DoE 정보 유전자 설계의 설계 및 조립

1. DSD(Definitive Screening Design) 계획에 따라 다변량 플라스미드 구성을 시작합니다.
   1. 초기 변수(예: 프로모터, RBS 등)를 식별합니다. 발현 벡터를 선형화하기 위해 프라이머를 설계 및 주문하고, 프라이머가 표적 가변 영역 측면에 있는지 확인하여 기존 서열 요소를 제거합니다.
   2. 각 조절 노드(P_out P_reg RBS_out RBS_trans)에 대해 사전 정의된 라이브러리 수준(예: -1, 0, +1)에 해당하는 변이 서열을 특이적으로 증폭하는 프라이머를 설계하고 주문합니다. 각 프라이머에 발현 벡터 삽입 부위와 상보적인 30bp 상동성 암이 포함되어 있는지 확인합니다.
   3. miniprep 을 통해 식별된 변수에 대한 +1, 0 및 -1 라이브러리 수준에 해당하는 관련 cryo-stock 배양에서 플라스미드 DNA를 정제합니다.
2. 얼음 위에 선형화된 발현 벡터 및 라이브러리 단편에 대한 PCR 반응을 설정하고 2.1.1 및 2.1.2단계에 설명된 대로 산물의 농도를 결정합니다.
   1. 프로토콜의 2.3 내지 2.4단계를 반복하여 선형화된 발현 벡터 및 라이브러리 단편의 Gibson 어셈블리를 수행합니다. 이 단계에서 표준 크기의 페트리 접시를 사용해야 합니다.
   2. 제안된 각 DSD 설계에 대한 올바른 구성 어셈블리를 확인하기 위해 Sanger 시퀀싱을 사용하여 콜로니를 스크리닝한 다음 P. putida 의 형질전환을 진행합니다(단계 2.5 - 2.6).
   3. PCR을 사용하여 형질전환된 콜로니에 올바른 플라스미드가 존재하는지 확인합니다. 확인된 형질전환체를 선택하고 30°C에서 18시간(180rpm) 동안 하룻밤 성장을 위해 항생제가 보충된 LB 10mL에 접종합니다. 극저온 스톡(25% 글리세롤 파이널)을 만들고 -80°C에서 보관합니다.

7. 심사 및 데이터 합리화

1. 극저온 스톡에서 관련 DSD 설계 구조로 형질전환된 P. putida 를 항생제가 보충된 LB 한천에 줄무늬로 만들고 30°C에서 밤새 18시간 동안 배양하여 콜로니를 성장시킵니다.
   1. 제안된 DSD 설계에 해당하는 각 플레이트에서 3개의 단일 콜로니를 선택하고 30°C에서 항생제가 보충된 LB 배지 10mL에서 18시간 동안 밤새 배양합니다.
   2. 다음날, 행당 0mM에서 1mM(최종 농도) 범위의 이펙터 농도 구배를 웰당 총 부피 50μL로 DWB를 로드합니다. 하룻밤 배양액을 신선한 LB로 1/100 희석하고 농도 구배에 걸쳐 DWB에 450μL의 배양액을 첨가합니다.
   3. 3.3.14 및 3.3.16단계를 수동으로 반복하여 성장한 DWB를 얻은 다음 3.3.18, 3.3.20단계로 건너뛰고 수동으로 수행합니다. 및 3.3.21. 제안된 각 변형에 대한 RFU/OD 데이터를 얻습니다.
2. Hill 함수(가변 기울기 포함)를 사용하여 선량 반응(RFU/OD) 데이터를 적합시켜 EC₅₀, 언덕 기울기, 동적 범위 또는 작동 범위와 같은 최적화를 위한 적절한 매개변수(요인)를 추출합니다. 결과 데이터를 log10으로 변환하고 추출된 매개변수를 테스트된 각 설계에 대한 DSD 테이블에 입력합니다.
   1. 바이오센서 성능에 영향을 미치는 중요한 요인을 식별하기 위해 2단계 스크리닝 분석을 수행합니다. Lenth의 t-비율 및 반정규 그림 분석^{23, 30} 을 사용하여 예상 분포에서 벗어나는 요인을 결정하고 모형에 유지합니다. 유전의 영향을 유지하여 상호 작용에서만 중요한 모든 요인도 개별적으로 포함되도록 합니다.
   2. 식별된 유의미한 요인만 통합하여 각 반응 변수에 대해 독립적으로 표준 최소 제곱 회귀(SLSR) 모델링(^SLSR ) 모델링을 수행합니다. 잔차 그림, 적합성 부족 검정 및 R² 값을 포함한 회귀 모델 진단을 평가하여 적절한 데이터 적합을 보장합니다.
   3. 반응 프로파일러를 사용하여 원하는 바이오센서 특성을 기반으로 최적의 요인 설정을 결정합니다. 각 반응에 대한 목적 함수(예: 동적 범위 최대화 및 EC₅₀ 최소화)를 정의하여 시스템 제약 조건과 절충안을 고려하면서 모든 반응에서 최상의 균형을 달성하는 요인 설정을 생성합니다.
3. 변이 라이브러리로 돌아가서 프로토콜의 6.1-6.2단계에 따라 반응 프로파일러에서 제안한 모듈에 따라 최적화된 바이오센서를 구성합니다. 용량-반응 특성화 를 통해 최적화된 구조의 성능을 검증합니다.

Results

처음에는 바이오센서 기능에 영향을 미치는 것으로 생각되는 모듈을 변형에 대해 선택해야 합니다. 여기에는 리간드의 세포 내 농도와 바이오센서 출력에 영향을 미칠 수 있는 수송 단백질의 조절이 포함될 수 있을 뿐만 아니라 aTF 자체의 상대적 전사 및 번역 수준과 형광 리포터 또는 출력 유전자도 포함됩니다(그림 1). 그림 2 는 바이오센서 최적화를 위한 DoE 기반 실험 개발에 사용되는 일반적인 워크플로를 보여줍니다. 특히 운영자 부위, 헥스박스 또는 RBS의 서열 수준에서의 변화를 통해 합성 생물학 을 통해 조작할 수 있는 개별 모듈로 조절 요소를 구성하는 것부터 시작합니다(그림 2A). 따라서 DoE 워크플로의 다음 단계는 변이체 라이브러리를 생성하기 위해 서열 부위를 무작위화하는 것입니다(그림 2B). 스크리닝된 콜로니의 수는 무작위화 정도 4^N에 따라 조정되어야 하며, 여기서 N은 무작위화된 기본 위치의 수와 같으므로 무작위화 정도를 신중하게 고려해야 합니다. 각각의 고유한 프로모터 또는 RBS 서열을 DoE에서 고유한 범주형 변수로 취급하는 것은 라이브러리의 특성화를 통해 연속 변수로의 변환이 무작위화를 통해 획득된 기능의 범위를 측정하고 상위, 중간, 그리고 기능의 하한. 이것은 먼저 리포터 유전자를 통한 RBS 또는 프로모터 변이체의 강도를 측정하는 라이브러리의 출력 분석을 통해 달성됩니다(그림 2C). 그림과 같이 lin-log 변환을 수행하여 연속 변수를 DoE에서 다양한 조합을 탐색하고 이러한 변형의 효과를 설명하는 모델을 개발하는 데 사용할 수 있는 수준으로 이산화합니다. 그런 다음 각 요인에 대한 활동 범위를 조합 방식으로 설명하는 3가지 수준을 사용하여 스크리닝 설계를 구현합니다(그림 2D). 제안된 설계의 조립 및 테스트를 통해 실험 공간을 효율적으로 탐색하고 요인 간의 상호 작용을 밝힙니다. 결과 데이터의 통계 분석을 사용하여 바이오센서 출력에 가장 중요한 영향을 미치는 요인 조합을 결정하고, SLSR은 다양한 기준에서 시스템의 동작을 예측하는 데 사용되며, 동적 범위 또는 감도 증가와 같은 특정 결과에 대한 바이오센서의 최적화를 용이하게 합니다(그림 2D).

그림 3 aTF 조절 프로모터 라이브러리의 조립 및 스크리닝을 보여줍니다. 퇴행성 올리고뉴클레오티드를 사용한 등온 조립을 수행하여 플라스미드 암호화 라이브러리를 생성했으며, 이에 따라 각 플라스미드는 특정 위치에서 고유하게 무작위화됩니다. 라이브러리 다양성의 정도에 따라 궁극적으로 스크리닝할 콜로니의 수가 결정되며, 이론적 라이브러리 크기가 클수록 자동화의 이점을 크게 누릴 수 있습니다. TphR에 대한 상동 오페론의 프로모터 서열 분석은 무작위화 위치, 특히 어느 정도의 변이를 나타내므로 절대적으로 필수적이지 않은 활동을 조절할 수 있는 염기를 알리는 데 사용되는 염기 보존 지도를 제공했습니다²³. -35 및 -10 육각 상자 각각의 3개 염기가 시술자 부위의 6개 염기 외에 완전한 무작위화를 대상으로 했습니다(그림 3A), 이론적 프로모터 라이브러리는 ~500,000입니다. 플라스미드 라이브러리는 이후 숙주 균주를 형질전환하는 데 사용되었습니다. 이 단계에서는 다음과 같은 일반적인 문제 해결 접근 방식을 통해 충분한 라이브러리 범위를 얻기 위해 우수한 변환 효율성이 중요합니다. 그림 3B. DNA 농도, 형질전환 방법 및 클로닝 설계의 최적화는 형질전환체 수율을 크게 향상시킬 수 있습니다. 그림 3C 형질전환체를 얻을 때 고유한 변이체에 해당하는 개별 콜로니는 특성화 작업을 시작하기 전에 먼저 배지에서 성장해야 하는 일반적인 워크플로를 보여줍니다. 이론적인 라이브러리 크기를 커버하려면 방대한 수의 변형을 선택하고 플레이트에 배열해야 합니다. 액체 처리기 및 콜로니 피커와 같은 자동화 시스템을 활용하면 이 노동 집약적인 단계를 간단히 줄일 수 있습니다. 1단계 그림 3C 액체 핸들러 도크에 수동으로 적재된 MTP로 성장 배지를 옮긴 다음 콜로니 피커에 의한 자동 접종을 보여줍니다. 플레이트를 밀봉하고 오프라인 인큐베이터로 옮기는 것과 같은 일부 단계는 수동이지만 원하는 경우 자동화할 수도 있습니다. 배양의 성장에 따라 액체 처리기를 사용하여 다음과 같이 글리세롤을 첨가하여 극저온 스톡을 생성할 수도 있습니다. 그림 3C. 이 단계에서 플레이트의 바코드를 통해 선택된 모든 변형이 특정 플레이트 및 웰 위치에 연결되므로 추가 다운스트림 특성 분석을 위해 쉽게 참조할 수 있습니다. 자동화된 접근 방식의 주요 장점 중 하나는 노동력 절감 외에도 인적 오류가 줄어들고 라이브러리 준비 단계의 실수가 이월될 가능성이 적다는 것입니다. 2단계 그림 3C 라이브러리 준비의 자동화된 특성화 단계를 보여줍니다. 이것이 시작됩니다. via 액체 처리기 플랫폼을 사용하여 DWB에 배지를 채운 다음 바코드가 있는 극저온 재고를 사용하여 접종합니다. 이 단계의 자동화를 통해 피펫팅 오류와 노동력이 최소화됩니다. 그런 다음 플레이트를 밀봉하고 성장을 위해 오프라인 인큐베이터로 수동으로 옮기며, 이 시점에서 이펙터 화합물을 신선한 딥 웰 플레이트로 배열할 수 있습니다. 부품 라이브러리의 초기 스크린을 위해, 기본 구성체와 같거나 더 나쁜 활성을 나타내는 비기능적 변형을 사전 스크리닝하고 향상된 활성을 나타내는 변형 풀을 강화하는 데 사용할 수 있기 때문에 간단한 ON/OFF 스크린이 바람직할 수 있습니다. 이는 대규모 라이브러리 스크리닝 프로토콜에서 금지될 수 있는 팁 및 플레이트의 재료 비용을 줄이는 추가 이점이 있습니다. 그러나 보다 복잡한 바이오센서 성능 지표의 최적화가 필요한 경우(예: EC₅₀), 추가 이펙터 농도가 필요합니다. 배양액의 성장에 따라 플레이트는 액체 처리기 플랫폼으로 반환되며, 리퀴드 핸들러 플랫폼은 이펙터 화합물을 포함하는 플레이트에 접종을 시작한 후 분석 기간 동안 수동으로 다시 한 번 인큐베이터로 되돌립니다. 그림 3D 데이터 수집 전 최종 자동화 단계를 보여줍니다. 성장 및 바이오센서 활성화를 위한 경과 기간이 지나면 플레이트는 오프라인 인큐베이터에서 제거되어 액체 처리기 플랫폼으로 반환됩니다. 형광 데이터 수집을 방해할 수 있는 잔류 성장 배지를 제거하려면 원심분리, 상청액 제거 및 1x PBS로 세포를 세척해야 합니다. 액체 처리기를 사용하면 배양의 자동 재현탁을 통해 스크리닝을 위해 세척된 세포를 96웰 형식 MTP로 옮기는 것을 포함하여 플레이트의 신속한 처리가 가능해짐으로써 이 과정을 다시 간단하게 만들 수 있습니다. 데이터 수집은 수동 또는 자동 방식으로 수행할 수 있으며, 일부 리더기에는 데이터 수집 프로세스를 더욱 자동화하기 위해 액체 처리기와 인터페이스할 수 있는 플레이트 스택이 있습니다. 이펙터(ON)의 존재와 부재(OFF)에서 바이오센서 활성화의 비율을 비교함으로써 바이오센서 기능을 결정하기 위해 바이오센서 활성화 정도(배수 변화)를 사용하여 5,000개의 변이체를 평가했습니다. 산점도(그림 3D). 농축된 변이 풀의 플레이트 및 웰 위치를 기반으로 워크플로우의 1단계에서 생성된 원래 바코드 크라이오 스톡 플레이트를 다시 참조하여 생물학적 복제 또는 다양한 이펙터 농도를 사용하여 강력한 특성화를 수행할 수 있습니다.

그림 4 는 감도를 최적화하기 위한 프로모터 라이브러리 개발을 목표로 하는 초기 라이브러리 스크리닝에서 분류된 변이체의 스크리닝을 보여줍니다. 이전 워크플로에서 스크리닝된 5,000개 변이체의 데이터를 사용하여 부모 서열보다 더 활성인 것으로 결정된 초기 ON/OFF 화면에서 분류된 226개 변이체 풀을 추가로 특성화하고 민감도에 따라 순위를 매겨 DSD를 설계할 수 있는 수준으로 작용했습니다. 첫 번째 단계로 범주형 변수(이 경우 P_out top 변형)를 넓은 민감도 범위에 걸쳐 있는 연속 변수로 변환해야 합니다. 민감도를 스크리닝하려면 플로팅된 Hill 함수에서 EC₅₀ 데이터를 얻기 위해 용량 반응 곡선이 필요합니다. 이는 도금 작업을 극적으로 증가시키고 그림 4A와 같이 분석 설정 및 스크리닝 프로세스를 단순화하기 위해 액체 처리기를 사용하는 자동화에 매우 적합합니다. 그림 3C의 2단계에서 확립된 워크플로우에 따라, 농축된 변이체 풀에 해당하는 플레이트 바코드 및 웰 위치를 사용하여 성장 배지 및 항생제로 채워진 DWB를 접종했습니다. 실험적 견고성을 향상시키기 위해 변이를 생물학적 삼중으로 스크리닝했습니다. 플레이트를 오프라인 인큐베이터로 옮겨 성장시킨 후, 신선한 DWB는 노동력을 줄이기 위해 액체 처리기를 사용하여 0, 1, 25 및 1000μM 이펙터 보충 성장 배지로 채웠습니다. 분석에 필요한 플레이트 수를 줄이기 위해 곡선의 하단, 중간 및 상단을 포함하는 농도 범위를 선택했으며, 중간 지점 농도는 그림 4A에 설명된 바와 같이 각 변이체의 상대적 민감도를 나타냅니다. 각 이펙터 농도에서 변이 풀을 접종하고 형광 및 OD₆₀₀을 분석한 후, EC₅₀을 결정하기 위해 비선형 회귀 분석을 사용하여 용량 반응 곡선을 플롯했습니다. 이 단계에서 고유한 EC₅₀ 값을 가진 각 변이체의 원시 라이브러리가 생성되었으며, 라이브러리 크기를 더욱 줄이기 위해 그림 4B 와 같이 가장 강력한 상위 100개 변이체가 진행되었습니다. 그러나 이 라이브러리를 DoE에서 사용하려면 먼저 고유한 변형을 포함된 민감도 범위를 나타내는 순위 라이브러리로 변환해야 합니다. 이는 각 변형이 가장 민감한(-1)에서 가장 덜 민감한(+1)으로 순위가 매겨지도록 데이터의 순위를 매기고 크기를 조정하고 데이터 세트의 기하 평균을 나타내는 중간점 값(0)을 정의하는 데이터의 lin-log 변환을 수행하여 달성되었습니다. 그림 4C. 원시 데이터의 변환은 그림 4D에 표시된 파란색 플롯을 생성했으며, 여기에서 +1, 0 및 -1에 해당하는 개별 P_out 서열이 P_out 요인 수준으로 최종 스크리닝 설계로 전달되었습니다.

그림 5 DSD 생성에서 모델링 및 DoE 지원 학습을 기반으로 하는 바이오센서의 글로벌 최적화에 이르기까지 라이브러리 생성 후 전체 워크플로를 보여줍니다. 그림 5A 일반적인 바이오센서를 1개(운송 및 조절기 모듈) 또는 2개(출력 모듈) 조절 노드가 있는 3개의 모듈로 분류하는 기능을 제공합니다. 의 예를 따라 그림 4, RBS 또는 프로모터 라이브러리가 개발되고 각 요인의 가장 큰 변형을 포함하도록 +1, 0 및 -1 범위의 수준이 선택됩니다. 스크리닝된 라이브러리의 크기는 일반적으로 설계 공간을 완전히 탐색하는 데 필요한 실험 수를 결정하며, 예를 들어 각 라이브러리의 크기가 22인 경우 이는 22와 같습니다⁴ (234,256) 조합. DoE는 구조화된 스크리닝 설계를 통해 조합 수를 줄여 실험 작업량을 단순화하는 것을 목표로 합니다. 많은 방법론이 가능하지만 DSD는 혼란스러운 2차 효과를 피하면서 주요 요인과 2요인 상호 작용을 식별할 수 있으므로 바이오센서 개발에 이상적입니다. 또한 DSD 설계는 3단계를 활용하므로 곡률(비선형성)을 추정할 수 있습니다. 그림 5A 4개의 모듈 각각이 서로 다른 레벨로 설정된 일반적인 DSD 출력을 보여줍니다. 각 수준은 특정 프로모터 또는 RBS 변이체에 해당하므로 등온 어셈블리는 DSD의 권장 설계에 해당하는 유전적 구조를 생성하는 데 사용됩니다. 권장 구조로 숙주 균주를 조립하고 변형한 후, 각 구조의 성능에 대한 더 많은 확신을 제공하기 위해 전체 범위의 이펙터 농도를 사용하여 용량 반응 곡선을 얻습니다 그림 5B. DSD는 구조의 수를 크게 줄이기 때문에 이 단계는 종종 손으로 수행하거나 원하는 경우 자동화된 액체 처리기를 사용하여 수행할 수 있습니다. 그림 5C DSD 화면에서 제안된 조합을 구성 및 테스트하고 Hill 계수(n_H) 및 EC₅₀ 테스트된 각 조합의 출력입니다. 실험의 목적은 두 가지 모두에 대해 전 세계적으로 최적화된 바이오센서 구조를 개발하는 것이었습니다._H 및 EC₅₀ 두 매개변수를 모두 최대화하기 위해 4개의 조절 노드의 발현을 조절합니다. 각 조절 인자는 lin-log 변환된 프로모터 및 RBS 파트 라이브러리(-1 - +1)에 해당하는 x축을 따라 표시된 발현 정도와 함께 자체 열에 표시됩니다. 두 EC에서 노드의 표현식을 변경하는 효과₅₀ 및 n_H 는 서브플롯의 곡선으로 표시됩니다. 프로파일 플롯은 바이오센서 최적화의 종종 직관적이지 않은 특성을 강조하며, 이에 따라 하나의 조절 노드의 조정이 출력 매개변수에 반대 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, RBS_트랜스 n과 강한 상관관계가 없는 것으로 나타났습니다._H,_{그러나 EC와 양의 상관관계가 있습니다.50} 비선형 방식으로. RBS의 경우 고차(비선형) 상호 작용도 암시됩니다_아웃 강도가 증가하면 기울기가 증가합니다(N_H) 감도의 증가와 함께 (낮은 EC₅₀), 그 결과 더 디지털 기울기와 증가하는 이펙터 농도에 대한 더 날카로운 반응을 가진 곡선이 생성됩니다. 이러한 모델에서 바이오센서 튜닝의 직관적이지 않은 측면을 보다 명확하게 렌더링할 수 있으므로 글로벌 최적으로 조절 노드를 최적화할 수 있습니다. 모델은 두 EC에 대한 글로벌 최적을 예측하는 데 사용되었습니다.₅₀ 및 n_H , 플롯의 빨간색 선은 각 조절 노드의 최적 수준(그림 5C). 그림 5D 최고 성능의 DSD 설계(녹색) 및 전 세계적으로 최적화된 구성(라일락)과 비교하여 초기 부모 바이오센서 구조(파란색)의 용량-반응 프로파일을 보여줍니다. 모델을 사용하여 EC를 극대화하기 위한 이상적인 모듈 강도 예측₅₀ 및 n_H, RBS에 해당하는 변형_트랜스 (-1), P_등록 (-0.7), P_아웃 (-0.3) 및 RBS_아웃 (+1) 강도를 조립하고 EC의 향상을 보여주는 최적화된 구조로 특성화했습니다.₅₀ 및 n_H (그림 5D). DSD와 전 세계적으로 최적화된 바이오센서 모두 유사한 EC를 표시합니다.₅₀ (0.8 대 0.7 μM), n_H EC를 손상시키지 않고 크게 개선되었습니다.₅₀ 이미 달성된 이득. 결과는 직관 기반 접근 방식에 비해 데이터 기반 설계의 이점을 명확하게 보여주며 바이오센서 튜닝 프로세스를 간소화하고 단순화하는 수단으로서 DoE를 검증하는 데 도움이 됩니다.

그림 1: 유전적으로 인코딩된 바이오센서 매개변수의 조정. aTF, 운영자 부위(OS), 헥스박스(-35, -10) 및 RBS 구성 요소를 포함하여 유전적으로 암호화된 바이오센서의 유전자 모듈 레이아웃. 컬러 상자는 리간드-aTF 친화성(회색), aTF-연산자(분홍색), RNAP-Hexbox(녹색) 및 RBS(주황색)와 같은 바이오센서 매개변수에 일반적으로 영향을 미치는 상호 작용에 해당합니다. 용량-반응 특성에 대한 각 매개변수의 영향은 대표 그래프 내에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 일반적인 DoE 바이오센서 최적화 워크플로우 개요. (A) 표적 이펙터를 가져오기 위해 수송 단백질을 암호화하는 수송 모듈, aTF와 관련된 조절자 모듈 및 sfGFP와 같은 리포터 단백질을 암호화하는 출력 모듈을 보여주는 바이오센서 구성 요소의 모듈화에 대한 개요. 또한 RBS_trans, P_reg, P_out 및 RBS out과 같은 조절 노드가 표시되며_, 이는 바이오센서 매개변수를 탐색하기 위해 무작위화될 유전적 노드에 해당합니다. (B) 프로모터 및 RBS를 포함하여 염기 무작위화가 가능한 서열 요소의 선택'. 프로모터의 부모 서열은 맨 윗줄에 표시되며, 최종 돌연변이 서열은 아래와 같이 표시되며, 별은 변경되지 않은 염기를 나타내는 반면, K, M 및 N은 각각 구아닌/티민, 아데닌/시토신 또는 임의의 뉴클레오티드를 나타냅니다. 프로모터는 헥스박스 또는 운영자 부위를 표적으로 삼아 더 큰 무작위화 가능성을 제공하며 서열의 복제 또는 간격 수정도 포함할 수 있습니다. RBS 라이브러리는 더 제한된 무작위화 옵션을 제공하지만 최대 다양성이 작기 때문에 스크리닝하기가 훨씬 쉽습니다. (C) 변이체의 발현 수준을 특성화한 다음 순위가 매겨진 lin-log 라이브러리로 변환하여 범주형 변이 요인을 DoE 를 통한 분석에 더 적합한 3개의 개별 수준으로 변환합니다. (D) 실험 공간의 매핑은 각 모듈의 세 가지 수준의 다중화된 조합을 사용하여 수행되어 바이오센서 성능을 원하는 결과(동적 범위 또는 감도)에 맞게 조정하기 위한 설계 선택을 알리는 데 사용할 수 있는 모델을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 바이오센서 모듈화, 프로모터 라이브러리 구축 및 자동화된 워크플로우. (A) aTF 프로모터에서 특정 서열의 무작위화 및 등온 어셈블리 를 통해 바이오센서 구조에 삽입하는 예. 굵은 글자는 퇴행성 올리고뉴클레오티드 합성 중에 제공된 키에 따라 운영자 사이트 또는 육각형에서 무작위화된 위치를 나타냅니다. (B) 생성된 바이오센서 변이 라이브러리의 대 장균 과 같은 클로닝 숙주로의 형질전환 및 형질전환체 수율에 따른 다음 단계를 설명하는 패널. 변환 효율이 낮으면 이론적 라이브러리 적용 범위가 낮고 설계 공간에 대한 탐색이 부적절할 수 있습니다. 이 단계에서의 문제 해결은 일반적인 문제 해결 조치가 요약되어 있는 변형의 상당 부분을 특성화에 사용할 수 있도록 하는 데 필수적입니다. (C) 프로토콜에 설명된 대로 1단계와 2단계의 워크플로우로, 빨간색 손 기호는 수동 단계를 나타내고 톱니바퀴는 자동 단계를 나타냅니다. 1단계 워크플로는 콜로니 선택에서 냉동 스톡 생성에 이르기까지 프로토콜의 주요 단계를 강조합니다. 2단계 워크플로는 용량 반응 곡선에 의한 분석을 위한 극저온 스톡의 부활 및 재배열을 보여줍니다. (D) 형광 및 OD를 측정하기 전에 세포 세척 및 분석 플레이트로 옮기는 것을 포함하여 스크리닝 전 최종 절차를 시연하는 패널. 5000개의 스크리닝된 변이 풀이 패널에 표시되며, 주황색 상자에 강조 표시된 부모 프로모터 서열(3.6배)을 초과하는 ON/OFF를 나타내는 변이체가 표시됩니다. 많은 변이가 1 주위에 모여 있는 것을 볼 수 있으며, 이는 기능 상실을 유발하는 서열 수준에서의 무작위화로 인해 성능이 좋지 않고 가변성이 낮음을 나타냅니다. 플롯에 상자로 표시된 226개의 변이체는 강력한 특성화를 위해 앞으로 나아갔습니다. 데이터는 Alvarez Gonzalez et^{al 23}의 원본 간행물에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 프로모터 라이브러리 상위 변이체 스크리닝 및 lin-log 변환 을 통한 이산화. (A) RBS 또는 프로모터 라이브러리에 대한 발현 데이터를 생성하기 위한 표준 절차의 개요. 적절한 범위의 발현 수준을 나타내는 분류된 변이체를 사용하여 액체 처리기는 분류된 226개 변이체의 용량 반응 곡선을 도출하기 위해 미리 결정된 농도의 이펙터로 미리 채워진 분석 플레이트를 생성하는 데 사용됩니다. (B) EC₅₀ 결정 및 특성화된 라이브러리를 100개 변이체로 추가로 축소한 후, 데이터는 프로모터 무작위화에서 생성된 다양한 민감도의 혼합을 보여주는 막대 차트로 표시됩니다. (다)EC₅₀ 데이터는 lin-log 속도 방정식을 사용하여 변환되어 연속 데이터 세트를 DSD의 인수분해에 더 적합한 범주형 데이터 세트로 변환합니다. (D) 변환된 EC₅₀ 변이 데이터는 이제 단순화된 척도로 축소되고 높은 EC 50 활성에서 낮은 EC₅₀ 활성으로 순위가 매겨진 것으로 표시됩니다. 여기에서 상단(+1) 기하학적 평균(0) 및 하단(-1) 변형에 해당하는 3개의 수준이 선택되고 실험 공간을 탐색하기 위해 DSD로 전달됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: DSD 실험 설계, 테스트 및 모델 기반 학습 결과. (A) RBS_trans, P_reg, P_{out 및 RBSout} 모듈의 lin-log 변환 순위 라이브러리를 기반으로 DSD 설계 테이블 생성을 보여주는 개략적 워크플로. DSD 설계 테이블은 실험 공간을 효율적으로 매핑하기 위해 가장 적은 수의 조합을 제안합니다. +1, 0 및 -1은 lin-log 변환에 의해 설명된 대로 각 규제 노드에 대한 상단, 중간 및 하단 수행 변형을 참조하는 예제 출력이 제공됩니다. 이들은 등온 조립을 통해 구성되고 특성화를 위해 발현 숙주로 변환되기 전에 시퀀싱에 의해 확인됩니다. (B) 형질전환 후, 세포를 성장시키고 광범위한 이펙터 농도에 대해 분석하고, 형광 출력을 측정하여 용량-반응 곡선을 생성합니다. nH 및 EC50과 같은 다양한 매개변수가 용량-반응 곡선에서 추출되어 DSD에 공급되어 각 요인에 대한 예측 모델을 생성합니다. (C) 모델을 사용하여 모든 조절 모듈의 발현 수준을 변경하여 하나의 바이오센서 매개변수를 조절하는 데 미치는 영향을 예측할 수 있습니다. 중요한 것은 조절 노드의 전역 튜닝이 가능해져서 각 서브플롯에서 빨간색 점선으로 표시된 하나 이상의 바이오센서 매개변수를 동시에 최대화할 수 있다는 것입니다. (D) 최대 감도를 향해 모델을 최적화하면 전역적으로 최적화된 구조(라일락)가 생성되며, 그 용량 반응 곡선은 최고 성능의 DSD 구조(녹색) 및 부모 바이오센서 구조(파란색)에 대해 표시됩니다. 추출된 n_{, H} 및 EC₅₀ 매개변수가 플롯 아래에 표시되어 최고 성능의 DSD 구성 이상으로 두 매개변수의 개선을 보여주고 DSD에서 생성된 예측 모델의 효능을 검증합니다. 데이터는 Alvarez Gonzalez et^{al 23}의 원본 간행물에서 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 바이오센서 라이브러리 준비 및 분석 설정에 사용되는 자동화된 액체 취급 프로토콜 단계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2에서 보충 그림 6: DSD(Definitive Screening Design)의 단계별 생성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

광범위한 유전적 가변성을 포괄하는 유전적 요소 라이브러리는 DoE 기반 방법론의 성공에 매우 중요합니다. 그림 2A에서 알 수 있듯이, 이론적 변이의 수는 돌연변이 유발의 표적이 될 위치의 수와 무작위화 정도에 따라 증가하며, 이러한 계속 증가하는 라이브러리 크기는 상당한 스크리닝 병목 현상을 야기합니다. 표적 위치의 수 또는 무작위화 정도를 줄이면 스크리닝해야 하는 변이의 수를 줄일 수 있으며 튜닝에 대한 보다 표적화된 접근 방식이 필요하거나 시스템에 대한 중요한 선 험적 지식이 가이드로 존재하는 경우 매력적인 접근 방식입니다. 그러나 중복되는 특징이 많거나 잘 특성화된 유전적 요소가 없을 수 있는 바이오센서와 같은 시스템의 경우 라이브러리 크기 요구 사항을 우회하기 어렵습니다. 자동화된 액체 처리기를 사용하면 특히 ON/OFF와 같은 두 데이터 포인트 비교기와 같은 용량 반응 곡선과 같은 고급 기능을 플로팅하기 위해 데이터 포인트 수집을 늘려야 하는 경우 콜로니 피킹 및 변종 배양의 노동력을 사소하게 줄일 수 있습니다. 자동화된 워크플로를 포함하여 절약된 시간을 구체적으로 정량화하기는 어렵지만, 구현의 주요 이점은 다른 병렬 실험에 할애할 수 있는 시간에 있습니다.³⁸.

그럼에도 불구하고 라이브러리 크기가 10⁴을 초과하는 많은 경우 액체 처리기 지원 방법론조차도 비실용적이 됩니다³⁹. 이러한 경우, 유세포 분석기를 사용한 변이체의 예비 스크리닝은 h⁴⁰당 최대 10⁷ 세포의 훨씬 더 큰 분류 용량을 가진 매우 매력적인 접근 방식입니다. 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 2라운드의 양성 선택 및 적어도 한 라운드의 음성 선택과 함께 사용하여 보다 광범위한 특성화 16,26,42 전에 바이오센서의 최고 성능 변이체의 분류에 일상적으로 사용되었습니다. FACS를 활용한 이러한 프로토콜의 개발 및 실행은 다른 곳에서 자세히 검토되었습니다³¹. 초기 분류 스크린은 위 프로토콜에 설명된 대로 플레이트 기반 액체 처리기 분석을 사용하여 가능합니다. 그림 3D와 같이 단일 이펙터 농도를 사용하여 ON/OFF 데이터를 비교하면 상당한 기능 이득(방법에 제공된 3.6배)을 가진 변형 바이오센서만 선택하여 더 자세한 특성화를 위해 라이브러리 개발 및 실험 실행 시간을 간소화할 수 있습니다. 그러나 FACS와 액체 처리기 플랫폼 모두 실험실에 상당한 자본 투자가 필요하며 운영 및 유지 관리에 일정 수준의 기술 전문 지식이 필요한 경우가 많습니다. 한천 플레이트 기반 스크리닝은 진입에 대한 더 낮은 기술적, 재정적 장벽을 제공하며, 형광 강도에 따라 효소 돌연변이뿐만 아니라 RBS 라이브러리 변이체를 선택하기 위해 gfp 또는 청백색 콜로니 스크리닝과 함께 사용되었습니다^43,44. 그러나 이들 역시 효과적으로 스크리닝할 수 있는 변이체의 수가 제한되어 있지만, 검출 가능하기 위해서는 형광의 상당한 차이가 필요합니다⁴⁴. 한 번에 여러 요소의 완전한 조합 동시 돌연변이 사이의 절충안으로서, "분할 정복" 방법론은 대신 큰 변이 라이브러리를 보다 관리하기 쉬운 스크리닝 블록으로 분할하는 것을 목표로 합니다⁴¹. 모듈화된 접근 방식은 실용적일 수 있지만, 생물학적 구성 요소의 성능은 특히 전사 및 번역 결합이 널리 퍼져 있는 박테리아에서 상황에 따라 매우 의존하는 것으로 알려져 있기 때문에 조합 설계 공간을 효과적으로 탐색하지는 않습니다. 이로 인해 전역 최적 대신 로컬 최대값을 대상으로 하는 설계 선택이 발생할 가능성이 있습니다.

특정 유도제의 수송 및 인식은 설명된 프로토콜의 주요 초점이 아님에도 불구하고 언급할 가치가 있는 바이오센서 개발의 또 다른 중요한 특징을 나타냅니다. 표적 분자에 대한 적절한 aTF가 부족하다는 것은 연구자에게 중요한 과제입니다. 표적 이펙터의 구조적 유사체에 결합하는 기존 aTF의 합리적인 선택은 aTF의 특이성을 원하는 이펙터⁽¹⁷)에 조정하기 위해 코돈 무작위화를 적용할 이상적인 템플릿을 제공할 수 있다. 해결된 구조 또는 알파폴드 예측에 대한 표적 서열의 정렬은 프로토콜¹⁷에 적응할 수 있는 반합리성 무작위화 및 순위 지정을 거친 의심되는 아미노산 잔기를 갖는 이펙터 결합 부위의 식별을 가능하게 할 수 있습니다. 유사하게, 이펙터의 수입/수출을 담당하는 수송체의 선택 및 조절은 바이오센서 용량 반응 특성을 크게 변경할 수 있습니다. 수송체 유전자 발현은 바이오센서 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, P_tac 프로모터 및 RBS의 다양한 라이브러리는 여러 라운드의 FACS에서 발현을 안정화하는 데 사용되는 MucK 수송체의 발현을 제어하여 바이오센서 반응의 견고성을 향상시킵니다¹⁷. 유사하게, 상이한 수송체 단백질 자체의 스크리닝은 PCA 반응성 바이오센서를 사용하여 추정되는 PcaK 수송체 세트의 스크리닝을 통해 3,5-수산화 기질을 흡수할 수 있는 두 개의 수송체를 식별하여 해당 시스템에 의해 검출 가능한 화합물 세트를 확장함으로써 바이오센서의 특이성을 조절할 수 있습니다²⁴.

자동화된 플랫폼은 DoE 원리를 딥 러닝 모델과 결합할 때 특성화 및 탐색을 위한 훨씬 더 강력한 도구가 될 수 있습니다^46,47. 처리량이 많은 플랫폼을 사용하여 바이오센서의 설계 공간을 처음 탐색한 후, 기계 학습 알고리즘을 활용하여 특성화되지 않은 서열의 기능을 우수한 정확도로 예측했습니다 ⁴⁷. 이 프로토콜에 설명된 방법은 교차 RBS 서열 예측을 기반으로 개발된 모델과 유사하게 프로모터 설계를 위한 새로운 언어 학습 모델의 테스트에 쉽게 적용될 수 있습니다⁴⁸. 또한 이러한 모델의 통합은 비기능적 프로모터 설계에 포함된 서열 기능 데이터를 활용하고 바이오센서 전체의 광범위한 기능에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 즉, 이는 DoE 워크플로의 중요한 한계, 즉 비기능적 프로모터와 같은 오탐이 반드시 측정된 출력이 0과 동일하지 않다는 점을 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며, 가짜 전사 또는 식별 및 제어가 어려운 DoE 데이터에 노이즈 요소를 도입하는 것과 같은 현상이 있습니다. 결정적으로, 전체 실험 설계 공간을 포괄하기 위해, 생성된 모든 라이브러리는 광범위한 활동을 나타내야 하는데, 이는 활동 범위가 충분하지 않으면 설계 출력이 왜곡되고 데이터 세트⁽³⁰)에서 생성된 모든 통계 모델에서 신뢰성이 떨어지기 때문입니다. 낮은 라이브러리 가변성이 문제가 되는 경우 다른 서열 요소를 탐색하거나 무작위화 정도를 높이는 것을 구현할 수 있으며 적절한 변이 풀을 얻을 때까지 라이브러리 간의 변동을 비교할 수 있습니다.

DoE 프로세스의 중요한 측면에는 DSD에서 얻은 1차 및 2차 효과를 정확하게 추정하고 선택한 다음 통계 분석에 통합하는 것이 포함됩니다. 모델링 기반 접근 방식인 DoE는 과적합 및 편향이 발생하기 매우 쉬우며, 이는 반복적인 엔지니어링 노력을 설계 공간의 차선책 섹션으로 안내함으로써 최적화 프로세스를 빠르게 복잡하게 만들 수 있습니다⁴⁹. 따라서 모든 설계가 구상 단계와 데이터 분석 단계 모두에서 이러한 영향으로부터 견고하게 격리되도록 하는 것이 중요합니다. 초기 스크리닝 설계 단계에서 모든 요인이 기하 평균(즉, 0,0,0,0)으로 설정된 중심 실행은 상당한 실험 부담(1-3회 추가 실행)을 추가하지 않으면서 비선형 상호 작용을 더 잘 설명하여 모델 편향을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다(1-3회 추가 실행)⁴⁹. 또한 무작위 설계를 포함하면 실험 설계에 포함되지 않았지만 여전히 측정 중인 반응 변수에 영향을 미칠 수 있는 외부 변수를 설명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 생물학적 맥락에서 무작위화는 플레이트 위치와 같은 시공간 효과 또는 배치 간 변동과 같은 문제를 해결하여 이러한 효과가 데이터 해석에 큰 영향을 미치는 것을 방지합니다. 이 초기 단계에서 이러한 세부 사항에 주의를 기울이면 모델의 견고성을 향상시키고 보다 신뢰할 수 있는 결론을 도출할 수 있습니다. DSD가 제안한 실험을 수행한 후 출력 매개변수에 상당한 영향을 미친 요인을 밝히기 위해 데이터의 통계 분석이 필요합니다. 반정규 플롯은 효과 크기를 직관적으로 시각적으로 표현하며, 유의성이 없는 효과는 일반적으로 직선을 따라 떨어지는 반면, 상당한 영향이 있는 효과는 이 선에서 벗어나 바이오센서 최적화에서 가장 중요한 요소를 간단하게 선택할 수 있습니다. 이를 염두에 두고 모델 과적합의 위험을 줄이기 위해 모든 모델링과 마찬가지로 효과 선택에 대한 보수적인 접근 방식을 취해야 합니다.

바이오센서 및 기타 유전자 회로를 신속하게 설계하고 최적화할 수 있는 능력은 균주 및 효소 개발뿐만 아니라 실시간 진단과 같은 생명공학 분야의 연구 속도를 크게 가속화할 것입니다. 이 분야에서 DoE 기반 스크리닝 방법론의 출현은 특히 유망하며, 가능한 최대 설계 공간을 탐색하면서 시간과 자원의 효율적인 사용을 촉진하며 대사 경로 및 바이오센서에 대한 유전자 회로의 최적화에 이미 큰 효과를 거두었습니다 31,33,34,51. DoE는 많은 1차, 2차 또는 3차 상호 작용이 작동하는 다요인 최적화 문제에 특히 적합하며, 그렇지 않으면 한 번에 하나의 요인으로 일반적인 실험 설계 접근 방식으로 조사하기 어렵습니다. 또한, 바이오센서의 한 측면을 설계하려는 노력은 종종 동적 범위⁽⁵¹)를 희생하면서 감도를 향상시키는 것과 같은 다른 매개변수의 희생을 의도치 않게 초래한다. 이러한 숨겨진 상호 작용을 매핑하고 바이오센서 동작을 예측하는 모델을 생성하는 DoE의 기능을 통해 빌드 테스트 학습 주기가 크게 가속화됩니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1000 & 마이크로; L CO-RE 팁, 멸균 비필터	해밀턴	235939
2.2 mL 96 딥웰 플레이트, V자형 바닥이 있는 정사각형 웰	열	11594754
300 & 마이크로; L CO-RE Tips, 적층형 NTR, 멸균	해밀턴	235985
96개의 투명한 바닥, 검은색 마이크로타이터 플레이트	그라이너	655097
아가로스	인비트로젠	16500100
조립된 플라스미드 DNA	사용자 제공	NA
ClarioStar Plus 마이크로플레이트 리더	BMG	NA
덱시누클로에타이드(dNTP) 용액 혼합	NEB	N0447엘
디메틸 설폭사이드(DMSO)	피셔 바이오리젠트	BP231-100
DNA 사다리 100bp	NEB	N3231L
DNA 사다리 1KB	NEB	N3232L
DNA 시퀀싱	출처 바이오사이언스	NA
DNA 합성	IDT	NA
대장균 DH5&알파; 권능 세포	NEB	C2987H
젤 로딩 염료, 보라색 x6 SDS 없음	NEB	B7025S
유전자 펄서/마이크로펄서 전기천공 큐벳, 0.2cm 간격	바이오라드	1652082
그래프 패드 프리즘 10	그래프패드	NA
해밀턴 스타 리퀴드 핸들러	해밀턴	NA
HT 멀티트론 플레이트 셰이커 인큐베이터	인포어 HT	NA
JMP 통계 분석 제품군	JMP	NA
LB 육수(밀러)	밀러	L3522
한천 를 곁들인 LB 국물(밀러);	시그마	L3147
MicroPulser 전기천공기	바이오라드	1652100
NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스	NEB	E2621S
Q5 고충실도 DNA 중합효소	NEB	M0491S
QIAprep 스핀 미디프렙 키트	키아겐	12143
QIAprep 스핀 미니프렙 키트	키아겐	27104
QIAquick 젤 추출 키트	키아겐	28706X4
QIAquick PCR 정제 키트	키아겐	28104
Qpix 420 콜로니 피커	Molecular Devices 영국	NA
SOC 성장 매체	NEB	B9020S
SYBR Safe DNA 젤 염색	인비트로젠	S33102
TAE 완충액(트리스-아세테이트-EDTA, 50X)	써모 피셔	나49
UltraPureTM Dnase/Rnase-Free 증류수	인비트로젠	10977015