표적 농축 워크플로우를 사용하여 임상 샘플에서 전체 박테리아 게놈 생성

요약

여기에서는 표적 농축을 사용하여 임상 샘플에서 박테리아 성병 감염의 전체 게놈 시퀀싱을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 이 새로운 증후군 패널 기반 방법은 풍부한 인간 DNA와 낮은 박테리아 부하의 문제를 극복하여 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 팔리듐 트레포네마 및 마이코플라스마 제니탈리움에 대한 게놈 감시를 용이하게 합니다.

초록

임상 샘플에서 직접 세균성 감염(STI)의 완전한 게놈을 얻는 것은 인간 DNA, 미생물군 및 매우 낮은 박테리아 병원체 부하의 존재로 인해 어렵습니다. 이러한 종은 까다롭고 대부분의 샘플은 미생물을 용해하는 수송 매체에서 채취되어 배양에 적합하지 않기 때문에 배양은 선택 사항이 아닌 경우가 많습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 우리는 박테리아 STI의 전체 게놈 서열을 생성하기 위해 4종에 걸쳐 설계된 프로브 패널을 사용하고 게놈 시퀀싱 전에 2-3일간의 혼성화 절차인 표적 농축을 수행했습니다. 우리의 초기 결과는 직접 시퀀싱이 성공하지 못한 샘플을 사용하여 우수한 게놈 데이터를 생성했습니다. 표적 농축은 특히 병원체 부하가 높을 때 박테리아 STI 게놈 시퀀싱에 매우 효과적인 것으로 입증되었습니다(Ct < 30). 마이코플라스마 제니탈륨 을 함유한 테스트 샘플은 Ct 값이 30 이상인 경우가 많아 게놈 회복 성공률이 낮아졌습니다. 혼성화 온도를 65°C에서 62.5°C로 최적화한 후 개선이 관찰되었습니다. 게놈 감시를 가능하게 하는 것 외에도 완전한 게놈의 가용성은 임균과 관련된 후천 적 내성 결정 인자를 식별하는 것과 같은 항균제 내성에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 방법은 이미 부에노스아이레스에서 클라미디아 트라코마티스 림프육아종 성병의 새로운 계통인 ompA-유전자형 L4를 식별하여 새로운 게놈 다양성을 발견하고 STI 감시를 개선하기 위한 이 접근 방식의 잠재력을 강조했습니다.

서론

차세대 시퀀싱(NGS) 기술의 출현으로 박테리아 전체 게놈 시퀀싱(WGS)이 촉진되어 많은 종의 인간 박테리아 병원체 내에서 임상 분리주의 시퀀싱이 가능해졌습니다. 이 기술은 전례 없는 규모로 완전한 게놈 생성을 통해 수많은 비교 연구를 가능하게 했습니다. 이는 WGS를 통해 임상 샘플의 게놈 데이터에 액세스하면 항균제 내성 유전자의 타이핑 및 검출이 가능하기 때문에 임상 및 공중 보건 미생물학에 큰 영향을 미쳤습니다. 또한 메타게놈 접근법을 사용하면 임상 샘플에서 질병 관련 병원체를 직접 검출할 수 있습니다. 이러한 정보는 환자를 위한 맞춤형 치료 전략을 위한 새로운 기회를 창출합니다. 또한 WGS는 특정 병원체의 순환 변종의 진화와 전염 패턴에 대한 통찰력을 제공하여 공중 보건 당국이 병원체 발생을 더 잘 이해하고 대응할 수 있도록 하는 강력한 도구입니다^1,2,3.

WGS에 대한 충분한 시퀀싱 품질을 달성하기 위해서는 일반적으로 필요한 미생물 DNA 양을 얻기 위해 배양을 통한 박테리아 분리가 필요합니다 ^4,5,6. 이는 배양하기 어려운 유기체, 생존 불가능한 진단 샘플 처리로 인해 배양할 수 없는 유기체 또는 환자 치료 중에 항생제에 노출된 유기체에 대한 제한 요인을 나타냅니다. 이러한 배양하기 어려운 미생물의 예로는 클라미디아 트라코마티스, 임질균, 트레포네마 팔리듐 및 마이코플라스마 제니탈리움 ^7,8,9와 같은 성병 전염성 세균 병원체가 있다. 이 종은 세포 내 특성, 취약성, 까다로운 성장 요구 사항, 느린 복제 속도 등 여러 요인으로 인해 배양이 어렵습니다. 이러한 이유로 환자 샘플에서 흔히 발생하는 것처럼 낮은 DNA 함량에도 불구하고 WGS를 가능하게 하는 기술을 개발하고 구현하는 것은 임상 환경에서 게놈 분석을 수행하는 데 매우 중요합니다.

표적 농축은 미생물 DNA가 부족할 때 게놈 시퀀싱을 위한 가장 유망한 방법입니다¹⁰. 예를 들어, 성병(STI)을 유발하는 병원체의 경우 환자 샘플에 존재하는 DNA의 극히 일부만이 병원체에서 유래합니다. C. trachomatis 감염의 경우 병원체 DNA가 전체 DNA의 최대 0.6%를 구성하는 것으로 밝혀졌지만 값은 일반적으로 훨씬 낮습니다¹¹. 표적 농축 방법은 NGS 전에 관심 있는 미생물 DNA를 선택적으로 포획하는 것으로 구성됩니다. 이는 표적 미생물 DNA를 보완하는 특별히 설계된 비오틴 태그 RNA 프로브를 사용하여 달성됩니다. 어댑터 결찰은 하이브리드화 전에 게놈 라이브러리를 생성하기 위해 수행되며, 그 동안 이러한 프로브는 상보적인 미생물 DNA에 결합합니다. 그 후, 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드를 사용하여 비오틴 표지 핵산 복합체를 포획하여 강력한 비오틴-스트렙타비딘 상호작용을 활용합니다. 마지막으로 중합효소연쇄반응(PCR)은 선택된 DNA 단편을 증폭합니다. 이러한 주요 개념 단계는 표적 강화 전략을 이해하는 데 필요합니다. 그러나 세척 및 품질 관리와 같은 추가 절차 단계도 전체 프로토콜^10,12에 포함됩니다.

시퀀싱 프로토콜을 시작하기 전에 입력 DNA의 양을 평가하고 워크플로 전체의 조건이 무결성을 유지하는지 확인하는 것이 중요합니다. 제조업체의 권장 사항에 따르면 표준 프로토콜에는 약 1.4 내지 28.6 ng/μL의 농도 범위에 해당하는 7 μL 부피에 10-200 ng의 DNA가 필요합니다. DNA 농도가 낮을 때, 필요한 투입량을 유지하면서 0.6 내지 11.8 ng/μL 사이의 농도를 허용하는 17 μL를 사용하는 수정된 버전의 프로토콜이 권장된다¹². 임상 표본에서 종종 얻는 낮은 농도를 감안할 때 우리는 일상적으로 17μL 프로토콜 변형을 구현했습니다. 하이브리드화 및 시퀀싱 성능은 DNA 품질과 관련이 있으며, 핵산 무결성을 보존하기 위한 적절한 샘플 보관 및 운송 조건의 중요성을 강조합니다. 따라서 수집 배지 안정화, 신속한 처리, 콜드체인 조건 유지, 동결-해동 주기 최소화와 같은 적절한 취급 관행은 DNA 품질을 최적화하는 중요한 조치입니다. 필요한 DNA 농도뿐만 아니라 DNA 단편 길이는 무결성의 지표입니다. 더 긴 단편을 얻고 시퀀싱 결과를 최적화하기 위해 샘플 취급 및 보관 중 DNA 분해를 최소화하는 것이 좋습니다. 이는 수집 방법, 배지 및 취급의 다양성이 일반적인 임상 환경에서 특히 관련이 있습니다. 우리는 대표적인 결과에 자세히 설명된 바와 같이 평균 단편 길이가 1kb인 2-SP 배지 및 NAAT 수송 배지 모두에서 추출된 DNA에 이 프로토콜을 성공적으로 적용했습니다. 마지막으로, 성공적인 시퀀싱은 평균 판독 깊이가 10x¹⁰을 초과하는 95% 이상의 게놈 커버리지를 달성하는 것으로 정의되었습니다.

현재까지 표적 농축은 다양한 연구 그룹에서 STI를 유발하는 병원체, 노로 바이러스, 가축 바이러스 및 식물 병원체를 포함한 광범위한 미생물 및 바이러스에 성공적으로 적용되었습니다 10,13,14,15,16. 그러나 지금까지 프로브 설계는 일반적으로 여러 증후군적으로 연결된 병원체의 완전한 게놈을 표적으로 하는 패널이 아닌 단일 병원체로 제한되었습니다. 이상적인 표적은 실제로 C. trachomatis, T. pallidum 및 M. genitalium을 포함하는 작고 보존된 게놈을 가진 유기체입니다. N.gonorrhoeae는 더 다양한 게놈과 더 큰 범 게놈을 가지고 있지만, 이를 덮는 프로브는 다른 세 박테리아와 함께 설계할 때 여전히 합리화될 수 있습니다. 이러한 박테리아 간에 %G+C에는 약간의 차이가 있고 증후군적으로 연결될 수 있는 다른 박테리아는 조건을 최적화해야 할 수 있습니다.

이 프로토콜의 목표는 계통 발생 및 역학 분석을 가능하게 하기 위해 임상 샘플에서 직접 완전한 게놈을 얻는 것입니다. 우리는 비뇨생식기 및 항문직장 면봉과 같은 임상 샘플에서 추출된 DNA를 사용하여 완전한 게놈을 복구하기 위해 C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum 및 M. genitalium에 맞춤화된 프로브 패널을 사용하여 새롭고 효과적인 전략을 보여줍니다. 이 접근법은 성공적인 것으로 나타났으며 부에노스아이레스에서 성병 림프육아종(LGV) 발병의 특성화에 적용되어 C. trachomatis LGV^10,13의 새로운 계통을 설명할 수 있게 되었습니다.

C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum 및/또는 M. genitalium으로 진단된 환자의 임상 샘플에서 직접 완전한 게놈을 얻기 위해 사용되는 차세대 시퀀싱(NGS)을 위한 포획 후 풀링과 함께 상업적으로 이용 가능한 DNA 포획 방법의 사용을 포함하여 표적 농축 절차가 설명될 것입니다 감염. 최적의 성공을 위해서는 Ct 값이 높을수록 병원체 부하가 낮고 완전한 게놈을 생성할 가능성이 적기 때문에 Ct 값이 30 미만인 샘플을 선택하는 것이 좋습니다. 이 방법을 위한 DNA 추출물은 다양한 샘플 유형 및 수집 매체의 임상 샘플에서 얻을 수 있습니다. DNA 추출 절차는 인간 면봉 샘플에서 병원체 또는 바이러스 DNA를 분리하도록 설계된 키트를 사용하여 수동 또는 자동화 시스템을 사용하여 수행할 수 있습니다( 재료 표 참조).

표적 농축 절차에 사용된 프로브 세트( 재료 표 참조)는 C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. pallidum 및 M. genitalium의 게놈 다양성을 포착하도록 특별히 설계되었습니다. 각 종에 대한 여러 개의 완전한 게놈을 사용하여 맞춤형 프로브를 생성하여 알려진 범 게놈의 적용 범위를 최적화했습니다¹⁰. 설계 기준에는 참조 서열에 대한 최소 90%의 서열 상동성과 표적 캡처 효율성을 향상시키기 위한 1x-2x의 타일링 빈도가 포함되었습니다. 비용 효율성을 최적화하기 위해 프로브 설계에 사용된 알고리즘은 포괄적인 게놈 표현을 유지하면서 프로브 수를 최소화했습니다. 최종 프로브 세트는 C. trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium 및 T. pallidum을 표적으로 하는 다중 설계를 위한 242,000개의 프로브로 구성되었습니다. 전체 표적 농축 프로토콜은 2일 또는 3일 내에 수행할 수 있습니다. 중지 지점에 대한 명확한 표시는 2일 및 3일 워크플로우 옵션 모두에 제공됩니다.

윤리 선언문
이 연구는 이전에 발표된 프로토콜^10,13을 기반으로 방법론적 개선을 제안합니다. 설명된 절차에는 비식별화된 샘플만 포함되며 환자 데이터는 포함되지 않습니다. 따라서 방법론적 측면에 대한 특별한 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 대표적인 결과는 이전에 연구된 두 세트의 샘플에서 얻었습니다: 승인된 프로토콜에 따라 수집된 아르헨티나 샘플 Detección de C. trachomatis en pacientes con rectitis infecciosa: prevalencia y tipificación(Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires, 승인 번호 201723), 모든 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 특별한 윤리적 승인이 필요하지 않은 익명화된 핀란드 샘플. 결과 시퀀싱 데이터를 데이터베이스에 제출하기 전에 인간 읽기를 제거해야 합니다.

프로토콜

참고: 작업 공간은 오염을 방지하기 위해 사전 PCR 구역(앰플리콘 없는 작업 공간)과 사후 PCR 구역(앰플리콘 처리 작업 공간)으로 나누어야 합니다. 명시적으로 달리 명시되지 않는 한, 모든 단계는 두 개의 제어된 작업 영역 중 하나에서 수행되어야 합니다. 모든 마스터 믹스 및 PCR 반응 믹스는 앰플리콘이 없는 작업 공간에서 준비해야 하며, 증폭된 DNA와 관련된 모든 후속 단계는 앰플리콘 처리 작업 공간에서 수행되어야 합니다. 이 프로토콜의 모든 양은 8개의 샘플을 처리하도록 계산됩니다.

1. DNA 단편화

1. 고감도, 정확한 형광 기반 방법(이중 가닥 DNA[dsDNA] 분석, 1 μL의 샘플 사용, 최대 120 ng/μL의 검출 범위, 재료 표 참조)을 사용하여 표적 병원체 DNA(DNA)를 포함하는 임상 샘플에서 DNA 추출물의 DNA 농도를 측정합니다. 이 정량 방법은 DNA 농도가 측정될 때마다 프로토콜 전반에 걸쳐 일관되게 사용됩니다.
2. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 각 DNA 샘플을 10 - 200ng의 농도로 희석하여 각 PCR 튜브 스트립에서 최종 부피가 17μL되도록 합니다. 최적의 시퀀싱 결과를 얻으려면 권장 범위 내에서 가능한 한 많은 양의 입력 DNA를 사용하십시오.
   참고: 총 DNA 농도가 17μL에서 권장되는 최소 10ng 미만인 경우, 제조업체가 제안한 대로 입력 요구 사항을 충족하기 위해 배경 DNA(예: 인간 게놈 DNA)를 보충하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 라이브러리 준비 반응을 안정화하고 저투입 임상 샘플에서 시퀀싱 성능을 향상시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
3. 단편화 완충액(5x)을 해동하고 소용돌이치고 얼음 위에 놓습니다.
4. 표 1에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 일시 중지하십시오.
   참고: 37°C 배양 단계의 지속 시간은 초기 DNA 단편 크기와 원하는 NGS 판독 길이에 따라 달라질 수 있습니다. 고품질 DNA 샘플의 경우, 2 100x 판독에 적합한 150 내지 200 bp의 단편을 얻기 위해 15분의 배양 시간을 권장하고, 2 150배 판독에 대해 180 내지 250 bp의 단편을 얻기 위해 10분의 배양 시간을 권장합니다.
5. -20°C 보관소에서 단편화 마스터 믹스에 필요한 바이알을 회수합니다. 표 2를 기반으로 마스터 믹스를 준비합니다. 튜브를 밀봉하고 5-10초 동안 고속으로 소용돌이치십시오. 거품을 제거하고 마스터 믹스를 얼음 위에 보관하기 위해 잠시 회전시킵니다.
6. 17μL의 입력 DNA가 포함된 각 웰에 3μL의 단편화 마스터 믹스를 추가합니다. 위아래로 20회 피펫팅하여 혼합하고 PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다.
7. PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고( 재료 표 참조) 1단계 시작 부분에서 표 1에 표시된 프로그램을 다시 시작합니다.
8. 4°C 유지 단계에 도달하면 열 순환기에서 PCR 튜브 스트립을 제거하고 30μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 얼음 위에 놓습니다.

표 1: 효소 단편화를 위한 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: 단편화 마스터 믹스의 준비 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

2. 라이브러리 준비

1. 결찰 마스터 믹스의 준비
   참고: 결찰 마스터 믹스는 실온으로 평형을 이루는 데 30-45분이 필요하기 때문에 이 시점에서 준비해야 합니다.
   1. -20°C 보관에서 결찰 완충액을 회수하고 얼음 위에서 해동합니다. -20°C 보관에서 T4 DNA 리가아제를 회수하고 바이알을 뒤집어 혼합한 다음 얼음 위에 보관합니다.
   2. 표 3에 따라 결찰 마스터 믹스를 준비합니다. 튜브를 밀봉하고 10-20초 동안 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전시킨 후 실온에서 30-45분 동안 보관한 후 사용하십시오.
2. 말단 수리 및 dA-tail 조각
   1. 표 4에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다.
   2. -20°C 보관에서 최종 수리 테일링 완충액을 회수하고 얼음 위에서 해동합니다. 해동되면 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전합니다. 끝 수리-테일링 효소 혼합물을 회수하고 바이알을 뒤집어 혼합하고 얼음 위에 보관합니다.
   3. 표 5에 따라 최종 수리/dA-테일링 마스터 믹스를 준비합니다( 재료 표 참조). 튜브와 와류를 고속으로 10-20초 동안 단단히 밀봉하여 혼합하고 잠시 회전시킨 다음 얼음 위에 둡니다.
   4. 20 μL의 말단 수리/dA-테일링 마스터 믹스를 50 μL의 DNA 단편이 포함된 각 웰에 피펫팅합니다(1.1-1.8단계에서). PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 고속으로 소용돌이하여 완전히 혼합합니다. PCR 튜브 스트립을 잠깐 돌려 열순환기에 넣습니다. 표 4의 프로그램을 다시 시작합니다.
3. MBC 태그 어댑터의 결찰
   1. 표 4의 프로그램이 마지막 단계를 완료하면 PCR 튜브 스트립을 얼음 위에 놓습니다. 표 6의 매개변수에 따라 열 순환기를 설정합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 일시 중지하십시오.
   2. 2.1단계에서 준비된 각 샘플에 실온 결찰 마스터 믹스 25μL를 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다.
   3. MBC 태그 라이브러리( 재료 표 참조)에 대한 어댑터 올리고 믹스를 -20°C 보관에서 회수하고 얼음 위에서 해동합니다. 해동되면 5-10초 동안 고속으로 소용돌이치십시오. 잠시 회전하고 얼음 위에 머물러 있습니다.
   4. MBC 태그 라이브러리용 어댑터 올리고 믹스 5μL를 각 샘플에 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다. 즉시 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고 표 6에 지정된 대로 프로그램을 계속 실행합니다.
4. 결찰 청소
   1. 마그네틱 비드를 사용하여 DNA 정제를 수행합니다. 4°C 보관에서 비드를 꺼내 사용하기 전에 실온에 도달시키십시오.
   2. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 70% 에탄올 4mL를 준비합니다. 실온에 보관하십시오.
      참고: 최적의 성능을 보장하기 위해 세척 단계에 사용할 70% 에탄올 용액을 새로 준비하는 것이 좋습니다. 70% 에탄올 제제의 경우 사용 직전에 뉴클레아제가 없는 물을 사용하십시오.
   3. 혼합물이 균일하고 색상이 일관되게 나타날 때까지 마그네틱 비드 현탁액을 철저히 소용돌이치게 합니다.
   4. 표 6의 프로그램이 4°C 유지 단계에 도달하면 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에서 실온으로 옮깁니다. 각 웰에 80μL의 비드 현탁액을 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다.
   5. 비드 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드로 옮기고( 재료 표 참조) 용액이 투명해질 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
   6. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 보관하면서 비드와의 접촉을 피하면서 각 웰에서 제거된 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
   7. 마그네틱 스탠드에 PCR 튜브 스트립을 사용하여 다음과 같은 방법으로 70% 에탄올로 두 번 세척합니다. 각 샘플에 200μL의 70% 에탄올을 추가합니다. 1분 정도 기다렸다가 에탄올 70%를 제거합니다. 용액을 제거하는 동안 구슬을 만지지 마십시오.
   8. 두 번째 세척 후 PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 샘플을 잠시 회전시켜 잔류 에탄올을 수집합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓습니다.
   9. 구슬을 만지지 않으면서 수집된 에탄올을 제거합니다. 잔류 에탄올을 제거하려면 마그네틱 스탠드에서 PCR 튜브 스트립을 제거하고 최대 5분 동안 밀봉을 해제한 상태(이상적으로는 후드 내부)합니다. 구슬이 완전히 건조되었지만 외관상 금이 가지 않았는지 확인하십시오. 이렇게 하면 용출 공정의 효율성이 저하됩니다.
   10. 각 샘플 웰에 35μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 DNA를 용리합니다. 위아래로 10x-15x로 피펫팅하여 완전히 혼합하고 튜브를 밀봉한 다음 5-10초 동안 소용돌이치게 합니다. 눈에 보이는 덩어리가 없는지 확인하십시오. 있는 경우 용해될 때까지 소용돌이치십시오.
   11. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 맑아질 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
   12. 각 웰에서 제거된 상청액(~34μL)을 조심스럽게 제거하고 신선한 PCR 튜브 스트립의 해당 웰로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 구슬을 버립니다.
       참고: 3일 프로토콜의 경우 이것이 1일차의 끝을 표시합니다. 샘플을 4°C에서 밤새 보관합니다.
5. 증폭 및 이중 인덱스
   참고: 시퀀싱 중에 적절한 식별을 보장하기 위해 각 샘플에 대해 적절한 인덱스 프라이머 쌍을 선택하십시오. 각 인덱스 서열은 사전 캡처 라이브러리의 증폭에 사용되는 프라이머 내에 통합된 8bp 태그로 구성됩니다.
   1. -20°C 보관에서 dNTP(5x)가 포함된 고충실도 DNA 중합효소 완충액을 회수하고 얼음 위에서 해동합니다. -20°C 보관에서 선택한 인덱스 시퀀싱 프라이머를 회수하여 얼음 위에 보관합니다.
      알림: 시퀀싱 프로세스 전반에 걸쳐 정확한 식별 및 추적성을 위해 각 샘플에 할당된 특정 바코드를 기록해야 합니다.
   2. 표 7에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 일시 중지하십시오.
      참고: 제조업체는 입력 DNA의 품질과 양에 따라 8-14회의 사전 캡처 PCR 주기를 수행할 것을 권장합니다. 이 프로토콜에서는 제조업체의 권장 사항에 따라 11개의 주기가 구현되어 고품질 시퀀싱 데이터^(10,12)가 생성되었습니다.
   3. -20°C 보관에서 PCR 증폭을 위한 고충실도 융합 효소를 회수합니다. 과도한 교반을 피하면서 효소를 위아래로 피펫팅하여 혼합하고 균질성을 보장하기 위해 충실도가 높은 DNA 중합효소 완충액을 소용돌이칩니다. 사전 캡처 PCR 반응 혼합물을 준비합니다( 표 8에 설명된 대로). 최종 믹스를 소용돌이치고 잠시 회전 다운하고 얼음 위에 유지합니다.
   4. 11 μL의 사전 캡처 PCR 반응 혼합물( 표 8에 설명된 대로 준비됨)을 정제된 DNA 라이브러리를 포함하는 각 샘플 웰에 분배합니다. 선택한 인덱스 프라이머 쌍 5μL를 각 반응에 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5초 동안 소용돌이치게 한 다음 빠르게 회전시킵니다.
   5. 표 7에 지정된 대로 열 순환기 프로그램을 재개하십시오. 온도가 98°C에 도달하면 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고 뚜껑을 단단히 닫습니다.
6. 도서관 정리
   1. 사용하기 전에 마그네틱 비드를 최소 30분 동안 실온으로 평형을 유지하십시오. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 70% 에탄올 4mL를 준비합니다. 실온에 보관하십시오.
   2. 혼합물이 균일하고 색상이 일관되게 나타날 때까지 마그네틱 비드 현탁액을 철저히 소용돌이치게 합니다.
   3. 표 7의 프로그램이 4°C 유지 단계에 도달하면 PCR 튜브 스트립을 열 순환기에서 실온으로 옮깁니다. 각 샘플에 50μL의 비드 현탁액을 첨가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 5-10초 동안 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다(마그네틱 비드를 펠릿화하지 않고).
   4. 비드 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액이 투명해질 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
   5. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 보관하면서 각 웰에서 투명한 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 용액을 제거하는 동안 구슬을 만지지 마십시오.
   6. 마그네틱 스탠드에 PCR 튜브 스트립을 사용하여 다음과 같은 방법으로 70% 에탄올로 두 번 세척합니다. 각 샘플에 200μL의 70% 에탄올을 첨가합니다. 1분 정도 기다렸다가 에탄올 70%를 제거합니다. 용액을 제거하는 동안 구슬을 만지지 마십시오.
   7. 두 번째 세척 후 PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 잠시 회전시켜 잔류 에탄올을 수집합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓습니다. 비드를 만지지 않으면서 잔류 에탄올을 제거하십시오.
   8. 잔류 에탄올을 제거하려면 마그네틱 스탠드에서 PCR 튜브 스트립을 제거하고 최대 5분 동안 밀봉을 해제한 상태(이상적으로는 후드 내부)합니다. 비드가 완전히 건조되었지만 외관상 균열이 없는지 확인하면 용출 공정의 효율성이 떨어질 수 있습니다.
   9. 각 샘플 튜브에 15μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 라이브러리 DNA를 용리합니다. 위아래로 10x-15x씩 피펫팅하여 완전히 혼합하고 PCR 튜브 스트립을 밀봉한 다음 5-10초 동안 소용돌이칩니다. 눈에 보이는 덩어리가 없는지 확인하십시오. 있는 경우 용해될 때까지 소용돌이치십시오.
   10. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 맑아질 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
   11. 각 웰에서 제거된 상청액(~15μL)을 조심스럽게 제거하고 신선한 PCR 튜브 스트립의 해당 웰로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 구슬을 버립니다.
7. 품질 관리
   1. 정제된 라이브러리 DNA의 DNA 농도를 측정합니다. 감도가 높기 때문에 형광 기반 방법을 사용하여 1μL의 DNA를 정량화합니다.

표 3: 결찰 마스터 믹스의 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 4: 최종 수리/dA-테일링을 위한 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 5: 최종 수리/dA 테일링 마스터 믹스의 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 6 결찰을 위한 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 7: 사전 캡처 PCR 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 8: 사전 캡처 PCR 반응 혼합물의 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

3. 샘플 하이브리드화/캡처

1. 프로브할 하이브리드화 라이브러리
   1. 표 9에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 일시 중지하십시오.
      알림: 제조업체는 65°C의 혼성화 온도를 권장합니다. 이 온도는 62.5°C로 낮아져 결과가 개선되었습니다.
   2. -20°C 보관에서 혼성화 완충액을 회수하여 얼음 위에서 해동한 다음 사용할 때까지 실온에서 보관합니다. RNase 차단제와 올리고뉴클레오티드 차단제 혼합물을 -20°C 보관에서 모두 회수하고 얼음 위에서 해동합니다. 이 바이알은 사용할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
   3. 2.7단계에서 측정한 DNA 농도를 기준으로 각 샘플이 500-1000ng의 DNA 라이브러리를 포함하는 데 필요한 부피를 계산합니다. 계산된 부피를 새 PCR 튜브 스트립으로 옮기고 뉴클레아제가 없는 물로 총 부피를 12μL로 조정합니다.
   4. 올리고뉴클레오티드 차단제 혼합물을 소용돌이치고 빠르게 회전시킵니다. 각 샘플 튜브에 5 μL를 추가합니다. PCR 튜브 스트립을 밀봉하고 열 순환기로 옮깁니다. 표 9 에 설명된 열 순환 프로그램을 재개하고 열 순환기의 샘플 웰에 직접 시약을 추가해야 하는 3단계까지 실행합니다.
   5. 표 10에 따라 25% RNase 블록 용액을 준비합니다. 튜브와 소용돌이를 고속으로 10-20초 동안 밀봉하고 잠시 회전시킨 다음 사용할 때까지 얼음 위에 둡니다.
      알림: 프로브 함유 용액을 실온에 장기간 노출시키지 마십시오. 준비 단계에서만 실온에 보관하십시오.
   6. -80°C 보관소에서 프로브 바이알을 꺼내 사용하지 않을 때는 바이알을 냉각 선반에 보관합니다. 해동을 위해 얼음에 옮깁니다. 프로브는 제공된 대로 사용하는 것이 좋지만 테스트하면 희석할 수 있습니다^10,13.
   7. 표 11에 나열된 모든 시약이 실온에 도달하면 결합하여 프로브 혼성화 혼합물을 준비합니다. 5초 동안 고속으로 소용돌이를 일으켜 용액을 혼합하고 잠시 회전시킨 후 즉시 다음 단계로 진행합니다.
   8. 열 순환기가 표 9에 설명된 프로그램의 3단계에 도달하면 각 샘플 웰에 실온 프로브 혼성화 혼합물 13μL를 추가하고 공정 내내 튜브를 열 순환기에 유지합니다. 8x-10x로 천천히 위아래로 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.
   9. PCR 튜브 스트립을 단단히 밀봉하고 잠시 소용돌이를 일으킨 다음 튜브를 아래로 회전시킵니다. 기포가 없는지 확인한 다음 즉시 스트립 튜브를 열 순환기로 되돌립니다. 튜브가 적절하게 밀봉되어 있는지 다시 확인하십시오.
   10. 프로브와 준비된 라이브러리 DNA 샘플의 혼성화를 수행하기 위해 열 순환 프로그램을 재개합니다. 하이브리드화는 하룻밤 사이에 진행됩니다.
       참고: 2일 프로토콜의 경우 이것이 1일차의 끝을 표시합니다. 3일 프로토콜의 경우 이것이 2일차의 끝을 나타냅니다.
2. 스트렙타비딘 비드의 준비
   1. 스트렙타비딘 코팅된 마그네틱 비드(스트렙타비딘 비드)를 4°C 보관에서 회수합니다. 비드가 완전히 재현탁되도록 바이알을 완전히 소용돌이치십시오. 서스펜션은 균질해야 합니다.
   2. 각 혼성화 샘플에 대해 완전히 재현탁된 비드 50μL를 새 PCR 튜브 스트립의 개별 튜브로 옮깁니다.
   3. 스트렙타비딘 비드를 다음과 같은 방법으로 세척합니다: 각 튜브에 200μL의 결합 완충액을 첨가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 밀봉하고 5-10초 동안 고속으로 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓습니다. 용액을 5분 동안 제거한 다음 조심스럽게 상청액을 제거하고 버립니다. 2단계를 반복하여 총 3회 세탁을 완료합니다.
   4. 200μL의 결합 완충액에 비드를 재현탁합니다.
3. 하이브리드화된 라이브러리 캡처
   1. 표 9에 표시된 혼성화 열 순환 프로그램이 마지막 단계를 완료하면 PCR 튜브 스트립을 실온으로 옮깁니다.
   2. 각 튜브의 전체 부피(~30μL)를 200μL의 사전 세척된 스트렙타비딘 비드가 들어 있는 해당 튜브로 옮깁니다. 위아래로 5x-8x로 피펫팅하여 완전히 혼합한 다음 스트립 튜브를 단단히 밀봉합니다.
   3. 스트립 튜브를 96웰 플레이트 믹서에 놓고 실온에서 30분 동안 1800rpm에서 격렬하게 혼합합니다. 웰 내에서 액체가 적절하게 혼합되도록 하십시오.
      참고: 96웰 플레이트 믹서를 사용할 수 없거나 샘플이 효과적으로 혼합되지 않는 경우 스트립 튜브를 믹서 상단 표면에 수평으로 고정하거나 온도 제어 셰이커(가열 옵션 꺼짐)를 사용하여 샘플을 완전히 교반하는 등의 대체 방법을 고려하십시오.
   4. 이 배양 시간 동안 각 샘플에 대해 200μL의 고온 세척 완충액 6개 분취량을 준비합니다(즉, 이 경우 각각 200μL가 포함된 6 x 8 스트립 튜브). 튜브를 밀봉하고 필요할 때까지 70°C로 유지된 열 순환기에서 배양합니다.
   5. 30분 캡처 배양이 완료되면 PCR 튜브 스트립을 잠시 돌려 액체를 수집합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓아 비드를 수집합니다. 용액이 투명해질 때까지(약 2분) 기다린 다음 비드를 만지지 않으면서 조심스럽게 상청액을 제거하고 버립니다.
   6. 마그네틱 스탠드에서 PCR 튜브 스트립을 제거한 후 200μL의 실온 세척 완충액을 추가합니다. 스트렙타비딘 비드가 완전히 재현탁될 때까지 위아래로 피펫팅합니다(15x-20x).
   7. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 현탁액이 제거될 때까지 기다립니다(약 1분). 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다.
      참고: 포획 특이성을 보장하려면 아래에 설명된 세척 절차 전반에 걸쳐 비드 현탁액을 70°C로 유지하는 것이 중요합니다. 따라서 사용하기 전에 고온 세척 완충액이 70°C로 예열되었는지 확인하십시오.
   8. 스트렙타비딘 비드를 분취하여 6회 세척하고 아래 설명된 대로 70°C 고온 세척 완충액으로 예열합니다.
      1. 마그네틱 스탠드에서 비드가 들어 있는 PCR 스트립 튜브를 제거합니다. 비드가 들어 있는 각 튜브에 70°C 예열된 고온 세척 완충액 200μL를 추가합니다. 비드가 완전히 재현탁될 때까지 위아래로 피펫팅합니다(15x-20x). PCR 튜브 스트립을 조심스럽게 밀봉하고 8초 동안 고속으로 소용돌이치고 비드를 펠릿화하지 않고 빠르게 회전시킵니다.
      2. 재현탁된 비드가 들어 있는 샘플 스트립 튜브를 열 순환기 블록에 70°C에서 5분 동안 넣습니다. 열 순환기에서 실온에서 마그네틱 스탠드로 스트립 튜브를 옮깁니다.
      3. 용액이 제거될 때까지 1분 정도 기다리십시오. 그런 다음 상층액을 제거하고 버립니다. 총 6회 세척에 대해 5회 반복합니다.
   9. 모든 세척 완충액이 완전히 제거되었는지 확인한 다음 각 샘플 튜브에 25μL의 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다. 기포 형성을 피하기 위해 위아래로 8회 피펫팅하여 비드를 천천히 재현탁합니다.
   10. 샘플이 들어 있는 PCR 스트립을 아래에 설명된 PCR 반응에 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 보관하십시오.
4. 증폭이 풍부한 라이브러리
   1. 표 12에 따라 열 순환기를 프로그래밍합니다. 프로그램을 시작하고 즉시 일시 중지하십시오.
      참고: 제조업체는 프로브 설계의 크기에 따라 10-16개의 캡처 후 PCR 주기를 수행할 것을 권장합니다. 이 프로토콜에서는 22주기가 구현되어 성공적인 병원체 게놈 복구가 이루어졌습니다^10,12.
   2. dNTP가 포함된 고충실도 DNA 중합효소 완충액(5x)과 포획 후 프라이머 혼합물( 재료 표 참조)을 -20°C 보관에서 회수하고 해동한 후 얼음 위에 보관합니다. 고속으로 소용돌이치고 사용하기 전에 빠르게 회전합니다.
   3. PCR 증폭을 위한 고충실도 융합 효소( 재료 표 참조)를 -20°C 보관에서 회수합니다. 효소 용액을 적절하게 혼합하려면 과도한 교반을 피하기 위해 액체를 위아래로 피펫팅하십시오. 그런 다음 표 13에 따라 모든 시약을 결합하여 포획 후 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 최종 믹스를 소용돌이치고 잠시 회전 다운하고 얼음 위에 유지합니다.
   4. 캡처 후 PCR 반응 혼합물 25μL를 각 샘플 튜브(각각 25μL의 비드 결합 표적 농축 DNA 포함)에 추가합니다. 비드 현탁액이 균일해질 때까지 반응을 혼합하기 위해 위아래로 피펫팅합니다. PCR 튜브 스트립을 단단히 밀봉합니다. 이 단계에서 PCR 튜브 스트립을 회전시키지 마십시오.
   5. PCR 튜브 스트립을 열 순환기에 넣고 표 12에 지정된 대로 열 순환기 프로그램을 재개합니다. 프로그램이 마지막 단계에 도달하면 PCR 튜브 스트립을 잠깐 돌립니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 맑아질 때까지 약 2분 동안 기다립니다.
   6. 각 PCR 튜브 스트립에서 약 50μL의 상청액을 새 PCR 튜브 스트립의 해당 웰로 옮깁니다. 스트렙타비딘 비드가 들어 있는 스트립 튜브는 폐기될 수 있습니다.
5. 최종 라이브러리 정리
   1. 사용하기 전에 마그네틱 비드를 최소 30분 동안 실온으로 평형을 유지하십시오. 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 70% 에탄올 4mL를 준비합니다. 실온에 보관하십시오.
   2. 혼합물이 균일하고 색상이 일관되게 나타날 때까지 마그네틱 비드 현탁액을 철저히 소용돌이치게 합니다.
   3. 각 샘플 튜브에 50μL의 비드 현탁액을 추가합니다. 튜브를 밀봉하고 5-10초 동안 소용돌이치고 잠시 회전시킵니다(마그네틱 비드를 펠릿화하지 않고).
   4. 비드 현탁액을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드로 옮기고 용액이 투명해질 때까지 5-10분 동안 기다립니다.
   5. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 보관하면서 각 웰에서 투명한 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다. 용액을 제거하는 동안 구슬을 만지지 마십시오.
      1. 마그네틱 스탠드에 PCR 튜브 스트립을 사용하여 다음과 같은 방법으로 70% 에탄올로 두 번 세척합니다. 각 샘플에 200μL의 70% 에탄올을 추가합니다. 교란된 비드가 가라앉을 때까지 1분 정도 기다렸다가 70% 에탄올을 제거합니다. 용액을 제거하는 동안 구슬을 만지지 마십시오.
   6. 두 번째 세척 후 튜브를 밀봉하고 PCR 튜브 스트립을 잠시 돌려 잔류 에탄올을 수집합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 30초 동안 놓습니다.
   7. 잔류 에탄올을 제거하려면 마그네틱 스탠드에서 PCR 튜브 스트립을 제거하고 최대 5분 동안 밀봉되지 않은 상태(이상적으로는 후드 안)로 유지합니다. 비드가 완전히 건조되었지만 외관상 균열이 없는지 확인하면 용출 공정의 효율성이 떨어집니다.
   8. 각 샘플 튜브에 25μL의 뉴클레아제가 없는 물을 첨가하여 라이브러리 DNA를 용리합니다. 위아래로 10x-15x씩 피펫팅하여 완전히 혼합하고 PCR 튜브 스트립을 밀봉한 다음 5-10초 동안 소용돌이칩니다. 눈에 보이는 덩어리가 없는지 확인하십시오.
   9. 샘플을 실온에서 5분 동안 배양합니다. PCR 튜브 스트립을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 맑아질 때까지 약 5분 동안 기다립니다.
   10. 각 웰에서 제거된 상청액(약 25μL)을 조심스럽게 제거하고 신선한 PCR 튜브 스트립의 해당 웰로 옮깁니다. 샘플을 얼음 위에 보관하고 구슬을 버립니다.
6. 품질 관리
   1. 정제된 라이브러리 DNA의 DNA 농도를 측정합니다. 더 나은 감도를 얻으려면 형광 기반 방법을 사용하여 1μL의 DNA를 정량화하십시오.
7. 차세대 염기서열 분석
   참고: 사용되는 플랫폼의 용량과 샘플당 필요한 시퀀싱 데이터의 양에 따라 여러 배치의 인덱싱된 라이브러리를 단일 시퀀싱 실행에서 멀티플렉싱할 수 있습니다.
   1. 샘플을 풀링하기 전에 각 샘플의 DNA 농도를 5ng/μL로 조정합니다. 균형 잡힌 표현을 유지하기 위해 등몰 양으로 라이브러리를 풀링합니다.
   2. 예를 들어 150bp 쌍말단 판독 구성과 함께 처리량이 높은 짧은 판독 시퀀싱 시스템을 사용하여 준비된 라이브러리를 시퀀싱합니다( 재료 표 참조).

표 9: 혼성화를 위한 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 10: RNase 블록 용액의 제조. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 11: 프로브 혼성화 혼합물의 준비. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 12: 포획 후 PCR 열 순환기 프로그램. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 13: 포스트 캡처 PCR 반응 혼합물의 제조. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

결과

아르헨티나 부에노스아이레스에서 발생한 C. trachomatis LGV 발병에 대한 연구에서는 샘플에서 몇 가지 새로운 특징, 즉 ompA-유전자형 L1과 비교하여 ompA 유전자의 10개 뉴클레오티드 치환과 특이한 MLST(Multi-Locus Sequence Typing) 서열 유형 2 17,18,19. 우리는 이러한 임상 샘플의 게놈을 조사하여 글로벌 데이터의 맥락에 배치하는 것을 목표로 했습니다. 이를 달성하기 위해 우리는 낮은 박테리아 부하와 풍부한 인간 및 미생물 DNA로 인한 문제를 극복하기 위해 임상 샘플에서 박테리아 STI의 WGS에 대한 직접 메타게놈 시퀀싱과 표적 농축 접근법의 성능을 비교했습니다.

사용된 DNA는 2017년에서 2023년 사이에 아르헨티나 부에노스아이레스에서 수집된 직장 면봉 샘플에서 2% 송아지 태아 혈청(FCS)과 항생제(겐타마이신 25μg/mL, 반코마이신 0.5mg/mL 및 암포테리신 B 2.5μg/mL)가 보충된 2-SP 배지(자당-인산염 배지)에 배치되거나 -80°C에서 보관되거나 풀링된 요도, 항문직장, 취리히 대학 병원(USZ)에서 NAAT(Nucleic Acid Amplification Tests) 완충액으로 수집한 인두 면봉. 부에노스아이레스 샘플의 DNA는 실리카 기반 수동 추출 키트를 사용하여 추출되었고, USZ 샘플의 DNA는 자동화된 마그네틱 비드 기반 시스템을 사용하여 추출되었습니다.

이 연구에 포함된 모든 임상 샘플은 다음과 같은 범위의 qPCR 주기 역치(Ct) 값을 가진 자체 개발된 다중 실시간 PCR 분석(재료 표 참조)에 의해 양성으로 확인되었습니다: C. trachomatis: 17-34, N. gonorrhoeae: 24-31, T. pallidum: 27-36 및 M. genitalium: 30-37. DNA 농도는 임상 샘플의 입력 물질을 특성화하기 위해 시퀀싱 전에 고감도 형광 분석을 사용하여 정량화되었습니다( 재료 표 참조).

직접 메타게놈 시퀀싱을 표적 농축과 비교하기 위해 32개의 샘플을 사용했으며, 그 중 29개는 C. trachomatis, 9개는 N. 임질, 5개는 T. pallidum, 3개는 M. genitalium에 대해 양성이었습니다. 직접 메타게놈 시퀀싱은 완전한 게놈을 생성하지 못했으며 실제로 음성 샘플에서 볼 수 있는 기준선 이상의 목표 데이터를 거의 달성하지 못했습니다. 65°C에서 혼성화를 통한 표적 농축은 각 병원체에 대해 훨씬 더 나은 결과를 가져왔고, 이 방법을 통해 많은 경우 성공적인 게놈을 얻었습니다 (그림 1).

표적 농축을 위한 최적의 샘플 선택을 평가하기 위해 우리는 표적 판독 비율(%OTR)으로 측정한 진단 qPCR Ct 값과 게놈 회수 효율성 사이의 관계를 평가했습니다. 이 지표는 표적 유기체의 게놈에 매핑되는 시퀀싱 판독의 비율을 반영하며 일반적으로 농축 성능을 평가하는 데 사용됩니다. C. trachomatis의 병원체 부하와 시퀀싱 성공 사이에 유의미한 상관관계가 발견되었으며, Ct30 주후의 성공에 대한 Ct 컷오프가 있었습니다. 다른 표적 병원체에 대한 데이터는 제한적이었지만 게놈 시퀀싱 성공이 주로 병원체 부하가 Ct30 미만인 샘플에서 발생한 유사한 추세가 관찰되었습니다 (그림 2).

65°C의 혼성화 온도를 사용한 이 실험은 Ct 값이 30 미만인 샘플을 기반으로 C . trachomatis, N. gonorrhoeae 및 T. pallidum에 대해 75%-80%의 표적 농축으로 게놈 시퀀싱 성공률을 제공했습니다. 3개의 M. genitalium 양성 샘플은 Ct 값이 30-37이었고 더 낮은 게놈 범위와 평균 판독 깊이를 달성했습니다. 이러한 결과를 개선하기 위해 우리는 M. genitalium 게놈의 낮은 %G+C 함량으로 인해 혼성화를 개선하는 혼성화 온도를 낮추는 실험을 했습니다. 현재 권장되는 온도인 62.5°C와 같은 더 낮은 혼성화 온도를 사용하면 다른 게놈의 회수를 손상시키지 않으면서 M. genitalium 게놈의 회수를 향상시킬 수 있습니다 (그림 3). 이러한 결과는 표적 농축이 임상 샘플에서 귀중한 게놈 정보를 얻기 위한 효과적인 접근 방식이며 패널 기반 설계 전반에 걸쳐 광범위한 게놈에 적용될 수 있음을 보여줍니다.

성공적으로 농축된 C. trachomatis 게놈의 계통 발생 분석은 부에노스아이레스의 샘플 대부분이 ompA 유전자형 L2b 계통 내에 모여 있는 것으로 나타났으며, 이는 전 세계 순환을 통한 성공적인 계통을 시사합니다. 분석 결과 아르헨티나에는 LGV를 유발하는 새롭고 뚜렷한 계통이 존재하는 것도 밝혀졌습니다. 이 계통의 샘플은 다른 LGV 계통과 약 600 SNP가 다르며, 이 계통은 ompA-유전자형 L4로 제안됩니다 (그림 4). 그림 1, 그림 2 및 그림 4에 사용된 샘플에 대한 자세한 설명은 보충 표 1에 나와 있습니다.

이러한 발견은 병원체 다양성 연구에서 표적 농축의 가치를 강조하고 임상 샘플에서 높은 수준의 게놈 시퀀싱 성공을 보여줍니다.

그림 1: 직접 메타게놈 시퀀싱과 비교한 표적 농축을 사용한 게놈 농축. 표적 유기체의 게놈에 매핑되는 시퀀싱 판독의 백분율로 정의되는 표적 판독 비율(%OTR)은 표적 농축으로 달성된 농축 정도를 보여줍니다. 선은 모든 데이터 포인트의 중앙값을 나타내고 상자는 50% 사분위수 범위(IQR)를 나타냅니다. 데이터 포인트 색상은 샘플 원본에 해당합니다(아르헨티나의 경우 옅은 파란색, 스위스의 경우 빨간색). 적용 범위>95% 및 평균 판독 깊이 >10으로 정의되는 게놈 시퀀싱 성공은 큰 점으로 표시되고 실패는 작은 점으로 표시됩니다. y축의 다른 눈금을 확인합니다. 약어: CT = C. trachomatis, NG = N. 임질, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. 이 수치는¹⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 표적 농축의 %OTR과 진단용 qPCR Ct 값의 상관관계. 데이터 포인트 색상은 샘플 소스를 나타냅니다(아르헨티나의 경우 옅은 파란색, 스위스의 경우 빨간색). 적용 범위>95% 및 평균 판독 깊이>10으로 정의되는 게놈 시퀀싱 성공은 큰 점으로 표시되고 실패는 작은 점으로 표시됩니다. y축의 다른 눈금을 확인합니다. 약어: CT = C. trachomatis, NG = N. 임질, TP = T. pallidum, MG = M. genitalium. 이 수치는¹⁰에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 10개 샘플의 모든 STI 박테리아 병원체에 대한 전체 게놈 회복에 대한 혼성화 온도의 영향. 임상 샘플의 범위 내의 인간 DNA는 알려진 농도의 표적 박테리아 DNA를 개별적으로(단일) 스파이크하여 여러 감염이 있는 샘플을 나타내기 위해(풀링됨) 또한 모두 스파이크되었습니다. 각각 5가지 병원체/조합을 사용한 두 가지 실험을 수행했습니다: 샘플의 전체 DNA에 대한 각 미생물의 DNA의 대략적인 백분율을 나타내기 위해 0.01% 및 0.03%(나머지 DNA는 인간 DNA에 해당함). M. genitalium 의 회복은 더 낮은 온도에서 향상됩니다. C. 트라코마티스 DNA는 낮은 농도로 스파이크되었습니다. 추가 실험은 온도가 C. trachomatis 게놈의 회복에 영향을 미치지 않았음을 보여줍니다(데이터는 표시되지 않음). 약어: CT = C. trachomatis, MG = M. genitalium, NG = N. 임질, TP = T. pallidum. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 아르헨티나의 LGV 균주의 재조합 조정 계통 발생. 분석에는 공개된 데이터와 함께 사용 가능한 모든 LGV 게놈이 포함됩니다. 계통 발생 오른쪽에 표시되는 메타데이터에는 중복 환자 샘플, 인구 구조의 베이지안 분석(BAPS; 클러스터 = 계통군, 다계통 BAPS 클러스터 6은 인구의 유전적 다양성을 나타내며), 게놈 시퀀싱 방법(이 연구의 데이터), ompA 유전자형, 국가 및 연도가 포함됩니다. 누락된 데이터는 흰색으로 표시됩니다. 이 연구의 게놈 이름은 아르헨티나의 경우 연한 파란색으로, 핀란드의 경우 진한 파란색으로 강조 표시되어 있습니다(표적 농축으로 얻지 않음). 이러한 색상은 이 연구에서 생성된 게놈을 구별하는 데만 사용됩니다. 1000개의 초고속 부트스트랩의 부트스트랩 값은 주요 분기에 백분율로 표시됩니다. 이 수치는¹³에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 연구에 사용된 재료, 시약, 기기 및 장비에 대한 설명. 이 표에는 DNA 추출, 라이브러리 준비, 표적 농축 및 시퀀싱에 사용되는 구성 요소의 상업적 이름, 제조업체 및 카탈로그 번호에 대한 자세한 정보가 포함되어 있습니다. 또한 사내 qPCR 분석 및 일반 분자 생물학 절차에 사용되는 항목도 포함됩니다. 별표(*)로 표시된 항목에는 동등한 대안을 사용할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

임상 샘플에서 완전한 박테리아 게놈 데이터를 생성하는 것은 특히 어렵습니다. 그러나 순환하는 클론에 대한 정보를 얻고 특히 까다롭고 배양하기 어려운 박테리아에서 항균제 내성 프로필을 조사하기 위해서는 이 데이터가 필요합니다. Oxford Nanopore Technologies를 사용한 딥 시퀀싱 또는 적응형 시퀀싱과 같은 대체 방법을 사용하면 전체 게놈 서열 분석을 위한 충분한 데이터를 얻을 수 없습니다. STI 샘플과 같은 경우 표적 농축은 전체 게놈에 접근하는 최적의 기술이며 이 방법은 박테리아 STI 병원체 패널에 걸쳐 사용할 수 있습니다. 값싼 절차는 아니지만 제공할 수 있는 결과는 다른 방법으로는 얻을 수 없습니다¹⁰.

진단 및 연구에서 관련성이 높고 중요한 질문에 답하는 것이 이상적이면 적절한 샘플을 신중하게 선택해야 합니다. 수집에 사용되는 배지가 반드시 중요한 역할을 하는 것은 아니며 2-SP 및 NAAT 배지 모두에서 성공적인 서열을 얻습니다. DNA 무결성을 유지하기 위해 샘플 보관이 중요합니다. 가장 중요한 요인은 Ct30 이하의 대략적인 Ct 값을 목표로 하는 진단 부하인 것으로 밝혀졌습니다. Ct 값이 30 이상인 샘플의 경우 전체 게놈 시퀀싱 성공 가능성은 낮지만 일부 경우 부분 데이터가 관련 정보를 제공할 수 있습니다.

이 절차는 PCR 주기, 혼성화 및 많은 비드 세척을 포함한 많은 단계를 포함하는 사소하지 않습니다. 최적의 결과를 얻으려면 절차에 세심한 주의가 필요합니다. 프로토콜의 중요한 단계인 DNA 단편화, 포획 프로브를 사용한 혼성화, 세척을 통한 마그네틱 비드 기반 포획에는 신중한 실행과 적절한 취급이 필요합니다. 이 프로토콜은 연구원과 기술자가 몇 번의 시도 후에 배울 수 있습니다. 첫 번째 라운드에서는 학습하는 동안 3일 프로토콜이 이점이 될 수 있습니다. 경험이 많은 사용자의 경우 2일 프로토콜을 사용하면 결과 속도를 높일 수 있습니다. 시약은 비싸기 때문에 프로브와 같은 값비싼 구성 요소 없이 테스트 실행을 실행할 가치가 있습니다. 대체 미끼 세트의 경우 혼성화 온도를 조정할 수 있어 농축의 민감도나 특이성이 향상될 수 있습니다. 충분한 데이터가 생성되고 상당한 비율의 PCR 중복이 관찰되면 캡처 전 및 캡처 후 PCR 주기 수도 조정할 수 있습니다.

이러한 실험에서 얻은 데이터는 MLST 및 기타 관련 대상을 추출하여 타이핑에 사용할 수 있습니다. 이는 전 세계 또는 지역적으로 역학적 맥락에서 현대적 통찰력을 얻기 위해 관련 게놈과 비교하여 추가로 분석할 수 있습니다. 게놈 전반에 걸친 재조합 및 이동 요소 분석은 또한 시간 경과에 따른 변화와 선택적 압력 하에서 변화와 동시 감염 가능성을 추론합니다. 충분한 데이터와 관련 메타데이터를 통해 시간적 계산을 할 수 있으며 특정 특성과 혈통의 조상, 가능한 전염 경로 및 메커니즘을 추론할 수 있습니다. 중요한 병원체 그룹에 대한 지식의 이러한 모든 발전은 공중 보건 전략에 정보를 제공할 수 있습니다. 우리의 프로토콜 및 대표적인 결과는 박테리아 STI 샘플에 효과적이고 추가 샘플 유형으로 확장될 수 있는 증후군 패널 표적 프로브 세트의 사용을 보여줍니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8채널 피펫 0.5-10 & 마이크로; L	에펜도르프	3125000010	에펜도르프 리서치  플러스, 8채널, 0.5-10 및 마이크로; L, 미디엄 그레이, 가변 볼륨.
8채널 피펫 10-100 & 마이크로; L	에펜도르프	3125000036	에펜도르프 리서치  플러스, 8채널, 10-100 및 마이크로; L, 노란색, 가변 볼륨.
MBC 태그 라이브러리용 어댑터 올리고 믹스	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
바이러스/병원체 DNA 추출 키트를 이용한 자동 핵산 추출 시스템	키아겐	937036 (키트) / 9001297 (악기)	자동 DNA 추출을 위해 QIAamp DSP 바이러스/병원체 키트와 함께 사용되는 QIAsymphony SP/AS 기기.
바인딩 버퍼	애질런트 테크놀로지스	5190-9687	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 박스 1(PCR 후 )의 일부입니다.
DNA 추출 키트 및 자동화 기기	자이모 리서치 코퍼레이션	D3024/D3025	임상 검체에서 전체 DNA 추출에 사용되는 Quick-DNA Miniprep 키트. 수동 또는 자동 워크플로우 호환.
엔드 리페어 - 테일링 효소 믹스	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
엔드 리페어 테일링 버퍼	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
에탄올	VWR 화학 BDH	20816.298	에탄올 절대 ≥ 99.5% Ph. Eur., USP
고감도 dsDNA 분석이 가능한 형광계 / DNA 정량화를 위한 형광 기반 방법	Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)	Q33238, Q33231	Qubit 4 형광계(1X dsDNA 고감도(HS) 분석 키트가 포함됨.
단편화 버퍼	애질런트 테크놀로지스	5191-4080	''5X Fragmentation Buffer''라는 이름의 SureSelect 효소 단편화 키트의 일부입니다.
단편화 효소	애질런트 테크놀로지스	5191-4080	SureSelect 효소 단편화 키트의 일부입니다.
충실도가 높은 DNA 중합효소 완충액	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	''Herculase II Buffer''라는 이름의 ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
dNTP를 사용한 고충실도 DNA 중합효소 완충액 (5X)	애질런트 테크놀로지스	5190-9687	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 박스 1(Post PCR)의 일부로, 이름은 'Herculase II Buffer'입니다.
PCR 증폭을 위한 고충실도 융합 효소	애질런트 테크놀로지스	5191-5688	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 박스 1(Post PCR)의 일부로, '헤르큘라제 II'라는 이름입니다.
고온 세척 완충액	애질런트 테크놀로지스	5190-9687	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 박스 1(사후 PCR)의 일부로, ''세척 완충액 2''라는 이름입니다.
혼성화 완충액	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
인덱스 시퀀싱 프라이머	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 인덱스 프라이머 쌍 1-96의 일부입니다.
사내 멀티플렉스 실시간 PCR 분석	팁 몰비올	해당 사항 없음	STI 검출을 위한 Lightmix 키트를 기반으로 자체 개발 및 공인 분석
결찰 완충액	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
청소용 마그네틱 비드	애질런트 테크놀로지스	5191-5740	SureSelect DNA AMPure XP 비드.
마그네틱 스탠드	Permagen 실험기구	MSRLV08	0.2mL PCR 8 스트립 마그네틱 분리기 5 및 마이크로; L ~0.2mL 용량.
차세대 염기서열 분석(NGS): 고처리량 단판독 염기서열 분석 시스템	일루미나, Inc.	해당 사항 없음	Illumina NextSeq1000 및 MiSeq 플랫폼에서 수행된 쌍단 150bp 시퀀싱(PE150).
뉴클레아제가 없는 물	바이오컨셉	3-07F04-H	분자 생물학용 물, DNA/DNAse/RNase 프리, 멸균, PCR 억제제 프리.
올리고뉴클레오티드 차단제 믹스	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
PCR 튜브 스트립	VWR 에서 제공하는 avantor;	732-3608	플랫 캡이 부착된 PCR 튜브 스트립.
포스트 캡처 프라이머 믹스	애질런트 테크놀로지스	5190-9687	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 박스 1(PCR 후 )의 일부입니다.
RNA 프로브	애질런트 테크놀로지스	5191-6916	SureSelect Custom Tier4 6Mb-11.9Mb 프로브, 예: 설계 ID S3465164).
RNase 차단제	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM(Pre PCR)용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트의 일부입니다.
실온 세척 완충액	애질런트 테크놀로지스	5190-9687	SureSelect 표적 농축 키트 ILM Hyb 모듈 상자 1(Post PCR)은 ''Wash buffer 1''이라는 이름입니다.
스트렙타비딘 비즈	애질런트 테크놀로지스	5191-5742	Sure스트렙타비딘 비드를 선택하십시오.
T4 DNA 리가아제	애질런트 테크놀로지스	5500-0147	ILM용 SureSelect XT HS2 라이브러리 준비 키트(Pre PCR)의 일부입니다.
표적 농축법 / DNA 포획법	애질런트 테크놀로지스	G9983-90000	SureSelect XT HS2 DNA 키트는 라이브러리 준비, Fast-Hyb 표적 농축 및 캡처 후 풀링 워크플로우를 제공합니다. 프로토콜 버전 F0, 2023년 5월. Illumina 플랫폼 NGS용
C. trachomatis, N. 임질, T. pallidum 및 M. genitalium	애질런트 테크놀로지스/농축 미생물학 연구소(IMM, UZH)	디자인 ID S3465164	4가지 STI 병원체의 다중 포획을 위한 맞춤형 프로브 세트(~242,000개 프로브). 다중 참조 게놈을 기반으로 설계합니다.
열 순환기	써모피셔	4375305	Veriti 96웰 열 순환기.