CRISPR 기반 셔틀 클로닝: High-throughput 클로닝 방법

Summary

당사는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 벡터 간에 관심 DNA 단편을 전달할 수 있는 고처리량 클로닝 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle 클로닝)을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

기존 게놈 저장소를 사용하여 게놈 전체 플라스미드 라이브러리의 개발은 다양한 생물학적 과정에 걸쳐 유전자의 체계적인 기능적 특성화를 위한 중추적인 전제 조건으로 작용합니다. 그러나 현재 inter-vector DNA fragment transfer를 위한 high-throughput 방법론은 클로닝 전에 타겟 염기서열의 PCR 증폭을 필요로 하기 때문에 게놈 규모의 plasmid collection 생성이 기술적으로 까다롭고 시간이 많이 소요됩니다. CRISPRshuttle 카세트를 활용하여 새로운 고처리량 클로닝 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle 클로닝)을 개발했으며, 이는 DNA 단편의 PCR 증폭 없이 동일한 백본 염기서열을 공유하는 donor plasmid에서 CRISPRshuttle 호환 벡터로 많은 DNA 단편을 쉽게 전달할 수 있도록 합니다. 여기에서는 CRISPRshuttle을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 박테리아 변형 전에 두 번의 순차적 시험관 반응이 포함됩니다. 먼저, 타겟 DNA 단편은 공유 벡터 백본 염기서열의 Cas9 매개 절단에 의해 donor plasmid에서 절제됩니다. 둘째, 절제된 DNA 단편은 Gibson 어셈블리를 통해 선형화된 CRISPR셔틀 호환 벡터에 삽입됩니다. 본 연구의 결과는 CRISPRshuttle의 효율이 94%를 초과하며, 2명의 연구원이 CRISPRshuttle을 사용하여 7일 동안 약 300개의 플라스미드를 생성할 수 있음을 입증했습니다. CRISPRshuttle은 벡터 간 효율적이고 적응력이 뛰어나며 비용 효율적인 DNA 절편 전달을 촉진하여 게놈 전체 플라스미드 라이브러리 생성을 크게 간소화합니다.

Introduction

사용 가능한 자원에서 게놈 전체의 플라스미드 라이브러리를 구축하는 것은 생물학적 과정을 해부하기 위해 기능적 유전체학을 사용하기 위한 기초이자 전제 조건입니다. Gateway, In-Fusion, Creator 및 Univector 클로닝 시스템을 포함한 현재의 high-throughput 클로닝 방법은 타겟 DNA 단편의 PCR 증폭을 필요로 합니다 1,2,3,4,5. 이 전제 조건에는 올리고뉴클레오티드 프라이머 설계, 겔 정제 및 염기서열분석을 통한 염기서열 검증을 포함하되 이에 국한되지 않는 여러 표준화된 작업을 포함하는 단편별 처리 워크플로우가 수반됩니다. 그 결과, 게놈 차원의 플라스미드 라이브러리(예: cDNA/ORF 과발현 라이브러리)를 구축하는 것은 노동 집약적이고 시간이 많이 소요되어 기능성 유전체학의 발전을 저해하고 있습니다.

이전에 당사는 특정 DNA 단편(예: UAS 모듈)을 동일한 벡터 backbone을 공유하는 여러 plasmid에 통합하도록 설계된 고처리량 클로닝 방법인 CRISPRmass를 개발했습니다⁶. CRISPRmass를 사용하여 초파리 cDNA/ORF 라이브러리, 초파리 유전체학 자원 센터( DGRC ) Gold Collection⁶에서 5,500개 이상의 GAL4/UAS 기반 UAS-cDNA/ORF 플라스미드를 구축했습니다. 그러나 CRISPRmass는 벡터 간에 DNA 단편을 전달할 수 있는 기능이 부족하여 고처리량 클로닝에 대한 적용이 제한됩니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 당사는 여러 표적 DNA 단편을 donor plasmid⁷에서 destination vector로 쉽게 전달할 수 있는 새로운 고용량 방법인 CRISPR 기반 셔틀 클로닝(CRISPRshuttle)을 개발했습니다. 이 공정은 단 두 번의 순차적 시험관 반응만 필요하므로 개별 DNA 표적⁷의 단편 특이적 처리에 대한 요구 사항을 피할 수 있습니다.

CRISPRshuttle 프로토콜에는 두 가지 순차적인 시험관 반응이 포함됩니다(그림 1). 먼저, donor plasmid의 공유 벡터 backbone sequence는 Cas9/sgRNA에 의해 절단되어 타겟 DNA 단편을 방출합니다. 그런 다음 이러한 단편은 Gibson 어셈블리를 통해 CRISPRshuttle 호환 벡터의 CRISPRshuttle 카세트로 전달되어 최종 플라스미드를 생성합니다. CRISPRshuttle 카세트는 donor plasmid에서 유래한 DNA 단편의 5' 및 3' 말단 측면에 위치한 ~20-40 bp 벡터 backbone sequence와 이러한 측면 염기서열 사이에 위치한 하나 또는 두 개의 고유한 제한 효소 인식 부위로 구성됩니다. CRISPRshuttle 호환 벡터는 CRISPRshuttle 카세트를 destination 벡터에 삽입하여 구성되며, 이는 이후에 카세트 내의 제한 부위를 소화하여 선형화됩니다. 목적지 벡터는 공여자 플라스미드의 유전자와 구별되는 항생제 내성 유전자를 가지고 있어야 합니다. 동일한 경우, 내성 유전자는 사용하기 전에 별개의 유전자로 교체해야 합니다.

여기에서는 CRISPRshuttle을 사용하여 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 라이브러리를 구축하는 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로세스에는 CCSB-Broad Lentiviral Expression Library에서 Drosophila transgenesis vector pBID-UASC ^8,9로 human ORF를 전송하는 작업이 포함됩니다. CRISPRshuttle은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리의 구축을 간소화하여 기능적 유전체학 연구를 촉진합니다.

Protocol

1. cDNA/ORF를 둘러싼 최적의 Cas9/sgRNA 절단 부위 측정

1. cDNA/ORF 플라스미드 준비
   1. 공용 저장소에서 cDNA/ORF 클론을 가져옵니다.
      참고: 이 프로토콜은 human CCSB-wide Lentiviral expression library⁸의 pLX304 벡터 기반 ORF 클론을 사용합니다.
   2. plasmid miniprep kit를 사용하여 plasmid를 분리하고 분광 광도계로 농도를 측정합니다.
2. sgRNA 디자인
   1. CHOPCHOP 웹사이트(https://chopchop.cbu.uib.no/)에 접속합니다. ORF 3' 말단 옆에 있는 pLX304 벡터 백본의 20-100bp 영역을 타겟 필드에 붙여넣습니다.
   2. 종으로 Drosophila melanogaster를 선택하고 대상 사이트 찾기를 클릭합니다. 80% 이상의 효율을 가질 것으로 예상되는 sgRNA 후보물질을 선정합니다.
3. sgRNA 제제
   1. 순방향 프라이머(5'-TAATACGACTCACTATAGG(N)₂₀GTTTTAGAGCTAGAAATAG-3')를 합성하고, 여기서 (N)₂₀ 은 sgRNA 타겟 염기서열을 나타내고, 역방향 프라이머 sgRNA-REV(5'- AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTT-3')를 합성합니다.
      참고: PAGE-purified 프라이머를 권장합니다.
   2. PCR을 통해 sgRNA 체외 전사(IVT)를 위한 DNA 템플릿을 생성합니다. 템플릿 pX330 (Addgene plasmid 42230; 0.1 ng/μL), forward primer (10 μM) 및 sgRNA-REV primer (10 μM) 각각을 5 μL 함유하는 100 μL 반응을 준비합니다. 50μL의 2x 고충실도 PCR 마스터 믹스; 및 디에틸 피로탄산염(DEPC) 처리된 초순수 35μL.
   3. 다음 프로그램을 사용하여 PCR Thermal Cycler에서 증폭 : 98 ° C에서 30 초; 8초 동안 98°C, 15초 동안 52°C, 5초 동안 72°C의 5개 사이클; 8초 동안 98°C, 20초 동안 72°C의 30주기; 72 °C에서 2 분간
   4. PCR 산물을 0.8% 아가로스 겔로 분해합니다. ~120-bp 밴드를 절제하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다.
   5. 정제된 DNA 단편 300ng, NTP 완충액 혼합물 3.33μL, T7 RNA 중합효소 혼합물 0.67μL 및 DEPC 처리된 초순수를 포함하는 10μL IVT 반응을 준비합니다. 37 ° C에서 4 시간 동안 배양하십시오.
   6. 분광광도계로 정제되지 않은 sgRNA를 정량화하고, DEPC 처리된 초순수로 20ng/μL로 희석하고, 작은 부분 표본에서 -80 °C에서 동결합니다.
      참고: 잔류 DNA가 다운스트림 반응을 방해하지 않으므로 DNase 처리는 필요하지 않습니다.
4. sgRNA 평가
   1. 제한 효소를 사용하여 pLX304 벡터 골격을 포함하는 cDNA/ORF 플라스미드를 분해합니다. 생성된 DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔을 통해 분해합니다. 겔 추출 키트를 사용하여 DNA 기질을 정제합니다.
   2. 0.2 μL의 1.22 μM S. pyogenes Cas9, 0.5 μL의 20 ng/μL sgRNA, 0.015 pmol의 DNA 기질, 0.5 μL의 10x Cas9 완충액 및 DEPC 처리된 초순수를 포함하는 5 μL Cas9 절단 반응 혼합물을 준비합니다. 37°C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
   3. 0.8% 아가로스 젤을 사용하여 분열 산물을 해결합니다. 절단되지 않은 DNA 기질을 negative control로 포함합니다.
   4. 디지털 이미징 시스템을 사용하여 절단 패턴을 시각화하고 후속 실험을 위해 잔류가 없는 기질이 최소화된 sgRNA를 선택합니다(그림 2).

2. 목적지 벡터의 항생제 내성 유전자 스왑

참고: 이 프로토콜에서는 목적지 벡터 pBID-UASC의 암피실린 내성 유전자를 클로람페니콜 내성 유전자로 교환하여 클로람페니콜 함유 목적지 벡터 pBIDC-UASC를 생성하는 예를 사용합니다.

1. pBID-UASC에서 암피실린 내성 유전자를 제거합니다.
   참고: pBID-UASC의 암피실린 내성 유전자는 두 개의 sgRNAs, f1Ori5-G4 (타겟 sequence: 5'-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3') 및 Amp3-G2 (target sequence: 5'-GGAACGAAAACTCACGTTAA-3')와 함께 Cas9 digestion에 의해 제거되었으며, 그 결과 7,687 bp linear pBID-UASC vector backbone이 생성되었습니다. 이 두 sgRNA는 각각 암피실린 내성 유전자의 5' 업스트림 및 3' 다운스트림을 표적으로 합니다.
   1. pBID-UASC 0.03 pmol, 1.22 μM S. pyogenes Cas9 0.25 μL, f1Ori5-G4 20 ng, Amp3-G2 20 ng, 1 μL 10x Cas9 Buffer 및 DEPC 처리된 초순수를 포함하는 10 μL 절단 반응을 준비합니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 정제되지 않은 Cas9-cleaved plasmid는 Gibson 어셈블리에 직접 적용됩니다.
2. 클로람페니콜 내성 유전자를 PCR 증폭합니다.
   참고: 840bp 클로람페니콜 내성 유전자를 f1Ori5-Cam-F(5'-TTACAATTCACTGGCC)를 사용하여 PCR을 통해 플라스미드 pMartini-Cam⁶ 에서 증폭했습니다.
   GTCGCGTATGTGTATGATACATAAGGTT-3') 및 Amp3-Cam-R(5'-AGTGGAACGAAAACTCAC
   GTAATTCTCATGTTTGACAGC-3') 프라이머.
   1. 840 bp 클로람페니콜 내성 유전자를 PCR 증폭하여 클로람페니콜 내성 유전자를 준비합니다. 2 μL의 pMartini-Cam (0.1 ng/μL), 1 μL의 f1Ori5-Cam-F (10 μM), 1 μL의 Amp3-Cam-R (10 μM), 4 μL의 5x buffer, 0.4 μL의 dNTPs (10 mM), 0.4 μL의 high-fidelity DNA polymerase (2.5 units/μL), 11.2 μL의 초순수를 포함하는 20 μL PCR 반응을 설정합니다.
   2. 다음과 같은 열순환 조건을 사용하여 PCR을 수행하십시오 : 1 분 동안 95 ° C의 1 사이클; 15초 동안 95°C, 15초 동안 46°C, 20초 동안 72°C의 5사이클; 95°C에서 15초, 61°C에서 15초, 72°C에서 20초의 30주기; 2분 동안 72°C의 1사이클. 열 순환기에서 반응을 수행합니다.
   3. 0.8% 아가로스 겔로 절단 산물을 분리하고 겔 추출 키트를 사용하여 840bp DNA 단편을 정제합니다.
3. 클로람페니콜 내성 유전자를 선형화된 pBID-UASC 벡터 백본에 삽입하여 pBIDC-UASC를 생성합니다.
   1. 2 μL Gibson 어셈블리 반응을 수행합니다: 840 bp 클로람페니콜 저항성 유전자 0.008 pmol, 선형화된 pBID-UASC 0.002 pmol(단계 2.1.1), 2x Gibson 어셈블리 마스터 믹스 1.0 μL. 50°C에서 1시간 동안 반응을 수행합니다.
   2. 10 μL의 E. coli competent cell을 1 μL의 ligation 반응 산물로 형질전환시킵니다. 15 μg/mL chloramphenicol이 보충된 LB 플레이트에서 형질전환체를 선택합니다.
   3. 단일 콜로니를 선택하고 후속 박테리아 배양 및 플라스미드 miniprep에 적용합니다. 제한 분석 및 DNA 염기서열분석을 통해 클로람페니콜 함유 목적지 벡터 pBIDC-UASC를 검증합니다.

3. CRISPR셔틀 호환 목적지 벡터의 구성

참고: CRISPRshuttle 카세트는 타겟 DNA 단편의 5' 및 3' 말단 양쪽에 위치한 약 20-40 bp 벡터 백본 염기서열로 구성되며, 그 사이에 하나 또는 두 개의 고유한 제한 부위가 있습니다.

1. 다음 프로그램으로 열 순환기를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 어닐링합니다: 94°C에서 2분; (95-N) °C에 52 s의 70 주기, 여기서 N는 주기 수를 나타냅니다.
   참고: 어닐링된 CRISPRshuttle 카세트에는 EcoRI 및 XbaI를 보완하는 5' 오버행이 포함되어 있습니다.
2. 어닐링된 CRISPRshuttle 카세트를 EcoRI/XbaI로 분해된 destination vector pBIDC-UASC에 연결하여 CRISPRshuttle 호환 destination vector pBIDC-UASC-pLXvect를 생성합니다.
   참고: 이 ligation은 여러 클로닝 부위 내에서 원래의 EcoRI 및 XbaI 부위를 제거하여 CRISPRshuttle 카세트 중간에 있는 EcoRI 및 XhoI 부위를 최종 벡터에서 고유하게 만듭니다. CRISPRshuttle 카세트의 고유한 제한 부위를 통해 CRISPRshuttle 호환 대상 벡터의 선형화가 가능합니다.
   1. 14ng의 8,451bp EcoRI/XbaI로 분해된 pBIDC-UASC, 0.02pmol의 어닐링된 CRISPRshuttle 카세트, 0.5μL의 10x T4 DNA 리가제 완충액, 0.3μL의 T4 DNA 리가제를 포함하는 5μL 결찰 반응을 준비합니다. 16 °C에서 밤새 반응을 배양합니다.
   2. 10 μL의 E. coli 수용 세포를 1 μL의 ligation 반응 산물로 형질전환시킵니다. 15 μg/mL 클로람페니콜이 보충된 LB 플레이트에서 형질전환체를 선택하고 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
   3. 단일 콜로니를 선택하고 후속 박테리아 배양 및 플라스미드 miniprep에 적용합니다. 제한 분석 및 DNA 염기서열분석을 통해 CRISPRshuttle과 호환되는 destination vector pBIDC-UASC-pLXvect 를 검증합니다.

4. CRISPRshuttle을 이용한 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 생성

참고: CRISPRshuttle 프로토콜은 박테리아 형질전환 전에 병렬로 수행되는 2단계 시험관 반응을 포함합니다(그림 1).

1. 시험관 반응 단계 1
   1. 두 개의 sgRNAs, pLX304-CMV-G1⁶ (타겟 서열: 5'-GAGCTCTCTGGCTAACTGTC-3', pLX304 벡터 백본 측면 ORF 5' 말단에 국한) 및 pLX304-3'-G1 (타겟 서열: 5'-TTGGTCTTAAAGTCGACGCG-3', pLX304 벡터 백본 측면 ORF 3' 말단에 국한)과 함께 Cas9를 사용하여 벡터 백본을 절단하여 pLX304-ORF 플라스미드에서 ORF를 절제합니다.
      1. 다음과 같이 주어진 수의 (N)소화 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다: (N+1) x 0.4 μL 1.22 μM S. pyogenes Cas9, (N+1) x 0.5 μL 80 ng/μL pLX304-CMV-G1 0.5 μL, (N+1) x 0.5 μL 80 ng/μL pLX304-3'-G1, (N+1) x 0.4 μL 10x Cas9 완충액, (N+1) x 1.45 μL DEPC 처리된 초순수.
      2. 철저히 혼합하고 마스터 믹스를 스핀 다운합니다. 마스터 믹스의 3.75μL를 각 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 0.75 μL의 0.03 μM pLX304-ORF 플라스미드를 추가합니다. 철저히 혼합하고 37 ° C에서 1 시간 동안 반응을 배양합니다.
         참고: DEPC 처리된 초순수로 각 pLX304-ORF 플라스미드를 0.03μM 농도로 희석합니다. 농도가 0.03 μM 미만인 경우 플라스미드 DNA를 반응에 직접 첨가합니다. Cas9-절단된 플라스미드는 절단 반응 후 정제할 필요가 없으며 후속 Gibson 조립에 직접 사용할 수 있습니다.
2. 시험관 반응 단계 2
   1. Gibson 어셈블리를 통해 절제된 ORF를 CRISPRshuttle 호환 대상 벡터 pBIDC-UASC-pLXvect 에 삽입하여 UAS-cDNA/ORF 플라스미드를 생성합니다.
      1. EcoRI 및 XbaI을 사용하여 pBIDC-UASC-pLXvect 다이제스트. 아가로스 겔 전기영동에 의해 선형화된 pBIDC-UASC-pLXvect 분리하고 겔 추출 키트를 사용하여 정제합니다.
      2. (N+1) x 0.14μL의 3.36μM 선형화된 pBIDC-UASC-pLXvect 및 (N+1) x 1.8μL의 Gibson 어셈블리 마스터 믹스와 같이 주어진 수(N)의 Gibson 어셈블리 반응에 대한 마스터 믹스를 준비합니다.
      3. 철저히 혼합하고 마스터 믹스를 스핀 다운합니다. 마스터 믹스 1.94μL를 각 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 1.66 μL의 Cas9-cleaved plasmid를 추가합니다. 철저히 혼합하고 50 ° C에서 1 시간 동안 반응을 배양합니다.
         알림: 배양 전에 마스터 믹스와 튜브를 50°C에서 얼음으로 유지하십시오.
3. Gibson 조립 제품으로 E. coli 를 변형하십시오.
   참고: Gibson 조립 제품은 대장균 형질전환 전에 정제가 필요하지 않습니다.
   1. 얼음 위에서 박테리아 수용 세포를 해동합니다. 10μL의 세포를 사전 냉각된 각 1.5mL 튜브에 분취합니다.
      참고: 형질전환 효율이 1 × 10⁸ CFU/μg 이상의 pUC19 DNA를 가진 유능한 박테리아 세포를 사용하는 것이 좋습니다.
   2. 10 μL의 competent cell과 1 μL의 Gibson 어셈블리 제품을 부드럽게 혼합합니다. 얼음 위에 30분 동안 놓습니다.
   3. 42°C에서 1분간 열충격을 가한 후 얼음에서 2분간 식힙니다.
   4. 각 튜브에 100μL의 예열된 SOC 배지(37°C)를 추가합니다. 250 rpm으로 37 °C에서 1 시간 동안 흔듭니다.
   5. 15μg/mL 클로람페니콜이 함유된 LB 플레이트에 세포를 놓습니다. 37 °C에서 밤새 배양합니다.
      참고: 이러한 절차를 대규모로 수행하려면 일반적으로 몇 시간이 걸립니다. 달리 명시되지 않는 한, 시약과 반응 설정을 모두 얼음 위에 보관하십시오.
4. UAS-cDNA/ORF 플라스미드 검증.
   1. 4.5mL의 LB 배지에 있는 단일 콜로니에 15μg/mL 클로람페니콜을 접종합니다. 37°C에서 밤새 250rpm으로 흔듭니다.
   2. plasmid mini-prep kit를 사용하여 plasmid DNA를 분리합니다.
   3. 300-500 ng의 플라스미드 DNA, 0.3 μL의 PvuII, 2 μL의 10x 완충액 및 초순수를 포함하는 각 플라스미드에 대해 20 μL 제한 분해 반응을 준비합니다. 37°C에서 1시간 동안 반응을 수행합니다.
   4. DNA 단편을 0.8% 아가로스 겔로 분해합니다. 자외선 아래의 이미지(그림 3).

Results

우리는 CRISPRshuttle을 사용하여 초파리⁷에 보존된 1,397개의 인간 유전자를 포함하는 UAS-cDNA/ORF 플라스미드 컬렉션을 구축했습니다. 제한 분석에 따르면 CRISPRshuttle은 두 개의 반복 시퀀스를 포함하는 CRISPRshuttle 호환 destination vector를 사용하는 경우 94.5%의 효율에 도달하고 반복 sequence⁷이 없는 destination vector를 사용하는 경우 96.1%의 효율성에 도달하는 것으로 나타났습니다. 우리의 데이터는 일반적으로 두 명의 연구자가 7일 이내에 CRISPRshuttle을 통해 ~300개의 플라스미드를 생성할 수 있음을 보여주었습니다⁷. 성공적인 CRISPR셔틀 매개 cDNA/ORF 단편 전달은 진단 제한 분해를 통해 검증되었습니다. CRISPRshuttle 호환 목적지 벡터(pBIDC-UASC-pLXve...

Discussion

CRISPRshuttle 프로토콜의 중요한 단계는 선형화된 CRISPRshuttle 호환 destination vector를 준비하는 것입니다. 완전한 분해를 보장하려면 과도한 제한 효소를 사용하여 벡터를 분해하고 분해된 벡터의 겔 정제를 강력히 권장합니다. 또 다른 중요한 단계는 Cas9으로 cDNA/ORF 플라스미드를 분해하는 것입니다. 플라스미드 구조가 실패하면 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 공여자 플라스미드에서 최소한 부분적인 cDNA/ORF가 방출되었는지 확인합니다. 또는 Gibson 조립을 진행하기 전에 전기영동으로 모든 플라스미드의 분해를 확인합니다. CRISPRshuttle은 일반적으로 부분적인 cDNA/ORF가 방출되는 한 효과적으로 작동합니다. cDNA/ORF가 donor plasmid에서 거의 방출되지 않는 경우 plasmid를 다시 추출합니다.

human CCSB-Broad Lentiviral E...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
한천 분말	켐베이스	KBS-001H
아가로스	상곤	A600014-0100
자동 디지털 겔 이미지 분석 시스템	타논	타논-2500B
클로람페니콜	상곤	A100230-0010
E.Z.N.A. 젤 추출 키트	오메가	D2500-02
E.Z.N.A. 플라스미드 DNA 미니 키트 I	오메가	D6942-02
에코리-HF	NEB	R3101S
Gibson 어셈블리 마스터 믹스	NEB	E2611S
HiScribe T7 빠른 고수율 RNA 합성 키트	NEB	2050년
NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 마스터 믹스	NEB	E2621X
PCR 열 순환기	롱진	T20
플래티넘 슈퍼파이 II DNA 중합효소	써모 사이언티픽	12361010
PVUII-고폭	NEB	R3151L
Q5 핫 스타트 하이파이 2x 마스터 믹스	NEB	M0494
S. 화농성 Cas9	젠스크립트	Z03386
쉐이킹 인큐베이터	지추	ZQLY-180V
분광 광도계	시마즈	바이오스펙-나노
T4 DNA 리가아제	프로메가	M1801
Trans 10 화학적으로 유능한 세포	트랜스젠	CD101-02
트립톤	옥소이드	LP0042
엑스바이	NEB	R0145S
효모 추출물	옥소이드	LP0021