CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

Xiaoxue Li; Yutian Peng; Wen Xue; Xuelian Liu; Si Luo; Ping Wei; Jiwu Wang

doi:10.3791/68503

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방법 논문

CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

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DOI:

10.3791/68503

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2025년 6월 13일

Xiaoxue Li^*¹^,² , Yutian Peng^*²^,³ , Wen Xue² , Xuelian Liu² , Si Luo⁴ , Ping Wei⁴ , Jiwu Wang²

¹Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, ²Clinical Research Institute, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ³Department of Clinical Laboratory, The Affiliated Nanhua Hospital, Hengyang Medical School, University of South China, ⁴Shanghai Diabetes Institute, Shanghai Key Laboratory of Diabetes Mellitus, Shanghai Clinical Center for Diabetes, Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

당사는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 벡터 간에 관심 DNA 단편을 전달할 수 있는 고처리량 클로닝 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle 클로닝)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

기존 게놈 저장소를 사용하여 게놈 전체 플라스미드 라이브러리의 개발은 다양한 생물학적 과정에 걸쳐 유전자의 체계적인 기능적 특성화를 위한 중추적인 전제 조건으로 작용합니다. 그러나 현재 inter-vector DNA fragment transfer를 위한 high-throughput 방법론은 클로닝 전에 타겟 염기서열의 PCR 증폭을 필요로 하기 때문에 게놈 규모의 plasmid collection 생성이 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 소요됩니다. CRISPRshuttle 카세트를 활용하여 새로운 고처리량 클로닝 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle 클로닝)을 개발했으며, 이는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 동일한 백본 염기서열을 공유하는 donor plasmid에서 CRISPRshuttle 호환 벡터로 많은 DNA 단편을 쉽게 전달할 수 있도록 합니다. 여기에서는 CRISPRshuttle을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 전에 두 번의 순차적 시험관 반응이 포함됩니다. 먼저, 타겟 DNA 단편은 공유 벡터 백본 염기서열의 Cas9 매개 절단에 의해 donor plasmid에서 절제됩니다. 둘째, 절제된 DNA 단편은 Gibson 어셈블리를 통해 선형화된 CRISPR셔틀 호환 벡터에 삽입됩니다. 본 연구의 결과는 CRISPRshuttle의 효율이 94%를 초과하며, 2명의 연구원이 CRISPRshuttle을 사용하여 7일 동안 약 300개의 플라스미드를 생성할 수 있음을 입증했습니다. CRISPRshuttle은 벡터 간 효율적이고 적응력이 뛰어나며 비용 효율적인 DNA 절편 전달을 촉진하여 게놈 전체 플라스미드 라이브러리 생성을 크게 간소화합니다.

서론

사용 가능한 자원에서 게놈 전체의 플라스미드 라이브러리를 구축하는 것은 생물학적 과정을 해부하기 위해 기능적 유전체학을 사용하기 위한 기초이자 전제 조건입니다. Gateway, In-Fusion, Creator 및 Univector 클로닝 시스템을 포함한 현재의 high-throughput 클로닝 방법은 타겟 DNA 단편의 PCR 증폭을 필요로 합니다 1,2,3,4,5. 이 전제 조건에는 올리고뉴클레오티드 프라이머 설계, 겔 정제 및 염기서열분석을 통한 염기서열 검증을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 표준화된 작업을 포함하는 단편별 처리 워크플로우가 수반됩니다. 그 결과, 게놈 차원의 플라스미드 라이브러리(예: cDNA/ORF 과발현 라이브러리)를 구축하는 것은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되어 기능성 유전체학의 발전을 저해하고 있습니다.

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