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방법 논문

고강도 런닝머신 운동 훈련 후 적외선 요법이 뼈에 미치는 영향 조사

701 조회수

⸱

DOI:

10.3791/68502

⸱

2025년 8월 22일

 ,  ,  , 
1School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport, 2College of Athletic Performance, Shanghai University of Sport, 3Institute of Orthopedic Surgery, Xijing Hospital, Air force Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

장기간의 고강도 런닝머신 운동 훈련은 생쥐의 뼈 형성을 억제하고 뼈 흡수를 촉진하여 골량을 감소시킵니다. 여기에서는 고강도 운동으로 인한 골대사 변화에 대한 적외선 요법의 효과를 조사하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 기본 분자 경로를 밝히기 위해서는 추가 기계론적 연구가 필요합니다.

초록

뼈 조직은 인체의 중요한 하중 지지 기관입니다. 적당한 운동은 기계적 부하를 통해 골량을 증가시키는 반면, 고강도 운동은 이를 억제할 수 있습니다. 적외선 요법은 혈액 순환을 개선하고 통증/염증을 줄이며 조직 복구를 돕습니다. 이 논문은 고강도 운동으로 인한 골격 대사 장애에 대한 적외선 요법의 조절 효과와 그 분자 메커니즘을 밝히기 위한 프로토콜을 제시합니다. 본 연구에서는 6주령 생후 마우스 24마리를 무작위로 대조군(CTR, N=8), 고강도 트레드밀 운동 훈련(HIT, N=8), 고강도 트레드밀 운동 후 적외선 요법(IRT, N=8) 그룹으로 나누었다. 후자의 두 그룹은 8주 동안 훈련을 받았습니다. 첫 주에 쥐는 런닝머신 적응 훈련을 받았습니다. 두 번째 주에 마우스는 50분 동안 24m/min의 속도로 운동했으며, 80분 동안 28m/min에 도달할 때까지 매주 1m/min 및 10분의 속도로 증가했으며 6일 동안 5°의 기울기로 운동했습니다. 5주차에 HIT 그룹 마우스를 42°C에서 45°C 사이로 온도를 조절한 상태에서 전신 적외선 요법 개입을 받았습니다. 전체 치료 과정은 일주일에 3회, ~40분 동안 지속되었습니다. 그 결과 HIT군은 CTR군에 비해 골량/총량과 섬유주수가 유의하게 감소하고, 섬유주 분리가 유의하게 증가했으며, Atf4, Runx2, Ocn 의 골형성 관련 유전자가 하향 조절되었으며, Ctsk 및 Mmp9 의 파골세포 관련 유전자가 하향 조절되었습니다 상향 조정되었습니다. IRT군 마우스의 micro-CT 결과는 유의한 차이를 보이지 않았지만, 골형성 관련 유전자인 Alp, Atf4, Runx2, Ocn, Oxx 는 대퇴골에서 상향 조절되었다. 또한 파골세포 관련 유전자 Ctsk 가 하향 조절되었습니다. 장기간의 고강도 런닝머신 운동은 골량을 감소시킬 수 있습니다. 적외선 요법은 골밀도에 영향을 미치지 않지만 뼈 대사를 개선할 수 있습니다.

서론

골다공증(OP)은 특히 노인들 사이에서 널리 퍼져 있는 가장 흔한 전신 대사성 뼈 질환 중 하나이며 주요 글로벌 건강 문제를 나타냅니다1. OP는 주로 골밀도(BMD), 뼈의 질 및 뼈 강도가 감소하여 골절 위험을 증가시키는 것이 특징입니다2. OP의 예방 및 치료는 약물 요법, 칼슘 및 비타민 D의 적절한 섭취, 흡연 및 음주 감소, 최고 골량 수준을 높이고 유지하기 위한 조기 신체 운동과 같은 접근 방식을 포함하여 인간의 삶의 질을 향상시키는 데 중요합니다 3,4.

뼈는 신체의 구조적 틀로서 근본적인 모양을 제공하고 내부 장기를 보호합니다. 신경계의 조절에 따라 뼈는 근육 수축 중에 다양한 움직임을 촉진합니다. 뼈는 일생 동안 지속적인 형성, 흡수 및 리모델링을 거칩니다. 파골세포는 오래된 뼈를 지속적으로 흡수하는 반면, 조골세포는 새로운 뼈를 형성하고 광물화합니다. 이러한 과정은 긴밀하게 결합되고 상호 조절되어 뼈 회전율의 동적 균형을 유지합니다5. 수많은 연구에서 적절한 신체 운동(예: 유산소 운동 및 저항 운동)이 OP6을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있음을 보여주었습니다. 운동은 골격에 가해지는 기계적 스트레스(예: 지면 충격, 충격, 근육 부착 부위 긴장)와 혈액 순환의 생화학적 요인(예: 호르몬 및 사이토카인)을 조절하여 뼈 대사에 영향을 미쳐 뼈 건강을 촉진합니다7. 그러나 장기간의 고강도 운동은 뼈 건강에 부정적인 영향을 미쳐 뼈 손실로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 회전근개 손상 마우스 모델에서 고, 중, 저강도(속도 15m/min)로 런닝머신을 8주 동안 실행한 후, 골량/총량(BV/TV), 섬유주수(Tb.N) 및 섬유주 두께(Tb.Th)는 대조군 및 중등/저강도군에 비해 고강도군에서 가장 낮았다. 섬유주 분리(Tb.Sp)가 가장 높았습니다. 이 발견은 고강도 훈련이 회전근개 회복 및 골량에 해로운 영향을 미친다는 것을 시사합니다8.

적외선 요법(IRT)은 중국에서 재활 물리 치료 장치에서 가장 널리 사용되는 원리 중 하나입니다. 국소 혈액순환을 촉진하고 염증성 물질의 흡수를 촉진하며 영양분 공급을 강화합니다 9,10. 비침습적 물리치료법인 IRT는 최근 몇 년 동안 스포츠 의학, 재활 과학, 골대사 연구 분야에서 널리 주목을 받고 있습니다. IRT는 다른 개입보다 임상 환경에서 더 일반적으로 사용됩니다. 연구에 따르면 뼈 조직 치유는 염증 해소와 세포 재생을 포함한 복잡한 과정이며, 염증, 증식, 리모델링의 세 단계로 나눌 수 있습니다. 염증 단계는 주로 혈관신생을 특징으로 합니다. 증식 단계는 조골세포의 증식과 새로운 뼈의 형성을 포함합니다. 리모델링 단계는 굳은살 내에서 새로 형성된 섬유주가 점진적으로 증가하는 것으로 특징지어지며, 골절 간격을 가로지르는 다리 굳은살은 완전히 골화를 겪습니다11. 골절 후에는 혈관에서 조직으로 흐르는 혈액이 빠르게 흡수되어야 하며, 이는 조골세포 증식과 뼈 형성을 자극합니다. 이러한 중요한 과정에는 유리한 내부 환경과 지원을 위한 충분한 영양소가 필요합니다. 어느 정도의 온열 요법은 이러한 기능을 효과적으로 촉진할 수 있습니다12. 임상에서 적외선 요법은 골다공증을 치료하고 관련 증상을 완화하는 보조 수단으로 사용될 수 있지만 골량에 대한 연구는 상대적으로 제한적입니다. 이 논문은 고강도 운동으로 인한 골격 대사 장애에 대한 적외선 요법의 조절 효과와 그 분자 메커니즘을 밝히기 위한 프로토콜을 제시합니다. 따라서 이전 연구13를 기반으로 한 본 연구는 마우스에서 고강도 트레드밀 운동 모델을 구축하여 골량의 변화를 관찰하고 온열 요법이 고강도 트레드밀 운동으로 인한 뼈 손실을 완화할 수 있는지 여부를 추가로 조사합니다. 목표는 OP의 운동 기반 예방 및 치료를 위한 참고 자료를 제공하는 것입니다.

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프로토콜

본 연구는 상하이체육대학교 실험동물윤리위원회(제102772023DW016호)로부터 윤리적 승인을 받았으며 국가/기관 동물 연구 규정을 준수하였다. 24마리의 5주 된 수컷 C57BL/6 쥐를 상하이 체육 대학의 SPF 등급 동물 시설에 수용했습니다. 마우스는 22 ± 2°C, 습도 40-70%에서 12시간의 빛/암흑 주기로 사육되고 자유롭게 음식/ 물을 제공했습니다. 뼈, 혈액 및 RNA 추출 시약으로 처리된 샘플을 포함한 모든 생물학적 물질은 폐기 전에 121°C에서 60분 동안 멸균된 Biohazard Level II 오토클레이브 백에 수집해야 하며 실험실 폐기물 기록에 적절한 문서가 있어야 합니다.

1. 동물

  1. 순응 1주일 후, 마우스를 체중별로 계층화하고 무작위로 대조군(CTR 그룹, N=8), 고강도 트레드밀 운동 훈련(HIT, N=8) 및 고강도 트레드밀 운동 후 적외선 요법(IRT, N=8) 그룹.

2. 고강도 런닝머신 운동 훈련 및 온열 요법 개입 프로토콜

  1. 개입 없이 정적 조건에서 CTR 그룹에 먹이를 줍니다.
  2. 1주간의 적응 후, HIT 및 IRT 그룹의 마우스에게 8주간의 고강도 런닝머신 훈련을 실시합니다. 첫 주는 적응 단계로 간주됩니다: 런닝머신 그룹의 마우스를 12, 15 및 18m/min의 속도로 각각 20, 30 및 40분 동안 0° 경사로 달리게 합니다. 두 번째 주에는 마우스를 50분 동안 24m/min의 속도로 운동시킨 후 매주 1m/min, 10분씩 28m/min에 도달할 때까지 80분, 5°의 기울기로 운동량을 늘립니다. 이 운동 요법을 주 6일 수행하고 일요일에는 휴식을 취합니다(표 1).
  3. IRT군의 경우 4주간의 런닝머신 운동 후 5주차에 적외선 요법(IRT)을 도입합니다.
    알림: 적외선 조사 중에는 마우스 체온을 42°C에서 45°C 사이로 엄격하게 유지하십시오.
    1. 복강내 주사로 마우스를 마취하여 의식을 유발합니다.
    2. 적외선 치료 장치를 사용하여 마우스의 전신을 조사하여 마우스의 온도가 42°C에서 45°C 사이로 유지되도록 합니다(온도 감지기로 감지). 샘플을 채취할 때까지 4주 동안 일주일에 3회(월요일, 수요일, 토요일) ~40분 동안 전체 치료 과정을 수행합니다.

3. 조직 수집

참고: 해부된 마우스 뼈 샘플은 RNA 무결성을 유지하기 위해 액체 질소 또는 -80°C에서 즉시 보존해야 합니다.

  1. 혈청 샘플 수집 및 보존
    1. 전자 저울을 사용하여 모든 마우스의 무게를 측정합니다.
    2. 트리브로모에탄올의 복강내 주사를 통해 마우스를 마취합니다.
      알림: 트리브로모에탄올을 취급할 때는 항상 니트릴 장갑과 보안경을 착용한 상태에서 화학 연기 후드 아래에서 신선한 용액을 준비하고, 빛이 보호되는 호박색 바이알에 4°C에서 보관하고, 승인된 화학 폐기물 채널을 통해 사용하지 않은 부분을 폐기하십시오.
    3. 심장 천자를 사용하여 무균 상태에서 혈액 샘플을 채취하여 0.5-0.6mL의 혈액을 얻습니다. 먼저 쥐의 가슴털을 면도하고 요오도포로 소독합니다. 그 후, 최대 심장 박동 지점을 촉진하고 주사기에 부착된 4-5G 바늘을 왼쪽 흉강의 세 번째와 네 번째 늑간 공간 사이에 삽입합니다. 마지막으로 혈액이 주사기로 자발적으로 흐르는 것이 관찰되면 부드럽게 흡인하여 채혈 절차를 완료합니다.
    4. 혈액 샘플을 실온에서 10분 동안 응고시킨 다음 1,000 × g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 분취하여 상청액(혈청)을 -80°C에서 보관합니다.
  2. 뼈 샘플 수집 및 보존
    1. 멸균 마이크로 가위와 핀셋을 사용하여 대퇴골과 경골을 모두 해부합니다. 골막을 긁지 않고 세로축을 따라 뼈 표면의 근육과 힘줄을 부드럽게 벗겨내고 성장판 보호에 각별한 주의를 기울입니다.
    2. 모든 샘플을 1x PBS(pH 7.4)로 헹구십시오. 왼쪽 대퇴골을 4% 파라포름알데히드(PFA)에 24시간 동안 고정합니다. 추가 분석 전에 골밀도 측정을 위해 왼쪽 대퇴골을 사용하십시오.
    3. 오른쪽 대퇴골을 미리 표지된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣고 -80°C에서 보관합니다.
    4. 뼈 대사 분석을 위해 오른쪽 대퇴골과 양쪽 경골을 사용하십시오.

4. 매개변수 측정

  1. 혈당 수치 측정
    1. 조직 수집 전에 마우스의 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 채취하십시오. 휴대용 혈당 분석기를 사용하여 혈당 수치를 측정합니다.
  2. 혈중 젖산 수치 측정
    1. 마지막 런닝머신 운동 세션 직후 꼬리 정맥에서 혈액 샘플을 채취합니다. 휴대용 젖산 분석기를 사용하여 혈중 젖산 수치를 측정합니다.
  3. 로타로드 테스트
    참고: 모든 개입이 완료된 후 각 그룹의 마우스에 대해 로타로드 테스트를 수행했습니다. 로타로드 테스트를 수행할 때 한 그룹의 마우스를 먼저 테스트하는 대신 일관된 휴식 시간을 보장하기 위해 동시에 테스트할 여러 그룹의 마우스를 선택하므로 휴식 시간으로 인한 차이를 배제할 수 있습니다.
    1. 머리가 반대 회전 방향을 향하도록 회전 장치 위에 마우스를 놓아 한 번의 적응 시험을 허용합니다.
    2. 로타로드 속도를 30rpm으로 설정하십시오. 시동 후 장치는 설정 속도까지 균일하게 가속됩니다.
    3. 마우스가 처음 떨어질 때까지의 시간을 기록합니다. 이 측정을 사용하여 마우스의 운동 조정 능력을 평가합니다.
  4. 대퇴 섬유주 골량 측정
    1. 멸균 마이크로 가위와 겸자를 사용하여 뼈에 부착된 근육과 결합 조직을 제거하고 PBS로 세척합니다.
    2. 마이크로 CT 스캐닝을 수행하여 다음 스캐닝 매개변수를 사용하여 왼쪽 대퇴골의 섬유주골 매개변수를 평가합니다. 마이크로 CT 스캐닝은 9μm 등방성 복셀, 31.0mm FOV, 250ms 노출, 기본 해상도(388층/세그먼트) 및 1,200mgHA/cc BH 보정을 사용하여 연속 회전 모드에서 55kVp/145μA(8W)에서 수행되었습니다.
    3. 섬유주 및 피질 미세 구조의 다음 결과를 측정합니다.
      1. 재구성된 이미지를 CT-vox로 가져와 3차원(3D) 렌더링 및 시각화를 수행합니다.
      2. 다중 평면 보기(관상면, 시상 및 횡면)를 사용하여 피질골과 섬유주골을 별개의 조직 영역으로 분리하고 추출하여 형태학적 특성을 독립적으로 분석할 수 있습니다.
      3. 뼈 발달 및 광물화 상태를 평가하기 위해 뼈 부피/총 부피(BV/TV), 섬유주 수(Tb.N) 및 섬유주 두께(Tb.Th) 섬유주 분리(Tb.Sp)를 포함한 주요 미세 구조 매개변수를 정량화합니다.
  5. 파라핀 절편 및 조직학적 염색
    1. 각 그룹의 왼쪽 대퇴골 3개를 PBS로 세척하고 완전한 탈회가 발생할 때까지 10% EDTA(pH 7.15)에서 석회질을 제거합니다.
    2. 등급이 매겨진 에탄올 농도(70%, 90%, 95% 및 100%)를 통해 샘플을 탈수하고 자일렌으로 투명하게 하고 파라핀으로 침투한 후 포장합니다( 표 2 참조).
    3. 5.0μm 두께의 연속 섹션을 절단합니다.
    4. 헤마트실린 및 에오신(HE) 염색
      1. 슬라이스를 먼저 자일렌 탈랍, 구배 에탄올 재수화에 적용한 다음 헤마톡실린에 5분 동안 담가눕니다.
      2. 과도한 얼룩을 제거하기 위해 세척하고, 1% 염산 알코올로 3초 동안 분화하고, 에오신으로 3분 동안 염색하고, 등급이 매겨진 에탄올을 통해 탈수하고, 자일렌으로 제거하고, 중성 검으로 마운트합니다( 표 3 참조).
      3. 현미경 이미지를 캡처하여 골수 공동의 뼈 조직 구조와 세포 형태 및 분포를 관찰합니다.
    5. 타르타르산염 내성 산성 포스파타제(TRAP) 염색
      1. 자일렌으로 슬라이스를 탈랍하고 그라데이션 에탄올로 재수화합니다.
      2. 슬라이스를 TRAP 시약과 함께 37°C 오븐에서 1시간 동안 배양하고 탈수한 후 투명하게 합니다( 표 4 참조).
      3. 유리 슬라이드에 중성 수지 한 방울을 바른 다음 기포 형성을 최소화하기 위해 한쪽 가장자리에서 45° 각도로 커버슬립을 조심스럽게 내립니다. 현미경 관찰 및 이미징을 진행하기 전에 장착된 슬라이드를 연기에서 완전히 건조시키십시오.
  6. 경골 조직에서의 유전자 발현 분석
    1. 골수 격리
      1. 마우스 경골을 해부하고 멸균 도구를 사용하여 과도한 근육/근막을 제거합니다.
      2. 세척된 경골을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다.
      3. 멸균 가위로 뼈의 양쪽 끝을 자릅니다.
      4. 1x PBS를 사용하여 멸균 분쇄 비드가 들어 있는 분쇄 튜브에 골수를 씻어냅니다.
        참고: 공동이 창백하게 보이고 눈에 보이는 모든 골수 조직이 제거될 때까지 PBS로 골수강을 세척합니다.
    2. RNA 추출
      알림: 클로로포름/이소프로판올 폐기물은 지정된 할로겐화 용매 용기에 분리해야 하며 독성 가스 형성으로 인해 표백제와 혼합해서는 안 됩니다.
      1. 튜브당 1mL의 RNA 추출 시약을 추가합니다. 탁상용 균질화기(30초 펄스, 4°C)를 사용하여 샘플을 균질화합니다. 용해물을 실온에서 5분 동안 배양합니다.
      2. 200μL의 클로로포름을 넣고 15초 동안 소용돌이치고 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
      3. 12,000 × g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다.
      4. 상부 수성을 새 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 500μL의 이소프로판올을 넣고 10배 반전시켜 혼합한 다음 4°C에서 20분 동안 배양합니다.
      5. 12,000 × g 에서 4°C에서 30분 동안 원심분리합니다. RNA 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 버립니다.
      6. 펠릿을 75% 에탄올 1mL(DEPC 처리수로 준비)로 세척합니다. 잠시 소용돌이치고 7,500 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
      7. 흄 후드에서 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조시킵니다(과도한 건조를 피하십시오).
      8. RNA를 20-50μL의 DEPC 처리수에 용해시킵니다.
      9. 분광 광도계를 사용하여 농도와 순도(A260/A280 비율 ≥ 1.8)를 측정합니다.
    3. cDNA 합성
      1. 총 RNA 1μg과 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 합성합니다.
      2. qPCR 분석을 위해 cDNA를 -20°C에서 보관합니다.
    4. qPCR 분석
      1. 골형성 마커에 대한 유전자 발현 분석: Alp, Atf4, Runx2, Ocn, Osx; 파골세포 마커: Nfatc1, Mmp9, Ctsk; 사이토카인: Tnf-α, Il-1β, Il-10 ( 표 5 참조).
      2. 표 6에 나열된 프라이머 서열을 사용합니다(어닐링 온도 포함).

5. 통계 분석

  1. 모든 데이터를 평균의 표준 오차 ± 평균(평균 ± SEM)으로 표시합니다.
  2. 사후 테스트에는 Bonferroni 및 Tamhani를 사용하십시오.
  3. 그룹 간의 차이를 평가하기 위해 일원 분산 분석을 수행합니다.
  4. P< 0.05를 통계적으로 유의하다고 생각합니다.

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결과

장기간의 고강도 런닝머신 운동 훈련으로 인한 피로
우리는 운동 하의 골격 변화와 적외선 요법이 뼈에 미치는 영향을 연구하기 위해 장기 고강도 플랫폼 달리기 운동 모델을 구축했습니다(그림 1A). 개입이 끝날 때 마우스의 체중 변화를 관찰했습니다. CTR군 마우스의 체중과 비교하여, HIT군에서는 유의한 변화가 없었고, IRT군에서는 유의한 감소가 나타났다(그림 1B). 세 그룹 사이에 혈당 수치에 유의미한 차이가 없었습니다(그림 1C). 로타로드 테스트 데이터는 HIT 그룹에서 마우스의 낙하 시간이 CTR 그룹보다 유의하게 낮은 반면 IRT 그룹의 낙하 시간은 HIT 그룹보다 유의하게 높았습니다(그림 1D).

상승된 혈중 젖산 수치와...

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토론

모든 대사성 뼈 질환 중에서 OP는 가장 흔하고 주요 글로벌 공중 보건 문제입니다11. OP는 조골세포 및 파골세포 기능이 기능 장애가 있을 때 발생하며 유병률이 높습니다18. 운동은 비용이 저렴하고 부작용이 적으며 향후 OP 치료 및 예방에 큰 잠재력을 고려할 때 OP의 예방 및 치료를 위한 잠재적인 전략으로 의사와 연구자에 의해 점점 더 강조되고 있습니다. 운동이 뼈 대사를 조절하는 메커니즘은 직간접적인 영향을 포함하여 잘 연구되어 있습니다19. 운동 중에 발생하는 기계적 부하는 조골세포 분화 및 광물화에 대한 주요 자극이며 골량을 촉진할 수 있습니다20. 또한, 운동은 뼈 대사에 관여하는 에스트로겐, PTH 및 글루코코르티코이드의 수치를 조절하여 골량을 조절하는 역할을 할 수 있으며, 그 중 에...

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공개 사항

저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국가자연과학재단(제82172475호, 82222046호, 82272608호)의 지원을 받았습니다. 상하이 인간 스포츠 역량 개발 및 유지 핵심 연구소(상하이 체육 대학)(No. 11DZ2261100).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
원적외선 치료 기기  코포 메디컬 테크놀로지그런 다음 적외선을 열원으로 적용하여 피하 모세혈관 네트워크의 혈액을 따뜻하게 했습니다. 치료 온도는 42 > C 및 45 ° C, 전체 치료는 주 3회, 약 40분 동안 지속되었습니다
마이크로 CT스캔코 메디컬 AGVIVACT80BV/TV, Tb.N, Tb.Th, Tb.Sp 및 피질 두께(Ct.Th)를 포함하여 왼쪽 대퇴골의 섬유주골 매개변수를 평가하기 위해 Micro-CT 스캔을 수행했습니다. 
마우스 런닝머신안후이 Zhenghua 생물학적 장치 시설 Co., Ltd쥐에서 달리는 고강도 런닝머신
파라핀 매립 기계라이카파라핀 포매 기계는 조직을 포매할 수 있습니다.
파라핀 슬라이서라이카파라핀 마이크로톰은 조직을 절단할 수 있습니다
PrimeScript RT 시약 키트 
SPSS 
트리브로모에탄올 아버틴
트리졸 정확한 생물학AG21101/AG21102

참고문헌

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