살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

G 단백질 결합 수용체(GPCR)는 막관통 수용체의 가장 큰 슈퍼패밀리를 나타내며, 세포외 자극을 세포내 신호 전달 캐스케이드로 형질도입하여 특정 생물학적 반응을 일으키는 역할을 합니다. 이는 시판 약물의 약 30%가 GPCR에 작용하는 중추적인 약리학적 표적입니다¹. GPCR 리간드 결합은 수용체의 형태 변화를 유도하여 이종삼량체 G 단백질 및/또는 GPCR 키나아제(GRK) 및 β-아레스틴과의 상호작용을 촉진하여 다운스트림 신호 전달 또는 수용체 내재화를 시작합니다².

이종 삼량체 G 단백질은 GPCR 신호 전달의 주요 세포내 변환기 역할을 하며 G_α, G_β 및 G_γ의 세 가지 하위 단위로 구성됩니다. 이러한 헤테로삼량체는 G_α 아형을 기반으로 G_i/o, G_s, G_q 및 G_12/13의 4가지 계열로 분류되며, 각 계열은 고유한 신호 전달 경로를 활성화합니다: G_i/o 아형은 아데닐레이트 시클라아제를 억제하는 반면 G_s는 이를 자극하고, G_q는 포스포리파제 C-β를 활성화하고, G_12/13은 Rho 계열 GTPase를 조절합니다.

GPCR 활성화는 구조적 재배열로 이어져 초 미만의 동역학 내에서 빠른 G 단백질 결합을 가능하게 합니다. 이 과정은 G 단백질 형태 변화를 유도하여 G_α 서브유닛에서 GDP-GTP 교환을 촉진합니다. GTP 결합은 G_α 서브유닛 형태를 추가로 변경하여 G_βγ 이량체에서 해리되어 신호 전파를 허용합니다. 따라서 G 단백질은 아데닐레이트 시클라제 또는 이온 채널과 같은 다양한 이펙터 단백질을 조절함으로써 세포 반응의 특이성과 시간적 역학을 조절하는 데 중요합니다 ^3,4,5.

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 GPCR 리간드 자극 시 생물발광 공명 에너지 전달(BRET) 기반 바이오센서를 사용하여 G 단백질 활성화 또는 불활성화의 측정을 간략하게 설명합니다. G 단백질 바이오센서 ^6,7,8,9에 대한 선구적인 작업에서 영감을 받은 G-CASE(G 단백질 트리시스트로닉 활성 센서) 시스템은 Schihada et ^al.10에 의해 도입되었으며 표지된 G_α와 G_βγ 서브유닛 사이의 BRET를 기반으로 하며 단일 플라스미드 형질감염만 필요로 하는 간소화된 접근 방식을 제공합니다. 이 기능은 이종삼량체 G 단백질의 세 가지 서브유닛(G_α, G_β 및 G_γ)을 코딩하는 여러 플라스미드의 공동 형질감염과 관련된 문제를 향상시키고 완화합니다. 이 센서는 학술 연구 그룹에서 상업적으로 사용할 수 있습니다( 재료 표 참조).

BRET는 FRET(Förster Resonance Energy Transfer)에 비해 상당한 이점을 제공합니다. BRIT에서는 외부 광원 없이 생물발광 공여체와 형광 수용체 사이에서 에너지 전달이 발생합니다. 이 고유 생물 발광은 자가형광 및 광 산란과 같은 FRET와 관련된 문제를 줄여 배경 신호를 낮추고 분석 감도를 향상시킵니다 ^6,7,11.

BRET에 외부 여기가 없기 때문에 광표백 및 광독성 효과가 최소화되어 FRET에 비해 배경 신호가 낮아집니다. 결과적으로, BRET 분석은 대부분 향상된 감도를 나타내므로 구성 활성 GPCR의 G 단백질 활성화를 측정할 수 있습니다. BRET 분석의 향상된 감도는 미묘한 생물학적 상호 작용의 검출을 용이하게 하며, 이는 수용체 활성의 정확한 측정이 중요한 약리학적 연구에서 특히 유용합니다.

이러한 바이오센서는 칸나비노이드 수용체 CB1R 및 CB2R의 활성을 분석하기 위해 멤브레인 기반 384웰 분석에서 이러한 바이오센서를 사용하는 방법이 개발된 Scott-Dennis et al.에 의해 최근에 입증된 바와 같이 96웰 또는 384웰 플레이트에서 고처리량 스크리닝으로 변환될 수 있습니다¹². 이 기사에서는_Gs 단백질과 클래스 A GPCR에 속하는 CB1R에 결합하고 G_i/o 패밀리 단백질을 활성화하는 클래스 A 프로토타입 GPCR로서 β2-AR의 활성을 측정하여 살아있는 세포의 96웰 플레이트에서 이러한 바이오센서의 사용에 대해 설명합니다. 두 개의 G-CASE 바이오센서의 사용이 검증되었습니다: GPCR이 일시적으로(β2-AR 사용) 또는 안정적으로 발현된(CB1R 사용) 있는 HEK 293T 세포에서 G_s 및 G_i3 .

이 실험은 다양한 세포주에서 수행될 수 있으며, 이는 다양한 세포 맥락에서 이 기술의 다양성과 견고성을 입증한다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이를 통해 이 방법을 다양한 실험 모델에 적용할 수 있으므로 다양한 생리학적 및 약리학적 환경에서 GPCR 신호 전달을 연구하는 데 유용한 도구가 됩니다. 그림 1 은 BRET 기반 G 단백질 활성 센서의 원리를 보여줍니다.

그림 1: BRET 기반 G 단백질 활성 센서의 원리. G 단백질 센서는 G_α, 천연 G_β 및 G_γ의 세 가지 하위 단위로 구성됩니다. G_α 서브유닛은 작고 밝은 나노루시페라제(Nluc)에 융합되는 반면, G_γ 서브유닛은 원형으로 순열된 금성(cpVenus¹⁷³)으로 N-말단으로 표지됩니다. 이러한 조작된 G 단백질 서브유닛을 암호화하는 유전자는 단일 플라스미드로 결합됩니다. GPCR에 대한 리간드 결합은 GPCR 구조 변화를 유도하여 G 단백질 모집 및 후속 해리에 이어 GTP 가수분해를 촉진합니다. 이러한 해리는 파트너 간의 에너지 전달을 방해하여 BRET 신호를 감소시킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

본 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 웰 플레이트 파종(1일차)

참고: 멸균 상태를 유지하기 위해 멸균 층류 후드의 모든 세포 배양 프로토콜을 따르십시오. 투명하고 평평한 바닥이 있는 흰색 웰 플레이트는 세포 성장과 생존력을 추적하는 데 사용됩니다. 3.2.1단계에서 스티커를 사용하지 않도록 전체 흰색 웰 플레이트를 사용하십시오.

1. 웰 플레이트 코팅
   알림: 사전 코팅된 플레이트를 사용하여 이 단계를 우회할 수 있습니다.
   1. 약 6mL의 멸균 여과 폴리-L-라이신(PLL) 용액(0.01%)을 다채널 저장소에 붓습니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 96 화이트웰 마이크로플레이트의 각 웰을 60μL의 PLL로 채웁니다.
   2. 마이크로플레이트를 어두운 곳에 놓고 20분 동안 배양합니다.
   3. 배양하는 동안, 단계 1.2.1-1.2.3에 설명된 대로 세포의 준비를 진행한다.
   4. 다중 채널 피펫으로 PLL 용액을 흡인하고 15mL 튜브에 4°C에서 보관합니다.
   5. 세포 분해를 유발할 수 있는 유리 PLL을 제거하기 위해 DPBS로 플레이트를 세 번 세척합니다.
2. 세포 준비 및 도금
   1. 5% CO₂에서 37°C에서 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 Dulbecco의 변형 Eagle 배지에서 HEK293 세포를 배양합니다.
      참고: FBS는 적절한 세포 생존력에 필요한 영양소와 성장 인자를 제공하기 위해 배양 배지에 첨가됩니다.
   2. 배지를 제거하고 2mL의 DPBS로 세포를 헹굽니다.
   3. 0.5mL의 트립신을 첨가하고 세포를 분리하기 위해 37°C에서 3-5분 동안 배양합니다.
   4. 플라스크에 DMEM 4.5mL를 첨가하여 트립신을 중화시킨 다음 위아래로 반복적으로 피펫팅하여 세포를 분리하고 재현탁합니다.
   5. 분리된 세포를 15mL 튜브로 옮기고 1000 x g(실온, RT)에서 5분 동안 원심분리합니다.
   6. 상청액을 제거하고 펠릿을 2mL의 DMEM에 재현탁합니다.
   7. Malassez 계수 챔버로 세포를 계수하고 300,000 cells/mL에서 9mL를 준비합니다. 이를 다중 채널 저장소에 넣고 다중 채널 피펫(최종 밀도 30,000 세포/웰)으로 웰당 100μL를 부어 96웰 마이크로플레이트를 시드합니다.
   8. 마이크로플레이트 à 37°C, 5% CO₂ 에서 약 24시간 동안 배양합니다.
      참고: 세포는 효율적인 형질감염을 위해 약 70%-80% 합류에 도달해야 합니다.

2. 플라스미드 형질감염(2일차)

참고: 세포 형질감염은 도금 전 부유 세포에 대해 1일차, 1.2.7단계 동안 수행하고 3일차에 데이터 수집을 수행할 수 있습니다.

1. 원하는 플라스미드 DNA 10μg(예: HEK wt 세포에서 β2-아드레날린성 수용체 5μg 및 G_s(short)-CASE 5μg 또는 HEK CB1 세포에서 G_i3-CASE 10μg만) 및 500μL의 Opti-MEM 배지가 들어 있는 튜브에 20μL Lipofectamine을 희석합니다. RT에서 5분 동안 배양합니다.
   1. 음성 대조군의 경우, β2-아드레날린성 수용체를 동일한 농도의 빈 플라스미드 pcDNA 3.1로 대체합니다. 용액을 하나의 튜브에 결합하고 혼합하여 형질감염 혼합물(1mL)을 얻습니다.
2. 형질감염 혼합물을 RT에서 20분 동안 배양합니다.
3. 2.2단계의 형질감염 혼합물 10μL를 각 웰에 적가하고 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 완전한 혼합을 보장합니다.
   참고: 웰당 100ng의 최종 농도를 얻습니다.
4. 마이크로플레이트를 37°C, 5% CO₂ 의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.

3. 데이터 수집(3일차)

1. 리간드 준비
   참고: 행크의 균형 소금 용액(HBSS) 완충액: NaCl 140 mM, 염화칼륨 5 mM, 염화칼슘 1 mM, 황산마그네슘 칠수화물 0.4 mM, 염화마그네슘 육수화물 0.5 mM, 인산나트륨 이염기성 이수화물 0.3 mM, 인산칼륨 일염기성 0.4 mM, D-포도당(포도당) 6 mM, 중탄산나트륨 4 mM, pH 7.4, 여과 0.22 μm.
   1. 상이한 리간드에 대한 적절한 가용화 용매에서 가능한 최고 농도로 원액을 준비합니다(이 프로토콜에서 이소프로테레놀은 H₂0 mQ 및 DMSO에서 WIN-55.212-2로 제조됨).
      참고: 리간드 원액의 농도는 리간드의 용해도와 알려진 해리 상수(K_d)에 따라 조정해야 합니다.
   2. 이 스톡에서 적절한 가용화 용매에서 리간드의 K_d 주위에 10μL의 리간드 연속 희석액을 준비합니다. 이 연속 희석액을 -20°C에서 보관하십시오.
      참고: 리간드에 따라 연속 희석 범위는 분해가 발생하기 전에 최대 10회까지 동결 및 해동될 수 있습니다. 비히클 조건(이 프로토콜에서는 H₂0 또는 DMSO)을 포함하기 위해 리간드 용해에 사용되는 용매만을 포함하는 용액을 준비합니다.
   3. 각 리간드 농도 및 비히클에 대해 총 부피 130μL에 각 농도 1.3μL를 첨가하여 HBSS에서 1/100 희석을 수행합니다. 그 결과 HBSS에서 1% 비히클의 최종 농도가 됩니다.
      참고: 이 최종 희석 범위는 웰당 총 부피 100μL를 얻기 위해 10μL를 추가하여 실험에 사용되는 범위입니다. 그 결과 모든 우물에서 0.1% 비히클의 최종 농도가 됩니다. 130μL 부피는 96웰 플레이트의 한 줄을 채우는 데 필요한 양((10 x 12) ± 10%에 해당합니다. 각 행은 서로 다른 리간드 농도에 해당하며 마지막 행은 비히클 컨트롤 역할을 합니다.
   4. 원액에서 980μL의 Furimazine 1/100 희석액을 준비합니다(총 부피 980μL를 얻기 위해 HBSS 970.2μL에 9.8μL).
      참고: 푸리마진의 신선한 용액을 준비하고 최소 3분 동안 배양합니다. 그런 다음 획득 직전에 추가합니다. 신호의 반감기는 실온에서 약 120분이므로 너무 일찍 준비해서는 안 됩니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 비바진 및 엔두라진과 같은 지속형 푸리마진 유도체를 사용할 수 있습니다. 이 기판은 최대 48시간 동안 안정적인 BRET 신호를 유지합니다.
2. 플레이트 판독값
   알림: 다중 모드 플레이트 리더를 사용하십시오. 연구된 조건과 반복 횟수에 맞게 측정값을 조정합니다. 여기서 데이터 획득은 32개의 웰에 해당하는 4개의 열로 구성된 3개의 판독값으로 나뉩니다. 모든 판독은 완충액 증발을 방지하기 위해 투명한 뚜껑이 있는 상단 광학 장치로 수행됩니다. 모든 판독 전에 측정 이득을 조정하십시오. 이 연구에서 이득은 3600으로 고정되었습니다. 많은 플레이트 리더에서 사용할 수 있는 자동 주사기 또는 주사기 시스템을 사용하여 수동 리간드 추가를 피할 수 있습니다.
   1. 96웰 플레이트의 처음 4개 컬럼에서 배지를 제거합니다. 각 웰을 100μL의 HBSS로 헹구고 80μL의 HBSS를 추가합니다. 접시 밑면에 흰색 스티커를 붙입니다. 이는 형광 및/또는 생물발광 측정을 개선합니다.
   2. G 단백질 발광 스펙트럼 기록: 96웰 플레이트를 플레이트 리더에 삽입합니다. 535/30nm 단색기를 사용하여 cpVenus¹⁷³ 방출을 기록하고 2nm 분해능으로 500에서 600nm 사이의 발광 방출을 측정합니다.
      참고: 이 기록은 cpVenus¹⁷³ 여기 시 형광이 방출되도록 하기 위한 대조군입니다.
   3. G 단백질 발광 스펙트럼 기록: 450/40nm 단색기를 사용하여 Nluc 방출 강도를 기록하고 5nm 분해능으로 400nm에서 600nm 사이의 발광 방출을 측정합니다.
      참고: 이 기록은 Nluc 기질인 furimazine을 추가하기 전에 생물 발광이 방출되지 않도록 하기 위한 대조군입니다.
   4. 플레이트 리더에서 플레이트를 제거하고 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 이전에 준비된 푸리마진 용액 10μL(단계 3.1.4.)를 추가합니다.
   5. 3.2.3단계를 반복합니다.
      참고: 이 기록은 푸리마진 첨가 시 생물발광이 방출되도록 하기 위한 대조군입니다. 이 측정 후 3.2.6단계를 직접 진행하여 푸리마진 소비 및/또는 분해로 인한 신호 변화를 방지합니다. BRET 신호 변화는 후리마진 소비 및/또는 분해 및 작용제 자극에 의해 유도된 반응을 종료하기 위해 발생하는 조절 과정으로 인해 발생할 수 있습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 GRK 억제제(CMPD101) 및 내재화 억제제(dynasore) 또는 GRK 또는 아레스틴이 없는 유전자 편집 세포를 사용할 수 있습니다.
   6. G 단백질 기저 BRET 기록: GPCR 리간드를 추가하기 전에 각각 450/40nm 및 535/30nm 단색기를 사용하여 Nluc 및 cpVenus¹⁷³ 방출 강도를 기록합니다. 0.30초의 측정 간격 시간(총 판독 시간 3분)으로 60초의 3주기를 측정합니다.
      참고: 측정 간격 시간을 0.90초로 늘리면 일반적으로 신호 대 잡음비가 크게 향상되지만 판독 시간이 훨씬 길어집니다. 실험자는 더 높은 시간 분해능 또는 향상된 신호 대 잡음비 중 어느 것이 응용 분야에 더 중요한지 결정해야 합니다.
   7. 플레이트 리더에서 플레이트를 제거하고 다중 채널 피펫을 사용하여 한 컬럼의 각 웰에 이전에 준비된 GPCR 리간드의 희석 범위(단계 3.1)의 10μL를 각각 추가합니다. 다른 3개의 열에 대해 동일한 절차를 따릅니다.
   8. G 단백질 리간드 유도 BRET 기록: 각각 450/40nm 및 535/30nm 단색기를 사용하여 Nluc 및 cpVenus¹⁷³ 방출 강도를 기록합니다. 0.30초의 측정 간격 시간(총 판독 시간 16분)으로 60초의 16주기를 측정합니다.
      참고: 열의 웰을 측정하도록 측정 매개변수를 설정합니다. 복제본은 2.4초의 시차로 읽힙니다.
   9. 3.2단계를 반복합니다. 다음 4개의 열에 대해 2회.

4. 데이터 분석

참고: 각 판독값의 데이터를 별도의 데이터 스프레드시트 파일로 수집합니다.

1. 제어 판독값
   1. 파장에 대한 방출 강도를 플로팅합니다.
2. 기본 BRET 판독값
   1. 각 웰에 대해 세 판독의 BRET 비율을 계산합니다. BRET 비율은 수용체 방출/기증자 방출로 정의됩니다.
      
   2. 각 웰에 대해 리간드 추가 전 세 가지 BRET 비율의 평균을 계산합니다. 이 값을 리간드 자극 전의 기본 BRET 비율이라고 합니다.
   3. 모든 웰의 이전 BRET 비율을 정규화하려면 세 가지 측정 각각에 대해 해당 측정 시간에 BRET 비율에서 차량 제어 우물에서 계산된 BRET 비율 값을 각각 뺍니다.
      참고: 분석된 데이터는 리간드 추가 전의 시점에 해당합니다. 리간드가 첨가된 우물이 알려져 있기 때문에 그에 따라 차량 제어 우물을 식별할 수 있습니다.
3. G 단백질 리간드 유도 BRET 판독값
   1. 각 웰에 대해 섹션 4.2.1에 설명된 대로 각 판독의 BRET 비율을 계산합니다. 이러한 값을 Ratio_stim이라고 합니다.
   2. 리간드 유도 변화를 정량화하려면 각 웰의 각 비율_자극 에 대한 ΔBRET 를 기초에 대한 백분율로 계산합니다. 이를 위해 섹션 4.2.2에서 이전에 계산된 해당 비율_기본 을 사용하십시오.
      
   3. ΔBRET(%)를 계산하여 각 웰의 ΔBRET 값을 정규화합니다. 이를 위해 차량의 각 ΔBRET 값을 뺍니다.
   4. 데이터 스프레드시트에서 ΔBRET 동역학을 시각화하려면 4.2.3단계에서 정규화된 3개의 기본 BRET 판독값을 추가합니다. 섹션 4.3.3의 각 웰에 대해 계산된 해당 ΔBRET(%) 값 앞에.
   5. 읽기 시간에 대해 이전 데이터를 플로팅하여 운동 그래프를 얻습니다.
   6. 정체기에 도달하면 선택한 시간에 ΔBRET(%) 값을 가져와 각 웰이 서로 다른 리간드 농도에 해당하므로 사용된 리간드의 농도에 대해 플로팅합니다. 용량-반응 곡선을 얻습니다.
      참고: 정체기는 일반적으로 리간드 자극 후 약 5분에 도달합니다. 이 프로토콜에서는 15분 리간드 자극 후 얻은 값이 표시됩니다. 서로 다른 실험의 데이터를 비교하려면 활성화 동역학에 따라 시간을 조정하십시오.
   7. 분석 소프트웨어에서 이전 데이터를 플로팅하고 다음 방정식에 따라 시그모이드 용량-반응 3매개변수 적합을 사용하여 적합합니다.
      
      여기서 X는 사용된 리간드의 농도, Y는 ΔBRET(%) 값, 상단 및 하단은 고원을 나타내고, EC₅₀ 은 최대 효과의 50%에 도달하는 데 필요한 리간드 농도입니다. 이를 통해 E_max와 EC₅₀을 얻을 수 있습니다.
   8. 비모수 Mann-Whitney 테스트를 사용하여 제어 조건의 데이터를 비교합니다. 결과는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주됩니다.

그림 2: BRET 분석을 수행하기 위한 주요 단계. 이 프로토콜에 설명된 세 가지 주요 실험 단계(세포 파종, 세포 형질감염 및 BRET 신호 획득)에 대한 개요 및 데이터 수집을 위한 자세한 단계별 가이드. 실험 설정: 1일째, 세포는 30,000개의 세포/웰의 밀도로 평평하고 투명한 바닥이 있는 PLL로 사전 코팅된 흰색 96웰 플레이트에 파종됩니다. 2일째에 세포는 연구된 GPCR 또는 pcDNA3.1 플라스미드와 함께 선택된 G 단백질 센서로 형질감염됩니다. 24시간 배양 후, 리간드 첨가 시 생물발광 및 형광 판독값을 통해 G 단백질 센서 활성을 측정합니다. 데이터 수집: 세포의 HBSS 세척 후 80μL의 HBSS를 웰에 추가하고 535/30nm 단색기를 사용하여 500nm에서 600nm 사이에서 cpVenus¹⁷³ 형광 방출을 측정합니다 (1). 다음으로, Nluc 생물발광은 450/40nm 단색기를 사용하여 ( 2) 및 (3) 첨가 전후에 400nm에서 600nm 사이에서 측정됩니다. 마지막으로, 기저 및 리간드 유도 G 단백질 활성에 대한 BRET 신호는 각각 450/40nm 및 535/30nm 단색기를 사용하여 3분(0.30초의 측정 간격으로 60초의 3주기)( 4) 및 16분(0.30초의 측정 간격으로 60초의 16주기)에 걸쳐 측정됩니다 (5). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

실험 설정 및 실행의 일반화된 체계는 그림 2에 자세히 설명되어 있습니다. 2개의 GPCR의 리간드 활성화에 따른 Gs 또는 Gi/o 계열 단백질의 활성화는 G-CASE 바이오센서를 사용하여 평가되었습니다. 먼저, HEK 293T 세포에 일시적으로 형질감염된 β2-AR인 프로토타입 계열 A GPCR을 연구했습니다. Gs(short)-CASE 단백질 센서와 함께 β2-AR을 발현하는 HEK wt 세포에 작용제(즉, 이소프로테레놀)를 적용했을 때, BRET 신호의 농도 의존적 감소가 관찰되어 Gs 단백질의 활성화를 나타냅니다(그림 3B). ΔBRET 값은 포화에 도달할 때까지 리간드 농도에 따라 감소했으며, 리간드 자극 후 약 5분 후에 고원이 관찰되었습니다. 대조적으로, 빈 pcDNA3.1 플라스미드와 Gs(short)-CASE 단백질 센서로 형질감염된 HEK wt 세포는 이소프로테레놀 자극에 대해 역이지만 낮고 유의하지 않은 반응을 보였습니다(그림 3B). 이 프로토콜에서는 15분의 리간드 자극 후에 얻은 값이 표시됩니다. 결과의 일관성과 시간 선택과의 독립성을 보장하려면 다른 시점을 테스트하여 평형에 도달했는지 확인해야 합니다. 또한 서로 다른 실험의 결과를 비교하려면 각 실험의 활성화 동역학에 따라 시간 선택을 조정해야 합니다.

그림 3C에 표시된 S상 용량-반응 곡선을 생성하기 위해 자극 후 15분(고원이 안정화될 때)에 측정된 ΔBRET 값을 서로 다른 리간드 농도에 대해 플로팅했습니다. 관찰된 EC50(9.4nM ± 2.1nM)은 이소프로테레놀(13nM ± 6nM)13,14에 대한 수용체의 알려진 Kd의 범위 값에 있습니다(그림 3C,D). 이러한 결과는 β2-AR의 존재와 특히 관련된 관찰된 반응으로 G 단백질 활성화를 평가하는 G-CASE 센서의 효율성을 보여줍니다.

그림 3: HEK wt 세포에서 GS 단백질 센서 평가. GS 단백질 센서 및 β2-AR(A) 또는 pcDNA3.1(B)로 형질감염된 HEK wt 세포에 작용제 이소프로테레놀을 첨가했을 때의 동역학 ΔBRET 판독값. (C) 다양한 리간드 농도에서 15분 리간드 자극 후 ΔBRET(%) 값을 피팅하여 얻은 용량-반응 곡선. (D) 이소프로테레놀로 자극된 대조군 pcDNA3.1 및 β2-AR 형질감염 세포 사이의 ΔBRET 최대값 비교. pcDNA3.1 조건에 대한 통계적 차이는 비모수 Mann-Whitney 테스트(**p < 0.01)를 사용하여 테스트되었습니다. 데이터는 이중으로 수행된 세 가지 독립적인 실험의 평균 ± SEM을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

둘째, 바이오센서는 CB1R을 안정적으로 발현하는 HEK 293T 세포주인 HEK CB1 세포에서 테스트되었습니다. 이 세포는 Gi3-CASE 단백질 센서로 일시적으로 형질감염되었습니다. CB1R 작용제 WIN-55,212-2를 사용한 자극은 농도 의존성 ΔBRET 신호를 유도하여 Gi3 경로의 활성화를 나타냅니다(그림 4A). 대조적으로, Gi3-CASE 단백질 센서로 형질감염되고 동일한 조건에서 자극된 HEK wt 세포는 어떠한 반응도 나타내지 않아 CB1R 활성화의 특이성을 확인했습니다(그림 4B). 리간드 활성화 후 약 5분에 정체기에 도달했습니다. 해당 용량-반응 곡선은 HEK-CB1 세포에서 WIN-55,212-2 자극에 의해 유도된 농도 의존적 ΔBRET 반응을 강조한 반면, HEK wt 세포에서는 그러한 반응이 관찰되지 않았습니다(그림 4C). 관찰된 EC50 (112 nM ± 25 nM)은 WIN-55,212-2 (354 nM ± 62 nM)15에 대한 수용체의 알려진 EC50의 범위 값 내에 있습니다 (그림 4C, D). 마지막으로, HEK CB1에서 10μM의 WIN-55,212-2로 작용제 자극 시 15분 동안 얻은 ΔBRET 값의 비교 및 HEK wt 세포는 Gi3 신호 전달 경로의 CB1R 의존성 활성화를 보여줍니다(그림 4D).

그림 4: HEK CB1 세포에서 Gi3 단백질 센서 평가. 작용제 WIN-55,212-2를 HEK CB1(A) 또는 HEK wt 세포(B)에 첨가했을 때의 동역학 ΔBRET 판독값. 리간드 농도(C)에 대해 15분의 리간드 자극 후 ΔBRET(%) 값을 피팅하여 얻은 용량-반응 곡선. WIN-55.212-2(D)로 자극된 대조군 HEK wt와 HEK CB1 세포 간의 ΔBRET 최대값 비교. HEK wt 조건에 대한 통계적 차이는 비모수 Mann-Whitney 테스트(****p < 0.0001)를 사용하여 테스트되었습니다. 데이터는 이중± 수행된 5개의 독립적인 실험의 평균 SEM을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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