이 연구는 쥐 모델에서 발광 결장직장암 세포의 생체 내 피하 유도와 이미징 시스템을 사용한 후속 발광 측정에 중점을 둡니다. 이 절차는 실시간 모니터링 및 치료 평가를 위한 재현 가능한 종양 성장 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.
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방법 논문
항종양 효능을 평가하기 위해 Athymic Nude 마우스에 인간 결장직장암 세포의 피하 주입
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
대장암(CRC)은 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며, 잠재적인 치료법을 평가하기 위해 개선된 전임상 모델의 시급한 필요성을 강조합니다. 동물 모델은 종양 생물학을 밝히고 새로운 치료 개입을 평가하는 데 필수적입니다. 마우스 모델은 유전자 조작 가능성, 빠른 증식, 비용 효율성, 면역 적능 및 면역 결핍 균주의 가용성 등 기존 모델에 비해 주요 이점을 제공하여 인간 암의 정확한 모델링을 가능하게 합니다.
이 프로토콜은 면역결핍 쥐 모델에서 생물발광 결장직장암 세포주 HCT-116의 피하 유도에 초점을 맞춘 다음, 종양 진행과 성장을 모니터링하기 위해 IVIS 시스템과 캘리퍼를 사용한 비침습적 생물 발광 이미징에 중점을 둡니다. 발광 세포를 사용하면 종양 발생 및 치료 개입에 대한 반응을 추적하기 위한 실시간 정량화 가능한 접근 방식을 제공하여 침습적 절차의 필요성을 줄일 수 있습니다. 종양 세포 이식을 위해서는 마우스 코호트(n = 12)가 필요하며, 치료 테스트를 위한 표준화된 모델을 확립하기 위해 발광 강도를 측정합니다. 종양 부피는 일반적으로 길이 및 너비 측정 또는 너비만 사용하여 계산됩니다.
현재의 방법론은 일관된 종양 확립을 보장하는 동시에 변동성을 최소화하여 궁극적으로 전임상 평가의 신뢰성을 향상시킵니다. 이 연구의 결과는 약물 테스트를 위한 종양 모델을 개선하고 임상 응용 분야에서 전임상 연구의 중개 잠재력을 향상시키는 데 기여할 것입니다. 본 연구는 첨단 이미징 기술과 재현 가능한 실험 설계를 사용하여 대장암 치료를 위한 생체 내 약물 평가의 정확성과 효율성을 향상시키는 것을 목표로 합니다.
서론
대장암(CRC)은 전 세계적으로 가장 흔하고 치명적인 악성 종양 중 하나로, 전 세계적으로 가장 흔하고 치명적인 악성 종양 중 하나입니다1. 기존의 체외 분석법은 살아있는 시스템에서 종양 성장 및 약물 반응의 복잡성을 완전히 포착하지 못하기 때문에 신뢰할 수 있는 전임상 모델을 개발하는 것은 새로운 치료 접근법을 평가하는 데 필수적입니다. 생체 내 모델, 특히 쥐 모델은 종양 생물학에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 데 사용되어 연구자들이 통제된 환경에서 잠재적 치료의 효능을 평가할 수 있도록 합니다.
쥐 모델에서 발광 CRC 세포를 사용하는 것은 전임상 연구의 상당한 발전을 의미하며, 종양 진행에 대한 실시간 비침습적 모니터링을 가능하게 합니다2. 이 연구는 종양 성장을 동적으로 추적하기 위해 피하 종양 유도 및 IVIS 이미징에 대한 표준화된 프로토콜을 수립하는 것을 목표로 합니다. 피하 주사 모델은 기술적 단순성, 재현성 및 종적 종양 모니터링의 용이성 때문에 선택되었습니다. 생물발광 이미징을 활용함으로써 연구자들은 여러 시점에서 동물을 안락사시킬 필요 없이 종양 발생 및 치료 반응에 대한 정확하고 정량화 가능한 데이터를 얻을 수 있습니다3.
IVIS 이미징 시스템은 높은 민감도와 특이도로 종양 부담을 평가하기 위한 강력한 도구로, in vivo 연구의 재현성과 정확성을 향상시킵니다. 이 연구는 향후 치료 평가의 기초가 될 것이며, 대장암 치료를 위한 전임상 약물 검사에 대한 표준화되고 효율적인 접근 방식을 제공할 것입니다. 종양 유도 방법을 개선하고 고급 이미징 기술을 구현함으로써 이 연구는 종양학에서 전임상 응용 분야와 임상 응용 프로그램 간의 격차를 해소하는 데 기여합니다4.
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프로토콜
동물은 Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria ( IMIB, Murcia) 윤리 위원회(No A13240502)에서 수립한 지침에 따라 특정 병원체가 없는 조건에서 유지되었습니다. 검사는 R. D. 1201/2005에 따라 자격을 갖춘 직원에 의해 매주 수행되었습니다.
1. 동물
참고: 모든 동물은 주사 전에 안전하고 안전하게 제지되어야 합니다. 면역 결핍 마우스(즉, Crl: NU(NCr)-Foxn1nu와 같은 누드 흉선 마우스)로 작업하는 경우 무임 상태를 유지하는 것이 필수적입니다. 현재 연구는 실험 시작 시 5주령(암컷의 경우 20-22g, 수컷의 경우 22-26g)인 12마리의 흉선 누드 마우스(50% 수컷)를 사용했습니다. 모든 마취 및 실험 절차는 기관 윤리 위원회(프로토콜 번호 A13240502)의 승인과 스페인 법률(R.D. 1201/2005)에 따라 센터의 Guía de Ética y Buena Práctica en Investigación 에서 수행되었습니다.
- 분석을 시작하기 전에 4주령의 마우스를 약 1주일 동안 동물 센터에 적응시킵니다. 그런 다음 다음 절차를 수행하십시오.
2. D-루시페린 원료 준비
- 생물 안전 작업대 내부의 원뿔형 튜브에 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)에 D-Luciferin Potassium Salt Bioluminescent Substrate의 15mg/mL 작업 용액을 준비합니다. 용액을 잘 균질화하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집습니다.
- 멸균을 위해 0.2μm 주사기 필터를 통해 용액을 옮깁니다.
- 멸균된 용액을 1mL 불투명 마이크로튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
참고: 루시페린은 빛에 민감합니다.
3. 세포외 기질 준비
- 페놀-레드가 없는 상업용 ECM(extracellular matrix) 하이드로겔을 2°C에서 8°C 사이의 냉장고 내부의 얼음에 넣고 밤새 해동합니다5.
- 주사 당일에는 ECM을 얼음 위에 보관하고 미리 냉각된 P1000 마이크로피펫을 사용하여 200μL의 ECM을 멸균 튜브에 분취합니다.
알림: 보어가 넓은 마이크로튜브를 사용하는 것이 좋습니다. 온도 변화를 최소화하고 반복되는 동결-해동 주기를 피하십시오. - ECM의 급격한 온도 변화를 방지하기 위해 주사를 준비하기 전에 주사기와 바늘을 얼음에서 미리 식히십시오.
4. 세포 분리 및 계수
- 충분한 세포 수를 보장하기 위해 종양 유도 며칠 전에 T75 플라스크에 HCT-116 생물 발광 세포(ATCC 세포주 CCL-247-LUC2)를 플레이트화합니다. 세포 배양을 37°C, 5% CO2로 유지하고 필요한 경우 배지를 교체합니다6.
- 실험 당일에는 부착 세포를 방해하지 않도록 배양 배지를 조심스럽게 흡인합니다.
- 8mL의 멸균 PBS(수조에서 30°C로 예열)로 세포를 세척하여 잔류 혈청을 제거합니다.
- 따뜻한 트립신-EDTA(0.05%) 플라스크당 2mL를 넣고 37°C에서 4-5분 동안 배양합니다. 도립 현미경으로 세포 분리를 모니터링합니다. 세포가 붙어 있으면 플라스크 측면을 부드럽게 두드려 분리를 돕습니다.
- 소 태아 혈청(FBS)을 함유한 완전 성장 배지 10mL를 첨가하여 트립신을 중화합니다.
- 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 세포를 15mL 코니컬 튜브로 이동합니다. 2mL의 새 배지로 플라스크를 헹구어 남아 있는 세포를 수집하고 세척제를 15mL 튜브에 추가합니다.
- 실온에서 200 × g 의 세포 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상등액을 조심스럽게 흡입합니다.
- 세포 펠릿을 3mL의 시딩 배지에 부드럽게 재현탁시켜 균일한 현탁액을 얻습니다.
- Neubauer 챔버 또는 자동 세포 계수기에 있는 세포를 계수합니다. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 Trypan blue를 혼합하여 세포 생존율을 측정하고 도립 현미경으로 생존 가능한 세포를 계수합니다.
참고: 연구를 위해 충분한 수의 세포를 준비하십시오: 마우스당 최소 3 × 106 개의 생존 가능한 세포. - 멸균 PBS(수조에서 30°C로 예열)에 세포를 재현탁하고 PBS를 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 2 × 107 cells/mL의 최종 농도로 수정합니다. 200 μL의 부분 표본을 준비합니다.
5. 장비 품목을 설치하고 동물을 마취합니다.
- 이미징하기 최소 4시간 전에 이미징 시스템을 켜십시오.
참고: 신호 대 잡음비에 따라 광도 및 카메라 노출 시간에 대한 설정 조정을 포함하여 초기화 단계를 허용하려면 시스템의 지침을 따릅니다. 이 설정은 실험 조건에 따라 수동으로 설정해야 합니다. - 동물의 무게를 측정하고 투여해야 하는 D-루시페린의 부피를 계산합니다(동물 20g당 15mg/mL 용액 200μL).
- 이미징 챔버와 캐비닛을 청소하고 소독합니다.
- 마취를 위해 각 마우스를 식별하고 안전하게 제지합니다.
알림: 피하 주사 중 우발적인 바늘 찔림으로부터 손을 보호하기 위해 두 켤레의 장갑을 착용하십시오. - 1.8-2.0 L/min 유량의 산소에 2% 이소플루란이 함유된 마우스를 마취합니다. 마취 펌프와 동시에 흡입 펌프를 켭니다.
6. 주입을 위한 세포의 준비
- 생물 안전 작업대 내부의 극저온에서 2 × 107 생물발광 CRC 세포/mL 200 μL를 ECM 200 μL와 혼합합니다. P1000 피펫으로 부드럽게 피펫팅하여 기포 형성 및 해리를 방지합니다.
- 400μL 혼합물을 1mL 주사기에 옮기고 기포를 제거한 후 즉시 주입을 진행합니다.
- 바늘의 뚜껑을 안전하게 풀고 항상 바늘의 무균 상태를 유지하십시오.
알림: 오염을 최소화하기 위해 각 동물에 대해 개별 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 마우스 간 감염을 방지하기 위해 각 마우스에 새로운 바늘이 사용됩니다. - 25G 바늘을 부착하고 주사기 함량을 200μL로 조정하여 기포를 제거합니다.
참고: 주입은 일반적으로 200μL로 수행되며 주입당 2 × 106 개의 세포로 이어집니다. - 동물이 구속되어 있는 동안 캡이나 바늘을 만지지 않고 바늘을 느슨하게 캡에 다시 밀어 넣습니다.
7. 피하 종양 유도
- 마취가 완료되면 마우스가 챔버에서 제거되고 동물의 주둥이를 동일한 마취제를 공급하는 배출구에 놓습니다.
알림: 우리의 경우 노즐은 장갑을 사용하여 만들어졌습니다. - 동물을 평평한 표면의 오른쪽에 눕힙니다. 주로 사용하지 않는 손의 손가락 끝을 사용하여 왼쪽 아래 사분면에 있는 동물의 피부를 부드럽게 꼬집고 들어 올립니다.
- 주사하기 전에 먼저 흡입하여 바늘이 적절하게 배치되었는지 확인하십시오. 주로 사용하는 손으로 바늘 베벨업을 몸과 평행하게 들어 올린 피부에 2/3 삽입하고 이중 장갑을 통해 손가락을 찌르거나 구멍을 뚫지 않도록 매우 조심합니다.
알림: 적절하게 배치하면 음압이 생성되어야 하며 바늘 허브에 흡인이 없어야 합니다. - 주사기의 내용물(200μL)을 들어 올린 두 손가락 사이의 피부에 주입합니다. 바늘을 천천히 빼기 전에 잠시 유지하십시오. 피하 주사 후 바늘을 제거하고 날카로운 물건 용기에 안전하게 폐기하십시오.
8. D-루시페린의 복강내 주사
- 동물을 마취실로 되돌리기 전에 30G 인슐린 주사기(동물 20g당 200μL)에 15mg/mL 원액과 함께 체중 150mg/kg 농도로 D-루시페린을 복강내(IP)로 투여합니다.
참고: 최대 0.5mL 주입까지 잘 견딥니다. - 동물의 두개골(머리) 끝이 아래를 향하도록 하여 등쪽 누운(복부 쪽이 위로) 수동으로 구속합니다. 장 내용물이 아래로 이동하도록 합니다.
- 바늘의 경사면이 위로 향하게 하고 15-20°로 약간 기울어진 상태로 바늘 끝을 복강 안으로 밀어 넣어 바늘 끝이 동물의 왼쪽 하복부 사분면의 복벽을 관통하도록 합니다.
- D-루시페린을 복강내강에 천천히 주입하고 바늘을 제거한 후 안전하게 폐기합니다.
- 마우스를 마취실에 넣고 약 5분 동안 안정화시킵니다. 15분 후 생체 내 이미징을 진행합니다.
참고: 각각의 새로운 동물 모델에 대해 D-루시페린 운동 곡선을 구성하여 피크 신호 시간을 결정합니다. 우리의 경우, 발광은 생체 내 이미징에서 약 15분으로 최고조에 달했습니다.
9. 생체 내 이미징 분석
- 완전히 마취된 동물을 이미징 시스템의 오른쪽 측면에 있는 챔버에 놓습니다. 종양 부위를 캡처하기 위해 동물이 카메라 및 광원과 적절하게 정렬되어 있는지 확인합니다.
- 연결된 소프트웨어를 엽니다. 시각 또는 사진 이미징 모드를 선택하여 동물의 위치를 확인하십시오. 데이터를 저장하고 폴더 이름을 변경합니다.
- 생물 발광 이미징 모드를 선택하고 자동으로 설정합니다. 생물 발광 이미지를 캡처하고 컴퓨터 화면에서 종양 빛을 모니터링합니다.
- 영상 촬영이 완료되면 동물을 우리로 되돌려 놓고 합병증이 있는지 관찰합니다.
- 후처리를 수행하고, 먼저 모든 마우스 종양이 일반적으로 1e6 에서 1e8 사이의 동일한 스케일을 나타내도록 생물 발광을 확대합니다.
- 분석을 위해 종양 주변에 관심 영역(ROI)을 설정하고 추가 분석을 위해 복사합니다. ROI의 빛을 측정하고 추가 분석을 위해 이러한 결과를 내보냅니다. 이전에 생성하고 복사한 동일한 크기의 ROI를 후속 종양에 대해 붙여넣습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 시스템을 종료하고 이미징 챔버를 청소합니다. 산소 흐름과 함께 추출 및 마취 펌프를 끕니다.
10. 종양 부피 측정
- 종양 측정을 위해 이소플루란으로 동물을 마취합니다. 동물을 안정된 위치에 놓고 머리를 덮습니다. 동물을 빠르게 움직이지 못하게 합니다.
- 보정된 디지털 캘리퍼를 사용하여 종양의 길이, 너비 및 깊이를 측정합니다.
알림: 동물이 마취실에서 꺼낸 후 약 1분 후에 깨어나기 시작하므로 측정을 빠르게 수행하십시오. - 측정을 반복하고 평균을 계산합니다.
- 구형 또는 타원형 종양에 대한 공식에 따라 부피를 계산합니다.
구형 종양의 경우 7
(1)
타원체 종양의 경우 8
(2)
참고: 측정 편향을 최소화하려면 연구 내의 모든 종양 측정이 동일한 작업자에 의해 수행되어야 합니다. 또한, 종양 유도 당일에는 종양 덩어리가 아직 완전히 응고되지 않았기 때문에 정확한 측정이 어려운 경우가 많다는 점에 유의해야 합니다.
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결과
이 프로토콜은 면역결핍 마우스 모델에 인간 세포를 도입할 수 있도록 하여 생체 내보다 항상 생리학적으로 더 관련성이 높은 생체 내에서 이러한 종양 세포의 성장을 가능하게 합니다. 실험 조건이 가능한 한 재현 가능한지, 종양에 비슷한 수의 생존 가능한 세포가 포함되어 있는지, 비교 가능하고 지속적으로 접근 가능한 위치에 이식되었는지 확인하는 것이 중요합니다.
생체 내에서 생물 발광 HCT-116 세포주의 감도를 테스트하기 위해 2 × 106 세포를 누드 마우스에 피하 주입했습니다(n = 12). 최적화된 프로토콜은 방출된 빛과 종양 부피(P > 0.05) 측면에서 실행 가능한 수의 세포를 균일하게 주입할 수 있습니다(그림 1 및 그림 2). 생물 발...
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토론
흉선 누드 마우스 모델에서 발광 결장직장암 세포의 피하 유도를 위한 프로토콜은 종양 형성 및 실시간 모니터링을 위한 표준화되고 재현 가능한 접근 방식을 제시합니다. 첫째, 이러한 연구는 일반적으로 28일에 걸쳐 수행되며, 발광 측정은 종양 유도 당일에 수행되고 이후에는 매주 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 반대로, 종양 부피의 캘리퍼 측정은 세포 현탁액이 아직 캡슐화되지 않았기 때문에 첫날에 수행되지 않습니다. 종양 측정은 첫 주부터 시작되어 매주 수행됩니다. 종양 성장은 피하 주사 당일부터 종양이 약 300mm³의 부피에 도달할 때까지 캘리퍼스 측정을 사용하여 모니터링되었으며, 이는 이전 연구에서 설명한 공식을 사용하여 계산되었습니다9.
이 방법에서 가장 중요한 단계 중 하나는 ECM에서 종양 세포 현탁액을 준비하는 것인데, 이는 세포 생존력과 증식을 지원하는 EC...
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공개 사항
저자들은 이 연구에서 보고된 연구에 영향을 미칠 수 있는 경쟁적인 재정적 이해관계나 개인적 관계가 알려진 바가 없다고 선언합니다.
감사의 글
ACS와 CNN은 "Health Sciences PhD Program, Universidad Católica de Murcia (UCAM), Campus de los Jerónimos nº 135, Guadalupe 30107, Murcia, Spain"에 속해 있으며 UCAM의 박사 학위 보조금을 보유하고 있습니다. 저자들은 전임상 분석이 수행된 IMIB(Instituto Murciano de Investigación Biosanitaria, Murcia)의 동물 시설 플랫폼에 감사를 표합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 불투명 마이크로튜브 | 에펜도르프 | 30125215 | D-루시페린 저장 |
| 15 mL 원뿔형 튜브 | 팔콘, 써모피셔 사이언티브 | 11507411 | 세포 배양 물질 |
| 고급 두베코 s 개조 이글 미디엄 (DMEM) | 써모피셔 사이언티브 | 1152046 | 세포 배양 시약 |
| 무서디크 누드 마우스 | 찰스 강 | CRL:NU(NCr)-Foxn1nu | 면역결핍 누드 마우스 |
| 생물발광 인간 대장암세포 HCT116 | ATCC | CCL-247-LUC2 | HCT 116-Luc2는 생체 내 생물발광에 이상적입니다 |
| D-루시페린 피어스 | 써모피셔 사이언티브 | 15215733 | 생물발광 측정을 위해 |
| 세포외 기질 (ECM) | 코닝 | 356231 | 세포 침범을 위한 매트리젤 매트릭스 |
| 태아 소 혈청 | 써모피셔 사이언티브 | 10500064 | 세포 배양 시약 |
| 필터 피펫 팁 | 핀팁, 써모피셔 사이언티픽 | 94056710 | 기포 형성을 방지하기 위해 |
| 인슐린 주사기 25 G 1 mL | 이베로메드 | JERINRAYS29 | 세포주 HCT-116 착상을 위한 |
| 인슐린 주사기 30G 0.5 mL | DH 머티브 메디코 | 9.41652E+15 | D-루시페린 투여를 위해 |
| Living Image 소프트웨어가 적용된 IVIS 이미지 시스템 | 퍼킨엘머/리브비티 | 128201 | 생물발광 및 형광 영상 스캐너 |
| 바늘 스테리칸 헤파린 | VWR | 612-0153 10 | D-루시페린 투여 및 HCT-116 이식 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) | VWR | 392-0042P | HCT-116 박리 및 주입을 위한 세포 현탁액 |
| 트립신-EDTA | 써모피셔 사이언티브 | 11590626 | 세포 배양 시약 |
| T-75 플라스크, TC-처리됨 | 스타랩 | CC7682-41 | 세포 배양 물질 |
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