살아있는 무표지 유방암 세포의 표현형 분석을 발전시키기 위한 다중 모드 이미징 프레임워크

요약

이 프로토콜은 살아있는 인간 유방암 세포의 무표지, 비침습적 표현형을 위해 라만 분광법과 단층촬영상 현미경을 결합한 다중 모드 접근 방식을 제시합니다. 여기에는 신속하고 정량적인 형태 화학 분석을 위한 사용자 친화적이고 인간 편견이없는 분석 파이프라인이 포함되어 있으며, 암 연구 및 세포 생물학에 응용하여 상세한 분자 및 구조적 통찰력을 제공합니다.

초록

우리는 인간 유방암 세포(MDA-MB-231)의 빠른 형태화학적 표현형을 위한 다중 모드 공초점 라만 현미세 분광법(RS) 및 단층촬영 위상 현미경(TPM)을 제시합니다. 이러한 고급 현미경 기술의 비섭동 특성을 활용하여 우리는 고유한 생리학적 환경에서 라벨이 없는 살아있는 세포로부터 상세한 형태 분자 데이터를 캡처했습니다. 초분광 라만 이미지(600cm-1에서 1800cm-1까지의 라만 모드에 걸쳐 광범위한 분자 결합 및 세포 내 구조를 고유하게 특성화함)와 3차원 굴절률 단층 촬영의 형태학적 데이터(나노미터 해상도에서 세포 부피, 표면적, 발자국 및 구형도 측정 제공)를 분석하기 위해 인간 편향 없는 데이터 처리 파이프라인이 개발되었습니다. 건조 질량 및 밀도와 함께). RS와 TPM이 제공하는 풍부한 단일 세포 세부 사항을 체계적으로 분석함으로써 종양 유방암 세포의 표현형을 분석하기 위한 이러한 다중 모드 현미경 방법의 이점을 정량적으로 입증합니다. 우리의 도구는 또한 라벨을 사용하지 않고도 세포하 정보에 대한 추가 통찰력을 제공합니다. 마지막으로, RS 및 TPM 파생 데이터 세트가 특징으로 하는 고유하거나 상관 관계가 있는 정보를 연구하고 논의합니다. 우리는 우리의 도구와 정량적 데이터 분석 파이프라인이 배양 중인 살아있는 세포에 대한 신속하고 비섭동적인 방법이 필요할 때 생물 의학 연구의 표현형 분석 작업에 혁명을 일으킬 수 있다고 믿으며, 향후 임상 및 진단 응용 분야로 전환될 가능성이 있습니다.

서론

세포 특성화 및 표현형 분석은 생물 의학 연구의 중추적인 측면입니다¹. 형태학적 및 분자 수준 모두에서 세포를 특성화할 수 있는 능력은 세포 기능, 분화 및 병리학을 이해하는 데 가장 중요합니다 ^1,2,3. 종양 진단, 질병 단계 결정 및 궁극적으로 치료 표적 식별을 위해 정확한 세포 프로파일링이 필요한 종양학 분야에서 특히 흥미롭습니다². 전통적인 세포 특성화 방법은 시간적 역학을 제공할 수 없으며 일반적으로 세포의 기본 상태를 방해하고 데이터 내에 잠재적인 편향을 도입할 수 있는 염색 또는 라벨링과 같은 침습적 기술을 기반으로 합니다⁴. 따라서 살아있는 세포의 자연적이고 교란되지 않은 상태에서 정확하고 철저한 표현형을 제공하기 위한 비침습적 전략이 점점 더 요구되고 있습니다.

이러한 맥락에서 무표지 다중 모드 이미징 방법은 형태학적 및 분자 정보를 모두 캡처하기 위해 보완적인 양식을 결합....

프로토콜

1. 샘플 준비

1. MDA-MB-231 셀을 석영 페트리 접시에 시드합니다.
   1. MDA-MB-231 인간 유방암 세포를 3.5cm 석영 유리 바닥 페트리 접시에 도금합니다.
   2. 표면에 완전히 부착될 때까지 5% CO₂ 환경에서 세포를 37°C에서 배양합니다(파종 후 최소 12시간).
2. 세포를 세척하고 측정을 준비합니다.
   1. 페트리 접시에 부착된 세포에서 배양 배지를 제거합니다.
   2. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척하여 잔류 배지를 제거합니다.
   3. 신선한 세포 배양 배지를 추가하고 전체 측정 절차 동안 세포를 배지로 덮어 생존력을 보장합니다.
      참고: 배양 배지로서 이 연구는 5% 태아 소 혈청(FBS) 및 페니실린(100 IU/mL)-스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 페놀 적색 프리 DMEM/F-12를 사용했습니다.

2. 고처리량 라만 현미경 시스템

참고: ....

결과

우리는 공초점 RS 및 TPM을 기반으로 살아있는 세포의 무표지 형태화학적 특성화를 위한 워크플로를 설명했습니다. 우리는 인간 유방암 세포주 MDA-MB-231의 분자 구성 및 형태학적 매개변수를 달성하기 위해 제안된 워크플로의 능력을 테스트했습니다(그림 1).

MDA-MB-231 세포를 석영 유리 바닥 페트리 접시에 시딩했습니다. 785nm 연속파 레이저 여기에서 작동하는 맞춤형 공초점 라만 현미경(그림 1A)을 사용하여 600cm-1에서 1800cm-1 사이의 라만 이동(Ω) 범위, 즉 생물학적 물질의 라만 진동 프로파일의 지문 영역을 획득했습니다²⁷. 각 단일 셀 라만 획득에는 약 40분이 걸렸습니다. 세포의 생리학적 조건은 측정 중에 온스테이지 인큐베이터를 사용하여 보존되었습니다. 또한.......

토론

우리는 RS 및 TPM이라는 두 가지 고급 무표지 이미징 기술을 통합하는 다중 모드 접근 방식과 간단한 분석 파이프라인을 제시했습니다. 설명된 워크플로는 외부 라벨링 없이 살아있는 인간 유방암 단일 세포(MDA-MB-231)의 신속하고 비침습적인 형태화학적 표현형을 가능하게 했습니다.

RS는 분자 9,27,34,35의 진동 모드의 검출을 통해 생물학적 샘플의 생화학적 조성을 특성화할 수 있는 비파괴 기술입니다. RS는 물에서 라만 산란이 무시할 수 있기 때문에 수성 환경에 적합합니다. 이러한 장점은 광범위한 샘플 준비 없이 배양 조건에서 살아있는 세포의 정확한 분자 검사를 가능하게 합니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CCD 카메라	프린스턴 인스트루먼트	PIXIS 100BR 엑셀론	라만 산란 신호에 대한 검출기.
CCD 카메라 제어 소프트웨어	프린스턴 인스트루먼트	라이트필드
연속파 Ti-사파이어 레이저(파장: 785nm)	스펙트럼 물리학	3900초	라만 현미경 여기에 사용됩니다.
이색성 거울	토르랩스	DMSP750B	749nm 이색성 거울, 785nm 라만 여기를 샘플로 편향시키고 형광 및 명시야 신호를 필터링합니다.
태아 소 세럼	써모 피셔 사이언티픽	A5256701
형광현미경 본체	올림푸스	IX83 시리즈
레이저(파장: 532nm)	스펙트럼 물리학	밀레니엄 eV	785nm Ti-Sapphire 레이저 시스템용 펌프 레이저.
MATLAB 소프트웨어	매스웍스	2023ᅡ
MDA-MB-231 세포주	ATCC	HTB-26
NIR 분광기	안드로르	홀로스펙 HS-HSG-785-LF	후방 산란 빛의 스펙트럼 분석에 사용됩니다.
대물 렌즈 (60&1.2 NA 수침)	올림푸스	UPLSAPO60×
무대 내 배양 챔버	도카이 히트	stxg-웰x-세트
오픈 소스 현미경 제어 소프트웨어	µ 매니저	마이크로 매니저-2.0
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	써모 피셔 사이언티픽	15140122
페놀 프리 DMEM/F-12	써모 피셔 사이언티픽	21041025
인산염 완충 식염수	깁코	10-010-023
석영 유리 바닥 페트리 접시	깨어난 B 테크	SF-S-D12 시리즈
라만 데이터 분석 소프트웨어	램앱		라만 초분광 데이터 처리를 위한 웹 기반 도구.
sCMOS 카메라	하마마츠 포토닉스	오르카 플래시 4.0 v2
주사기 펌프	케믹스	퓨전 720
단층촬영상 현미경	토모큐브, Inc.	HT-2H	정량적 위상 이미지를 얻기 위한 상용 시스템.
TPM 데이터 분석 소프트웨어	토모큐브, Inc.	토모스튜디오	단층촬영 위상 현미경(TPM) 데이터를 분석하는 데 사용되는 소프트웨어입니다.