저간섭성 홀로토마그래피를 통한 장내 오가노이드의 무표지, 고해상도 3D 이미징 및 머신러닝 분석

Summary

우리는 저간섭 홀로단층촬영을 사용하여 오가노이드의 고해상도, 무표지 및 3차원 이미징을 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 이미징 획득 및 전산 이미지 분석을 자세히 설명하여 살아있는 오가노이드의 구조 역학 및 약물 반응을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

Abstract

장 오가노이드의 정확하고 무표지 이미징은 형태, 성장 역학 및 환경 자극에 대한 반응을 연구하는 데 중요합니다. 홀로토그래피(HT)는 형광 마커 없이 살아있는 오가노이드의 고해상도 3차원(3D) 시각화를 제공하여 광독성을 최소화하고 샘플 무결성을 보존합니다. 실시간 위상 기반 이미징을 통해 구조 및 기능 변화를 지속적으로 라벨 없이 추적할 수 있습니다. 굴절률을 고유 이미징 대비로 사용함으로써 이 방법을 사용하면 부피, 단백질 밀도 및 단백질 함량과 같은 생물물리학적 특성을 정량화할 수 있습니다. 이미징 데이터는 머신 러닝 기반 세그멘테이션 (Segmentation) 및 기능 추출 (Feature Extraction) 을 통해 추가로 처리되어 일관되고 처리량이 많은 분석을 지원합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 준비, 이미징 획득 및 기계 학습 기반 데이터 분석을 다루는 오가노이드 연구에서 저일관성 HT를 사용하기 위한 완전한 실험 워크플로를 자세히 설명합니다. 계산 분할과 정량적 평가를 통합함으로써 이 접근 방식은 생존력, 구조적 조직 및 약물 반응을 포함한 주요 오가노이드 특성을 편견 없이 평가할 수 있습니다. 세포 내 해상도에서 실시간 형태학적 변화를 캡처할 수 있는 능력으로 인해 이 프로토콜은 재생 의학, 질병 모델링 및 제약 스크리닝의 오가노이드 기반 연구에 매우 적용 가능합니다. 여기에 설명된 단계별 방법론은 다양한 오가노이드 시스템에 걸쳐 재현성과 광범위한 적응을 촉진합니다.

Introduction

오가노이드는 줄기 세포에서 성장한 장기의 3차원(3D) 소형화 버전으로, 시험관 내에서 실제 장기의 주요 구조적 및 기능적 특징을 요약할 수 있습니다 1. 연구자들은 장, 뇌, 폐, 간, 신장을 포함한 광범위한 조직에 대한 오가노이드 시스템을 개발했으며, 각 조직은 생체 내 조직을 연상시키는 자기 조직화 구조와 세포 유형 다양성을 보여줍니다. 고유 장기 구조와 다세포 복잡성을 반영함으로써 오가노이드는 인간 발달, 조직 재생 및 질병 메커니즘을 연구하기 위한 강력한 모델 시스템 역할을 합니다¹. 이는 질병 모델링 및 약물 발견을 위한 중추적인 도구가 되었으며, 이를 통해 연구자들은 실험실에서 질병 경로를 탐색하고 환자별 3D 조직에서 새로운 치료법을 테스트할 수 있습니다². 특히, 오가노이드는 재생 의학에서도 유망합니다³: 장 및 간 오가노이드에서 입증된 바와 같이 오가노이드 유래 조직은 손상을 복구하기 위해 생체 내에서 생착될 수 있으며, 이는 장기 기능 회복 가능성을 강조합니다⁴. 이러한 다양성으로 인해 오가노이드는 현대 생물의학 연구와 맞춤형 의학에 없어서는 안 될 필수 요소입니다.

다중 세포 구성과 3D 구조적 복잡성을 고려할 때 오가노이드 역학을 포착하고 분석하는 것이 중요합니다. 그러나 기존의 이미징 기술은 오가노이드 구조 및 역학을 해결하는 데 상당한 한계에 직면해 있으며, 종종 완전한 생리학적 상태를 나타내지 못하는 2D 스냅샷을 생성합니다⁵.

명시야 현미경은 오가노이드를 포획하는 데 널리 사용되는 비침습적 방법입니다. 성장과 형태를 편리하게 모니터링하지만 염색되지 않은 3D 샘플에서는 제한된 대비를 제공합니다. 또한 광학 단면화가 부족하여 내부 구조의 해상도가 떨어집니다. 오가노이드는 대체로 투명하게 나타나 표면 아래의 미세한 특징을 감지하는 데 방해가 됩니다⁶. 위상차는 위상 변이를 강도 차이로 변환하여 가시성을 향상시켜 염색 없이 일반적인 구조(예: 중앙 내강)를 드러냅니다. 실시간 관찰을 위한 유용성에도 불구하고 위상차는 후광 아티팩트, 낮은 해상도 및 제한된 침투 깊이로 인해 문제가 발생하여 두꺼운 오가노이드에는 덜 효과적입니다⁷.

일련의 절편에 이어 헤마트실린 및 에오신(H&E) 염색 및 항체 기반 면역염색은 오가노이드 미세 구조 및 세포 구성을 분석하는 데 널리 사용됩니다⁸. 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 및 냉동 절편과 같은 개선된 조직 처리 기술은 형태 보존을 향상시키며 FFPE는 우수한 결과를 제공합니다⁹. 아가로스 및 원심분리와 같은 하이드로겔에 오가노이드를 포매하면 단일 섹션에 여러 샘플이 정렬되어 분석 효율성이 향상됩니다. 환자 유래 종양 오가노이드의 H&E 염색 절편은 원래의 종양 조직학을 반영하는 반면, 면역형광 염색은 세포 식별을 위한 CK8과 같은 마커를 강조합니다¹⁰. 그러나 이러한 기술은 살아있는 오가노이드를 모니터링할 수 없으며 절편 중에 조직 주름이나 변형과 같은 인공물을 유발할 수 있습니다.

공초점 형광 현미경은 오가노이드 이미징에 널리 사용되며, 오가노이드 구조 및 세포 구성의 상세한 시각화를 가능하게 하는 고해상도(마이크로미터 이하) 광학 섹션을 생성합니다^11,12. 그러나 3D 오가노이드의 공초점 이미징은 일반적으로 표면층(최대 100μm 깊이)으로 제한되며 포인트 스캐닝 레이저 조명으로 인해 시간이 많이 걸리고 광독성이 있을 수 있습니다¹³. 라이트 시트 형광 현미경(LSFM)은 이미징 평면만 비추어 이러한 한계 중 일부를 극복하고 광표백 및 광독성을 최소화하면서 전체 오가노이드의 빠른 체적 이미징을 달성합니다^14,15; 그러나 이 기술은 두꺼운 표본의 최적 이미징을 위해 조직 제거가 필요한 경우가 많습니다. 또한 LSFM 이미징 깊이는 빛 산란 및 굴절률(RI) 불일치에 의해 제한되며, 이는 적응 광학, 다중 뷰 이미징 및 최적화된 여기 파장을 통해 완화될 수 있습니다¹⁶. 샘플 장착은 또한 구조적 변형을 유발하는 반면, 대규모 3D 데이터 세트는 저장 및 분석에서 계산 문제를 야기합니다. 개선된 유전자 표지 기술, 새로운 투명 시약, 적응 광학 및 AI 기반 이미지 분석을 포함한 최근의 발전은 이러한 한계를 해결하여 LSFM을 오가노이드 연구에 점점 더 실현 가능하게 만들고 있습니다⁷.

이러한 발전에도 불구하고 3D 형광 이미징 기술은 살아있는 오가노이드의 장기 모니터링에 몇 가지 과제를 제기합니다. 첫째, 형광 표지의 사용은 광독성 효과를 도입하고 생물학적 과정을 교란하여 장기간의 라이브 이미징 연구에 어려움을 야기합니다¹⁷. 둘째, 항체 기반 라벨링은 조밀한 오가노이드 구조 내의 확산 장벽으로 인해 침투가 제한되어 있으며, 1차 및 2차 항체를 사용하기 위해 10일 이상의 배양이 필요한 고급 투과화 및 조직 제거 방법이 필요합니다¹⁸. 셋째, 오가노이드에서의 형질감염 및 안정적인 형광 단백질 발현은 기존의 유전자 전달 접근법이 3D 환경에서 어려움을 겪기 때문에 여전히 비효율적입니다¹⁹. 넷째, 심층 이미징에 필수적인 광학 투명화 기술은 종종 형광 신호 손실과 조직 왜곡으로 이어지므로 형광의 투명성과 보존의 균형을 맞추는 최적화된 투명화 프로토콜이 필요합니다²⁰.

이러한 한계를 해결하기 위해 홀로단층촬영(HT)은 시간이 지남에 따라 고해상도로 표지되지 않은 살아있는 오가노이드를 이미징하는 기술로 도입되었습니다. 3D 정량적 위상 이미징이라고도 하는 HT는 고유의 생리학적 상태를 보존하면서 오가노이드의 실시간 정량적 시각화를 가능하게 하는 라벨이 없는 고해상도 양식입니다. HT의 원리는 X선 컴퓨터 단층 촬영과 유사합니다. 다양한 조명 조건에서 여러 개의 2D 광장을 캡처함으로써 레이블이 지정되지 않은 샘플의 3D RI 분포는 역파 방정식 풀기 21,22,23을 통해 재구성됩니다. HT는 혈액학^24,25, 세포생물학의 상 응축 26, 미생물학²⁷ 및 조직병리학 ²⁸을 포함한 다양한 생물학적 분야에 널리 적용되었습니다. 보다 최근에는 고해상도, 무표지 3D 이미징 기능이 오가노이드 연구에 점점 더 많이 활용되고 있으며21,22,23,29, 구조적 및 기능적 역학을 연구하기 위한 비침습적 접근 방식을 제공합니다.

이 연구에서 우리는 마우스 소장 오가노이드(sIO)의 장기적이고 무표지 모니터링에서 저일관성 HT를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 24시간 동안 오가노이드 성장 및 약물 반응을 실시간으로 시각화하는 동시에 오가노이드 부피, 단백질 밀도 및 단백질 함량의 정량적 측정을 제공하여 오가노이드 거동에 대한 엄격한 데이터 기반 분석을 용이하게 합니다. 오가노이드의 형태학적 변화를 조사하기 위해 DNA 가교를 형성하고 세포 복제를 억제하여 세포사멸을 유도하는 것으로 알려진 백금 기반 화학요법제인 시스플라틴으로 샘플을 처리했습니다³⁰. 3D RI 이미징은 구조적 세부 사항을 캡처하지만 오가노이드 역학을 정량화하려면 체계적인 분석이 필수적입니다. 이를 달성하기 위해 우리는 오가노이드 영역을 배경과 구별하기 위해 기계 학습 기반 분할 툴킷(³¹ )인 ilastik을 통합합니다. 이 프로토콜은 오가노이드 배양 준비, 3D HT 획득, 기계 학습 기반 분할 및 RI 단층 촬영의 정량 분석을 포함한 전체 워크플로를 간략하게 설명합니다. 확장 가능하고 재현 가능하며 비침습적인 이미징 프레임워크를 제공함으로써 이 접근 방식은 질병 모델링, 재생 의학 및 약물 스크리닝에 광범위하게 응용되는 오가노이드 연구의 새로운 표준을 확립합니다.

Protocol

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 소프트웨어와 관련된 세부 정보는 자료 표에 나와 있습니다. 다른 제조업체의 동등한 제품을 대안으로 사용할 수 있습니다. 전체 프로토콜의 개략적인 프로세스가 그림 1에 나와 있습니다.

1. 샘플 준비

1. sIO 배양 배지의 준비
   1. 제조업체의 지침에 따라 시중에서 판매되는 배양 배지를 준비하십시오. 0.22μm 필터 장치를 통해 여과하여 배양 배지를 멸균합니다.
      참고: 배지가 세포 배양 후드의 멸균 조건에서 완전히 준비되고 모든 구성 요소가 사전 멸균된 경우(예: 멸균 병 및 바이알에 제공됨) 0.22μm 필터를 통한 여과가 엄격하게 필요하지 않을 수 있습니다.
   2. 준비된 배지 15mL를 멸균 저장 튜브에 분취합니다. 오가노이드 배양에 사용하기 전에 분취된 배지를 실온(15 - 25°C)으로 데우십시오.
2. sIO 재고 해동
   1. 37°C 수조를 사용하여 2분 이내에 냉동 오가노이드 스톡을 빠르게 해동합니다. 해동된 오가노이드 현탁액을 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 150 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 오가노이드를 펠릿화합니다.
   2. 상청액을 조심스럽게 제거하여 DMSO를 씻어내고 잠재적인 세포독성 효과를 최소화합니다.
   3. 배지와 신선한 세포외 매트릭스(ECM)를 1:4 비율로 추가하고 부드럽게 피펫팅하여 펠릿의 균일한 재현탁을 보장합니다. 48웰 플레이트의 각 웰에 돔당 15μL를 분배합니다. 조기 중합을 방지하기 위해 ECM을 얼음 위에 보관하십시오.
   4. ECM 중합을 허용하기 위해 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 거꾸로 1시간 동안 놓습니다. 중합 후 각 웰에 200μL의 신선한 배지를 조심스럽게 추가합니다.
      참고: 이 프로토콜은 다양한 상업용 이미징 접시 및 웰 플레이트와 호환됩니다. ECM 돔이 완전히 잠기도록 웰 유형에 따라 미디어 볼륨을 조정하십시오.
3. sIO의 전달
   참고: 오가노이드는 피펫 팁에 부착되는 경향이 있습니다. 접착을 최소화하려면 피펫 팁을 배지로 미리 적십니다.
   1. 흡인은 중간 소모를 사용했습니다. 각 웰에 200μL의 세포 회수 용액을 첨가하고 ECM 분해 및 오가노이드 회수를 용이하게 하기 위해 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
   2. 부드러운 피펫팅으로 오가노이드 현탁액을 수집하고 이를 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 상청액을 조심스럽게 제거합니다.
   3. (선택 사항) 단일 세포로 계대하려면 다음 해리 방법 중 하나를 수행하십시오.
      1. 효소 방법: 펠릿에 100μL의 단일 세포 해리 용액을 첨가하고 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 1-2분 동안 배양합니다. 150μL의 배지를 첨가하여 중화합니다. 피펫팅 또는 부드럽게 두드리는 작업을 수행합니다. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상층액을 제거하고 펠릿만 남깁니다.
         알림: 장기간 노출되면 세포에 매우 해로울 수 있으므로 과도한 배양을 피하십시오.
      2. 기계적 해리: 펠릿을 200μL의 배양 배지에 재현탁합니다. P200 피펫을 사용하여 위아래로 20x-30x를 피펫팅하여 오가노이드를 더 작은 조각 또는 단일 세포로 기계적으로 해리시킵니다. 150 x g 에서 3분 동안 원심분리한 다음 상청액을 흡인하고 펠릿을 유지합니다.
   4. 배지와 신선한 ECM을 1:4 비율로 추가하고 펠릿이 균일하게 재현탁되도록 부드럽게 피펫팅합니다. 48웰 플레이트의 각 웰에 돔당 15μL를 분배합니다.
   5. ECM이 중합될 수 있도록 플레이트를 37°C, 5%_CO2 인큐베이터에 거꾸로 1시간 동안 놓습니다.
   6. 중합 후 각 웰에 200μL의 신선한 배양 배지를 추가하고 증발을 방지하기 위해 빈 외부 웰을 PBS로 채웁니다. 배양 배지를 2-3일마다 교체하고 매주 오가노이드를 계대시킵니다. 원하는 오가노이드 크기에 따라 계대 간격을 조정합니다.
4. 약물 치료
   1. 3.00mg의 시스플라틴 분말(MW ≈ 300.05g/mol)을 1mL의 DMSO에 녹여 10mM 시스플라틴 원액을 준비합니다. 호박색 튜브를 사용하거나 알루미늄 호일로 감싸서 용액을 잠깐 소용돌이치고 빛으로부터 보호합니다.
   2. 처리 배지를 준비하기 위해, 10 mM 시스플라틴 스톡을 완전한 sIO 배양 배지에서 1:1,000으로 희석하여 10 μM 시스플라틴 및 0.1% DMSO의 최종 농도를 얻는다.
   3. 비히클 대조군의 경우, 시스플라틴 없이 최종 DMSO 농도와 일치하도록 배양 배지에 0.1% DMSO를 준비합니다.
   4. sIO 배양에서 사용한 배지를 제거하고 10μM 시스플라틴 함유 배지 또는 DMSO 전용 대조군 배지로 부드럽게 교체합니다.
   5. 처리 후 샘플을 이미징 시스템 인큐베이터로 옮깁니다.

2. 운영 소프트웨어를 이용한 저간섭 홀로단층촬영 이미징

1. 이미징을 위한 시료 준비
   1. 1.3.1-1.3.4단계에 설명된 절차에 따라 15μL의 오가노이드-ECM 돔을 #1.5 커버슬립 바닥 이미징 접시에 분배합니다. 최적의 이미징을 위해 접시의 각 돔을 가능한 한 중앙에 가깝게 배치하십시오.
   2. 중합하기 전에 실온에서 1분 동안 배양하여 오가노이드가 바닥으로 가라앉도록 합니다.
   3. 플레이트를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 거꾸로 놓아 ECM을 중합시키기 위해 1시간 동안 놓습니다. 그런 다음 오가노이드가 완전히 잠길 수 있을 만큼 충분한 배양 배지를 부드럽게 추가합니다.
      참고: 커버슬립 바닥 이미징 접시의 크기에 따라 오가노이드가 완전히 잠기도록 중간 부피를 조정합니다.
   4. 계대 후 5일에 이미징 직전에 PBS로 샘플을 2x-3x로 세척하여 파편을 제거하고 광학 인공물을 줄입니다.
2. 이미징 설정
   1. 샘플 생존력을 유지하려면 환경 컨트롤러를 켭니다. 챔버 컨트롤러 장치는 자동으로 온도를 37 ° C로, CO₂ 농도를 5% 로 조정합니다.
   2. 기기 전면의 도어 버튼을 눌러 도어를 엽니다. 배양 배지가 건조되는 것을 방지하기 위해 물을 추가하여 챔버 웰 내부에 얇은 층을 형성합니다.
   3. 이미징 접시를 적절한 용기 홀더에 놓고 이미징 챔버에 삽입한 다음 핀을 사용하여 움직이지 않도록 고정합니다. 접시가 기울어지지 않고 용기 홀더에 단단히 부착되어 있는지 확인하십시오.
   4. 외부 조명 간섭을 차단하기 위해 도어 버튼을 사용하여 기기의 도어를 닫습니다.
   5. TomoStudio X 소프트웨어를 실행하고 로그인합니다. 시작 을 클릭하여 기본 창을 엽니다.
   6. 왼쪽 상단 모서리에 있는 프로젝트 추가 를 클릭하고 실험 매개변수(예: 프로젝트 이름, 배지 유형, 샘플 유형 등)를 할당합니다. 시편 패널이 자동으로 생성됩니다. 실험에서 적절한 RI를 사용하기 위해 올바른 배지 유형이 할당되었는지 확인하십시오.
   7. 패널에서 원하는 웰 을 클릭하고 상단의 생성 을 클릭하여 웰을 표본으로 등록합니다.
   8. 오른쪽 상단 모서리에 있는 ROI 설정을 클릭하여 접시의 관심 영역(ROI)을 정의합니다. 모든 매개변수가 설정되면 오른쪽 하단 모서리에 있는 실험 실행 을 클릭하여 이미지 획득 창을 엽니다.
   9. 오른쪽 상단 모서리에 있는 선박 적재(Load Vessel )를 클릭합니다. 명시야 이미지가 나타납니다. +Z 및 -Z 버튼을 사용하여 Z 위치를 조정하여 초점을 맞춥니다.
   10. 단일 이미징 탭에서 ROI 크기를 조정합니다. 160 μm x 160 μm 시야 내에서 오가노이드를 캡처하고 최대 140 μm 깊이의 축 스택을 획득합니다. 더 큰 오가노이드의 경우 하단의 타일 이미징 확인란을 선택하여 여러 RI 단층 촬영 및 스티치 이미지를 획득합니다.
   11. Time Lapse Imaging(타임랩스 이미징) 탭으로 이동하여 장기 이미징을 구성합니다. 필요에 따라 지속 시간과 간격 시간을 설정합니다. 본 실험에서는 24시간 동안 10분 간격으로 타임랩스 이미징을 시행하였고, 같은 기간 동안 2시간 간격으로 분석을 실시하였다.
   12. 스캔 아이콘을 클릭하여 현재 ROI 위치를 캡처합니다. 명시야 이미징을 사용하여 ECM 돔을 수동으로 중앙에 배치합니다. BF 버튼을 클릭하여 명시야 이미징의 강도 및 노출 값을 조정합니다.
   13. [미리보기] 패널에 나타나는 ROI 상자를 이동하여 ROI 를 선택합니다. 원하는 ROI를 찾으면 하단의 Add Point(포인트 추가 )를 클릭합니다. 이미징 포인트 목록이 나타납니다.
   14. Acquire( 획득) 를 클릭하여 이미징을 시작합니다. 원시 이미지 데이터가 수집됩니다.
3. 이미지 획득
   참고: 이 프로세스는 원시 이미지 데이터에서 TCF(Tomocube Common File)를 생성합니다. 원시 이미지 데이터는 RI 단층 촬영 및 최대 강도 투영과 같은 여러 유형의 이미지가 포함된 TCF 파일로 처리되어야 합니다. RI 단층 촬영은 샘플의 3D RI 분포를 나타내며, 최대 강도 투영은 XY 평면의 각 측면 위치에 대해 가장 높은 RI 값을 보여줍니다.
   1. 원시 이미지 파일을 HTX 처리 서버로 끌어다 놓습니다. 프로세스를 클릭하여 원시 이미지 파일에서 TCF 파일을 생성합니다.
   2. TCF 파일에서 생성된 RI 단층 촬영을 보려면 TomoAnalysis Viewer, MATLAB 또는 Python을 사용합니다. MATLAB에서 TCF 파일을 보려면 h5info 및 h5read와 같은 함수를 사용합니다. 마찬가지로 Python에서는 H5 파일을 읽기 위해 h5py 패키지를 사용합니다.

3. 이미지 분석

1. 기계 학습 기반 이미지 분할
   1. TCF 이미지 파일을 HDF5 형식(보충 코딩 파일 1)으로 내보내 데이터가 ilastik과 호환되는 다차원 형식인지 확인합니다.
   2. ilastik을 열고 파일 > 새 프로젝트로 이동합니다. 선택 픽셀 분류 아래 세그멘테이션 워크플로우 섹션. 프로젝트 파일을 지정된 디렉토리에 저장합니다.
   3. 1로 이동하여 HDF5 파일을 로드합니다. 입력 데이터 탭. 새 파일 추가를 클릭하고 적절한 H5 데이터 세트를 선택한 다음 올바른 이미지 채널이 할당되었는지 확인합니다.
   4. 2로 이동합니다. 피처 선택 탭을 사용하여 관련 피처(색상/강도, 가장자리, 텍스처)를 선택하여 분할을 최적화합니다.
      참고: 기능 선택은 데이터 세트 및 이미지 특성에 따라 다를 수 있습니다. 현재 분석의 경우 선택한 피처에는 색상/강도(σ = 1.60), 가장자리(σ = 3.50) 및 텍스처(σ = 1.60)가 포함되었습니다. 이미지 복잡성에 따라 휴리스틱 접근 방식에 기반한 최적화가 필요할 수 있습니다. 또는 ilastik의 기능 제안 > 기능 선택 실행 을 사용하여 최적의 매개변수 세트를 식별할 수 있습니다.
   5. 3에서. 훈련 탭, 뚜렷한 색상의 브러시 스트로크를 적용하여 오가노이드 및 비오가노이드 영역에 레이블을 지정합니다. 분할 충실도를 높이려면 경계 주변의 영역에 주의 깊게 주석을 달아야 합니다.
   6. 라이브 업데이트 를 클릭하여 세그멘테이션 결과를 미리 보고 필요에 따라 구체화합니다.
   7. 4로 이동합니다. 예측 내보내기. [Source Selection]에서 [ Simple Segmentation] 을 선택하여 레이블이 지정된 예측을 내보냅니다. 모두 내보내기를 클릭하고 다운스트림 분석 요구 사항에 따라 출력 형식이 .h5 또는 .tiff로 설정되어 있는지 확인합니다.
2. 정량적 특징 분석
   참고: 이 프로토콜 단계는 MATLAB에서 실행되며 각 절차는 보충 코딩 파일 2에 자세히 설명되어 있습니다.
   1. RI 단층 촬영을 마스크 이미지와 결합하여 오가노이드 영역만 포함하는 마스크된 RI 이미지를 생성합니다.
   2. 마스킹된 RI 이미지를 사용하여 오가노이드 부피, 단백질 밀도 및 단백질 함량과 같은 정량적 매개변수를 계산합니다.
      1. 부피: 세그먼트 마스크의 픽셀 수에 X, Y 및 Z의 픽셀 해상도를 곱하여 오가노이드의 총 부피를 계산합니다. 내장된 MATLAB 함수 Sum을 사용하여 오가노이드 레이블 마스크 배열의 모든 복셀 값을 계산하여 픽셀 수를 계산합니다.
         참고: 픽셀 해상도는 이미징 시스템에 의해 결정되며 HDF5 구조 내의 데이터 > 3D 속성 그룹에서 찾을 수 있습니다.
      2. 단백질 밀도: 평균 오가노이드 RI에서 배지 RI 값을 빼고 이를 단백질 굴절률 증분으로 나누어 단백질 밀도를 계산합니다.
         1. 중간 RI: 분석 전에 굴절계를 사용하여 주변 매질의 RI를 측정합니다.
         2. 평균 RI 값: 오가노이드 마스크 내에 위치한 복셀의 RI 값을 평균화하여 오가노이드의 평균 RI를 결정합니다.
         3. 단백질 굴절률 증가(α): 굴절률 증가 연구에서 파생된 이전에 보고된 경험적 상수를 사용합니다.
      3. 단백질 함량: 3.2.2.1단계에서 결정된 부피에 3.2.2.2단계에서 얻은 단백질 밀도를 곱하여 총 단백질 함량을 계산합니다.

Results

그림 1은 sIO의 4D 이미징 및 정량 분석을 위한 개략적인 워크플로를 보여줍니다. 이 프로토콜은 배양, 4D 이미징, 이미지 처리 및 정량 분석의 4단계 프로세스를 통해 지속적인 라이브 이미징 및 sIO의 포괄적인 평가를 가능하게 합니다(그림 1D).

5일의 배양기 후, 성숙한 sIO를 저간섭 홀로단층촬영(HT)을 사용하여 시각화하기 위해 커버슬립 바닥 이미징 접시로 옮겼습니다(그림 1A). 이 이미징 기술은 디콘볼루션 알고리즘(그림 1B)을 통해 RI 단층 촬영을 재구성하여 살아있는 오가노이드의 고해상도, 무표지 이미징을 가능하게 합니다.

이후 기계 학습 지원 분할 접근 방식을 사용하여 이미지 처리가 수행되어 정확...

Discussion

홀로토그래피는 살아있는 오가노이드의 무표지 고해상도 이미징을 위한 강력한 접근 방식을 제시하여 기존 이미징 기술과 관련된 많은 문제를 극복합니다. 이 프로토콜에서 우리는 저일관성 HT를 sIO 연구에 적용하기 위한 포괄적인 방법론을 설명하여 오가노이드 형태, 성장 역학 및 약물 치료에 대한 반응의 실시간, 정량적 시각화를 가능하게 합니다. 기계 학습 기반 분할과 정량적 분석의 통합은 이 이미징 접근 방식의 분석 능력을 더욱 향상시켜 오가노이드 행동에 대한 편견 없고 재현 가능한 평가를 제공합니다.

HT의 주요 장점은 형광 표지 없이 살아있는 오가노이드를 기본 상태로 시각화할 수 있다는 것입니다. 공초점 및 LSFM과 같은 전통적인 형광 기반 이미징 방법에는 염색 또는 유전자 표지가 필요하며, 이는 광독성을 유발하고 오가노이드 생리학에 영향을 미치며 라이브 이미징 기간을 제한할 수 있습니다. 또한, 항체 기반 라벨링은 조...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
48웰 플레이트	코 닝	3548	배양 요리
세포 회수 솔루션	코 닝	354253	마트리겔 분해
시스플라틴	수펠코	PHR1624	해당 사항 없음
디메틸 설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D2650	차
Eppendorf 튜브	코 닝	MCT-175-CS	해당 사항 없음
HTX 처리 서버	Tomocube Inc., 한국	해당 사항 없음	데이터 처리 서버
HT-X1 시리즈	Tomocube Inc., 한국	해당 사항 없음	운영 소프트웨어
일라스틱	해당 사항 없음	해당 사항 없음	기계 학습 기반 세분화 툴킷
이미징 접시 용기 홀더	Tomocube Inc., 한국	해당 사항 없음	이미징 접시 홀더
IntestiCult 오가노이드 성장 배지 (마우스)	STEMCELL 기술	#06005	시중에서 판매되는 미리 만들어진 배양 배지
매트랩	매스웍스	매트랩 2024a	이미지 처리용 소프트웨어
마트리겔	코 닝	356231	3D 오가노이드용 ECM
밀리포어  스테리톱  진공 병 상단 필터	머 크	S2GPT05RE	0.22 &무; M 중간 살균용 필터 유닛
마우스 장 오가노이드	STEMCELL 기술	#70931	해당 사항 없음
굴절 계	애타고	R-5000	굴절률 계산기
토모디쉬	Tomocube Inc., 한국	901002-02	#1.5 커버슬립 바닥 이미징 접시
토모스튜디오 X	Tomocube Inc., 한국	해당 사항 없음	이미징 소프트웨어
트립레	깁코	12604	단일 세포 해리