방법 논문

성숙한 종자에서 멸종 위기에 처한 약용 난초 Hemipilia cucullata 의 비공생 발아 및 잎 외개 식물 기반 재생

DOI:

10.3791/68541

⸱

2025년 9월 19일

 ,  ,  , 
1Zhejiang Province Key Laboratory of Plant Secondary Metabolism and Regulation, College of Life Sciences and Medicine, Zhejiang Sci-Tech University, 2Laboratory of Systematic & Evolutionary Botany and Biodiversity, College of Life Sciences, Zhejiang University

이 논문에서

요약

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여기에서는 Hemipilia cucullata에서 비공생 종자 발아, 묘목 발달 및 새싹 신장을 최적화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 또한 멸균 잎 외식편에서 원코름 유사체를 유도하여 멸종 위기에 처한 약용 난초의 보존 및 지속 가능한 사용을 위한 효율적인 시험관 내 번식을 촉진합니다.

초록

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Hemipilia cucullata (Orchidaceae)는 약효와 관상용 매력으로 널리 평가되는 육상 난초이지만 서식지 황폐화, 낮은 종자 생존력 및 제한된 수분 성공으로 인해 야생 개체군이 멸종 위기에 처해 있습니다. 보존 및 지속 가능한 이용을 지원하기 위해 이 연구는 성숙한 종자의 비공생 발아, 원구 발달, 새싹 신장 및 불임 잎 외식편에서 원구 유사체(PLB) 유도를 위한 최적화된 프로토콜을 개발했습니다. 0.5mg/L NAA가 보충된 1/2 MS 액체 배지에서 배양된 종자는 72 ± 6%의 발아율을 보였으며, 이는 대조군(46%) 및 고체 배지(31%)보다 유의하게 높았으며, 액체 배양에서 발아가 약 21일 일찍 시작되었습니다. Protocorms는 0.5mg/L BA, 0.2mg/L NAA 및 100mL/L 코코넛 워터를 포함하는 B5 배지에서 계대 배양되어 효율적인 증식을 유도했습니다. 5-6주 후, 묘목을 새싹 신장 배지(0.5mg/L BA 및 1mg/L NAA가 보충된 B5)로 옮겼고, 그곳에서 강력한 새싹 신장과 건강한 잎 형성을 나타냈습니다. PLB 유도의 경우 BA(3mg/L) 및 NAA(0.2mg/L)를 함유한 MS 배지에서 가장 높은 유도율(44.3 ± 5.1%)을 달성했습니다. 이 포괄적이고 재현 가능한 프로토콜은 H. cucullata의 대규모 번식 및 현장 외 보존을 위한 효과적인 플랫폼이 될 수 있으며, 멸종 위기에 처한 난초의 회복 노력에 귀중한 지원을 제공할 수 있습니다.

서론

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Hemipilia cucullata (L.) Y.Tang, H.Peng &; T.Yukawa, 일반적으로 cucullate neottianthe orchid로 알려져 있으며 온대 유라시아가 원산지인 야생 육상 난초로 폴란드에서 일본까지 널리 분포합니다1. 처음에는 Neottianthe 속으로 분류되었지만, 이 종은 최근 분자 증거2에 따라 Hemipilia 속, Neottianthe 섹션으로 재지정되었습니다. 이 식물은 지하 괴경에서 자라며 높이가 최대 30cm에 달하며 한쪽 스파이크로 배열된 분홍빛 또는 보라색-빨간색 꽃을 생산합니다. 꽃의 우아한 모양과 매력적인 색상으로 인해 상당한 장식적 가치를 가지고 있습니다. 또한, 전체 식물은 여러 국가에서 약초로 인정받고 있으며, 심장 질환 치료, 혈액 순환 증진, 타박상 완화, 골절 치유 촉진 등 다양한 치료 목적으로 널리 활용되고 있습니다 3,4. 최근의 식물화학적 연구에서 이 종에서 시아니딘 3-옥살릴글루코사이드, 크리산테민 및 시아닌과 같은 여러 안토시아닌이 확인되었으며, 이는 항산화 및 혈관 보호 특성을 가지고 있으며 의약 효과에 기여할 수 있습니다 5,6.

현재 H. cucullata의 야생 개체군은 서식지 손실과 환경 교란으로 인한 위협에 직면해 있으며, 이로 인해 심각한 개체수 감소가 발생하고 일부 지역에서는 종이 멸종에 가까워졌습니다 3,7,8. 그러나 이 종의 보존은 자연 번식의 어려움으로 인해 특히 어렵습니다. 야생에서 H. cucullata는 클론적, 유성적으로 번식하지만 두 모드 모두 비효율적입니다. 자연 클론 번식은 느리고 드물며, 유성 생식은 낮은 수분 성공률과 낮은 종자 생존력으로 인해 제한됩니다 9,10. 더욱이, 현장 조사는 특히 인위적 또는 발열성 스트레스 조건에서 청소년 개체의 부족과 제한된 자연 모집으로 인해 현저하게 불균형한 연령 구조를 밝혔습니다 7,8,11. H. cucullata의 씨앗은 많은 난초와 마찬가지로 미세하고 배유가 부족하며 발아를 위해 특정 곰팡이 파트너가 필요하므로 자연 재생이 더욱 복잡해집니다. 결과적으로 광범위한 지리적 분포에도 불구하고 야생 개체군의 개체군 규모와 연령 구조는 감소하고 있으며 국지적 멸종 위험이 증가하고 있습니다7. 따라서 인공 급속 번식을 위한 효율적인 방법의 확립은 생식질 자원의 보존과 이 난초 종의 지속 가능한 활용 모두에 필수적입니다.

이용 가능한 번식 기술 중에서, 난초 균근 곰과의 연관성에 의존하는 공생 발아는 자연 과정을 밀접하게 시뮬레이션할 수 있지만, 종 특이적 곰팡이 파트너에 대한 의존성으로 인해 표준화하기 어려운 경우가 많다12,13,14. 대조적으로, 비공생 발아는 난초 조직 배양 시스템에서 널리 사용되는 더 간단하고 재현 가능한 대안을 제공합니다15. Bletilla, Dendrobium 및 Cypripedium 16,17,18,19와 같은 여러 약용 난초에 대해 비공생 발아 및 빠른 번식 프로토콜이 개발되었지만 H. cucullata에 대한 배양 배지 및 조직 배양 조건의 종별 최적화는 여전히 필요합니다.

이 연구에서 우리는 중국 동부의 Tianmu 산(북위 30°20′, E119°22′)에서 야생 개체(그림 1A)의 수동 교차 수분을 통해 얻은 H. cucullata의 성숙한 종자를 사용하여 비공생 종자 발아, 묘목 발달 및 신장 신장을 위한 효과적인 프로토콜을 확립하고 최적화했습니다. 또한 PLB 유도를 통해 잎 외식편에서 재생 시스템을 개발하여 멸종 위기에 처한 이 약용 난초의 보존 및 재배에 기여했습니다.

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프로토콜

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알림: 실험을 시작하기 전에 장갑, 실험실 가운, 보안경을 포함한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 멸균을 위해 층류 후드 아래에서 모든 절차를 수행합니다. 에탄올과 차아염소산나트륨을 주의해서 취급하고 실험실 안전 규정에 따라 폐기물을 처리하십시오.

1. 캡슐 살균 및 종자 추출

  1. 캡슐을 비커에 넣습니다. 세제 1-2방울을 넣고 수돗물로 철저히 헹구어 표면 오염 물질을 제거합니다.
  2. 흐르는 물에 캡슐을 5분 동안 씻습니다. 멸균 흡수지로 표면수를 흡수합니다.
  3. 추가 소독을 위해 캡슐을 멸균 작업대로 옮깁니다.
  4. 캡슐을 75%(v/v) 에탄올에 30초 동안 담급니다.
  5. 캡슐을 20%(v/v) 차아염소산나트륨 용액(~5% 사용 가능한 염소를 함유한 상업용 표백제에서 희석)50mL에 담그고 희석되지 않은 가정용 식기 세척 세제 2방울을 10-12분 동안 첨가하여 멸균합니다.
  6. 캡슐을 멸균 증류수로 5번 헹구어 잔류 소독제를 제거합니다.
  7. 멸균 메스를 사용하여 캡슐의 정점과 기저부(꽃자루 끝)에서 약 1mm를 제거합니다.
  8. 캡슐의 상단 끝을 작은 절개하여 씨앗을 노출시킵니다. 종자 추출을 위해 캡슐을 멸균 페트리 접시에 넣습니다.

2. 배양 배지 준비

  1. 1/2 MS 액체 배지 준비: 표준 MS 배지의 다량 영양소 농도의 절반을 사용하고 MS 배지에서와 같이 다른 모든 성분을 유지한 다음 20g/L 자당 및 α-나프탈렌아세트산(NAA, 0.5mg/L)을 첨가하고 pH를 5.8로 조정합니다.
  2. 끓인 후 즉시 배지를 500mL 배양병에 분배합니다(병 수는 원하는 증식 규모에 따라 조정할 수 있음).
  3. 분배된 배지를 오토클레이브에 넣고 121°C에서 15분 동안 멸균합니다. 멸균 후 오토클레이브에서 배지를 꺼내 실온으로 식힌 후 사용하십시오.

3. 종자 발아

  1. 멸균 겸자를 사용하여 약 500-600개의 종자를 각 배지 병에 고르게 분산시킵니다(2.3단계에서 준비). 씨앗이 물을 흡수하고 액체 매체의 바닥에 가라앉도록 합니다.
  2. 12시간의 빛/암흑 주기와 36μmol·m-2·s-1의 광도로 배양을 25°C로 유지합니다.
  3. 매주 종자 발아를 관찰하고, 형태학적 변화를 기록하고, 문서화를 위해 사진을 찍습니다.
  4. 약 12주 후, 대부분의 종자가 발아하면 발아한 종자의 수를 세고 발아율을 계산합니다. 멸균 접종 루프를 사용하여 종자가 포함된 액체 배지 한 루프를 무작위로 수집합니다. 샘플링된 종자를 페트리 접시 또는 유리 슬라이드로 옮기고 입체 현미경으로 관찰합니다.
  5. 발아한 원구를 형성한 종자의 수를 세십시오. 다음 공식을 사용하여 발아율을 계산합니다.
    발아율(%) = (발아된 종자 수/샘플의 총 종자 수) × 100.

4. Protocorm 아문화 및 증식

  1. B5 배지(3.21g/L)에 코코넛 워터(100mL/L), 6-벤질아미노퓨린(BA, 0.5mg/L) 및 NAA(0.2mg/L)를 보충하여 증식 배지를 준비합니다. 자당 20g/L과 한천 7.3g/L을 넣고 pH를 5.8로 조절한다.
  2. 끓인 후 즉시 배지를 150mL 배양병에 분배합니다(병 수는 원하는 증식 규모에 따라 조정할 수 있음).
  3. 분배된 배지를 오토클레이브에 넣고 121°C에서 15분 동안 멸균합니다. 사용하기 전에 배지를 실온으로 식히십시오.
  4. 병당 10-15개의 발아된 프로토코름(0.3-1cm 크기)을 단계 4.3에서 준비된 배양 배지에 무균 옮깁니다.
  5. 5주간의 재배 기간 후, 증식 상태를 평가하고 병당 새로 형성된 원구의 수를 기록합니다.
  6. 새싹 신장을 위해 이식하기 전에 눈에 보이는 새싹 정점과 뿌리 모양의 구조를 가진 묘목으로 발달할 수 있도록 증식된 원구를 추가로 4-6주 동안 계속 배양합니다.
    참고: 배양을 25°C에서 유지하고, 12시간의 빛/암흑 주기와 36μmol·m-2·s-1의 광도를 유지합니다.

5. 촬영 신장

  1. B5 배지(3.21g/L)에 BA(0.5mg/L) 및 NAA(1mg/L)를 보충하여 새싹 신장을 위한 배지를 준비합니다. 자당 20g/L과 한천 7.3g/L을 넣고 pH를 5.8로 조절한다.
  2. 끓인 후 배지를 150mL 배양병에 분배합니다(병 수는 원하는 증식 규모에 따라 조정할 수 있음).
  3. 새싹 신장을 위해 건강한 묘종(크기 1-2cm, 명백한 검게 변하거나 완전히 황변하지 않음)을 선택하십시오. 멸균 및 냉각된 집게를 사용하여 8-12개의 묘목을 5.1단계에서 준비된 신선한 배지가 들어 있는 각 150mL 배양 병에 무균 상태로 옮깁니다. 묘목이 각 병 안에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
  4. 5주간의 새싹 신장 기간 후, 잎 외식편 샘플링을 위해 완전히 발달된 새싹과 건강한 잎이 있는 묘목을 선택합니다.
    참고: 배양을 25°C에서 유지하고, 12시간의 빛/암흑 주기와 36μmol·m-2·s-1의 광도를 유지합니다.

6. 잎 외식편에서 PLB 유도

  1. MS 기초 배지(4.43g/L)에 BA(3mg/L) 및 NAA(0.2mg/L)를 보충하여 PLB 유도 배지를 준비합니다. 자당 20g/L과 한천 7.3g/L을 넣고 pH를 5.8로 조절한다.
  2. 끓인 후 배지를 150mL 배양병에 분배합니다(병 수는 원하는 증식 규모에 따라 조정할 수 있음).
  3. 새싹 신장 5주 후에 건강한 묘를 선택합니다(5.4단계). 완전히 팽창한 멸균 잎을 절제하고 정점 영역과 가장자리를 제거한 다음 무균 상태에서 멸균 메스를 사용하여 각 잎을 약 0.5cm × 0.5cm 세그먼트로 자릅니다.
  4. 10개의 잎 세그먼트를 PLB 유도 매체 위에 놓고 축 표면이 위를 향하도록 하여 매체 표면과 단단히 접촉하도록 합니다.
  5. 배양 5주 후, 성공적으로 유도된 PLB의 수를 평가하고 유도율(%)을 계산합니다. 또한 평균 새싹 높이(cm)와 외식편당 형성된 새싹 수를 기록합니다.
    참고: 배양을 25°C에서 유지하고, 12시간의 빛/암흑 주기와 36μmol·m-2·s-1의 광도를 유지합니다.

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결과

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이 연구에서 제시된 프로토콜 단계는 H. cucullata의 무공생 종자 발아, 원구 증식, 새싹 신장 및 PLB 유도를 개선하기 위한 일련의 비교 실험을 통해 개발된 최적화된 방법론을 나타냅니다. 예를 들어, 종자 발아를 촉진하기 위한 PGR 선택에서 NAA는 배아 발달과 수분 흡수를 향상시키는 반면 BA는 새싹 분화와 세포 분열을 촉진합니다. 이들의 시너지 효과는 난초 종자 배양에서 발아율과 조기 묘목 성장을 향상시키는 것으로 나타났습니다17. 프로토콜의 각 단계는 반복된 실험, 통계 분석 및 형태학적 관찰에서 파생된 성능 지표를 기반으로 개선되었습니다.

종자 발아 조건의 최적화
H. cucullata의 종자 발아 조건을 최적화하기 위해 두 가지 배양 배지 유형(액체 대 고체 1/2 MS)과 4가지 식물 성장 조절제(PGR) 처리(대조군(PGR 없음), NAA(0.5...

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토론

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난초 캡슐에는 일반적으로 종종 1만 개가 넘는 수많은 씨앗이 포함되어 있지만 배유가 없고 공생 곰팡이 결합 및 특정 환경 단서에 대한 의존도가 높기 때문에 자연 발아가 극히 제한적입니다20. 따라서 이러한 한계를 우회하고 통제된 조건에서 효율적인 묘목 번식을 가능하게 하기 위해 비공생 발아 프로토콜이 널리 채택되었습니다. 예를 들어, Chen etal 15는 초기 14일간의 암흑 전처리와 함께 MS 배지를 사용하여 Bletilla에서 93%의 발아율을 보고했습니다. 또한, 다양한 육상 난초 종의 비공생 발아를 위해 범용 배지(5% 코코넛 워터가 보충된 1/2 MS)가 제안되었습니다21,22. 그러나 발아 성공률은 종에 따라 다르며 배지 구성, 특히 PGR의 유형과 ...

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공개 사항

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
비타민이 함유된 1/2MS 염기 소금쿨라버PM1061
6-벤질아미노퓨린상하이 Macklin 생화학 기술 Co., Ltd.1214-39-7
한천 파워베이징 켐베이스 기술 유한 회사1400
클린 벤치쑤저우 정화 장비 Co., Ltd.SW-CJ-2G
코코넛 워터좋은 농부https://e.tb.cn/h.6F8GTrHG7pif7Tj?tk=jFTyVPU3OBs
세정제리비 과학 기술6920174756784
감보르 B5 미디엄식물 기술 연구소G398
유리병모어베터 바이오 테크놀로지 (주)MBT-BL-240
무라시게 & Skoog 기저염식물 기술 연구소M519
피펫에펜도르프3123000268
정밀 저울메틀러 토레도30834109
스프스국제 비즈니스 기계 공사통계적 유의성 테스트에 사용되는 소프트웨어
자당Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd.20210802
티디아주론상하이 Macklin 생화학 기술 Co., Ltd.51707-55-2
&알파;-나프탈렌아세트산상하이 Macklin 생화학 기술 Co., Ltd.86-87-3

참고문헌

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