자연 공급원에서 단백질 합성 억제제의 예비 스크리닝을 위한 형광 기반 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 단백질 합성의 천연 산물/소분자 억제제를 식별하기 위해 최적화된 형광측정 스크리닝 방법론을 도입합니다. 그 실용성 덕분에 학부 신약 개발 기술 교육과 의약 화학 캠페인 구현 모두에 적합합니다.

Abstract

천연제품은 특히 암을 포함한 여러 질병에 적용되는 풍부한 치료 화합물의 원천입니다. 이러한 생체분자를 신약 개발의 구조 템플릿으로 활용함으로써, 연구자들은 완전 합성 화합물에 비해 더 빠른 개발 일정과 향상된 생물학적 효과를 달성했습니다. 단백질 합성 경로는 특히 치료가 어려운 암에 관여한다는 점에서 천연 산물에 대한 매력적인 표적으로 떠올랐습니다. 스트렙토마이세스 그리세우스에서 유래한 강력한 단백질 합성 억제제인 사이클로헥시마이드는 이 분야에서 천연 화합물의 잠재력을 잘 보여줍니다. 이러한 천연 제품 유도체가 약물 유사 분자로 개발됨에 따라, 이들의 단백질 합성 억제 활성을 확인하는 것은 여전히 중요한 검증 단계로 남아 있습니다. 주요 목표는 화합물 억제 활성의 신속한 평가를 위한 학부 친화적인 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 형광 기질과 첨단 형광 현미경 기법을 사용하여 이러한 천연 생성물의 억제 능력을 체계적으로 검출하고 측정합니다. 이 연구는 두 식물 종인 Pinus sylvestris 와 Psoralea corylifolia에서 유래한 화합물을 조사했습니다. 사이클로헥시마이드를 기준으로 사용했을 때, 두 천연 산물 모두 단백질 합성 억제 수준이 다양하게 나타났습니다.

Introduction

단백질 합성은 전사와 번역이라는 매우 조절된 과정을 포함합니다. 전사 과정에서 유전자의 DNA 서열이 복사되어 메신저 RNA(mRNA)를 생성합니다. RNA 중합효소는 DNA 이중 나선을 분리하며, 한 가닥을 가이드로 사용해 일치하는 mRNA 분자를 만듭니다. mRNA가 완전히 형성되면, 핵에서 세포질로 이동하여 번역을 진행합니다. 번역은 리보솜에서 이루어지며, mRNA가 아미노산을 폴리펩타이드 사슬로 조립하는 템플릿으로 사용됩니다. 이 폴리펩타이드 사슬은 리보솜의 출구 터널을 벗어나면서 기능성 단백질로 접힙니다. 전사는 주로 전사 인자, 염색질 변형, 조절 RNA에 의해 조절되며, 번역은 개시 인자, 신호 전달 경로, RNA 안정성 메커니즘에 의해 조절됩니다. 이러한 조절 시스템은 세포가 세포 기능을 유지하고 스트레스나 손상에 효과적으로 반응할 수 있게 합니다^.

인간 암의 대다수, 약 85%는 고형 종양으로 나타납니다². 이 종양들은 구체적인 특징과 행동에서 극명하게 다를 수 있지만, 병인이나 해부^{학적 위치와} 상관없이 단백질 합성 상향 조절과 같은 공통된 생리학적 특성과 패턴을 공유하는 경향이 있습니다. 암세포는 높은 에너지 요구와 통제되지 않은 성장을 지원하기 위해 번역 기계를 탈취하여 단백질 합성을 조절하지 못합니다. 이 재프로그래밍은 거의 모든 주요 종양 유발 신호 경로의 조절 불균형으로 인해 세포 생존, 증식, 전이를 촉진하고 세포 사멸 경로를 억제하는 결과입니다^. 종양 세포에서는 리보솜을 만드는 기계가 과부하 상태에 들어가 단백질 생산이 증가하고 세포 분열이 빠르게 이루어집니다. 이 향상된 단백질 합성은 암 생존에 매우 중요하기 때문에, 이 과정을 표적으로 하고 차단하는 치료법은 잠재적 치료법으로 유망합니다^. 따라서 암 특이적 번역 인자, 독특한 리보솜 조성, 단백질 합성을 조절하는 신호 전달 경로 변화에 초점을 맞춘 연구는 치료 창이 개선된 더 표적 억제제를 제공할 수 있습니다.

천연 산물(NP)은 다양한 생물학적 활성으로 알려져 있기 때문에, 그들의 스캐폴드를 이용한 선택적 단백질 합성 억제제를 암 치료에 개발하는 것은 유망한 접근법입니다 ^6,7. NP는 리보솜 결합부터 시작인자 또는 신장 과정 간섭에 이르기까지 단백질 합성 기계의 다양한 구성 요소를 표적으로 할 수 있어, 고형 종양에서 단백질 합성 억제제 신약 개발에 매우 귀중한 출발점이^됩니다. 원하는 활성을 신속히 스크리닝할 수 있는 능력은 NP 히트를 효율적으로 식별하려는 신약 개발 플랫폼에 중요한 진입점이 됩니다. 일반적으로 고처리량 스크리닝은 형광 분석법을 이용해 납 후보 분자를 빠르게 좁혀냅^니다.

전 세계 과학자들은 생물학적 시스템 분석에 필수적인 도구로서 형광 기반 기법에 의존하고 있습니다. 이러한 접근법은 세포 과정을 연구하는 데 널리 사용되며, 연구자들이 생체분자 상호작용을 실시간으로 추적할 수 있게^합니다. 생체 직교 클릭 화학 반응과 결합하면 단백질 합성의 정확한 시각화가 가능하다¹⁰. 제시된 형광 단백질 합성 분석법은 세포 투과성 알킨 함유 푸로마이신 유사체인 O-프로파르길-푸로마이신(OPP)을 이용한 비방사성 단백질 합성 평가 기법입니다. 세포 처리 후 OPP는 연장된 폴리펩타이드 사슬의 C-말단에 통합되어 번역 종료를 일으킵니다. 이 알킨 표지된 절단 단백질들은 구리 촉매 클릭 화학과 5 FAM-아지드를 결합하여 검출됩니다.

이 형광측정 분석법은 학부생 교육에 유용한 연구 도구이자 접근성 높은 화학생물학 방법입니다. 최소한의 데이터 처리로 접근하기 쉽고 효율적인 프로토콜을 제공함으로써 학생들에게 현대 신약 개발 기법에 대한 실무 경험을 제공하고 신약 개발 과정을 가속화합니다. 새로운 단백질 합성 억제제에 대한 수요가 증가함에 따라, 이 접근법은 학부생들에게 의미 있는 연구 기회를 제공하고 암 치료제의 발전에 기여합니다.

Protocol

1. 키트에서 시약 준비

참고: 적절히 혼합하고 회전시키며, 사용 전까지 모든 시약을 얼음 보관하세요.

1. 단백질 합성 억제 키트, PBS 완충제, 세포 배양 배지, 세포 배양 처리 플레이트, 15 mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관, 2 mL 원심분리관, p10, p20, p200, p1000 피펫과 적절한 팁을 준비하고 확보하세요.
2. 세척 버퍼 준비하세요.
   1. 10배 워시 버퍼를 37°C에서 손에 컵으로 감아 녹입니다. 손에 있는 체온을 이용해 해동하고, 해동이 완료되었는지 자주 확인하세요.
   2. 10배 세척 버퍼 스톡을 원심분리기 튜브에 1:10 비율로 희석하세요. 피펫팅으로 위아래로 반전하거나 재현탁 방식으로 혼합하세요. 사용할 때까지 얼음에 보관하세요.
3. 고정액은 상온에서 해동하세요. 사용할 때까지 얼음에 보관하세요.
4. 투과성 완충 준비해.
   1. 10배 투과성 완충제를 37°C에서 손에 컵으로 감아 녹입니다. 손에 있는 체온을 이용해 해동하고, 해동이 완료되었는지 자주 확인하세요.
   2. 원심분리기 튜브에서 10배 스톡 1:10 비율의 탈이온수를 희석하세요. 피펫팅으로 위아래로 피펫팅하여 반전이나 재현탁으로 성분을 혼합하세요. 사용할 때까지 얼음에 보관하세요.
5. 400배 단백질 표지, 100배 형광 아지드, 100배 사이클로헥시마이드, DNA 염색, 그리고 20배 환원제를 상온에서 해동합니다. 사용 중에는 어두운 환경에서 얼음을 보관하세요. 염료는 호일로 덮거나 사용하지 않을 때는 2 °C 냉장고에 보관하세요.

2. 대조군과 실험 세포 표지

참고: 이 프로토콜은 안정적인 부착성 상피성 유방암 MDA-MB-231 세포를 사용하여 개발되었습니다. 어떤 부착 세포주든 사용할 수 있습니다. 아래 나열된 모든 단계는 96웰 플레이트를 사용하며, 모든 부피와 농도는 두 개의 시험 화합물과 두 개의 대조군(작업 부피 100 μL)에 대해 계산됩니다.

1. 부착 포유류 세포 배양
   참고: 건강한 기하급수적 성장을 유지하고 접촉 억제나 분화를 방지하기 위해 세포가 80-90% 합류에 도달하기 전에 통과해야 합니다.
2. 냉동 보존 세포 바이알을 실온까지 해동한 후 적절한 배지로 희석합니다.
3. 현탁액을 원심분리해서 세포에 펠릿을 넣고 상청액을 흡인하세요. 신선한 배지를 다시 담은 후 적절한 세포 밀도의 새 플라스크로 옮기세요.
4. 세포가 80% 합쳐지면 배지를 제거하고 플라스크에서 오래된 배지를 흡입하세요. 그 후 세포를 멸균된 PBS로 세척하여 트립신을 억제하는 잔류 혈청을 제거합니다. 트립신-EDTA 용액을 세포층을 덮고 3-5분 또는 세포가 37°C에서 분리될 때까지 배양합니다.
5. 트립신을 비활성화하기 위해 완전한 혈청 함유 배지를 넣고, 세포 현탁액을 튜브로 옮긴 후 부드럽게 섞은 후 세포 수를 세세요.
6. 선별판 내 씨앗 세포는 적절한 분할 비율(예: 1:3 또는 1:5)으로 희석하여 신선한 플라스크에 새 배지와 함께 배양하여 배양(일반적으로 37 °C, 5%_CO2)에서 원하는 세포 농도를 얻습니다.
   참고: 여기서 설명한 실험에서는 세포주를 웰당 2 × 10⁴ (96웰 플레이트)에 플레이트링하고 37°C에서 12시간 배양했습니다.

3. 화합물 첨가

1. 마스터 믹스 A를 준비하세요.
   1. 원심분리기 튜브에 "A"라고 라벨을 붙이세요. 598.5 μL 배양지와 1.5 μL 단백질 표지를 "A"에 피펫 넣습니다. 혼합물을 다시 현탁하여 균질성을 위해 피펫팅을 위아래로 움직이세요.
2. 마스터 믹스 B 준비.
   1. 원심분리기 튜브에 "B"라고 라벨을 붙이세요. 피펫으로 단백질 라벨 1.5 μL, 사이클로헥시마이드 6.6 μL, 배양 배지 591.9 μL을 "B"에 넣습니다. 혼합물을 다시 현탁하여 균질성을 위해 피펫팅을 위아래로 움직이세요.
3. 원하는 화합물(그림 1), 양성 및 음성 대조군으로 세포를 처리합니다.
   1. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 흡인으로 배지를 제거합니다. 플레이트를 기울이고 웰 중앙이 아닌 측면에서 흡입하여 세포 교란을 방지하세요.
   2. 시험 화합물 1 μL을 웰에 피펫, 시험 화합물 유체(0.1% v/v DMSO)를 웰에 피펫 주입합니다. 중복 연구의 경우, 각 샘플을 두 번째 우물에 추가하고 이 과정을 반복하세요. 이 웰에 마스터 믹스 A를 99 μL로 첨가합니다. 세포의 운동학적 교란을 막기 위해 웰 측면에 각도를 두고 부드럽게 피펫을 삽입하세요.
      참고: 화합물 스크리닝을 위한 최대 DMSO 농도는 세포 유형과 분석법에 따라 다르지만, 일반적인 지침은 다음과 같습니다: 0.1-0.5% DMSO(대부분의 세포 기반 검사법에서 일반적으로 안전하고 독성이 적으며), 1% DMSO(일반적으로 사용되고 단기 검사에서 많은 세포 유형에 대해 최대 허용 가능)입니다.
   3. 마스터 믹스 B 100 μL 피펫을 두 개의 웰에 담습니다. 셀 손상을 막기 위해 웰 측면에 각도를 두고 피펫을 삽입하세요.
   4. 원하는 성분을 세포에 통합하여 플레이트를 부드럽게 두드리세요. 세포를 37°C에서 0.5-2시간 배양합니다.

4. 실험 종료 및 세포 세척

1. 흡인 배지를 제거하세요. 플레이트를 기울이고 웰 중앙이 아닌 측면에서 흡입하여 세포 교란을 방지하세요.
2. 각 웰에 100μL PBS 버퍼를 추가하고 900 × g 에서 5분간 원심분리합니다.
3. 흡인으로 PBS 완충제를 제거하세요.

5. 고정 및 투과화

1. 각 웰에 100μL의 고정액을 추가합니다. 세포를 어두운 환경에서 15분간 실온에서 배양하세요.
2. 흡입으로 고정액을 제거하세요. 플레이트를 기울이고 중앙이 아닌 우물 옆면에서 흡입하세요.
3. 세포를 100 μL 세척 완충제로 세척하고 흡입으로 완충액을 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복하세요.
4. 각 웰에 100 μL 투과성 완충제를 추가하고 상온에서 10분간 배큐합니다.
5. 흡인을 통해 투과성 완충제를 제거하세요. 플레이트를 기울이고 중앙이 아닌 우물 옆면에서 흡입하세요.

6. 단백질 반응과 염색

1. 반응 칵테일 마스터 믹스를 준비하세요.
   1. 원심분리관에 651 μL PBS 버퍼, 7.0 μL 100x 구리 시약, 7 μL 형광 아지드, 마지막으로 35 μL 환원제를 추가합니다. 이 혼합물을 재현탁하여 균질성을 확보하세요.
      참고: 시약을 추가할 때는 이 정확한 순서를 따르세요. 준비 후 15분 이내에 사용하세요.
2. 각 웰에 반응 칵테일 100 μL을 추가합니다. 세포를 어두운 환경에서 실온에서 30분간 배양하여 광표백을 방지하세요.
3. 원심분리기 셀을 900 × g에서 5분간 사용하세요. 원심분리기에 빈 판을 추가해 무게를 고르게 분산시키세요. 흡인으로 혼합물을 제거하세요.
4. 세포를 100 μL 세척 완충제로 세척하고 흡입으로 완충액을 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복하세요.

7. DNA 염색

1. 총 DNA 염색액의 1배 희석액을 준비하고 각 웰에 100 μL을 추가합니다. 세포를 어두운 환경에서 실온에서 20분간 배양하여 광표백을 방지합니다.
2. 플레이트를 900 × g 에서 5분간 원심분리합니다. 원심분리기에 빈 판을 추가해 무게를 고르게 분산시키세요. 흡인으로 혼합물을 제거하세요.
3. 세포를 100 μL 세척 완충제로 세척하고 흡입으로 완충액을 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복하세요.
4. 세포를 100 μL 냉각된 PBS 완충제로 재현탁하여 영상 촬영을 준비합니다.

8. 영상

1. 플레이트를 플레이트 리더기에 넣으세요.
2. 배율을 20배로 설정하세요.
3. GFP 469/525 nm 채널로 핵 염색을 분석합니다. 자동 비닝과 자동 초점을 사용해 영상 결과를 향상시키세요.
4. 텍사스 레드 586/647nm 채널로 활성 단백질 합성을 분석합니다. 자동 비닝과 자동 초점을 사용해 영상 결과를 향상시키세요.

Results

이 분석법은 형광을 이용해 다양한 천연 산물의 단백질 합성 억제 능력을 시각화하고 정량화했습니다. 사이클로헥시마이드(CHX)는 신장 과정에서 전위 과정을 방해하는 것으로 알려진 단백질 합성 억제제^입니다. 이 연구에서는 녹색 형광 핵염료로 살아있는 세포를 검출했습니다. OPP는 퓨로마이신의 유도체로, 신생^{단백질에 공유} 결합합니다. MDA-MB-231 세포주는 광범위한 접근성과 신뢰할 수 있는 실험 성과를 고려하여 적절한 모델로 작용했다¹³. 구리가 존재하면, 형광 아지드는 OPP와 클릭 화학 반응을 일으켜 적색 형광을 통해 활성 단백질 합성을 감지할 수 있습니다. 검사된 화합물이 단백질 합성을 억제하는 경우, 세포는 녹색으로 보이고, 이어서 빨간색으로 표시되는 세포가 감소합니다(그림 2A-D...

Discussion

이 프로토콜은 천연 생성물과 소분자를 검사하여 단백질 합성 억제 능력을 평가하는 형광 선별 방법론을 제공합니다. 이 프로토콜의 단순함 덕분에 학부 연구자들은 이를 올바르게 구현할 수 있어 과학 지식에 실질적인 기여를 할 수 있습니다. 프로토콜은 생물학적 방법과 기술에 대한 기본적인 이해를 요구하며, 정확하고 신뢰할 수 있는 결과를 보장하기 위해 단계별 신중한 실행이 필요합니다.

예를 들어, 프로토콜 2.1 단계는 재현성을 보장하기 위해 모든 웰에 걸쳐 균일한 셀 분포와 정확한 정량화를 요구합니다. 부정확한 세포 계수는 화합물 대 세포 비율을 변화시켜 용량-반응 관계를 손상시키고 데이터 해석을 혼동시킬 수 있습니다. 3.3.2 단계에서는 전단 응력을 방지하기 위해 비스듬한 화합물을 첨가합니다. 마찬가지로, 웰 가장자리에 흡입 배지를 넣고 플레이트를 기울여 세포 단층을 방해하지 않도록 합니다. 세포 분리는 기계적 교란이 발...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
애질런트 바이오텍 사이테이션 1 세포 영상 멀티모드 리더	애질런트	BTCYT1V
화합물 1 (디하이드로아비에틸아민, CAS 1446-61-3)	에나민	EN300-7409771
화합물 2 (바쿠치올, CAS 10309-37-2)	켐페이시스	CFN99047
헤라우스 메가퓨지 16R	열로 과학	75004271
Ibidi Gmbh-슬라이드 96웰 플레이트	이비디	80826
MDA-MB-231 세포주	ATCC	ATCC HTB-26
인산염 완충 식염수 pH 7.4	ATCC	ATCC 30-2200
단백질 합성 분석기 키트 (녹색)	앱캠	Ab239725