방법 논문

살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

DOI:

10.3791/68498

⸱

2025년 8월 22일

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1Department of Mechanical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Laser Biomedical Research Center, G. R. Harrison Spectroscopy Laboratory, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Mechanical Engineering, Politecnico di Milano, 4Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT and Harvard, 5Department of Molecular Biochemistry and Pharmacology, Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 살아있는 인간 유방암 세포의 무표지, 비침습적 표현형을 위해 라만 분광법과 단층촬영상 현미경을 결합한 다중 모드 접근 방식을 제시합니다. 여기에는 신속하고 정량적인 형태 화학 분석을 위한 사용자 친화적이고 인간 편견이없는 분석 파이프라인이 포함되어 있으며, 암 연구 및 세포 생물학에 응용하여 상세한 분자 및 구조적 통찰력을 제공합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)의 빠른 형태화학적 표현형을 위한 다중 모드 공초점 라만 현미세 분광법(RS) 및 단층촬영 위상 현미경(TPM)을 제시합니다. 이러한 고급 현미경 기술의 비섭동 특성을 활용하여 우리는 고유한 생리학적 환경에서 라벨이 없는 살아있는 세포로부터 상세한 형태 분자 데이터를 캡처했습니다. 초분광 라만 이미지(600cm-1에서 1800cm-1까지의 라만 모드에 걸쳐 광범위한 분자 결합 및 세포 내 구조를 고유하게 특성화함)와 3차원 굴절률 단층 촬영의 형태학적 데이터(나노미터 해상도에서 세포 부피, 표면적, 발자국 및 구형도 측정 제공)를 분석하기 위해 인간 편향 없는 데이터 처리 파이프라인이 개발되었습니다. 건조 질량 및 밀도와 함께). RS와 TPM이 제공하는 풍부한 단일 세포 세부 사항을 체계적으로 분석함으로써 종양 유방암 세포의 표현형을 분석하기 위한 이러한 다중 모드 현미경 방법의 이점을 정량적으로 입증합니다. 우리의 도구는 또한 라벨을 사용하지 않고도 세포하 정보에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, RS 및 TPM 파생 데이터 세트가 특징으로 하는 고유하거나 상관 관계가 있는 정보를 연구하고 논의합니다. 우리는 우리의 도구와 정량적 데이터 분석 파이프라인이 배양 중인 살아있는 세포에 대한 신속하고 비섭동적인 방법이 필요할 때 생물 의학 연구의 표현형 분석 작업에 혁명을 일으킬 수 있다고 믿으며, 향후 임상 및 진단 응용 분야로 전환될 가능성이 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 특성화 및 표현형 분석은 생물 의학 연구의 중추적인 측면입니다1. 형태학적 및 분자 수준 모두에서 세포를 특성화할 수 있는 능력은 세포 기능, 분화 및 병리학을 이해하는 데 가장 중요합니다 1,2,3. 종양 진단, 질병 단계 결정 및 궁극적으로 치료 표적 식별을 위해 정확한 세포 프로파일링이 필요한 종양학 분야에서 특히 흥미롭습니다2. 전통적인 세포 특성화 방법은 시간적 역학을 제공할 수 없으며 일반적으로 세포의 기본 상태를 방해하고 데이터 내에 잠재적인 편향을 도입할 수 있는 염색 또는 라벨링과 같은 침습적 기술을 기반으로 합니다4. 따라서 살아있는 세포의 자연적이고 교란되지 않은 상태에서 정확하고 철저한 표현형을 제공하기 위한 비침습적 전략이 점점 더 요구되고 있습니다.

이러한 맥락에서 무표지 다중 모드 이미징 방법은 형태학적 및 분자 정보를 모두 캡처하기 위해 보완적인 양식을 결합함으로써 세포 생물학 연구에 혁명을 일으켰습니다 2,5. 이러한 접근법은 개별 전통 기술이 항상 제공할 수 없는 세포의 통합적이고 비침습적인 특성화를 허용합니다 2,5,6. 예를 들어, 형광 현미경과 같은 현미경 기술은 형태학적 및 기능적 세포 이미징에 널리 사용되어 왔지만 고유한 한계가 있습니다. 형광 방법은 종종 광표백, 광독성 및 표적 가능한 분자의 양이 적어 분석 가능성을 제한합니다4. 또한, 이러한 접근법은 종종 외인성 표지 또는 염료의 사용을 필요로 하며, 이는 천연 세포 상태를 방해하거나 인공물을 유발할 수 있습니다7.

여러 이미징 양식의 강점을 결합한 다중 모드 이미징 플랫폼은 라벨링 없이 살아있는 세포에서 다양한 유형의 데이터를 수집할 수 있어 이러한 한계를 능가합니다. 라만 분광법(RS)을 위상차 현미경 또는 단층 촬영 위상 현미경(TPM)과 같은 다른 이미징 기법과 통합하는 것은 단일 기술의 한계를 극복하기 위한 유망한 전략이었습니다. 실제로, 다중 모드 이미징은 특히 분자 및 구조적 특성이 정확한 특성화에 중요한 암과 같은 복잡한 생물학적 조건 및 병리에서 세포 표현형에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다2,5.

무표지 RS는 세포의 화학적 이미징에 매우 적합합니다8. 분자 진동 모드를 검출함으로써 RS는 세포의 분자 구성에 대한 심층적인 정보를 밝힐 수 있는 생화학적 지문을 제공합니다 9,10,11. 생물학적 샘플에서 얻은 라만 스펙트럼에는 지질, 단백질, 핵산 및 대사 산물과 같은 다양한 생체 분자에 대한 정보가 포함되어 있으며, 이는 세포의 분자 특성을 이해하는 데 필수적인 역할을 합니다 9,12. RS의 주요 강점 중 하나는 비침습적이어서 생리적 상태를 변경하지 않고 자연 상태의 살아있는 세포의 특성을 분석할 수 있다는 것입니다.

많은 장점에도 불구하고 RS에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 실제로, RS는 상세한 분자 정보를 제공하지만, 세포의 형태나 구조에 대한 정량적 정보는 허용하지 않는다2. TPM과 같은 보완 이미징 기술이 중요한 역할을 하는 곳입니다.

TPM은 정량적 위상 이미징(QPI)13,14의 한 형태이며, 세포 형태에 대한 고해상도, 무표지 정량적 정보를 시각화할 수 있습니다15,16. TPM은 조영제가 필요하지 않다는 점에서 기존 현미경 기술과 다릅니다. 대신, 샘플(17)의 굴절률(RI)의 변화로 인한 위상 변이를 측정하여 작동합니다. 위상 변이는 부피, 표면적, 모양 및 내부 구조를 포함하여 셀의 구조적 특성에 대한 정보를 제공합니다 2,18. TPM은 나노미터 수준까지 높은 공간 해상도를 달성할 수 있으므로 살아있는 세포의 고해상도 형태학적 세부 사항을 기록하는 데 이상적인 기술입니다. 또한, 3D RI 단층 촬영을 재구성하는 능력은 생체 환경에서 세포 내 구조를 시각화할 수 있게 하여18 2D 투영에 비해 더 정확한 정보를 제공합니다. 그러나 TPM의 주요 한계 중 하나는 별개의 화학 성분을 구별하거나 생화학적 특징을 식별할 수 없는 상태에서 주로 세포의 형태와 상 분포에 대한 정보를 제공하기 때문에 화학적 특이성이 부족하다는 것입니다.

다중 모드 기술에서 RS와 TPM의 조합은 세포 표현형 분석에 이점을 제공합니다. RS는 풍부한 분자 정보를 허용하는 반면, TPM은 구조적 측면을 추가하여 세포 형태를 상당히 자세하게 분석할 수 있습니다. 최근 RS와 TPM의 조합은 암 연구에 초점을 맞춘 여러 연구에서 성공적으로 입증되었습니다 2,19,20. 예를 들어, 이전 연구에서는 라만 분광법을 홀로그램 위상 현미경 데이터와 공동 등록하면 상호 보완적인 분자 및 형태학적 정보를 제공하여 다양한 세포 유형 및 종양 발달 단계를 구별할 수 있다고 보고했습니다2. 이러한 조사는 특히 세포의 분자 및 구조적 특성이 악성 및 행동과 밀접하게 연관되어 있는 암의 맥락에서 세포 표현형의 정확성을 향상시키는 다중 모드 이미징의 힘을 강조했습니다 2,20.

다중 모드 이미징의 최근 발전에도 불구하고 특히 데이터 처리 및 분석에서 해결해야 할 과제가 여전히 있습니다21. 다중 모드 이미징 기술이 생성하는 대량의 데이터는 분석하기가 번거로울 수 있으며 의미 있는 정보를 추출하려면 간단한 절차를 사용해야 합니다. 이러한 문제에 대응하려면 데이터의 복잡성을 처리하고 분석에서 사람의 편향을 최소화하기 위해 사용자 친화적인 데이터 처리 파이프라인을 구축해야 합니다. 이러한 파이프라인은 결과의 정확성과 재현성을 달성하고 이러한 접근 방식을 임상 및 진단 응용 분야로 전환하는 데 매우 중요합니다.

현재 작업의 목표는 살아있는 단일 암세포의 무표지, 고속 및 비교란 표현형을 위해 RS와 TPM을 병합할 수 있는 잠재력을 설명하는 것입니다. 이 두 가지 강력한 이미징 접근법을 병합함으로써 우리는 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)의 분자 및 형태학적 특성에 대한 포괄적이고 정량적인 특성화를 제공합니다. 이 작업은 또한 다중 모드 데이터 세트에서 추출된 정보가 정확하고 신뢰할 수 있는지 확인하기 위해 인간 편견 없는 데이터 처리 파이프라인을 구축하는 것의 중요성을 강조합니다. 여기에서 우리는 다른 유형의 세포로 일반화될 수 있는 암세포 표현형을 위한 강력한 플랫폼을 구축하고자 합니다. 이 접근 방식의 다양성과 민감성으로 인해 기초 세포 생물학 연구부터 진단에 이르기까지 광범위한 생물의학 응용 분야의 잠재적 후보가 됩니다.

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프로토콜

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1. 샘플 준비

  1. MDA-MB-231 셀을 석영 페트리 접시에 시드합니다.
    1. MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 3.5cm 석영 유리 바닥 페트리 접시에 도금합니다.
    2. 표면에 완전히 부착될 때까지 5% CO2 환경에서 세포를 37°C에서 배양합니다(파종 후 최소 12시간).
  2. 세포를 세척하고 측정을 준비합니다.
    1. 페트리 접시에 부착된 세포에서 배양 배지를 제거합니다.
    2. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척하여 잔류 배지를 제거합니다.
    3. 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 전체 측정 절차 동안 세포를 배지로 덮어 생존력을 보장합니다.
      참고: 배양 배지로서 이 연구는 5% 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린(100 IU/mL)-스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 페놀 적색 프리 DMEM/F-12를 사용했습니다.

2. 고처리량 라만 현미경 시스템

참고: MDA-MB-231 세포의 살아있는 세포 이미징에 관한 현재 작업에 사용되는 집에서 만든 라만 현미경의 기술적 세부 사항은 이전에 설명되었습니다22. 간단히 말해서, 활용된 맞춤형 고처리량 라만 현미경 시스템은 532nm 레이저로 펌핑된 785nm Ti-Sapphire 레이저를 특징으로 합니다(그림 1A). 785nm 라만 여기 레이저는 749nm 이색성 거울을 사용하여 UPLSAPO60× 1.2 NA 수침 대물렌즈를 통해 샘플에 향하는 거꾸로 된 IX83 형광 현미경 본체에 결합됩니다. 편광판은 현미경의 후면 포트에서 평균 레이저 출력을 조정합니다. 명시야 이미징은 유사한 방식으로 백색광을 결합함으로써 가능합니다. 시스템은 이색성 필터를 자동으로 변경하여 라만과 명시야 모드 사이를 전환합니다. 이 시스템은 높은 처리량 이미징을 위해 galvo-mirror 기반 및 스테이지 스캐닝을 결합합니다. 사용자 정의 MATLAB 스크립트는 오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어, 데이터 수집 (DAQ) 보드 및 신호 감지 시스템과 상호 작용하여 데이터 수집 프로세스를 자동화합니다. 후방 산란 라만 광은 동일한 대물렌즈에 의해 수집되는 반면, 가시광선은 785nm 이색성 미러에 의해 필터링되어 NIR 분광기와 CCD (Charge-Coupled Device) 검출기로 향합니다. 이 설정을 통해 다차원 이미징이 가능하며 다양한 위치와 z-스택 2,22에서 명시야, 형광 및 라만 신호를 캡처할 수 있습니다.

  1. 라만 이미징 절차
    1. 샘플 준비 및 생리적 조건 보존
      1. 생리학적 조건을 유지하기 위해 샘플을 온스테이지 인큐베이터에 설치합니다. 인큐베이터가 온도 제어를 위한 실시간 피드백 조절과 함께 37°C로 설정되어 있는지 확인합니다.
      2. 증류수로 채워진 내부 주변 수조 장치를 사용하여 챔버 내 습도 수준을 >95%로 유지합니다. CO2 가스 컨트롤러를 설정하여 5%CO2 와 95% 공기를 혼합하여 인큐베이터 챔버에 공급합니다.
    2. 자동화된 침수 관리
      1. 집에서 만든 자동 수침 피더를 켜서 대물렌즈 팁에 접착된 주사기 펌프와 주사기 바늘을 사용하여 2 μL/min의 유속으로 대물 렌즈에 물을 공급합니다.
      2. 증발을 방지하기 위해 정기적으로 수위를 확인하고 측정 전반에 걸쳐 일관된 이미징 조건을 보장하십시오.
    3. 라만 분광법 데이터 수집
      1. 펌프 레이저를 켜고 출력을 조정하여 샘플 평면에서 75mW의 레이저 출력을 얻습니다.
      2. Micro-manager 오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어를 엽니다. Configuration settings(컨피그레이션 설정)에서 BF를 선택하고 소프트웨어 창 왼쪽에 있는 Live(라이브)를 클릭하여 명시야 이미지를 시각화합니다. 라만 스펙트럼을 획득할 원하는 단일 셀을 선택합니다. 그런 다음 중지를 클릭하여 명시야 시각화를 종료합니다.
      3. CCD 카메라의 신호 수를 최대화하여 라만 이미징 평면의 Z 좌표를 설정합니다.
      4. 이렇게 하려면 CCD 카메라 제어 소프트웨어(LightField)를 엽니다. 실험 설정에서 노출 시간을 1.5초로 설정합니다. 그런 다음 실험 도구 모음에서 실행을 클릭하고 레이저 빔을 켭니다.
      5. 그런 다음 Z 위치를 조정하여 지문 영역의 신호 수를 600cm-1에서 1800cm-1로 최대화하여 생물학적 시그니처와 관련된 라만 피크의 시각화를 최적화합니다. 그런 다음 레이저를 끄고 CCD 카메라 소프트웨어의 실험 표시줄에서 중지를 클릭하고 소프트웨어를 종료합니다.
        참고: CCD 카메라에서 최대화된 라만 신호 수는 석영 내부에 상당히 떨어지는 초점으로 인해 세포 관련 라만 피크의 흔적을 나타내지 않는 이미징 평면에 대해 +8μm와 일치하는 Z축을 따라 있는 위치와 일치하는 것으로 관찰되었습니다. 이 값은 셀 유형 및 상태에 따라 다를 수 있습니다.
    4. 다차원 측정에서 라만 채널을 자동으로 처리하고 초분광 라만 데이터를 저장하는 MATLAB 스크립트를 사용하여 데이터 수집 프로세스를 시작합니다.
    5. 시야를 50 × 50 μm2, 40 × 40 픽셀로 설정하고 각 픽셀 영역은 1.25 × 1.25 μm2에 해당합니다. 각 라만 스펙트럼의 노출 시간을 1.5초로 설정합니다.
      참고: 알려진 라만 피크에 주석을 달기 위해 아세타미도페놀 샘플을 사용하여 정기적으로 파수 보정을 수행합니다. 2차 보간을 통해 라만 이동 축을 보정합니다.
      주의 : 레이저를 조심스럽게 다루십시오. 설정 및 작동 중에는 항상 레이저 파장에 맞는 적절한 보호 안경을 사용하십시오.

3. RS 데이터 분석

  1. RamApp 웹 기반 도구(https://ramapp.io/)를 통한 후처리 라만 초분광 맵:
    1. 웹 기반 도구에 로그인합니다.
    2. 초분광 데이터를 가져옵니다. 내 분석 탭에서 새로 만들기 를 클릭하고 공간 및 스펙트럼 데이터 변수와 x축 변수(즉, 라만 이동 값)가 포함된 .mat 파일을 업로드합니다.
    3. 라만 시프트에서 지정된 영역으로 스펙트럼을 자르려면 자르기 및 회전 드롭다운 메뉴에서 스펙트럼 자르기를 클릭하고 라만 시프트 영역의 하쪽 경계와 위쪽 경계를 각각 600 cm-1 및 1800 cm-1로 정의합니다.
      참고: 이 스펙트럼 잘림을 수행하면 페트리 접시의 석영 재료와 관련된 광범위하고 진폭이 높은 피크가 분석에서 제외됩니다.
    4. 우주선에 대한 라만 스펙트럼을 수정하려면 노이즈 제거 옵션 내에서 Despike를 클릭하고 Z-점수를 방법으로 선택한 다음 임계값을 8로 설정합니다.
      참고: Despike 전처리 기능은 우주선으로 인해 발생하는 신호에 스파이크가 포함된 픽셀 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.
    5. 스펙트럼을 따라 강도의 첫 번째 이산 차이를 사용하여 이상값을 찾으려면 첫 번째 차이 사용 옵션을 선택하고 스파이크 수정 옵션을 선택합니다. 각 불량 픽셀의 스펙트럼은 인접한 픽셀의 중앙값 스펙트럼으로 대체됩니다.
    6. 실행을 클릭하여 스파이크를 수정합니다.
    7. 각 파수에 해당하는 맵에서 노이즈를 제거하려면 노이즈 제거 옵션 내에서 Smooth Map을 클릭하고 Median filter를 선택한 다음 맵의 각 픽셀에 필터를 적용할 때 고려되는 사각형의 한 변의 크기를 3픽셀로 설정합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.
    8. 필터를 적용하여 각 픽셀의 스펙트럼을 매끄럽게 하려면 노이즈 제거 선택 항목 내에서 스펙트럼 매끄럽게를 클릭합니다. Savitzky-Golay 필터를 방법으로 선택하고 필터 창의 길이를 7로 설정하고 필터의 다항식 차수를 2로 설정합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.
      참고: Savitzky-Golay 필터는 필터 창의 길이(양의 홀수 정수)와 다항식의 순서를 지정해야 합니다.
    9. 포그라운드에서 평균 배경 신호를 제거하려면 광학 기판 제거 패널을 열고 기판 식별을 클릭합니다. k-평균 을 메서드 로 설정하고 클러스터 수를 2로 설정합니다.
      참고: 이 기능은 클러스터링 접근 방식을 사용하여 세포("전경")와 기질을 분할합니다. 그런 다음 전경에서 평균 배경 신호를 제거하거나 일부 단계를 전경 픽셀에서만 작동하도록 제한할 수 있습니다. 선택할 클러스터의 수는 특정 표본에 따라 다를 수 있습니다.
    10. 고급 옵션에서 형태학적 청소를 선택하여 전경에서 작은 얼룩(예: 가짜 셀 부분 등)을 제거합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.
    11. 광학 기판 제거 패널에서 평균 배경 신호를 빼려면 기판 제거를 클릭한 다음 글로벌 평균(값의 중앙 95% 평균)을 선택하고 실행을 클릭합니다.
      참고: K-평균은 일반적으로 비결정적이지만 더 빠릅니다(그러나 무작위 시드가 고정되어 있기 때문에 다른 모든 것이 동일할 때 각 실행에서 동일한 결과를 얻을 수 있습니다). 전경의 특정 부분이 여전히 배경으로 인식되는 경우 클러스터 수를 2개 이상으로 늘릴 수 있습니다. 평균 신호가 가장 낮은 클러스터가 배경으로 정의됩니다.
    12. 기준선 형광을 보정하려면 기준선 패널을 열고 기준선 수정을 클릭합니다. asPLS(Adaptive Smoothness PLS) 를 선택하고 λ를 5000000으로 설정합니다. 그런 다음 실행을 클릭합니다.
      참고: 선택할 수 있는 7가지 방법이 있으며 그 중 5가지는 페널티가 부과된 최소 제곱(PLS)을 기반으로 합니다. 이러한 PLS 방법에서는 평활화 매개변수(λ)가 필요합니다. λ 값이 높을수록 기준선이 더 매끄러워집니다.
    13. 각 라만 초분광 맵을 Frobenius 노름으로 나누어 정규화하려면 기타를 클릭하고 정규화 옵션을 선택합니다. 그런 다음 메서드로 Frobenius를 선택하고 실행을 클릭합니다.
      참고: Frobenius 노름은 전체 데이터 행렬을 정규화하는 데 사용됩니다.
    14. 세포 내 구성 요소의 공간적 분포를 보여주는 거짓 색상 이미지를 얻으려면 오른쪽의 이미지 패널의 강도 이미지에서 열기 메뉴 기호를 클릭합니다. 그런 다음 이미지 편집 편집 옵션을 선택하여 편집 패널을 엽니다.
    15. 편집 패널에서 단일 밴드를 선택한 다음 스펙트럼 범위를 정의합니다(예: 세포질의 경우 715-725 cm-1). 색상 맵에서 이중 색상을 선택하고 색상, 강도 임계값 및 불투명도를 정의한 다음 확인을 클릭합니다.
    16. 단일 지점 스펙트럼을 다운로드하려면 이미지에서 관심 있는 픽셀을 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 스펙트럼 범례 패널의 커서 섹션에서 스펙트럼 다운로드를 클릭합니다. 다른 세포 내 구성 요소에 대해 동일한 절차를 반복합니다.
    17. 전경 및 기판 라만 스펙트럼을 내보내려면 스펙트럼 범례 패널의 기판 식별 섹션에서 전경 및 기판 섹션 모두에 대해 스펙트럼 다운로드를 클릭합니다.
      참고: 이전에 설명한 RS 데이터 분석 프로토콜에서는 주요 세포 내 구성 요소의 공간 분포, 전경 및 기질 모두의 라만 강도 스펙트럼 및 세포 내 구조의 단일 지점 스펙트럼을 보여주는 가색 이미지를 생성하기 위해 전처리 단계 및 단변량 분석이 설명되었습니다. 다운스트림 분석은 종종 특정 생물학적 질문에 맞게 조정되지만 이 연구는 이제 사용된 웹 기반 도구의 지도 분석 섹션을 통해 액세스할 수 있는 대표적인 다변량 및 분류 방법을 강조합니다. 여기에는 클러스터 분석, PCA (Principal Component Analysis), MCR (Multivariate Curve Resolution), N-FINDR 및 Spectral 피팅이 포함됩니다. 스펙트럼 피팅을 사용하면 Pearson Correlation Coefficient 또는 Spectral Angle Mapper와 같은 거리 기반 접근 방식을 사용하여 스펙트럼 특징을 정량화하고 비교할 수 있습니다. 클러스터 분석은 k-평균, 미니 배치 k-평균, 계층적 응집 클러스터링과 같은 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있으며, 스펙트럼 유사성을 기반으로 초분광 데이터의 분할을 용이하게 합니다. PCA를 적용하여 데이터 차원을 줄이고 분산 패턴을 강조 표시할 수 있으며, MCR을 사용하면 혼합 신호를 순수한 컴포넌트 스펙트럼으로 분해할 수 있습니다. N-FINDR 알고리즘은 먼저 PCA를 적용하여 차원을 줄임으로써 최종 멤버 스펙트럼 추출을 돕기 때문에 특히 초분광 데이터 세트에 적합합니다. 이러한 도구는 라만 스펙트럼 데이터에 인코딩된 생물학적 패턴의 다운스트림 탐색을 위한 강력한 프레임워크를 제공합니다.

4. TPM 측정 프로토콜

  1. 현미경 설정을 준비합니다.
    1. 현미경의 대물 렌즈에 증류수 한 방울을 놓습니다. 현미경의 번역 단계에 샘플을 배치합니다. 샘플 위치를 조정하여 대물 렌즈와 정렬합니다.
  2. 대물렌즈와 콘덴서 렌즈를 정렬합니다.
    1. 현미경을 켜고 TomoStudio 이미징 소프트웨어를 실행합니다. 도구 모음에서 현미경 아이콘을 클릭합니다. 초기화 후 구성을 클릭합니다. 작업 패널에서 LiveCell을 선택하고 PBS를 매체로 선택합니다.
      참고: PBS를 매체로 선택하면 Medium(매체) 패널의 RI 값이 자동으로 1.337로 설정됩니다.
    2. 이미징 소프트웨어의 제어판에서 보정 탭에 액세스합니다. 초점 (Focus) 과 표면(Surface) 을 각각 선택하여 대물렌즈와 콘덴서 렌즈의 축 위치를 설정합니다.
    3. 스캔 모드를 클릭하여 렌즈를 수동으로 조정하여 조명 패턴이 시야 중앙에 집중되어 거의 정지해 보이도록 합니다.
  3. 샘플을 찾습니다.
    1. 일반 모드를 클릭하고 변환 단계를 조정하여 셀을 시야에 배치합니다. 샘플 경계가 화면에서 거의 보이지 않을 때까지 대물 렌즈의 축 위치를 조정하여 샘플에 초점을 맞춥니다.
    2. 변환 단계를 조정하여 셀이 없는 영역을 찾아 방해받지 않는 시야를 보장합니다.
  4. 시스템을 보정합니다.
    1. 이미징 소프트웨어에서 보정 을 선택하여 다양한 조명 각도에서 여러 2D 홀로그램을 캡처합니다.
  5. 3D RI 단층 촬영을 획득합니다.
    1. 변환 단계를 조정하여 시야 내에서 셀을 중앙에 배치합니다. 획득 탭으로 이동하여 3D 스냅샷 을 선택하여 세포의 단층 촬영을 캡처합니다.
      참고: 단일 세포의 3D RI 단층 촬영에 대한 획득 시간은 RS 데이터에 필요한 획득 시간에 비해 훨씬 짧습니다(초 단위). 따라서 TPM을 위한 무대 인큐베이터의 채택은 일반적으로 필요하지 않습니다. 그러나 많은 수의 세포에 대한 측정을 수행하거나 특정 조건에서 생리학적 조건을 제공하는 전용 상업용 배양 챔버를 사용할 수 있으며 TPM 시스템에 통합할 수 있습니다.

5. TPM 데이터 분석

  1. TomoStudio 소프트웨어를 사용하여 TPM 맵을 후처리합니다.
    1. 홀로그램 단층 촬영을 시각화하려면 데이터 탐색 패널에서 데이터를 선택하고 데이터를 마우스 오른쪽 단추로 클릭한 다음 열기를 클릭합니다. 추가 분석을 위해 연구 탭이 자동으로 열립니다. 데이터 관리자 패널에서 RI 단층 촬영을 클릭합니다.
    2. 볼륨 시각화 패널에서 RI 를 선택하고 RI 캔버스 내에 4개의 직사각형 색상 상자를 그립니다.
      참고: 각 색상 상자를 사용하면 디스플레이 패널에 표시된 단층 촬영에서 RI 캔버스의 상자로 식별되는 RI 범위로 특징지어지는 세포 구성 요소에 특정 색상을 연결할 수 있습니다. 각 색상 상자를 그리면 관련 정보가 RI 캔버스 아래의 테이블에 자동으로 나타납니다.
    3. RI 캔버스 아래 패널에서 각 색상 상자에 대한 RI 범위 의 최소값과 최대값을 설정합니다(즉, 첫 번째 색상 상자: MinRI = 1.3450 및 MaxRI = 1.3499, 두 번째 색상 상자: MinRI = 1.3506 및 MaxRI = 1.3571, 세 번째 색상 상자: MinRI = 1.3586 및 MaxRI = 1.3650, 네 번째 색상 상자: MinRI = 1.3688 및 MaxRI = 1.3866). 불투명도 값과 색상(각 상자를 두 번 클릭하고 색상 선택)을 각 상자에 연결합니다. 이를 통해 3D RI 분포에 따라 단층 촬영을 시각화할 수 있습니다.
    4. 저장을 클릭하여 정의된 RI 범위 및 색상 상자를 저장합니다.
      알림: RI 범위는 특정 샘플에 따라 조정되어야 합니다.
    5. 세포 형태의 정량적 설명자(즉, 부피[V], 표면적[S], 투영 면적[A], 평균 RI, 밀도[D], 건조 질량[DM] 및 구형도[Φ])를 얻으려면 분석 인터페이스를 활용합니다.
      참고: 정량적 매개변수의 이론적 계산에 대한 자세한 내용은 2,23에서 찾을 수 있습니다.
      1. 도구 모음에서 분석을 클릭합니다. 오른쪽의 분석 패널의 세분화 패널에서 수동을 선택하고 1.3450을 RI 임계값으로 설정합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.
        참고: RII(fl/pg) 및 기준선 RI의 값이 각각 0.19(이전 조사24에 의해 널리 확립된 굴절 증분) 및 1.3370(PBS 배경 보정의 RI에 사용되는 PBS의 RI)인지 확인하십시오. 이미징 소프트웨어는 설정된 RI 임계값에 따라 표적 세포의 체적 분할을 수행하고 형태학적 지수(V, S, A, 평균 RI, D, DM 및 Φ)를 계산하여 측정 패널의 출력 테이블에 보고합니다.
      2. 저장을 클릭하여 계산된 형태학적 인덱스를 저장합니다.
        참고: 사용된 소프트웨어 외에도 TPM 데이터에서 형태학적 특성을 정량화하기 위해 여러 오픈 소스 도구를 사용할 수 있습니다. CellProfiler(https://cellprofiler.org/)는 위상차 이미지와 호환되는 분할 및 특징 추출을 포함한 이미지 분석 도구를 제공합니다. 피지(https://fiji.sc/)는 분할 및 형태학적 매개변수 계산을 위한 플러그인이 있는 오픈 소스 소프트웨어입니다25. Napari(https://napari.org/)는 세분화 및 분석을 위해 기계 학습 모델 통합을 지원하는 다차원 이미지 뷰어입니다. Ilastik(https://www.ilastik.org/)은 머신러닝 기반 세분화 도구를 제공하며, DeepImageJ(https://deepimagej.github.io/)는 고급 분석을 위해 딥러닝 모델을 ImageJ/Fiji와 통합합니다. 또한 MorphoLibJ(https://imagej.net/plugins/morpholibj)는 피지에서 2D 및 3D 형태학적 작업을 위한 도구를 제공합니다. Cellpose326 은 위상차 이미징에 적용할 수 있는 세포 분할을 위한 또 다른 딥 러닝 기반 도구입니다.

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결과

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우리는 공초점 RS 및 TPM을 기반으로 살아있는 세포의 무표지 형태화학적 특성화를 위한 워크플로를 설명했습니다. 우리는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231의 분자 구성 및 형태학적 매개변수를 달성하기 위해 제안된 워크플로의 능력을 테스트했습니다(그림 1).

MDA-MB-231 세포를 석영 유리 바닥 페트리 접시에 시딩했습니다. 785nm 연속파 레이저 여기에서 작동하는 맞춤형 공초점 라만 현미경(그림 1A)을 사용하여 600cm-1에서 1800cm-1 사이의 라만 이동(Ω) 범위, 즉 생물학적 물질의 라만 진동 프로파일의 지문 영역을 획득했습니다27. 각 단일 셀 라만 획득에는 약 40분이 걸렸습니다. 세포의 생리학적 조건은 측정 중에 온스테이지 인큐베이터를 사용하여 보존되었습니다. 또한...

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토론

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우리는 RS 및 TPM이라는 두 가지 고급 무표지 이미징 기술을 통합하는 다중 모드 접근 방식과 간단한 분석 파이프라인을 제시했습니다. 설명된 워크플로는 외부 라벨링 없이 살아있는 인간 유방암 단일 세포(MDA-MB-231)의 신속하고 비침습적인 형태화학적 표현형을 가능하게 했습니다.

RS는 분자 9,27,34,35의 진동 모드의 검출을 통해 생물학적 샘플의 생화학적 조성을 특성화할 수 있는 비파괴 기술입니다. RS는 물에서 라만 산란이 무시할 수 있기 때문에 수성 환경에 적합합니다. 이러한 장점은 광범위한 샘플 준비 없이 배양 조건에서 살아있는 세포의 정확한 분자 검사를 가능하게 합니다

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공개 사항

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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 MIT-이탈리아 재단의 Progetto Rocca, NIH 보조금(P41EB015871, UH3CA275687, R01DC021326), Apollon(대한민국 서울) 및 한국 국립암센터(NCC-24H1170)의 자금 지원을 받았습니다. Leonardo Bianchi는 매사추세츠 공과대학과 밀라노 공과대학에서 공동 연구를 수행하기 위해 Progetto Rocca 박사후 연구원을 수상했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CCD 카메라프린스턴 인스트루먼트PIXIS 100BR 엑셀론라만 산란 신호에 대한 검출기.
CCD 카메라 제어 소프트웨어프린스턴 인스트루먼트라이트필드
연속파 Ti-사파이어 레이저(파장: 785nm)스펙트럼 물리학3900초라만 현미경 여기에 사용됩니다.
이색성 거울토르랩스DMSP750B749nm 이색성 거울, 785nm 라만 여기를 샘플로 편향시키고 형광 및 명시야 신호를 필터링합니다.
태아 소 세럼써모 피셔 사이언티픽A5256701
형광현미경 본체올림푸스IX83 시리즈
레이저(파장: 532nm)스펙트럼 물리학밀레니엄 eV785nm Ti-Sapphire 레이저 시스템용 펌프 레이저.
MATLAB 소프트웨어매스웍스2023ᅡ
MDA-MB-231 세포주ATCCHTB-26
NIR 분광기안드로르홀로스펙 HS-HSG-785-LF후방 산란 빛의 스펙트럼 분석에 사용됩니다.
대물 렌즈 (60&1.2 NA 수침)올림푸스UPLSAPO60×
무대 내 배양 챔버도카이 히트stxg-웰x-세트
오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어µ 매니저마이크로 매니저-2.0
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)써모 피셔 사이언티픽15140122
페놀 프리 DMEM/F-12써모 피셔 사이언티픽21041025
인산염 완충 식염수깁코10-010-023
석영 유리 바닥 페트리 접시깨어난 B 테크SF-S-D12 시리즈
라만 데이터 분석 소프트웨어램앱라만 초분광 데이터 처리를 위한 웹 기반 도구.
sCMOS 카메라하마마츠 포토닉스오르카 플래시 4.0 v2
주사기 펌프케믹스퓨전 720
단층촬영상 현미경토모큐브, Inc.HT-2H정량적 위상 이미지를 얻기 위한 상용 시스템.
TPM 데이터 분석 소프트웨어토모큐브, Inc.토모스튜디오단층촬영 위상 현미경(TPM) 데이터를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어입니다.

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