염기서열 특이적 핵산 분석을 위한 신호 리포터로 DNA 형광 라이트업 압타머를 활용하는 분할 혼성화 프로브

Summary

이 프로토콜은 형광 라이트업 압타머 DAP-10-42를 신호 리포터로 사용하는 분할 혼성화 프로브의 설계와 핵산 검출 및 단일 뉴클레오티드 치환이 있는 표적 간의 구별을 위한 응용 프로그램을 간략하게 설명합니다.

Abstract

DNA 기반 형광 라이트업 압타머(FLA)는 순간 핵산 검출에 사용되는 기존의 혼성화 프로브와 달리 형광단 및/또는 소광체로 핵산 신호 리포터를 라벨링할 필요 없이 저렴한 형광 신호 판독을 제공하기 때문에 생물 분석 분석에 유망합니다. 대신, FLAP은 염료 리간드를 비공유 결합하며, 이는 수용액에서 본질적으로 낮은 형광을 나타내지만 FLAP 결합 시 높은 방출이 됩니다. 이 프로토콜은 지금까지 보고된 가장 효율적인 DNA FLAP인 DAP-10-42를 사용하여 분할 발광 압타머 센서(SLAS)를 설계하는 알고리즘을 설명합니다. 관심 핵산 표적을 보완하는 핵산 염기서열이 장착된 경우, SLAS는 핵산 분석을 위한 유망한 도구로서 단일 뉴클레오티드 치환(SNS)을 분석할 수 있도록 하나의 뉴클레오티드까지 선택성으로 핵산 표적을 염기서열 특이적으로 검출할 수 있습니다. SLAS는 기존의 큐벳 기반 형광 분광 광도계, 휴대용 형광 분석기로 측정하거나 휴대용 광원으로 여기할 때 육안으로 관찰할 수 있는 라벨이 없는 형광 기반 신호 판독의 이점을 제공합니다. SLAS 접근 방식은 질병 진단, 환경 모니터링 및 생체 분자 연구의 바이오센싱 응용 분야에 유용합니다.

Introduction

특정 DNA/RNA 염기서열을 검출하고 정량화하기 위해 혼성화 프로브를 사용한 핵산 분석이 일상적으로 수행됩니다¹. 가장 성공적인 혼성화 프로브 중 하나는 헤어핀 모양의 DNA인 MB(Molecular Beacon) 프로브입니다
올리고뉴클레오티드는 반대쪽 말단에서 형광단과 소광제로 표지됨 ^2,3. 즉시(프로브의 초과분에서 프로브 타겟 복합체를 세척할 필요 없이) 프로브의 루프 단편에 상보적인 핵산 서열의 존재를 감지하며 정량적 PCR(qPCR)에 일반적으로 사용됩니다. 프로브의 올리고뉴클레오티드 염기서열에 형광단과 소광단이라는 두 가지 염료를 공유 결합해야 하는 필요성은 특히 새로운 핵산 염기서열을 표적으로 하는 새로운 MB 프로브가 필요한 경우 비용을 증가시킵니다. 대안적으로, MB 프로브는 2개의 비표지 올리고뉴클레오티드가 표적 및 MB 프로브 리포터⁴ 모두와 상호 작용하는 다성분(분할) 혼성화 프로브 형식의 신호 리포터로 사용될 수 있습니다. 다성분 프로브 접근법은 핵산 인식을 위한 선택성을 향상시키고 구조화된 표적 ^5,6,7에 대한 프로브의 결합을 개선하지만, 그럼에도 불구하고 이 접근법은 형광단⁸로 리포터의 공유 표지의 필요성을 없애지 않습니다.

FLUORESCENT Light-up Aptamers (FLAPs)⁹는 저형광 환경에 민감한 염료 (fluorogens)에 친화력을 가진 aptamer로, FLAP에 의한 결합은 fluorogen manifold의 형광을 향상시킵니다. 형광 표지된 프로브 및 신호 리포터와 달리, FLAP은 감지 요소를 하나 이상의 염료로 공유 표지할 필요가 없으므로 무표지 형광 검출¹⁰의 이점을 제공합니다. 이는 만족스러운 분석 성능을 달성하기 위해 수십 개의 핵산 구조를 테스트해야 하는 최적화 단계에서 특히 중요합니다. 또한 FLAP 분석은 센서의 설계를 변경하는 대신 플루오로겐 및/또는 FLAP 센서의 농도를 조정하여 최적화할 수 있습니다. 이러한 이점은 저예산 연구 및 교육 실험실에 중요할 수 있습니다. DNA FLAP은 SLAS(Split Light-up Aptamer Sensors)¹¹라고 하는 다성분 혼성화 프로브의 신호 리포터로 특히 유망합니다. 현재까지 보고된 가장 효율적인 DNA FLAP은 DAP-10-42로, 원래는 다폭실 설포닐 염료¹²의 형광을 향상시키기 위해 선택되었으며, 다양한 아릴 메탄 염료(예: 아우라민 O, AO, 결정 바이올렛, CV)의 형광을 결합하고 향상시키는 난잡한 능력을 가지고 있습니다¹³. DAP-10-42는 핵산 분석 ^13,14,15에 사용하기 위해 SLA로 변환되었습니다.

여기에 설명된 방법의 목표는 label-free SLAS 가닥 및 형광 염료를 완충액 성분으로 사용하여 관심 핵산 표적의 염기서열 특이적 분석을 가능하게 하는 것입니다. 이 프로토콜은 DAP-10-42를 기반으로 SLA를 설계하는 알고리즘을 설명하고 단일 뉴클레오티드만큼 작은 핵산 염기서열의 매우 선택적인 검출을 위한 SLAS 성능을 강조합니다.

SLAS 핵산 검출 분석에는 최대 성능을 위해 0.5-1 μM의 최종 농도에서 사용되는 두 개의 맞춤형 합성 비변형 DNA 올리고뉴클레오티드가 필요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 시판되는 Auramine O(AO) 염료를 플루오로겐으로 사용합니다. 분석의 최종 AO 농도는 1-10μM 범위로, 블랭크 위에 특정 핵산 표적이 존재할 때 높은 형광 향상을 보장합니다(표적의 부재; 보충 그림 1). 분석 완충액의 필수 구성 요소는 칼륨 이온과 마그네슘 이온입니다(보충 그림 2). 칼륨 이온 (1.25-40 mM)은 신호 리포터로 사용되는 FLAP의 제안 된 G-quadruplex domain을 안정화시킵니다. 마그네슘 이온(2.5-50mM)은 SLAS 표적 상호 작용에서 음전하를 띤 인산기의 반발을 감소시킵니다. 신호 보고 도메인에 대해 보고된 시퀀스를 사용하는 SLAS 분석의 온도는 성능¹⁶의 손실을 방지하기 위해 28°C를 초과해서는 안 됩니다.

SLAS는 비대칭 PCR 또는 등온 DNA 증폭 반응(예: 재조합효소 중합효소 증폭, RPA¹⁷)의 DNA 앰플리콘, 전사 매개 증폭(TMA) 또는 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA)¹⁸의 RNA 산물, miRNA, rRNA 또는 ncRNA와 같은 네이티브 RNA 분자와 같은 단일 가닥 핵산 표적과 호환됩니다. 단일 뉴클레오티드에 대한 표적의 뉴클레오티드 서열의 변화는 SLAS 접근법^13,14를 사용하여 검출할 수 있습니다.

Protocol

1. DAP-10-42를 신호 리포터로 사용하는 SLAS(Split Light-up Aptamer Sensor) 설계

1. SLAS를 구성하는 두 개의 변형되지 않은 DNA 올리고뉴클레오티드 가닥의 염기서열을 설계합니다. DAP-10-42의 뉴클레오티드(nts) 4,6-39를 함유하는 단편을 사용한다(표 1, 도 1A).
2. 위치 nt 5에서 부풀어 오른 티민 잔류물을 제거하고, 줄기를 4 bp (nts 4,6-8 및 36-39)로 단축하고, 말단 C-G bp를 추가하여 줄기 1 (nts 1-8 및 36-42)의 서열을 줄기 1'로 변환합니다 (그림 1A, 1 단계). 또한 SLAS 가닥 중 하나에는 DAP-10-42 코어 서열의 nts 9-29가 포함되고 다른 SLAS 가닥에는 서열의 nts 30-35가 포함됩니다.
3. nts 9-29를 포함하는 단편의 3' 말단 서열을 d(GGTCAT)로, nts 30-35 단편의 5' 말단 서열을 d(ATGACC)로 확장하여 6-bp 줄기 2를 형성합니다(그림 1A, 2단계).
   참고: DAP-10-42에 있는 스템 1의 염기쌍 T4-A39, A6-T38, C7-G37 및 G8-C36은 앱타머의 점등 기능에 필요합니다. 스템 1'의 서열은 말단 bp에서만 수정할 수 있으며 G-C, A-T, T-A 염기쌍이 되거나 필요에 따라 1-2개의 염기쌍으로 확장될 수 있습니다. 스템 2의 순서는 임의적이며 변경될 수 있습니다. 그러나 분석 온도가 28°C 이상으로 상승하지 않는 한 스템 2의 열역학적 안정성이 유지되는 것이 좋습니다. 줄기 2를 단축하거나 불안정하게 만드는 것은 SLAS 기반 형광 분석의 높은 배경이 관찰되는 경우 표적 없이 조기 염료 결합을 방지합니다. nts 29-30 대신 nts 28-29, 27-28 또는 26-27 사이의 DAP-10-42 뉴클레오티드 서열의 분할도 허용됩니다(그림 1B).
4. 설계된 SLAS를 핵산 표적 또는 관심에 맞게 조정하려면 d(TT) 링커를 통해 표적-표적 결합 단편(arms)을 보완하는 DNA 염기서열로 stem 1'을 확장합니다(그림 1A, 3단계). 이를 통해 프로브를 구성하는 SLAS-U 및 SLAS-S의 가닥 염기서열을 얻을 수 있습니다.
5. SLAS-S의 타겟 결합 암을 SNS 사이트를 포함하는 표적의 7-10-nt 단편에 상보적이고, SLAS-U의 표적 결합 암을 SLAS-S의 표적 결합 군에 인접한 표적의 15-25 nt 단편에 상보적으로 만듭니다(표 1).
   알림: SLAS-S의 타겟 바인딩 암을 DAP-4-39 시퀀스의 nt 10 또는 nt 42에 연결할지 여부는 선택 사항입니다(각각 그림 1, 암 1 또는 암 2).
6. UNAFold 웹 서버(unafold.org)¹⁹를 사용하여 관심 대상과 SLAS-S 및 SLAS-U의 대상 결합 암 사이의 듀플렉스의 용융 온도(T_m)를 평가합니다.
   1. 웹 페이지 상단의 DINAMelt 탭을 클릭합니다. Applications(응용 프로그램)로 이동하여 Two State Melting Hybridization (보충 그림 3A)을 선택합니다. Two-State Melting Hybridization 페이지에서 왼쪽 상자에 상호 작용 서열 중 하나를 입력하고 오른쪽 상자에 다른 하나를 입력합니다(보충 그림 3B). 두 시퀀스가 모두 5'에서 3' 순서로 되어 있는지 확인합니다. 두 개 이상의 상호 작용 시퀀스 쌍을 세미콜론으로 구분하여 입력할 수 있습니다.
   2. 페이지 하단에 분석 조건과 일치하도록 분석 온도(22°C), 1가 및 2가 양이온 농도(각각 20mM 및 25mM)를 표시합니다. 상호 작용하는 시퀀스의 농도를 나타냅니다.
   3. Submit(제출)을 누릅니다(보충 그림 3B). 결합의 Gibbs 에너지 변화, 엔탈피 변화 및 엔트로피 변화와 해당 듀플렉스에 대한 T_m 값을 포함하는 결과를 관찰합니다(보충 그림 3B).
   4. 완전히 일치하는 타겟(M)과 SLAS-S 및 SLAS-U의 타겟 결합 암 사이의 듀플렉스에 대한 T_m 값이 분석 온도(현재 프로토콜에서 22°C)보다 높은지 확인합니다. 여기서,_Tm 값은 각각 32.2°C 및 74.4°C였다(보충 그림 3C).
   5. SLAS-S와 SNS를 포함하는 일치하지 않는 타겟(MM) 사이의 듀플렉스가 분석 온도보다 T_m 낮은지 확인합니다. 이는 프로브 표적 인식의 높은 선택성을 보장하여 SLAS 결합 단편에 SNS가 포함된 경우 AO 플루오로겐이 표적 핵산 분석물의 존재 신호를 보내는 것을 방지합니다(그림 2). 여기서_{, Tm은} 21.3°C(보충 그림 3C)였으며, 이는 정합된 복합체와 미스매치를 구별하기에 충분하였다.
   6. 필요한 경우 표시된 안정성 요구 사항을 충족하기 위해 타겟 상보적 단편을 줄이거나 확장하여 타겟 결합 암의 서열을 조정합니다.
7. 맞춤형 DNA 올리고뉴클레오티드를 공급하는 상용 공급업체로부터 설계된 가닥 SLAS-S 및 SLAS-U를 얻거나 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 사내에서 DNA 가닥을 합성합니다.

그림 1: 형광등 조명 앱타머(FLAP) DAP-10-42를 분할 조명 앱타머 센서(SLAS)로 변환. (가)DAP-10-42¹²의 2차 구조는 22°C, 20mM Na⁺, 25mM Mg²⁺에서 UNAFold Web Server¹⁹의 DNA 폴딩 애플리케이션에 의해 예측됩니다. 압타머는 스템 1에 의해 안정화된 G-quadruplex 모티브로 접히는 코어가 있는 헤어핀 2차 구조를 특징으로 합니다. DAP-10-42가 SLA로 변환되기 위해, (1) 압타머의 스템 1은 4 bp로 단축되고 측면에 추가 G-C bp가 있어 스템 1'을 만든다. (2) 코어 서열은 NT 29와 30으로 분할되며, 분할 부위의 3'- 및 5' 측면은 각각 상보적 서열 d(GGTCAT) 및 d(ATGACC)로 확장되어 스템 2를 만듭니다. (3) 줄기 1'은 관심 대상인 표적 결합 암의 인접한 단편에 상보적인 서열로 확장되며, 표적 결합 암과 프로브의 신호 보고 도메인 사이에 d(TT)-링커가 있습니다. (B) 코어는 또한 신호 및/또는 형광 폴드-증가의 현저한 손실 없이 nts 28-29, 27-28 또는 26-27 사이에서 분할될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: SLAS 신호 생성 메커니즘. SLAS는 SLAS-U 및 SLAS-S의 두 가닥과 형광 염료(예: Auramine O; AO)를 참조하십시오. 관심 있는 핵산 표적이 없는 경우, 두 가닥 모두 해리된 상태이며 염료를 결합할 수 없습니다. 신호가 관찰되지 않습니다(중앙). 완전히 일치하는 타겟 M이 있는 경우, SLAS-U와 SLAS-S는 모두 M 의 인접한 단편에 하이브리드화하여 코어 단편을 근접하게 만듭니다. 이것은 염료 결합 부위의 형성을 허용합니다. AO의 결합은 형광을 강화하며, 이는 형광 신호 판독으로 측정됩니다(왼쪽). SLAS-S와 상호 작용하는 단편에 단일 뉴클레오티드 치환(SNS)을 포함하는 일치하지 않는 타겟 MM 이 있는 경우 SLAS-U만 MM 타겟에 하이브리드화할 수 있으며 SLAS-S는 해리 상태에 있습니다. 이것은 염료 결합 부위의 형성을 방지하고 신호가 관찰되지 않습니다(오른쪽). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 표적 염기서열의 증폭

1. SLAS assay로 분석할 유전자 단편을 증폭합니다. PCR 또는 RPA 증폭의 경우 비대칭 조건(예: Reverse Primer보다 10배 과도하게 Forward Primer가 추가된 경우)을 사용하여 단일 가닥 앰플리콘을 생성합니다. Linear After The Exponential (LATE) PCR²⁰을 사용하여 NANOGP8 유전자로부터 126 nt 단편을 증폭하기 위해, 표 2에 나열된 프라이머 염기서열을 사용하십시오. 여기서, 126-nt 유전자 단편에 해당하는 단일가닥 DNA 주형(주형 NANOGP8 또는 주형 G1423C, 표 2)을 사용하였다. 이 템플릿은 Integrated DNA Technologies, Inc.에서 맞춤 합성했습니다.
   1. 10 μL의 10x Standard Taq 반응 완충액, 2 μL의 10 mM dNTP 혼합물(최종 농도 0.2 mM), 10 μL의 10 μM 순방향 프라이머 및 10 μL의 1 μM 역방향 프라이머(1 μM 및 0.1 μM의 최종 농도에 대해)를 혼합하여 100 μL PCR 반응을 준비합니다. 각각), 0.5 μL의 5U/μL Taq DNA 중합효소, DNA 템플릿 및 뉴클레아제가 없는 물. 템플릿이 없는 컨트롤의 경우 템플릿 대신 물을 추가합니다.
   2. 다음과 같은 열순환 조건을 사용하십시오 : 95 ° C에서 1 분 동안 초기 변성; (1) 95°C에서 15초 동안 변성, (2) 60°C에서 30초 동안 프라이머 어닐링, (3) 68°C에서 30초 동안 프라이머 확장의 45 사이클; 68 ° C에서 5 분 동안 최종 확장.
      참고: NASBA¹⁸ 과 같은 전사 기반 증폭 기술은 특히 RNA 템플릿을 증폭에 사용할 수 있는 경우 PCR 또는 RPA 대신 사용할 수 있습니다. NASBA는 마이크로몰 범위의 최종 산물 농도에서 단일 가닥 RNA 앰플리콘을 생성하며, 이는 산물 농도 없이 다운스트림 SLAS 분석에 사용할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.
2. 3M 아세트산 나트륨(pH 5.5)의 0.1배 부피와 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 증폭된 샘플을 에탄올로 침전시킵니다. -20 ° C에서 1 시간 동안 배양하고 12,000-18,000 x g 에서 5 분 동안 원심 분리기를 배양 한 다음 상등액을 버립니다.
3. 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 다시 원심분리한 다음 상등액을 다시 버립니다. 펠릿을 자연 건조하고 10μL의 뉴클레아제가 없는 물에 용해시켜 SLAS 분석에 사용합니다.

3. SLAs를 이용한 형광 분석

1. AO(DMSO에서 0.1mM, 10x), SLAS-S(뉴클레아제가 없는 물에서 10μM, 10x), SLAS-U(뉴클레아제가 없는 물에서 10μM, 10x) 및 4x 분석 버퍼(80mM Tris-HCl, pH 7.4, 100mM MgCl₂, 80mM KCl)의 원액을 준비합니다.
   참고: 칼륨 이온은 염료 결합 부위의 일부인 압타머의 추정되는 G-4중 모티프를 안정화하는 데 필요합니다. 1x 분석 버퍼에서 1mM KCl(25mM MgCl₂에서)만으로도 블랭크(비표적 샘플; 보충 그림 2B). 마그네슘 이온은 핵산 가닥(SLAS-S, SLAS-U 및 표적 사이)의 상호 작용을 안정화합니다. 1x 분석 버퍼에서 Mg²⁺의 농도는 최소 5mM이어야 합니다(20mM KCl에서; 보충 그림 2C,D). AO(~1mM)의 원액을 DMSO에서 제조합니다. SLAS-S 및 SLAS-U의 스톡 농도는 임의적이며 가닥의 최종 농도가 유지되는 한 필요한 경우 조정할 수 있습니다(논의에서 최종 SLAS 농도 선택에 대한 근거 참조).
   주의 : AO는 삼키면 유해하고 피부와 접촉하면 독성이 있으며 암을 유발할 것으로 의심됩니다. AO 솔루션으로 작업할 때는 항상 장갑을 착용하십시오. AO의 계량 및 원액 준비는 화학 후드 아래에서 수행되어야 합니다.
2. 표적을 제외한 모든 분석 성분을 포함하는 마스터 믹스를 준비합니다. 샘플 부피(60 μL)에 샘플 수에 1을 더한 값(n+1)을 곱하여 마스터 믹스 부피(V_mix)를 계산합니다.
   
   표본 n의 수에는 필요한 음성 대조군과 양성 대조군이 포함되어야 합니다.
3. 0.25x V_혼합 μL의 4x 분석 버퍼, 0.1x V_혼합 μL의 0.1 mM AO, 0.1x V_혼합 μL의 10 μM SLAS-S, 0.1x V_혼합 μL의 10 μM SLAS-S를 결합합니다. 3.4단계에서 추가된 목표 부피를 수용하도록 의 최종 부피 에 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. Vortex를 사용하여 마스터 믹스를 간단히 원심분리합니다. 마스터 믹스의 50 μL를 n개의 샘플 튜브에 부분 표본으로 추출합니다.
   알림: 샘플 볼륨은 형광 신호를 감지하는 데 사용되는 기기의 특성에 따라 조정할 수 있습니다. 샘플 튜브에 분주되는 마스터 믹스의 부피는 3.4단계에서 추가된 목표 부피에 따라 조정할 수 있습니다. 마스터 믹스를 만들기 위해 첨가된 뉴클레아제가 없는 물의 양은 그에 따라 조정되어야 합니다. 예를 들어, 타겟 함유 샘플이 최종 샘플 부피의 10%(V/V)로 추가되는 경우, 물은 최대 0.9x V_믹스까지 마스터 믹스에 첨가되어야 합니다.
4. 하나의 시료를 비표적 대조군(비어 있음)으로 사용하고 다른 시료를 양성 대조군으로 사용합니다. 타겟 함유 시료 10μL를 마스터 믹스(50μL)에 추가하여 10-1000nM 표적을 포함하는 60μL의 최종 시료 부피를 만듭니다. 블랭크의 경우 타겟 대신 뉴클레아제가 없는 물(10μL)을 사용합니다. 양성 대조군을 위해, 표적 염기서열을 포함하는 합성 DNA 올리고뉴클레오티드(예: 표적 M, 표 1)를 사용합니다. 10 μL의 0.6-3 μM 대조군을 추가하여 0.1-0.5 μM 최종 농도를 만듭니다.
   참고: 이 양성 대조군의 높은 형광은 테스트된 알려지지 않은 샘플에 대해 음성 신호가 관찰되더라도 분석이 예상대로 작동하도록 합니다.
5. 샘플을 혼합하고 마이크로 원심분리기를 사용하여 스핀다운합니다. 샘플을 22°C에서 10-60분 동안 배양합니다. 신호는 40분에서 60분 사이에 <15%만 증가합니다(그림 3).
6. 형광 분광 광도계를 사용하여 475nm에서 여기 시 540nm에서 샘플의 형광을 측정합니다.
   참고: 얇은 벽의 PCR 튜브에서 형광을 측정하는 휴대용 형광계를 사용할 수 있습니다. 형광측정기에는 AO 형광을 검출하는 데 적합한 여기 및 방출 필터가 있어야 합니다. 적합한 여기 필터의 예로는 495nm 단역 통과가 있습니다. 적합한 방출 필터의 예로는 510-580nm가 있습니다. 또는 UV 또는 Blue 광원이 있는 샘플에서 AO 형광이 여기될 때 신호를 시각적으로 관찰할 수 있습니다.
   주의 : UV 램프를 사용하는 경우 자외선 차단 고글을 착용하십시오.

그림 3: SLAS-29U/30S에 대한 신호 생성의 시간 의존성. AO, SLAS-29U 및 SLAS-30S를 포함하는 샘플을 형광 분광 광도계의 동역학 모드(475nm에서 여기, 540nm에서 방출, 5nm 여기/방출 슬릿)를 사용하여 60분 동안 분석했습니다. 5분 시간(화살표로 표시)에 타겟 M 이 샘플에 추가되었습니다. 데이터는 2건의 독립적인 임상시험에서 얻은 평균을 구한 것이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Results

DAP-10-42 코어를 신호 리포터로 활용하는 SLAS의 성능은 공격적인 뇌종양인 교모세포종(GBM)의 진행에 중요한 NANOGP8 유전자 단편을 조사하도록 설계된 프로브를 사용하여 입증되었습니다²¹. 이 단편은 암세포에서 유래한 엑소좀의 DNA 화물에 SNS를 함유하고 있는 것으로 보고되었습니다²². 따라서 SLAS는 유전자의 SNS 부위에 맞게 조정되었습니다. nt 1423(GenBank NM_001355281.2)에서 각각 G 또는 C를 포함하는 NANOGP8 유전자의 염기서열을 모방한 합성 DNA 표적 M 또는 MM을 사용하여 이 프로토콜에서 SLAS 성능을 입증했습니다. 표적 M은 SLAS-S 가닥과 완전히 상보적인 반면, 표적 MM은 SLAS-S와 G>C 불일치를 포함했습니다(표 1). SLAS-U의 ...

Discussion

보고된 프로토콜에서 중요한 단계에는 (i) SLAS 설계; (ii) 분석 온도; (iii) 모노 및 2가 금속 양이온(K⁺ 및 Mg²⁺)의 존재; (iv) SLAS 가닥의 농도.

SLAS 설계
SLAS 가닥을 설계할 때, 표적이 없고 특이적 또는 비특이적 표적(SNS 분화가 필요한 경우)이 있는 경우 SLAS-S 및 SLAS-U 가닥에 의해 형성된 복합체의 열역학적 안정성을 고려하는 것이 중요합니다. SLAS-S/U 복합체의 안정성은 스템 1' 및 2의 서열을 변경하여 조절할 수 있습니다(그림 1). 줄기의 뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 염기서열이 없는 경우 SLAS-S 및 SLAS-U 가닥의 결합을 방지하도록 설계되어야 하므로 분석된 표적이 없을 때 낮은 백그라운드 신호를 보장해야 합니다. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
아우라민 O	MP 바이오메디컬스	195064	신호 보고에 사용되는 형광 염료
Cary Eclipse 형광계	애질런트 테크놀로지스	G9800A	샘플의 형광 신호를 측정하기 위해
디메시 설폭사이드	MP 바이오메디컬스	196055	Auramine O의 원액을 제조하기 위한 용매
DNA 올리고뉴클레오티드(프라이머, SLAS 가닥, PCR용 합성 주형)	IDT	해당 사항 없음	공급업체가 맞춤 제작하고 탈염했으며 추가 정제 없이 사용
dNTP 혼합물, 10 mM	써모피셔 사이언티픽	R0191	LATE PCR 반응용
염화마그네슘	인비트로젠	AM9530G	버퍼 구성 요소; 프로브의 가닥과 분석된 대상의 올바른 연관성을 위해 필요합니다.
마이크로 원심분리기 튜브(1.5mL)	피셔브랜드	02-681-320	샘플 준비용 플라스틱
마이크로피펫(0.1-2.5 & micro; L)	에펜도르프	K56877G	샘플 준비에 사용
마이크로피펫(100-1000 & micro; L)	에펜도르프	K13160F	샘플 준비에 사용
마이크로피펫(20-200 & micro; L)	에펜도르프	J05253M	샘플 준비에 사용
마이크로피펫(2-20 & micro; L)	에펜도르프	G24675G	샘플 준비에 사용
미니 원심분리기	코닝	6770	샘플&NBSP를 회전시키는 데 사용됩니다.
뉴클레아제 프리 워터(DEPC 처리되지 않음)	써모피셔 사이언티픽	AM9932	PCR 및 SLAS 분석의 샘플에 사용
PCR 튜브(0.5mL)	인비트로젠	AM9932	Quantus 형광계를 사용하여 형광을 측정하려면
피펫 팁(20-200 & micro; L)	VWR	76322-150	샘플 준비용 플라스틱
피펫 팁(1-10 uL)	VWR	76322-528	샘플 준비용 플라스틱
염화칼륨	인비트로젠	AM9640G	버퍼 구성 요소; 프로브의 형광 조명 압타머 도메인을 올바르게 접는 데 필요합니다.
Quantus 형광계	프로메가	E6150	형광 측정에 사용할 수 있는 휴대용 저가형 형광계
석영 큐벳	스타나	16.50F-Q-10/Z15	Cary Eclipse 형광계를 사용한 형광 측정에 사용
표준 Taq 완충액이 포함된 Taq DNA 중합효소	뉴잉글랜드 바이오랩스	M0273S	SLAS 분석으로 분석할 유전자 단편의 증폭을 위해
Tris-HCl 완충액(pH 7.4)	보스턴 바이오프로덕츠	R-314 시리즈	버퍼 구성 요소
UV 램프	UVP	95-0016-14	시각적 신호 관찰을 위해 AO를 여기시키기 위해
와류 믹서	VWR	10153-838	샘플 혼합에 사용