방법 논문

생체 내 Paramecium tetraurelia의 단백질 상호 작용 연구를 위한 근접 비오티닐화

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DOI:

10.3791/68504

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2025년 9월 12일

 ,  ,  , 
1Institute of Cell Biology, University of Bern, 2Graduate School for Cellular and Biomedical Sciences, University of Bern

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 관심 단백질에 융합된 비오틴 리가아제에 대한 근접성을 기반으로 단백질에 비오틴의 생체 내 공유 결합 방법을 제시합니다. 이 변형을 통해 단백질 상호작용 연구에서 필요에 따라 스트렙타비딘 비드를 사용하여 단백질을 선택적으로 농축할 수 있습니다.

초록

Paramecium 은 减수분열 생식 중 프로그래밍된 게놈 재배열 및 트랜스포존 제거와 관련된 분자 메커니즘 연구를 위한 주요 모델 유기체입니다. 이 과정의 많은 세부 사항은 관련된 분자 기계의 복잡성과 일시적인 단백질-단백질 상호 작용으로 인해 수수께끼로 남아 있습니다. 여기에서는 관심 있는 표적 단백질에 가까운 곳에 위치한 비오틴으로 단백질의 시간 분해 라벨링 방법을 제시합니다. 이 방법은 조작된 비오틴 리가아제에 융합된 표적 단백질을 암호화하는 DNA를 주입하여 비오티닐화가 달성되기 때문에 다양한 표적에 쉽게 적용될 수 있습니다. 융합 구조물은 내인성 유전자의 프로모터로부터 발현되어 천연 단백질과 유사한 단계별 발현 프로파일을 가능하게 합니다. 특히, 공유 결합된 비오틴 부분은 스트렙타비딘 코팅 비드를 사용하여 표지된 단백질의 선택적 농축을 허용합니다. 또한, 면역형광 염색을 통해 효율적인 라벨링에는 배양액에 비오틴을 보충해야 함을 보여줍니다. 여기에 시연된 효율적인 주입 절차와 결합된 플러그 앤 플레이 조작 발현 벡터는 변형된 단백질을 발현하는 Paramecium 계통의 빠른 생성을 허용합니다. 여기에 시연된 비오티닐화 절차는 표적 단백질의 상호 작용 파트너를 포함하는 농축된 단백질의 식별을 위해 질량 분석법으로 후속 조치를 취할 수 있습니다. 근접 비오티닐화는 Paramecium 에서 단백질-단백질 상호 작용의 발견을 단순화 및 가속화하고 게놈 편집 기계를 이해하려는 노력을 강화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

섬모 단세포 유기체 Paramecium tetraurelia는 유전 정보의 장기 저장을 위한 생식계열 핵과 세포의 생리적 기능을 위한 체세포 핵의 두 가지 유형의 핵을 보유하고 있습니다1. 이 유기체의 유성 생식은 새로운 체세포 게놈의 형성을 필요로 합니다. 이 과정에는 전위 요소3 및 기타 반복을 포함하는 체세포 게놈2에서 45,000개 이상의 DNA 단편을 비가역적으로 절제하는 것이 포함됩니다. 특히 눈에 띄는 것은 절제 이벤트가 단일 염기쌍1까지 정확도로 실행된다는 것입니다. 절제된 DNA 단편이 단백질 코딩 영역4을 파괴하고 잘못된 절제가 프레임 시프트 돌연변이를 유발하거나 조기 정지 코돈 또는 단백질 코딩 서열을 변경할 수 있기 때문에 이러한 정확성은 생물학적으로 필요합니다. 복잡한 RNA 비교 메커니즘을 통해 세포는 새로운 체세포 게놈에 필요한 서열을 구별할 수 있습니다. 이는 전체 생식계열 게놈5의 전사로 시작된 후 25bp6의 크기로 트리밍되고 모든 상보적 RNA가 폐기되는 오래된 체세포 게놈7로 수송됩니다8. 이전 체세포 게놈에서 상보적 서열이 부족한 나머지 sRNA는 새로 발달하는 체세포 게놈으로 추가로 운반되어 생식계열 제한 서열에 정렬되고 절제를 지시합니다9. 이 복잡한 다단계 과정은 많은 세포 구성 요소의 정확하고 시기적절한 상호 작용을 필요로 하며, 특히 작은 RNA가 서로 다른 핵 사이를 통과함에 따라 일시적인 약한 상호 작용이 필요합니다10,11. 이전에는 추정 성분이 공정에 필수적인지 확인하기 위해 녹다운 실험을 사용하여 공정의 분자 역학을 이해하려는 시도가 이루어졌고, 이어서 필수 단백질의 상호 작용을 밝히기 위한 면역침전 접근법이 뒤따랐습니다 12,13,14. 이 방법은 풀다운 동안 비생리적 조건을 견디는 강력하고 연속적인 결합을 감지하는 데 유용하지만 약하고 일시적인 상호 작용을 감지하려면 지루한 최적화가 필요할 수 있습니다. 게놈 편집 과정과 관련된 많은 상호 작용의 잠재적으로 일시적인 특성으로 인해 생체 내 방법은 이러한 상호 작용의 검출을 향상시킬 수 있습니다. 또한, 일부 단백질은 세포외 조건에서 효율적으로 가용화될 수 없으며15, 이는 비오틴에 의한 근접 표지와 같은 생체 내 상호작용 기반 단백질 변형을 통해 해결될 수 있는 문제를 나타냅니다.

여기에서는 원하는 표적 단백질에 가깝게 국한된 단백질의 특정 생체 내 비오티닐화를 허용하는 새로운 방법을 설명합니다. 공유 비오틴 변형은 스트렙타비딘 기반 풀다운 접근법을 사용하여 효율적인 농축을 위해 사용될 수 있습니다. 이 방법의 개발은 Paramecium tetraurelia에서 단백질 상호작용 연구를 수행하기 위해 비오틴 리가아제 TurboID16을 사용하여 달성되었습니다. 우리의 접근 방식은 프로토콜에 설명된 단계에 따라 모든 표적 단백질에 쉽게 적용할 수 있습니다. 따라서 이 기사에서는 저명한 원생동물 모델 유기체에서 고처리량 단백질체 연구에 사용할 수 있는 근접 비오티닐화를 위한 효율적이고 확장 가능한 전략을 제공합니다.

프로토콜

1. 일반적인 방법

  1. 표 1에 나열된 완충액, 시약 및 기타 재료를 얻으십시오.
  2. 앞서 설명한 대로 단클론 Paramecium 계통을 배양합니다17. 간단히 말해서, 세포 밀도가 500 cells/mL 미만으로 유지되도록 세균화된 가벼운 배지(0.8μg/mL β-sitosterol)를 포함하는 새로운 우울증 슬라이드 웰에 하나의 세포를 옮겨 감수 분열 주기의 조기 시작을 방지합니다. 50회 세포 분열에서, 세포를 세균이 풍부한 배양액(0.8μg/mL β-시토스테롤 포함)으로 옮기고 모든 박테리아가 소비될 때까지 방치하여 유성 생식(자가결혼)을 유도합니다18.
    참고: 유성 생식 주기가 완료되면 세포는 새로운 영양 공급원이 제공될 때까지 비분열 자가혼 후 상태로 유지됩니다.
  3. 업스트림 제한 효소 절단 부위가 있는 코돈에 최적화된 3x HA turboID 서열을 포함하는 벡터를 사용하여 표적 유전자의 융합 단백질을 구축합니다.
    1. 적절한 제한 부위를 암호화하는 돌출부로 설계된 프라이머를 사용하여 게놈 DNA에서 표적 유전자 및 프로모터 영역의 PCR 증폭을 수행합니다.
    2. 표준 제한 분해를 사용하여 turboID 코딩 영역의 업스트림 프레임 내 호환 절단 부위19 에 제품을 삽입합니다.
  4. E.coli DH5α에서 구성된 플라스미드 DNA를 시퀀싱, 검증 및 증폭합니다. 플라스미드 midiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 분리하고 제한 분해를 통해 100μg의 플라스미드 DNA를 선형화합니다.
  5. 페놀-클로로포름 추출을 사용하여 정제한 다음 원심 필터를 통해 여과합니다12. 에탄올 침전을 수행하고 DNA 펠릿을 물에 용해시켜 5mg/mL의 농도를 얻습니다.
    참고: DNA는 다음과 같은 미세 주입 절차를 사용하여 Paramecium 세포의 체세포에 도입될 수 있습니다.

2. 체세포핵(MAC)에 미세주입

  1. 1.2단계에서 얻은 자가혼 후 배양물로부터 0.8μg/mL의 β-시토스테롤이 함유된 세균화된 가벼운 배지가 있는 신선한 우울증 슬라이드로 세포를 옮깁니다. 세포를 회수하기 위해 주입 전 2일 동안 27°C에서 배양합니다.
  2. 실체현미경을 사용하여 회수된 배양물의 세포를 세척 배지로 채워진 새로 준비된 함몰 슬라이드로 옮깁니다.
  3. 세포가 세척 배지에 있는 동안 20μL의ddH2O를 유리 슬라이드에 첨가하고 커버 유리로 오버레이합니다.
  4. 커버 유리 위에 200μL의 미네랄 오일을 추가합니다.
  5. 그런 다음 가능한 한 적은 양의 액체를 사용하여 세척된 개별 세포를 미네랄 오일 아래에 물방울로 옮깁니다. 슬라이드당 단일 세포를 포함하는 최대 20개의 기포를 배치한 다음 준비된 슬라이드를 주입 현미경의 받침대에 놓습니다.
  6. 흡인 바늘을 부착하고 제자리로 이동한 다음 로봇 팔과 사출기를 시동합니다.
  7. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 1.5단계에서 준비된 DNA 용액 2-3μL를 주사 바늘에 첨가합니다. 바늘을 로봇 팔에 부착하고 제자리로 이동한 다음 사출기의 압력 밸브에 연결합니다.
  8. 로봇 팔을 사용하여 슬라이드의 빈 물방울에 주사 바늘을 배치합니다. 그런 다음 청소를 눌러 DNA의 흐름이 관찰될 때까지 주사 바늘에 남아 있는 공기를 제거합니다.
  9. 세포가 포함된 물방울로 이동한 다음 흡인 바늘을 내립니다. 세포가 고정될 때까지 이 물방울에서 액체(물)를 부드럽게 제거합니다.
  10. 흡인 바늘을 올리고 주사 바늘을 내린 다음 더 높은 배율로 전환하십시오.
  11. 체세포핵(MAC)이 이제 주사 바늘을 삽입해야 하는 음식성 액포가 없는 더 어두운 영역으로 보이는지 확인합니다( 그림 1c 참조).
  12. 주사 바늘로 MAC을 완전히 관통하는 것을 목표로 하고 몇 초에 걸쳐 천천히 바늘을 집어넣습니다.
    알림: 바늘이 MAC 내부에 있으면 주입기에 의해 가해지는 일정한 공기압으로 인해 DNA가 MAC에서 흐릅니다. 주입된 DNA로 구성된 미만성 액포가 MAC의 경계 내에서 보일 수 있습니다.
    참고: 성공적인 주입을 위해 동일한 세포를 여러 번 주입할 수 있습니다.
  13. 세포 주입이 완료된 후 2.9단계에서 흡인한 물이 들어 있는 흡인 바늘을 내립니다. 세포가 다시 움직이기 시작할 때까지 흐름을 역전시켜 물방울에 충분한 물을 되돌립니다.
  14. 세포를 포함하는 모든 물방울이 처리될 때까지 계속합니다.
  15. 슬라이드에서 물방울을 수집하고 각각을 0.8μg/mL의 β-시토스테롤로 균화된 가벼운 배지로 채워진 별도의 웰로 옮겨 주입된 각 세포를 회수합니다.
  16. 27°C에서 밤새 배양하고, 각 웰에서 단일 세포를 새 웰로 옮기고, 백업으로 원래 웰을 18°C로 유지합니다.
  17. 이식된 세포를 27°C에서 1일 동안 밤새 배양한 다음 각 단클론 웰에서 5개의 세포를 PCR 튜브로 옮깁니다. 증폭을 위해 구조물 특이적 프라이머를 사용하여 세포에 주입된 DNA의 존재를 확인합니다.

3. 올바른 단백질 국소화 및 비오틴 리가아제 기능 검증을 위한 면역형광 염색

  1. 선택된 PCR 양성 클론을 0.8μg/mL의 β-시토스테롤이 포함된 20mL의 세균화 배지에서 배양합니다.
  2. 배지가 덜 탁해지면 배양액에서 50μL 샘플을 수집합니다. DNA 염색을 위해 1μL의 DAPI 용액(0.1mg/mL)과 1μL EDTA(0.5mM)를 첨가하여 자가결혼의 시작을 확인합니다.
    참고: 자가결혼은 일반적으로 2,000 cells/mL의 세포 밀도에서 시작됩니다.
  3. 비오티닐화가 필요한 경우, 세포를 수확하기 전에 최소 1시간 동안 배양 배지에 비오틴을 최종 농도 500μM로 보충합니다.
  4. 280 x g 의 배 모양 튜브가 장착된 오일 측정 원심분리기를 사용하여 적절한 발달 단계에서 세포를 2분 동안 수확합니다. 배양 배지를 버리고 튜브에 PBS를 첨가한 다음 다시 원심분리하고 PBS를 제거합니다.
  5. 세포 펠릿을 PBS에 재현탁하고 투명한 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  6. 37% 원액에서 PBS에 3.7% PFA 희석액을 준비합니다.
  7. 세포 펠릿을 0.5mL의 3.7% PFA에 재현탁하고 튜브 로테이터에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  8. 눈에 보이는 펠릿이 형성될 때까지 600 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. PFA 용액은 지정된 특수 폐기물 용기에 버리십시오.
  9. PBS에 있는 1mL의 50mM 글리신에 펠릿을 재현탁합니다. 튜브 로테이터에서 5-10분 동안 배양합니다.
  10. 600 x g 에서 1분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 0.8mL의 1x PBS를 추가합니다. 선택적으로 PBS로 한 번 더 세척하십시오.
    참고: 이 시점에서 필요한 경우 세포를 4°C에서 보관할 수 있습니다.
  11. 600 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 PBS를 제거한 다음 PBS에 500μL의 0.5% Triton X-100을 첨가합니다. 튜브 로테이터에서 20분 동안 배양합니다.
  12. 펠릿이 보일 때까지 원심분리하고(2분 동안 1,000 x g ) Triton X-100 용액을 제거하고 세포를 PBS에 재현탁합니다.
  13. 필요한 항체 부피에 따라 PBS에서 5% BSA 용액을 준비합니다.
  14. 세포에서 PBS 세척액을 제거하고 PBS의 5% BSA로 희석된 1차 항체 100μL를 세포에 첨가합니다. 사용된 항체에 따라 배양 시간을 조정하십시오.
    참고: 대부분의 항체는 실온에서 2시간 동안 배양하는 것으로 충분합니다.
  15. 600 x g으로 원심분리하고 1차 항체 희석액을 제거한 다음 500μL의 PBS로 세포를 세척합니다.
  16. PBS에 5% BSA로 희석된 2차 항체 100μL를 첨가합니다. 배양 시간을 조정하십시오. 일반적으로 실온에서 1시간이면 충분합니다. 형광단을 빛으로부터 보호하기 위해 튜브를 알루미늄 호일로 덮습니다.
  17. 2차 항체와 함께 배양하는 마지막 10분 동안 DAPI 용액 1μL(0.1mg/mL)를 첨가합니다.
  18. 600 x g 에서 1분 동안 원심분리하고 염색액을 제거한 후 PBS로 2회 세척합니다. 20μL의 두 번째 세척액을 튜브에 남겨두고 세포를 재현탁합니다.
  19. 현미경으로 검사하기 위해 슬라이드에 10μL를 장착합니다.

4. 비오티닐화 단백질의 선택적 농축

  1. 3.4에 설명된 대로 올바른 발달 단계에서 1 x 106 세포를 수확합니다.
  2. 펠릿을 용해 완충액 3mL에 재현탁합니다.
  3. dounce 균질화기로 옮기고 유봉 100회 스트로크로 세포를 용해합니다.
  4. 용해물을 2개의 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 4°C에서 10분 동안 21,000 x g 로 원심분리합니다.
  5. 20μL(샘플당)의 펄스 소용돌이 재현탁 비드 슬러리를 미세 원심분리기 튜브에서 1mL의 용해 완충액과 혼합하고 2분 동안 배양하여 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드를 평형화합니다.
  6. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드에서 용해 완충액을 제거하고 용해 완충액에 재현탁합니다.
  7. 4.6단계를 반복합니다.
  8. 용해 완충액을 제거하고 평형화된 비드를 4.4단계의 상청액(정화된 용해물)과 혼합합니다.
    참고: 비드에 결합하기 위한 최적의 염분 농도와 세제의 비율은 다를 수 있으며 실험적으로 검증해야 합니다. 또한, 펠릿을 50μL의 2% SDS에서 4.4에서 60°C에서 10분 동안 배양하여 불용성 분획에서 단백질을 추출한 후 21, 000 x g 에서 10분 동안 원심분리할 수 있습니다. 이 추출물을 정화된 용해물과 비드에 첨가하십시오.
  9. 튜브 회전 장치에서 실온에서 1-2시간 동안 배양합니다.
  10. 튜브를 잠시 원심분리(<1초)하여 모든 액체를 튜브 바닥으로 회수하고 마그네틱 스탠드에 비드를 수집한 다음 상청액(플로우스루)을 세척 완충액 1로 교체합니다.
  11. 튜브 로테이터에서 5분 동안 배양한 다음 2차 세척을 위해 4.10단계와 같이 반복합니다.
  12. 세척 완충액 1을 세척 완충액 2로 교환하여 두 번의 추가 세척(세척 3 및 4)을 수행합니다.
  13. 두 번의 최종 세척(세척 5 및 6)을 위해 세척 완충액 2를 세척 완충액 3으로 교환합니다.
  14. 최종 세척을 제거한 후 다운스트림 처리 전에 비드를 -20°C에서 보관합니다.
    참고: 비드는 웨스턴 블롯 분석을 위해 Laemmli 완충액으로 용출될 수 있으며 단백질 식별을 위한 온비드 펩타이드 준비를 위해 질량 분석 서비스에 제출할 수 있습니다.

결과

우리의 프로토콜은 표적 단백질 근처의 단백질에 공유 비오틴 변형을 도입하기 위한 단순화된 방법을 설명합니다. Paramecium (그림 1A). 이러한 비오티닐화된 단백질은 스트렙타비딘 풀다운을 사용하여 추가로 농축되고 질량 분석법을 사용하여 식별될 수 있습니다20. 이 방법의 실제 사용 사례를 보여주기 위해 프로토콜을 Nowa1 단백질에 적용했습니다. 이 단백질은 게놈 재배열 과정에 필수적이며 국소화에 동적 변화가 있습니다12. 초기 단계에서는 오래된 체세포 핵과 단편에 남아 있지만 나중에는 새로 발달하는 핵에 위치합니다. 특히, Nowa1 상호 작용 단백질의 태그 매개 농축에 대한 이전 시도는 실패했습니다(미발표 결과). 이는 풀다운 절차 중 최적이 아닌 조건에서 자가 응집을 유발할 수 있는 프리온 단백질 PrP27과 유사성을 지닌 복합 반복 때문일 수 있습니다21. 우리는 프로모터를 포함하는 업스트림 비코딩 영역과 함께 Nowa1 코딩 영역을 PCR로 증폭했습니다. 그런 다음 생성물을 코돈에 최적화된 turboID 인코딩 시퀀스(그림 1B). 순환 DNA의 주입으로 인한 이식유전자 유도 침묵을 피하기 위해 Paramecium, 벡터는 주입 전에 선형화되었습니다. 선형화 및 정제된 DNA를 이 프로토콜에 설명된 대로 체세포핵(MAC)에 미세 주입했습니다. 체세포핵의 어두운 영역 내에 갇힌 분산된 물방울이 성공적인 주사 중 일부(그림 1C). 그런 다음 세포 분열 중 세포에 의한 DNA의 성공적인 주입 및 증폭을 PCR로 확인했습니다. 예상대로, 세포의 40-50%는 Nowa1 구축물의 주입된 DNA에 대해 양성이었습니다(예상 제품 크기 685bp)(그림 2). 다음 단계는 주입된 DNA에 의해 암호화되는 단백질의 존재를 확인하는 것이었습니다. 수용자 벡터에는 삼중 HA 태그 옆에 있는 turboID 서열이 포함되어 있기 때문에 면역형광 염색을 사용하여 태그를 검출했습니다. 이를 통해 주입된 세포가 융합 단백질을 발현하고 있는지, 그리고 그것이 적절하게 국소화되었는지 확인할 수 있었습니다. 우리는 이전에 야생형 Nowa1 단백질에 대해 관찰된 바와 같이 두 개의 새로운 발달 핵에서 융합 단백질의 국소화를 보인 후기 단계 세포를 사용했습니다12. 주입된 개별 세포주는 서로 다른 수준의 융합 단백질(그림 3). 낮은 발현 수준은 감소된 배경이 바람직한 응용 분야에 도움이 될 수 있지만, 이 경우 최대 신호를 선택하고 가장 높은 발현을 보인 클론 2를 진행했습니다. 그런 다음 융합 단백질의 국소화를 추적하기 위해 다양한 발달 단계에서 샘플을 수집했습니다. 이 단백질은 처음에 오래된 체세포 핵에서 형성된 타래와 자가결혼의 초기 단계에서 분리된 핵 조각에 국한되었습니다. 핵 안라겐이 나타나자 융합 단백질은 이러한 새로운 발달 핵(그림 4). 서로 다른 단계에서 근위 프로테옴의 비오티닐화를 촉진하기 위해 IF에 대한 세포를 수확하기 전에 2시간 동안 500μM 비오틴으로 배양물을 보충했습니다. 우리는 형광 태그가 부착된 스트렙타비딘을 사용하여 IF 염색을 통해 비오틴 표지 단백질을 시각화했습니다. 관찰된 신호는 HA 태그가 붙은 융합 단백질의 국소화에 해당했습니다. 중요한 것은 비오틴과의 짧은 배양만으로도 상당한 비오티닐화를 달성하기에 충분하기 때문에 다양한 핵 발달 단계에 특이적인 비오티닐화 국소화를 얻을 수 있었다는 것입니다(그림 4). 또한, 보충 비오틴을 첨가하지 않고, 주입된 세포에서 무시할 수 있는 비오티닐화만 검출될 수 있었다. 야생형 세포에서 보충 비오틴의 첨가는 검출 가능한 비오티닐화를 일으키지 않았습니다(그림 5A). 특히, 비오틴은 변성 조건에서도 단백질에 부착된 상태로 남아 있기 때문에 단순히 발달 중인 핵에 축적되는 것이 아닙니다. (그림 5B). 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드를 사용하여 비오티닐화된 단백질(그림 6). 농축된 단백질은 질량 분석법을 사용하여 식별할 수 있습니다. 이러한 후속 단백질 식별 실험에서, 보충되지 않은 배양물과 융합되지 않은 터보ID 단백질을 발현하는 세포를 배경 대조군으로 사용할 수 있습니다.

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그림 1: P. tetraurelia의 근접 비오티닐화 절차 개요. (A) 프로토콜의 일반화된 개요. (B) 플러그 앤 플레이 turboID 수용자 벡터 및 Nowa1 융합 단백질에 대한 결과 구조에 대한 복제 원리. 이 플라스미드에 사용되는 3'UTR 영역은 CenH3a에서 파생됩니다. (C) DNA의 성공적인 주입 시 체세포핵(MAC)에 해당하는 어두운 영역 내에 포함된 눈에 보이는 확산 물방울. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 성공적인 주입을 위한 PCR 테스트. 암피실린 내성(amp start)을 암호화하는 업스트림 영역에 특이적인 순방향 프라이머와 Nowa1에 보완적인 역방향 프라이머가 있는 제품에 대한 PCR 반응의 아가로스 겔 분석. 화살촉은 예상 제품 크기를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: turboID 융합 단백질의 올바른 국소화를 검증하기 위한 면역형광 염색. Nowa1-HA-turboID 융합 단백질을 암호화하는 DNA에 대한 양성 PCR 신호가 있는 단클론 Paramecium 계통의 토끼-항-HA 1차 항체(1:100) 및 염소-항-토끼 Alexa Fluor 568 접합 2차 항체(1:1000)를 사용한 면역형광 염색. 스케일 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 다양한 발달 단계에서 Nowa1 특이적 비오티닐화. 새로운 체세포 핵 형성 중 진행 단계에서 단클론 라인 2의 면역형광 염색. 배양 배지에는 최적의 터보ID 활성을 위해 500μM 비오틴이 보충되었습니다. HA-태그는 도 3과 같이 검출되었고, 비오틴은 Streptavidin-FITC(1:200)를 사용하여 검출되었습니다. 스케일 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: turboID에 의한 효율적인 근접 라벨링에는 배양에 보충 비오틴이 필요합니다. (A) Nowa1-HA-turboID의 발현 및 500μM 보충 비오틴으로 관찰된 비오티닐화를 보여주는 후기 발달 단계에서 wt 및 주입된 세포의 면역형광 염색. HA-태그와 비오틴은 그림 4와 같이 검출되었습니다. 스케일 20 μm. (B) 비오틴 유무에 관계없이 500μM 비오틴 및 turboID 주입 세포로 배양된 wt 세포의 HRP-스트렙타비딘을 사용한 비오틴에 대한 웨스턴 블롯 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 스트렙타비딘 마그네틱 비드로 비오티닐화된 단백질의 농축. 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비드를 사용한 풀다운 실험에서 샘플의 비오틴에 대한 웨스턴 블롯 분석. 샘플은 Nowa1-HA-turboID 세포 용해물(입력), 결합되지 않은 분획(플로우스루), 세척 단계(세척 1-6) 및 비드에 결합된 단백질(출력)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 프로토콜은 관심 단백질의 근접한 단백질에 비오틴 부분을 부착하는 기술을 설명합니다. 비오틴에 대한 스트렙타비딘의 강력한 친화력을 기반으로 이는 변형된 단백질을 빠르고 효율적으로 농축할 수 있습니다. 관심 있는 다양한 단백질에 대한 빠른 적응성과 결합된 제시된 방법은 Paramecium의 다중 단백질 상호 작용 연구를 용이하게 할 수 있습니다. 이 모델 유기체는 감수 분열 번식 중 트랜스포존-숙주 상호 작용에 대한 연구를 위해 잘 확립되어 있습니다3. 또한 프로그래밍된 게놈 재배열 중에 45,000개 이상의 서열을 절제하므로 정확한 게놈 편집을 위한 새로운 분자 도구를 제공할 수 있습니다. 이 과정은 각 세대에 걸쳐 재현 가능한 절단 부위를 가진 이러한 DNA 단편의 정확한 RNA 지향 절제를 가능하게 하는 복잡한 다중 성분 기계에 의해 조정됩니다. 여기에 제시된 방법은 이 프로세스를 연구하는 데 두 가지 주요 이점을 제공합니다. 일시적인 단백질-단백질 상호 작용의 발견을 단순화합니다. 또한, 플러그 앤 플레이 수용체 벡터는 많은 기능적 융합 단백질을 신속하게 생성할 수 있습니다. 여러 요인이 서로 다른 단계에서 프로세스에 관여할 가능성이 높기 때문에 적응성을 통해 절제 기계의 일부가 될 수 있는 많은 단백질의 상호 작용을 밝힐 수 있습니다. 중요한 것은 융합 구조물이 내인성 유전자의 프로모터로부터 발현되므로 천연 발현 시간 경과와 좁게 일치한다는 것입니다. 또한, 이 모델 유기체에 외인성 유전 물질을 전달하기 위한 미세 주입의 입증된 사용은 균질한 단클론 집단의 생성을 허용합니다. 이러한 개체군은 새로운 체세포 핵의 발달이 일어나는 자가결혼 과정의 보다 동시적인 시작을 가능하게 합니다.

turboID 융합 구조물을 도입하기 위해 입증된 절차는 강력하지만 비오티닐화 메커니즘으로 인해 다운스트림 단백질 농축 프로토콜에서 특정 최적화가 필요할 수 있습니다. 융합된 터보ID 효소는 효소에서 확산되는 반응성 비오틴-AMP 부분을 생성하기 때문에 잠재적으로 근처의 친핵성 부분과 반응할 수 있습니다. 따라서 이 방법론의 필수 단계는 실제 상호 작용 파트너가 아닌 배경 히트 및 터보 ID 융합 단백질의 일반적인 근처에 국한된 단백질로부터 진정한 상호 작용 파트너를 식별하는 것입니다. 이를 달성하기 위해 비오틴16과의 배양 기간과 같은 매개변수의 변형을 조정할 수 있습니다. 또한, 배지에 보충 비오틴이 없는 대조군을 포함하는 실험 설정은 배경 결합을 나타낼 수 있습니다. 입증된 바와 같이, 이러한 대조군은 실제 실험과 유전적으로 동일하지만 비오틴의 풍부도가 낮기 때문에 turboID에 의한 비오티닐화가 크게 감소합니다. 추가적인 중요한 대조군에는 비융합된 터보ID 단백질과 야생형 그룹이 포함될 수 있으며, 둘 다 비오틴이 보충된 배지에서 배양됩니다. 또한, 비오틴에 대한 스트렙타비딘의 강한 친화력은 항체 기반 풀다운에 비해 상당한 이점이지만, 염분과 세제 농도가 다르면 농축의 순도와 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다.

우수한 단백질체학적 접근법은 Paramecium과 잠재적으로 다른 섬모충의 독특한 분자 기계에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 새로운 기능을 가진 분자 구성 요소는 합성 생물학의 도구로 용도가 변경될 가능성이 있으며 따라서 생명 공학 발전을 촉진할 수 있습니다22,23. 조작된 합성 단백질은 이전에는 실행 불가능했던 치료 적용을 가능하게 하는 새로운 특성을 가진 기능적 도메인의 조합으로 구성되는 경우가 많습니다. 조작된 단백질은 의약품 생산 공정에서도 사용할 수 있습니다24. Paramecium의 RNA 지시 게놈 절제 시스템은 이러한 개발에 특히 관심이 있습니다. 이 시스템은 단일 뉴클레오티드25까지 정밀도로 수천 개의 DNA 단편을 RNA 의존성 절제합니다. 이러한 매개변수는 인간 세포에서 게놈 편집의 정확도를 향상시키는 것을 흥미롭게 만듭니다. 제시된 근접 비오티닐화 방법은 다중 단백질 분자 기계 내에서 새로운 단백질 성분 및 상호 작용의 발견을 가속화하고 촉진하는 데 사용될 수 있습니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 베른 대학교 DigiK 보조금과 스위스 국립 과학 재단 보조금으로 자금을 지원받았으며 B.-A.S.229074 수여되었습니다. 스위스 국립 과학 재단 보조금214853 M.N.에게 수여되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
현미경 Axiovert 40 CFL (10x, 40x 렌즈)자이스나
b-시토스테롤시그마 알드리치567152
소 혈청 알부민(BSA)시그마 알드리치A9647
CellTram 오일에펜도르프나
코돈 최적화 3xHA-turboID DNA 서열트위스트 생명과학나GCTAGCTATCCATAcGAaGTTC
CTGATTATGCTTATCCTTACGAT
GTTCCTGATTATGCTTATCCTTAT
GATGTACCTGATTACGCTGGATC
AAAAGATAATACTGTACCTCTTAA
ATTAATCGCTTTATTAGCTAATGG
TGAATTTCATTCTGGTGAACAAC를
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GGTATACTTGTTGAATTAGCTGGT
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CTATGAGAAGAGTTGAAGAATCAG
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TTAGAGAACACTTAGAGCTGCTTTAGA
ATTATTTGAACAAGAAGGTTTGGCT
CCTTATCTTCCTAGATGGGAAAAAT
TAGATAATTTCATTAATAGACCTGTTA
AATTAATTATTGGTGATAAAGAAATTT
TCGGTATTTCAAGAGGTATAGATAAAC
AAGGAGCTCTTTTATTAGAACAAGATG
GTGTTCAAACCATGGATGGGTGGT
GAAATTTCATTGAGATCAGCTGAAAA
GAAATGA
DAPI시그마 알드리치디9542
EDTA피셔 사이언티픽AAA151610B
epT.I.P.S. 마이크로로더 팁에펜도르프5242956003
에탄올그로그 케미1009832500
펨토젯 4i에펜도르프나
펨토팁 II칼리버 사이언티픽5242957000
포름알데히드 용액시그마 알드리치F8775
글리신어플리켐10021259
염소 항토끼 IgG 항체, Alexa Fluor 568Thermo Fischer ScientificA-11011
HA-tag(C29F4) 토끼 mAB세포 시스템3724
인젝맨 NI 2에펜도르프나
라이트 미디엄나나2.5 mM Na2HPO4 중 0.2x 밀싹 분말 용액
미네랄 오일시그마 알드리치M8691
Na2HPO4시그마 알드리치71643
페놀-클로로포름-이소아밀알코홀시그마 알드리치77617
형광체 완충 식염수 피셔 사이언티픽10722497
플라스미드 플러스 미디렙 키트키아겐12945
리치 미디엄나나2.5 mM Na2HPO4의 밀싹 분말 용액 1개
스트렙타비딘-FITC써모 피셔 사이언티픽11-4317-87
Ultrafree-MC GV 원심 필터 EMD 밀리포어UFC30GV00
세척액나나Volvic 물의 0.1% BSA 
밀싹 분말 용액파인스 인터내셔널나앞서 설명한 대로 분말에서 20x 스톡으로 준비합니다(0.5g/10mL).
스트렙타비딘-HRP앱캠AB7403
스트렙타비딘 코팅 마그나틱 비즈시그마 알드리치LSKMAGT02
풀다운용 용해 버퍼나나50mM 트리스 pH 8; 150mM 나클; 0.5% 데옥시콜산나트륨; 1% 트리톤 X-100; 5 mM MgCl2; 2x cOmplete 프로테아제 억제제(Roche);  
풀다운용 세척 버퍼 1나나50mM 트리스 pH 8; 150mM 나클; 0.5% 데옥시콜산나트륨; 1% 트리톤 X-100; 5 mM MgCl2;
풀다운용 세척 버퍼 2나나10 mM 트리스 pH 7.4; 150mM 나클; 0.01 % NP40; 1 mM MgCl2
풀다운용 세척 버퍼 3나나10 mM 트리스 pH 7.4; 150mM 나클;

참고문헌

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