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방법 논문

유형 I 및 유형 II FLT3 억제제에 노출된 후 FLT3 돌연변이 발현 32D 세포에서 DNA 손상을 정량화하기 위한 혜성 분석

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/68469

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2025년 10월 17일

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1Department of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Department of Hematology, The Second Affiliated Hospital of Soochow University, 4Taizhou University Affiliated Municipal Hospital, School of Medicine, Taizhou University, 5National Clinical Research Center for Hematologic Diseases, Jiangsu Institute of Hematology, The First Affiliated Hospital of Soochow University, 6Department of Radiation Oncology, The Affiliated Hospital of Soochow University, 7Department of Medical Ultrasound, Suzhou TCM Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 혜성 분석의 적용을 통해 FLT3 돌연변이 세포에서 유형 I 및 유형 II 억제제에 의해 유도된 DNA 손상의 차이를 정량화하는 효과적인 방법을 설명합니다.

초록

클래스 III 수용체 티로신 키나아제인 FMS 유사 티로신 키나아제 3(FLT3)은 급성 골수성 백혈병(AML) 환자에서 약 30%의 돌연변이 빈도를 나타내며 중요한 치료 표적을 구성합니다. 대표적인 I형 및 II형 FLT3 억제제로서 각각 길테리티닙과 퀴자티닙(AC220)이 FLT3 돌연변이 AML 관리에 임상적으로 사용됩니다.

길테리티닙은 활성화된 FLT3 단백질과 비활성화된 FLT3 단백질을 모두 억제하고 AXL 표적을 추가로 억제하여 내성을 극복하는 데 도움을 줍니다. AC220은 활성화된 FLT3를 억제합니다. 혜성 분석은 돌연변이 세포에서 유형 I 대 유형 II FLT3 억제제에 의해 유도된 DNA 손상 패턴을 정량화하고 비교하기 위해 체계적으로 사용되었습니다. 실험 결과 AC220으로 인한 DNA 손상이 길테리티닙에 의한 DNA 손상보다 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 강력한 DNA 손상의 경우 FLT3 억제제를 DNA 손상 복구 억제제와 결합하여 DNA 복구 결함을 표적으로 삼을 수 있습니다. 결과는 DNA 손상 표적 약물의 합리적인 조합 전략에 대한 실험적 지원을 제공합니다.

서론

급성 골수성 백혈병(AML)은 미분화 골수성 전구세포의 병리학적 확장으로 정의되는 클론성 조혈모세포 장애를 나타내며, 이는 조혈 억제 및 골수 부전을 초래합니다. AML의 고유한 분자 이질성은 심각한 치료 문제를 야기합니다1. 특히 임상적으로 중요한 FMS 유사 티로신 키나아제 3(FLT3) 돌연변이는 AML에서 가장 널리 퍼진 유전적 변이 중 하나이며 사례의 약 30%에서 발생하며 불리한 임상 결과와 강한 상관관계를 보여줍니다2. FLT3 수용체 티로신 키나아제는 원형질막에서 활성화되어 PI3K/AKT 및 RAS/MAPK 신호 전달 캐스케이드를 매개하는 반면, FLT3-ITD 돌연변이 변이체는 소포체 내에 유지되어 지속적인 신호 변환기 및 전사 활성화제 5(STAT5) 인산화를 유도합니다. 이러한 유전적 변화는 주로 신호 전달 조절 장애, 제어되지 않은 증식 신호 전달 및 세포사멸 저항성을 통해 여러 발암 메커니즘을 통해 백혈병 발생을 유도합니다3.

전형적인 FLT3 억제제인 AC220과 길테리티닙은 FLT3 발현을 억제하여 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 유도하지만 작용 기전은 다릅니다. 길테리티닙(I형 억제제)은 더 넓은 스펙트럼의 FLT3 활성화 돌연변이를 포괄할 뿐만 아니라 FLT3와 밀접한 관련이 있는 AXL 티로신 키나아제도 억제합니다. 이중 억제를 통해 길테리티닙은 암세포의 성장을 보다 포괄적으로 차단할 수 있습니다4. AC220(II형 억제제)은 활성화된 키나아제 형태에 대한 경쟁적 결합을 통해 억제 효과를 발휘하며, 특히 높은 특이성으로 ATP 결합 포켓을 표적으로 합니다5. 이러한 억제는 세포 주기 정지 및 DNA 복제 스트레스 증가로 이어질 수 있습니다.

길테리티닙은 내성 위험이 낮으며 재발성/불응성 FLT3 돌연변이 AML의 단일 요법에 사용됩니다. AC220은 FLT3-ITD 돌연변이에 효과적이고 선택적이며 임상 반응률이 좋지만 FLT3-TKD 돌연변이에는 효과가 없으며 2차 FLT3-TKD 돌연변이(예: D835 또는 F691L)로 인해 FLT3-TKD 돌연변이에 내성이 있을 수 있습니다. 이러한 억제제는 입증된 임상 효능과 개선된 치료 지수를 기반으로 AML 치료제에서 두각을 나타내고 있습니다6. 그러나 이러한 약물의 임상적 사용은 후천적 내성 및 표적 이탈 효과로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 임상에서 AC220을 장기간 사용하면 FLT3-TKD 돌연변이로 인한 내성이 발생하는 반면, 길테리티닙의 장기간 사용은 FLT3-TKD 돌연변이로 인한 내성을 초래하지 않더라도 복합 돌연변이(예: TKD와 결합된 FLT3-ITD)에 대한 제한이 있을 수 있습니다 7,8.

이 두 종류의 FLT3 억제제는 FLT3의 억제와 증식성 신호 전달 경로(RAS-MAPK, PI3K-AKT-mTOR, STAT5 신호 전달)의 차단을 통해 복제 스트레스를 간접적으로 유도함으로써 이중 치료 효과를 발휘합니다. 세포 증식의 차단은 일반적으로 세포 주기 정지, 대사 장애(산화환원 항상성의 조절 장애) 및 궁극적으로 세포사멸로 이어집니다 9,10. 이 메커니즘은 궁극적으로 저항성 세포 집단에서 보상적 DNA 복구 적응을 활성화하는 DNA 병변을 생성합니다. 혜성 분석은 FLT3 돌연변이 세포에서 억제제 특이적 DNA 손상 프로파일을 정량적으로 비교할 수 있습니다. 이 실험적 접근 방식은 DNA 손상 취약성을 활용하여 후천적인 치료 저항성을 극복하는 합리적인 병용 요법을 개발하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

DNA 손상 검출을 위한 현대 방법론에는 면역조직화학적 분석, DNA 단편의 아가로스 겔 전기영동, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 차세대 시퀀싱(NGS)이 포함되며, 각각 높은 분석 감도와 특이성을 보여줍니다11. 그러나 이러한 접근 방식은 상당한 재정적 요구 사항, 장기간의 처리 기간 및 엄격한 실험 조건으로 인해 제약을 받습니다. 이는 분석 정밀도와 운영 단순성의 균형을 맞추는 탐지 전략을 채택하는 것이 필수적임을 강조합니다.

혜성 분석은 우수한 민감도, 기술적 접근성, 시각화된 DNA 손상 정량화 및 생물학적 시스템 전반에 걸친 광범위한 적용 가능성으로 인해 환경 독성학 및 유전독성 평가에 광범위하게 활용되었습니다12,13. 단일/이중 가닥 절단 검출을 위한 알칼리성 혜성 분석, 이중 가닥 절단 분석을 위한 중성 혜성 분석, 특정 DNA 병변 식별을 위한 효소 변형 혜성 분석의 세 가지 주요 방법론적 변형이 확립되었습니다. 14

방법론적 원리는 다음을 포함합니다: (1) 실험적 치료를 통한 DNA 가닥 중단; (2) 세포막 및 핵막의 용해 완충액 매개 용해로 세포질/핵 단백질 및 RNA가 전기영동 완충액으로 확산되는 반면, 고분자량 DNA는 아가로스 매트릭스에 고정된 상태로 유지됩니다. (3) 알칼리성 변성(pH > 13)은 손상된 DNA 단편의 DNA 풀림 및 해방을 유도합니다. (4) 구형 핵양 구조를 유지하는 온전한 DNA와 함께 특징적인 혜성 형태를 생성하는 단편화된 DNA의 전기영동 필드 구동 양극 이동15,16. DNA 손상 정량화는 꼬리 DNA 백분율(TDP)의 컴퓨터 분석을 통해 달성되며, 단일 세포 분해능에서 유전 독성 영향을 정확하게 측정할 수 있습니다17.

이 조사는 검증된 FLT3 돌연변이 32D 세포에서 길테리티닙과 AC220의 차등 유전독성 효과를 비교하기 위해 체계적인 실험 프레임워크를 사용했습니다. 실험 설계는 (i) FLT3 돌연변이 특이적 DNA 손상 모델의 확립 및 (ii) 알칼리성 혜성 분석 방법론을 통한 약물 유발 DNA 손상의 정량적 평가의 두 가지 주요 구성 요소로 구성되었습니다. FLT3 돌연변이 32D 세포주는 연속적으로 희석된 FLT3 억제제에 노출되기 전에 표준 시험관 내 조건에서 유지되었습니다. 세포 생존력은 CCK-8 분석을 사용하여 평가되었으며, 이후 비선형 회귀 분석을 통해 절반 최대 억제 농도(IC50) 값을 계산했습니다. 5배의 IC50 값이 DNA 손상 유도 임계값으로 선택되었습니다. 약물 처리된 세포를 수확하여 후속 분석을 위해 슬라이드의 저융점 아가로스에 포매했습니다. 전기영동 분리는 알칼리성 완충액에서 30분 동안 24V(~0.74V/cm) 및 300mA에서 수행되었으며, 그 동안 단편화된 DNA는 양극으로 이동하여 특징적인 혜성 형태를 형성하는 반면 온전한 DNA는 구형 핵형 구성을 유지했습니다. DNA 손상 정량화는 꼬리 모멘트를 측정하는 컴퓨터 이미지 분석 혜성 분석 소프트웨어 프로젝트(CASP)를 통해 달성되었으며, 증가된 올리브 꼬리 모멘트 값은 DNA 단편화 정도와 직접적인 상관관계가 있습니다.

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프로토콜

1. FLT3-ITD 돌연변이가 있는 32D 세포에서 DNA 손상 모델 구축 18

  1. 세포 회수
    1. 집게를 사용하여 냉동 보존된 FLT3-ITD 돌연변이 32D 세포(-80°C에서 보관)를 빠르게 옮깁니다. 집게를 사용하여 냉동 바이알을 회수하고 즉시 온도 조절 수조(37°C ± 0.5°C)에 정확히 60초 동안 담가 제어된 해동을 완료합니다.
      알림: 해동하는 동안 균일한 가열을 보장하기 위해 수조에서 냉동 바이알을 간헐적으로 흔듭니다.
    2. 동결 보존된 샘플을 150 × g 에서 25 °C ± 1 °C에서 5 분 동안 원심 분리합니다. 세포 펠릿을 유지하면서 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 상청액을 조심스럽게 흡인합니다.
    3. 완전 성장 배지 1mL(RPMI 1640 + 10% 소 태아 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신)를 냉동 보존 튜브에 추가합니다. 완전한 재현탁을 보장하기 위해 10회의 순차적 피펫팅 주기(1mL 부피)를 통해 부드러운 분쇄를 수행합니다. 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시로 옮기고 7mL의 완전 배지를 첨가하여 최종 부피 8mL를 달성합니다.
    4. 5번의 수평 및 5번의 회전 운동으로 배양 용기를 부드럽게 교반합니다. 5% CO2 및 95% 습도에서 37.0°C ± 0.2°C의 가습 인큐베이터에서 세포를 유지합니다. 실험 처리 전에 24시간 동안 배양합니다.
  2. 세포 생존력 평가
    1. 실험을 위해 양호한 세포 상태를 가진 로그 성장 단계의 FLT3-ITD 돌연변이 32D 세포를 선택합니다.
      참고: 로그 성장 단계의 세포는 일반적으로 분열 주기가 짧고 세포 분열 빈도가 높습니다.
      1. FLT3-ITD 돌연변이 32D 세포의 형태와 성장 상태를 전자현미경으로 관찰한다. 세포 증식 역치에 대한 기준이 충족되는지 확인: 가장자리가 매끄럽고, 분산이 균일하며, 응집체가 적고, 세포 크기가 균일하고, 원형질막 무결성이 온전하고, 세포 파편이 5%< 단일 소구 형태의 che 세포를 찾습니다.
    2. 세포 계수기를 사용하여 세포 현탁액의 농도를 결정합니다.
      참고: 세포 현탁액을 혼합합니다(최대 피펫 속도 50%에서 1mL 멸균 팁을 사용하여 10회 순차적 피펫팅 주기).
    3. 반복적 희석을 사용하여 완전 성장 배지에서 세포 현탁액을 2.0 × 105 cells/mL로 표준화합니다. 피펫을 사용하여 50μL 분취량을 96웰 평평한 바닥 플레이트의 중앙 웰(B2-G7)에 분배합니다. 주변 웰(A1-H12)에 100μL의 멸균 PBS를 채워 습도를 유지하고 가장자리 증발 효과를 최소화합니다.
    4. FLT3 억제제 함유 배지 준비: 12웰 세포 배양 플레이트에서 9개의 웰을 선택하고 FLT3 억제제 농도 사다리(0, 3.90625, 7.8125, 15.625, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000nM)에 따라 라벨링합니다. 10.0μM로 표지된 웰에 400μL의 완전 배지를 추가하고 나머지 웰에 200μL의 완전 배지를 추가합니다.
      1. 길테리티닙 희석액: 피펫 건을 사용하여 1000nM로 표지된 각 웰에 100μM 길테리티닙 시약(디메틸 설폭사이드의 길테리티닙) 4μL를 첨가하고 용액을 완전히 혼합합니다. 200μL의 1000nM 길테리티닙을 500nM으로 표지된 웰에 피펫팅하고 혼합합니다. 그런 다음 200μL의 500nM 길테리티닙을 250nM으로 표지된 웰에 피펫팅하고 혼합합니다. 매번 이전 희석액 200μL를 다음 웰에 넣고 원하는 농도를 얻을 수 있도록 혼합합니다.
      2. AC220 희석: 피펫 건을 사용하여 1000nM으로 표지된 각 웰에 100μM AC220 시약 4μL(디메틸 설폭사이드의 AC220)를 추가합니다. 다른 우물에 대해서는 1.2.4.1단계를 따릅니다.
        참고: 잔류 용액을 방지하기 위해 피펫의 FLT3 억제제 원액이 웰로 완전히 옮겨졌는지 확인하십시오. 희석을 진행하기 전에 용액이 잘 혼합되었는지 확인하십시오.
    5. 배양: 피펫을 사용하여 FLT3 억제제 함유 배지를 지정된 웰(50μL/웰)에 분배합니다. 96웰 플레이트를 생리학적 배양 조건(37.0°C ± 0.2°C, 5% CO2, 95% 습도)에서 정확히 72시간 ± 15분 동안 유지합니다.
    6. 피펫을 사용하여 CCK-8 시약 10μL를 모든 실험 및 블랭크 대조군 웰에 분취합니다. 플레이트를 빛으로부터 보호하고 정상 산소 조건(37°C, 5% CO2)에서 2.0시간 ± 10분 동안 배양합니다.
      참고: 기포 형성을 최소화하기 위해 팁 침지 깊이가 2mm인 낮은 피펫 속도로 시약을 분배합니다. OD 판독값과의 간섭을 방지하기 위해 샘플을 추가하는 동안 기포를 피하십시오.
    7. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다. 결과를 기록합니다.
    8. IC50 계산 공식에 따라 % 억제를 계산합니다.
      억제(%) = figure-protocol-1 × 100%
      약물 실험 우물은 약물로 처리된 세포 우물을 나타냅니다. 세포 제어 우물은 약물로 처리되지 않은 세포 우물을 나타냅니다. 빈 대조군 웰은 세포가 없는 배지만 나타냅니다.
    9. 4개의 매개변수 로지스틱 모델을 사용하여 비선형 회귀를 통해 정규화된 용량-반응 데이터를 분석합니다. 커브 피팅을 위해 피팅 커브 버튼을 클릭합니다. 모델 수렴(R2 > 0.98, 잔차 제곱합 < 0.15)에서 절반 최대 억제 농도(IC50)를 도출하고 1000회 반복 부트스트랩 리샘플링을 통해 95% 신뢰 구간을 계산합니다.
  3. FLT3 억제제에 의해 유도된 FLT3-ITD 돌연변이가 있는 32D 세포의 DNA 손상 실험
    1. DNA 손상 평가를 위해 성장 급증(집단 배가 시간 < 24시간)을 나타내는 FLT3-ITD 돌연변이 32D 세포를 선택합니다.
    2. 셀 수를 계산합니다(자세한 내용은 1.2.2단계 참조).
    3. 세포 파종: 직경 6cm의 접시와 접시당 4mL의 세포 현탁액을 사용하여 세포 현탁액의 밀도를 접시당 1 × 106 세포로 조정합니다.
    4. 각 억제제 농도에 대해 3회 반복실험을 준비합니다: 55 nM 길테리티닙: 배지 4 mL + 100 μM 스톡 2.2 μL, AC220 0.15 nM AC220: 배지 4 mL + 100 nM 스톡 6 μL. 용액을 소용돌이-혼합하고 37°C에서 15분 동안 평형을 유지합니다. 적절한 혼합을 위해 튜브를 부드럽게 흔듭니다. 원래 배지를 흡인하고 멸균 혈청학적 피펫을 사용하여 새로 준비된 억제제 함유 배지 4mL/접시로 교체합니다.
    5. 처리된 세포를 생리학적 조건(37°C, 5% CO2, 95% 습도)에서 정의된 간격(0, 2, 4, 6H) 동안 배양합니다. 기본 DNA 손상 평가를 위해 즉시 시간 제로 제어를 처리합니다.
    6. 트리판 블루 배제 분석
      1. 수집된 세포를 150× g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1mL의 배양 배지로 세포를 재현탁합니다.
      2. 재현탁된 세포 100μL를 플라스틱 원심분리기 튜브에 피펫팅하고 트리판 블루 염색 염색 100μL(2x)을 첨가하고 부드럽게 혼합한 다음 3분 동안 염색합니다.
      3. 셀 수를 계산합니다(자세한 내용은 1.2.2단계 참조).
      4. 다음과 같이 세포 생존력을 계산합니다.
        % 세포 생존율 = figure-protocol-2 × 100%
        참고: 생존율이 ≥90%인 샘플만 혜성 분석을 위해 처리되었습니다.

2. 시약 준비 및 세포 샘플 준비

  1. 용해 용액(2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO 포함)을 냉장고를 사용하여 4°C ± 0.5°C에서 30분 동안 평형을 이룹니다.
  2. 저융점 아가로스(LMA)를 95°C에서 15분 동안 녹인 다음 응고를 방지하기 위해 37°C의 수조에 보관합니다.
  3. 전자 저울을 사용하여 NaOH 12g의 무게를 측정하고 500mM EDTA 용액 2mL를 피펫팅한 다음ddH2O를 첨가하여 최대 1L의 완충액을 만들어 알칼리성 전기영동 완충액(300mM NaOH, 1mM EDTA, pH >13)을 준비합니다.
  4. 세포 수확
    1. 세포 현탁액을 15mL 원심분리기 튜브에 수집합니다. 세포 현탁액을 800 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 진공 여과를 사용하여 상청액을 흡인합니다.
      1. 와이드 보어 1mL 피펫 팁을 사용하여 세포를 1mL의 완전 배지에 부드럽게 재현탁한 다음 10회 수직 반전시킵니다.
      2. 1.2단계와 같이 셀을 계산합니다.
      3. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에서 150 × g 에서 5분 동안 원심분리하여 완전한 배지를 제거합니다. 세척된 세포를 칼슘이 없는 PBS에서 ~5.0 × 105 cells/mL로 재현탁합니다.

3. 혜성 분석 절차

  1. 혜성 분석 슬라이드와 세포 샘플을 미리 준비하십시오. 피펫을 사용하여 1.5mL 튜브에 LMA 아가로스와 세포 현탁액(5 × 105 cells/mL)의 10:1(v/v) 혼합물을 준비하고 부드럽게 혼합합니다. 슬라이드 표면에서 2mm 거리를 유지하면서 45° 각도로 고정된 피펫을 사용하여 아가로스-세포 혼합물의 55μL 분취량을 혜성 슬라이드에 분배합니다. 혼합물로 코팅된 슬라이드를 빛을 피하기 위해 4°C에서 30분 동안 놓습니다.
    참고: 혜성 분석 슬라이드에 LMA 및 세포 혼합물을 첨가하는 동안 현탁액을 천천히 고르게 분배하여 기포 형성을 방지하고 균질한 겔 분포를 보장합니다.
  2. 응고된 슬라이드를 예냉된 용해 용액(2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, pH 10, 1% Triton X-100, 10% DMSO 포함)에 담그고 빛 보호 조건에서 4°C에서 ≥1시간 동안 용해를 수행합니다.
  3. 용해 후 용해물에서 슬라이드를 제거하고 피펫 건을 사용하여 패들 주변의 액체를 최대한 빨아들입니다. 그런 다음 슬라이드를 알칼리성 전기영동 완충액(300mM NaOH, 1mM EDTA, pH >13)에 넣고 빛을 피하도록 주의하면서 4°C에서 1시간 동안 사전 평형화합니다.
  4. 전기영동: 슬라이드를 전기영동 챔버에 넣고 슬라이드를 담그기 위해 충분한 알칼리성 전기영동 용액을 추가합니다. DNA 손상을 최소화하기 위해 사전 평형화된 완충액(4°C)을 사용하여 정전류(300mA)로 30분 동안 24V(0.74V/cm에 해당)에서 전기영동을 수행합니다.
  5. 중화: 전기영동 후 피펫건을 사용하여 슬라이드에서 알칼리성 전기영동 용액을 흡인하고 슬라이드를 dH2O에 2 x 5분 동안 담근 다음 70% 에탄올에 5분 동안 담급니다. 슬라이드를 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 건조시킵니다.
  6. 염색: 웰당 1x YeaRed 핵산 염색의 100 μL 분취량을 도포하고 빛 보호 조건에서 주변 온도에서 30분 동안 배양합니다. 부드러운 수성 헹굼 후 37°C에서 열 건조하여 과도한 얼룩을 제거합니다.
  7. 이미징: 4x 대물렌즈가 장착된 형광 현미경을 사용하여 형광 시각화를 수행하고 표준화된 노출 조건에서 디지털 이미지 획득을 수행합니다.

4. 데이터 처리

  1. 정량적 이미지 분석을 수행하여 꼬리 DNA(%), 올리브 꼬리 모멘트 및 꼬리 길이(μm)를 포함한 표준 혜성 매개변수를 결정합니다.
    1. 소프트웨어의 인터페이스를 엽니다(그림 5).
    2. 이미지를 소프트웨어로 가져오고 파일을 클릭한 다음 파일 선택 을 클릭하여 분석하려는 이미지를 소프트웨어로 가져옵니다. 그런 다음 마우스 버튼을 누른 상태에서 파란색 상자가 나타날 때까지 드래그합니다. 파란색 상자를 드래그하여 분석하려는 셀이 상자 안에 포함되도록 합니다. 그림의 조정 옵션을 사용하여 전체 셀을 포함하도록 프레임의 위치를 조정할 수 있습니다(그림 5).
    3. 분석을 시작하기 전에 시작을 클릭한 다음 분석을 클릭합니다. 단일 셀 분석 결과는 오른쪽의 '프로필' 아래에 표시됩니다. 각 셀을 분석한 후 저장을 클릭합니다. 감지할 수 있는 파라미터는 '프로필' 오른쪽에 표시되며, 하단에는 다양한 파라미터의 수치가 표시됩니다. 마지막으로 파일 | 결과를 내보냅니다. 얻은 결과에는 HeadArea, TailArea, HeadDNA, TailDNA, HeadDNA%, TailDNA%, HeadRadius, TailLength, CometLength, HeadMeanX, TailMeanX, TailMoment 및 OliveTailMoment가 포함됩니다.

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결과

혜성 분석은 FLT3 돌연변이 세포주에서 길테리티닙과 AC220에 의해 유도된 차등 DNA 손상 프로파일을 정량화하기 위해 체계적으로 사용되었습니다. 분석 결과 길테리티닙과 AC220으로 처리되지 않은 세포 집단 간의 DNA 손상 차이는 통계적으로 유의하지 않은 것으로 나타났습니다(P > 0.05). 꼬리 DNA(%) 및 올리브 모멘트 꼬리(OMT) 값의 용량 의존적 증가는 2-6시간 노출 후 통계적 유의성(P < 0.05)을 달성했습니다. OMT는 꼬리의 % DNA와 '머리-꼬리 형광의 무게 중심 사이의 거리'의 곱을 나타냅니다. 꼬리 DNA(%) 및 올리브 모멘트 꼬리(OMT) 차이는 AC220이 길테리티닙보다 세포에 더 많은 DNA 손상을 유발한다는 것을 나타냅니다(그림 3 및 그림 4). 결론적으로, 이 실험 패러다임은 혜성 분석이 돌연변이 세포 모델에서 FLT3 억제제의 D...

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토론

혜성 분석은 유전독성 평가 방법론의 상당한 발전을 나타냅니다. 이 기술은 기술적 접근성, 단일 셀 해상도 및 전기영동 이동 프로파일을 통한 손상 패턴의 직접적인 시각화를 통해 기존 접근 방식에 비해 뚜렷한 이점을 제공합니다. AML 치료제 개발에서 혜성 분석은 표적 검증 단계에서 후보 제제의 유전 독성 프로필을 체계적으로 평가할 수 있게 하여 전임상 최적화를 위한 중요한 약력학 데이터를 제공합니다19,20.

결과의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 실험 과정에는 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 실험 중 모든 슬라이드에 대해 용해 조건과 용해 시간을 일정하게 유지해야 합니다. 세포를 다룰 때 자외선 및 특정 화학 물질로 인한 DNA 손상을 방지하기 위해 실험 중에 불필요한 빛을 피해야 합니다. 아가로스 겔은 아가...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 장쑤성 고등교육기관 과학기술혁신연구팀(2021), 장쑤성직업대학 공학기술연구센터 프로그램(2023), 절강성 의료 및 보건 과학 기술 프로그램(2025KY1861), 중국 장쑤성 고등교육기관 자연과학 핵심 재단(보조금 번호 24KJA310008), 쑤저우 직업 보건 대학 프로그램(보조금 번호. SZWZYTD202201, szwzy202406), 수주대학교 방사선 의학 및 보호 국가 핵심 연구소 프로젝트(GZK12023013).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5M EDTA비요타임ST066
1x YeaRed 핵산 염색예센10202ES
32D 셀코비오에CBP60995
AC220타겟몰T2066
세포 계수 키트-8도진도CK04
세포 계수 플레이트치우징XB-K-25
CO2 인큐베이터열51032872
혜성 분석 소프트웨어 프로젝트(CASP)
CometAssay 키트 트레비겐4250-050-K
세포 분석 5바이오텍16280004
FBS팬ST30-3302
길테리티닙타겟몰티4409
그래프패드 프리즘 9.0
고속 원심분리기열  9AQ2861
L-1000XLS+ 피펫레인인17014382
L-20XLS+ 피펫레인인17014392
액체 질소 탱크MvecryogeYDS-175-216
Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계열1410101
Na2OH다마오1588
PBS솔라바이오P1020
페니실린-스트렙토마이신 용액, 100x비요타임C0222
RPMI 1640 중간깁코C22400500BT
삼안 생세포 현미경모틱1.1001E+12
초저온 냉동고헤어V118574

참고문헌

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