방법 논문

바이러스학의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영: 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 3D 이미징

DOI:

10.3791/68568

⸱

2025년 8월 6일

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1Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, 2Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 3Institute of Molecular Virology, Ulm University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 비디오 프로토콜은 바이러스 표본의 주사 투과 전자 현미경 단층 촬영을 수행하는 방법을 보여줍니다. 최적의 결과를 위해 샘플은 고압 냉동 및 후속 동결 대체를 통해 준비됩니다.

초록

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전자 현미경(EM), 특히 3차원(3D) EM 기술은 구조 바이러스학에서 확립된 방법이 되었습니다. 지카 바이러스(ZIKV) 유도 복제 공장 또는 코로나바이러스 복제 소기관과 같은 바이러스 유발 세포 미세 구조의 변화를 조사하려면 3D 이미징이 필요합니다. 투과 전자 현미경(TEM) 단층 촬영은 최대 200nm 두께의 샘플에 대한 제한에도 불구하고 널리 사용되는 방법입니다. 집속 이온 빔 주사 전자 현미경(SEM)-단층 촬영은 일반적으로 해상도가 낮지만 등방성으로 더 큰 부피의 3D 데이터를 생성할 수 있습니다. 블록 안면 주사 전자 현미경(BF-SEM), SEM 어레이 단층 촬영 또는 연속 절편의 TEM 이미징과 같은 대체 기술은 더 큰 부피의 이미징에 사용됩니다. 그러나 앞서 언급한 기술과 비교할 때 이러한 기술은 샘플의 Z축을 따라 훨씬 낮은 해상도를 희생합니다. 수 나노미터의 등방성 분해능으로 최대 1μm 두께의 샘플에 대한 3D 정보를 제공하는 기술은 주사 투과 전자 현미경(STEM) 단층 촬영입니다.

여기에서는 고압 냉동, 동결 치환 및 수지 포매 바이러스 표본의 준비와 STEM 단층 촬영을 사용한 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 생물학적 초미세 구조를 거의 천연 상태로 보존하면서 실온 이미징의 이점을 활용합니다. STEM 단층촬영을 사용하여 답변할 수 있는 질문에 대한 두 가지 대표적인 예를 보여줍니다. 먼저, 재조합 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 비리온 형태 형성을 연구하기 위한 프로토콜을 적용합니다. STEM 단층촬영은 2D 이미징으로 접근할 수 없는 재조합 VSV 발아에 대한 정보를 제공합니다. 둘째, EF-C 펩타이드 나노피브릴의 FRET(Foerster resonance energy transfer) 이미징과 STEM 단층촬영(FRET-3D-CLEM)을 사용하여 상관 광학 및 전자 현미경(CLEM)을 보여줍니다. 최근에 발표된 이 조합은 감염 강화 펩타이드 나노피브릴의 흡수 및 분해에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 특히 STEM 단층 촬영으로 접근할 수 있는 대량의 이점을 제공합니다.

서론

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그림 1: 해상도, 계측, 획득 시간 및 노력을 고려한 다양한 3D 현미경 기법 비교. 이 기술의 최대 실현 가능한 부피는 분자 분해능을 제공하는 기술적으로 까다로운 극저온 TEM 단층 촬영과 분해능이 빛의 회절 한계에 의해 제한되는 광학 현미경 사이에 있습니다. 약어: TEM = 투과 전자 현미경; STEM = 스캐닝 TEM; SEM = 주사 전자 현미경; FIB = 집속 이온 빔. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

바이러스 관련 구조 및 시스템은 옹스트롬 이하 체제(예: 바이러스 요법용 소분자, 분리된 바이러스 단백질)에서 수 미터(예: 감염된 유기체 전체)에 이르기까지 규모에 걸쳐 있습니다. 바이러스 입자는 20-1,000nm 범위에 있으며 주로 μm 범위에 있는 숙주 세포 및 바이러스 생산자 세포주와 같은 생물학적 맥락에서 조사됩니다. 따라서 특정 바이러스 관련 구조의 시각화는 충분한 시야와 적절한 해상도를 제공하는 기술을 선택하는 데 달려 있습니다. 바이러스에 감염된 세포와 조직 조각에 대한 연구는 현미경 기술에 의존합니다(그림 1). 세포와 조직의 개요 이미지는 고전적인 광학 현미경을 사용하여 획득할 수 있지만 바이러스 복제에 관여하는 세포내 구조는 종종 전자 현미경(EM)을 사용하여 연구됩니다. 오늘날 EM은 주로 기초 바이러스학 연구에 사용되지만 진단에도 사용되며 1,2 바이오 제약 응용 분야에도 사용되고 있습니다3.

종종 기존 투과 전자 현미경(TEM)과 같은 2D EM 접근 방식은 주어진 생물학적 질문에 충분히 답할 수 없습니다. 바이러스학에서 이것은 특히 비리온 부착 및 진입, 바이러스 공장의 형성 또는 비리온 형태 형성과 같은 바이러스-숙주-세포 상호 작용을 연구할 때 발생합니다 4,5,6,7,8,9. 따라서 EM 단층 촬영은 생물학적 샘플의 3D 미세 구조를 분석하는 데 사용됩니다. 원칙적으로 특정 샘플의 단층 촬영을 획득하는 방법에는 1) 나중에 3D 이미지 스택으로 결합되는 직렬 슬라이스의 단계적 이미징 또는 2) 샘플의 다양한 시야각에서 투영을 획득한 다음 정보를 가상 이미지 스택으로 계산적으로 재구성하는 두 가지 방법이 있습니다.

첫 번째 유형의 기술에는 TEM 또는 SEM(SEM 어레이 단층 촬영), 직렬 블록 페이스 SEM 및 집속 이온 빔(FIB)-SEM 단층 촬영에 의한 연속 절편 이미징이 포함됩니다. 직렬 섹션의 SEM 및 TEM 이미징은 단면 두께에 의해 제한되는 z의 해상도가 부족하지만 넓은 시야를 제공하고 대부분의 EM 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 장비에 의존합니다4. FIB-SEM 단층 촬영은 등방성 분해능을 얻을 수 있지만 장치 및 유지 보수 비용이 까다로울 수 있으며 등방성 분해능에서 전체 세포를 이미징하는 데 시간이 많이 걸립니다 9,10.

두 번째 유형의 단층 촬영은 샘플을 통한 전자빔의 전송에만 의존합니다. 이것은 TEM 또는 주사 투과 전자 현미경 (STEM) 의 두 가지 이미징 양식을 사용하여 수행 할 수 있습니다. TEM 단층 촬영은 더 널리 보급되고 구현하기 쉽지만 단면 두께는 ~200nm로 제한됩니다. 따라서 미토콘드리아, 소포 또는 비리온과 같이 절편 두께보다 큰 구조는 단일 단층 촬영 내에서 이미지화할 수 없습니다. STEM 단층 촬영은 최대 1μm 두께의 샘플을 이미지화할 수 있는 가능성을 제공합니다11,12. 그러나 가속 전압이 높은 STEM(≥200kV)과 높은 기울기 각도와 작은 반수렴 각도를 지원하는 설정이 필요합니다13. STEM 이미징은 재료 과학에서 일반적인 기술이지만 생물학적 EM 실험실에서는 여전히 드문 기술로 남아 있습니다.

여기에서는 바이러스 표본에 STEM 단층 촬영을 사용하는 응용 프로그램 기반 접근 방식을 제시합니다. EM 단층 촬영의 복잡성이 높고 노동 집약적인 특성으로 인해 고품질 샘플 준비가 매우 중요합니다. 극저온 TEM(단층 촬영)은 의심할 여지 없이 분자 수준 조사의 황금 표준이지만, 고압 동결 동결 치환 세포의 실온 이미징은 세포 미세 구조의 견고한 보존 및 명확성을 제공합니다 7,14. 간단히 말해서, 부착 세포는 사파이어 디스크에서 성장하고 감염되거나 원하는 대로 처리됩니다. 그런 다음 세포는 매우 높은 냉각 속도로 고압에서 동결하여 고정되어 내부의 물을 유리화합니다. 그 후, 물을 용매로 대체하고 샘플을 대조하고 천천히 실온으로 되돌립니다. 그런 다음 샘플을 수지에 점차적으로 묻습니다.

고압 냉동 및 동결 대체를 위한 많은 프로토콜이 있으며 이는 기계, 캐리어 시스템 및 시편의 구성이 다릅니다. Walther et al.15의 프로토콜과 마이크로파 보조 조영 증강을 사용하여 FIB-SEM을 위한 조직 준비에 초점을 맞춘 Steyer et al.16의 비디오 프로토콜을 포함하여 고압 냉동에 대한 자세한 프로토콜이 발표되었습니다. 바이러스학 연구를 위해 Read et al.17 및 Romero-Brey18은 사파이어 디스크로 고압 냉동 및 전자 단층 촬영을 사용한 후속 분석을 통해 바이러스 감염 세포를 준비하기 위한 자세한 프로토콜을 발표했습니다. 초박형 절편도 이전에 기술되었습니다15,17. 이러한 접근 방식에 대한 자세한 내용은 인용된 문헌을 참조하십시오.

여기에서, 우리는 이전에 발표된 프로토콜15,17의 적응 및 업데이트 된 버전인 워크플로우를 상세한 비디오 가이드와 처음으로 쌍을 이룬다. 이 프로토콜은 고압 동결, 동결 치환 및 에폭시 수지에 포매를 사용하여 시료 전처리를 위한 워크플로를 제공합니다. 800nm-1,000nm 두께의 절편은 울트라마이크로톰을 사용하여 절단됩니다. 틸트 시리즈는 소프트웨어 EM 도구를 사용하여 200kV STEM으로 획득됩니다. 이 프로토콜은 부착 세포에 최적화되어 있으며, 조직 또는 현탁 세포와 같은 다른 표본 유형에 대한 수정을 허용하면서 포괄적인 워크플로우를 제공합니다. 극저온 조건에서의 STEM 단층 촬영은 Michael Elbaum 그룹19,20의 작업을 참조하십시오.

프로토콜

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1. 세포 배양

  1. 사파이어 디스크 준비
    1. 사파이어 디스크를 100% 에탄올로 3분 동안 20회 세척하여 청소합니다. 마른 여과지 위로 디스크를 당겨 남은 에탄올을 제거합니다. 디스크를 37°C 건조실에 최소 30분 동안 또는 완전히 건조될 때까지 그대로 둡니다.
      참고: 이 프로토콜에서는 직경 3mm, 두께 0.16mm의 사파이어 디스크가 사용됩니다. 다른 시스템, 조직 또는 현유 세포에 최적화된 워크플로우의 경우 Walther et al.15을 참조하십시오. 배양 세포 및 기타 시스템에 대한 몇 가지 "팁과 요령"은 McDonald et al.21에 의해 제공됩니다.
    2. 깨끗한 시계 유리 위에 약 50개의 사파이어 디스크를 평평하게 놓고 탄소 코팅 장치를 사용하여 10-15nm 두께의 탄소 층으로 코팅하여 사파이어 디스크를 카본 코팅합니다. 탄소층을 안정화하기 위해 디스크를 120°C에서 밤새 굽습니다.
      참고: 상관 EM 접근법의 경우 좌표계를 도입합니다: 탄소 코팅 전에 사파이어 디스크 위에 파인더 그리드를 배치하여 그리드가 디스크21에서 음극으로 보이도록 합니다.
    3. 나중에 사파이어 디스크의 탄소 코팅면을 식별하려면 날카로운 도구(예: 핀셋 끝)를 사용하여 한쪽에서만 올바르게 읽을 수 있는 탄소의 자국을 긁습니다.
      알림: 숫자 "2" 또는 이와 유사한 것을 권장합니다(그림 2A,B). 코팅된 좌표계가 있는 사파이어 디스크의 경우 이 단계를 건너뜁니다.
    4. 사파이어 디스크는 추가 사용 전까지 37°C 건조실에 보관하십시오.
      알림: 사파이어 디스크를 재사용하면 고압 동결 중에 파손될 가능성이 높아지므로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
  2. 세포 배양
    1. 세포 배양에 배치하기 직전에 글로우 방전 장치로 디스크의 탄소 코팅 면을 글로우 방전하여 친수성(예: 40초 동안 20mA의 전류로 0.26mbar)을 만듭니다. 그런 다음 디스크를 15분 동안 자외선에 노출시켜 멸균합니다.
      알림: 자외선에 30분 이상 노출되면 탄소 코팅이 손상될 수 있습니다.
    2. 멸균 핀셋을 사용하여 배지가 들어 있는 배양 접시의 바닥에 디스크를 놓고 디스크가 뜨지 않도록 합니다. 위에 세포를 조심스럽게 시드하십시오. 사파이어 디스크가 세포 배양 배지에 떠 있는 경우 실험을 반복할 때 더 오랜 시간 동안 글로우 방전을 하십시오.
      알림: "2"의 방향이 올바른 것, 즉 탄소 코팅된 면이 위를 향하도록 하는 것이 중요합니다. 최종 합류가 ~80%인 디스크의 세포 단층이 바람직합니다. 사파이어 디스크의 세포 성장은 주변 배양 접시의 세포 성장과 다를 수 있습니다. 프로토콜을 계속하기 전에 도립 현미경으로 디스크에 있는 세포의 분포와 품질을 확인하십시오. 세포를 파종하는 동안 플레이트를 부드럽게 흔들면 세포의 분포를 개선할 수 있습니다.
      현탁 세포의 경우,15에 설명된 대로 탄소 코팅된 사파이어 디스크를 폴리-L-라이신으로 덮거나 모세관을 사용합니다. 폴리-L-라이신으로 덮인 디스크를 자외선에 노출시키면 폴리-L-라이신 코팅이 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오.
    3. 사파이어 디스크를 제자리에 유지하면서 원하는 세포 처리(예: 감염, 약물 치료)를 수행합니다. 셀이 분리되거나 카본 코팅이 긁히지 않도록 디스크를 조심스럽게 다루십시오. 그에 따라 세포를 배양합니다. 예를 들어 2.5% 글루타르알데히드, 0.1M 인산염 완충액(pH 7.3)에 1% 사카로스 또는 4% 파라포름알데히드를 사용하여 시료를 고압 냉동고로 운반하기 전에 현지 규정에 따라 화학적 사전 고정을 수행합니다 1,7,22.
      알림: 감염된 샘플이 생물안전 수준 실험실을 떠나기 전에 모델 시스템에 적용되는 모든 현지 생물안전 규정을 준수하십시오.

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그림 2: 고압 동결. (A) "2"(왼쪽) 또는 상관 광학 및 전자 현미경을 위한 좌표계(오른쪽)가 있는 탄소 코팅을 보여주는 사파이어 디스크. (B) 고압 냉동을 위해 준비되는 SD-금 스페이서-SD 샌드위치의 개략도. 디스크에서 자란 세포는 서로 마주보고 있어 단단한 구멍에서 보호됩니다. (C) SD 샌드위치가 들어 있는 고압 냉동용 홀더. (D) HPF 홀더를 적재하기 위한 재료 및 장치: (1) 가열판, (2) 실체 현미경, (3) 여과지, (4) 1-헥사데센이 포함된 반응 튜브, (5) 핀셋, (6) 코팅되지 않은 SD, (7) 금 스페이서가 있는 페트리 접시, (8) HPF 홀더. (E) HPF 시스템 설정: (1) 냉동 샘플 이송을 위한 LN-box( F 참조), (2) 냉동 후 HPF 홀더의 예열 속도를 높이는 헤어드라이어, (3) LN 상자를 리필하기 위한 질소 듀어. (F) HPF 홀더를 열 수 있는 중앙 트로프(점선 윤곽선)가 있는 고압 냉동 후 냉동 시료를 보관하기 위한 LN-box로 SD를 안전하게 취급할 수 있습니다. 고압 냉동 직후 필요한 재료: (1) 최대 6개의 샘플 용기를 위한 홀더, (2) 절연 핀셋, (3) 뚜껑이 있는 샘플 용기. 용기에는 액체 질소에 잠길 수 있도록 작은 구멍과 작은 무게(예: 나사)가 포함되어 있습니다. 약어: SD = 사파이어 디스크; HPF = 고압 냉동고; LN = 액체 질소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 전자현미경을 위한 시료 준비

  1. 고압 냉동
    참고: 이 프로토콜은 참조된 고압 냉동고(HPF, 재료 표). 설명된 단계는 동일한 용도로 사용되므로 다른 기계에 대해서는 크게 다르지 않아야 합니다.
    1. 제조업체의 지침에 따라 고압 냉동고를 설정하십시오. 적절한 액체 질소 공급을 보장하고(그림 2E) 기계를 켜고 테스트 실행을 수행합니다.
    2. HPF 홀더에 디스크를 로드하도록 작업 공간을 설정합니다(그림 2D). 다음 품목을 준비하십시오: 가열판(1), 실체 현미경(2), 여과지 조각(3), 필러로 헥사데센이 있는 반응 튜브(4), 핀셋(5), 셀이 있는 홀수 수의 SD를 동결하기 위한 빈/코팅되지 않은 사파이어 디스크(6), 금 스페이서(7) 및 HPF 홀더(8, 그림 2C의 세부 사항).
    3. 냉동 샘플을 처리하기 위한 작업 공간을 준비합니다(그림 2E,F). 고압 냉동을 시작하기 전에 다음 장비를 준비하십시오.
      1. LN 상자를 준비하고 액체 질소로 채워 주어 냉동 사파이어 디스크를 HPF 홀더에서 저장 캡슐로 취급하고 옮길 준비를 합니다(그림 2E,F).
      2. 작은 듀어(그림 2E의 3개)를 준비하고 액체 질소로 채우십시오: 냉동 과정에서 LN 상자에 액체 질소를 여러 번 다시 채울 준비를 하십시오.
      3. 절연 핀셋(그림 2F의 2개)을 준비하십시오.
      4. 고압 냉동 후 사파이어 디스크를 담을 샘플 용기(저장 캡슐, 그림 2F의 3개)를 준비합니다. 액체 질소를 부을 수 있는 뚜껑과 여러 개의 구멍이 있고 뜨지 않도록 작은 추(예: 작은 나사 등)가 있는지 확인하십시오. 사용하기 전에 용기에 라벨을 붙이고 LN 상자에서 예식시키십시오.
        참고: 우리는 BEEM 캡슐을 저장 캡슐로 사용합니다.
    4. 세포에 접두사가 붙어 있지 않은 경우 또는 가능하지 않은 경우 가열된 플레이트(그림 2D의 1)에 샘플을 인큐베이터에 보관하여 생리학적 조건(37°C, 5% CO2)을 가능한 한 오래 유지합니다.
    5. 고압 냉동을 시작하기 전에 사파이어 디스크에 충분한 수의 셀이 있고 양호한 셀 품질을 확인하십시오. 그렇게 하려면 도광현미경을 사용하여 디스크를 검사하십시오.
    6. 고압 냉동을 수행합니다.
      1. 핀셋으로 배양 접시에서 사파이어 디스크 하나를 꺼내 탄소 코팅된 면이 위를 향하도록 HPF 홀더(그림 2C)에 넣습니다("2"는 읽을 수 있음). 그 전에 디스크를 여과지에 빠르게 담그고 여분의 배지를 제거하되 셀이 마르지 않도록 주의하십시오.
      2. 금 스페이서를 헥사데센에 담그고 조심스럽게 사파이어 디스크 위에 올려 놓습니다. 두 번째 사파이어 디스크를 가져와 탄소 코팅면이 아래를 향하도록 금 스페이서 위에 놓아 셀이 서로를 향하도록 사파이어 디스크 - 금 스페이서 - 사파이어 디스크 샌드위치를 형성합니다. 샌드위치 캐비티에 공기가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오.
      3. HPF 홀더를 닫습니다. 특히 접두사가 붙지 않은 살아있는 세포의 경우 샘플에 가해지는 스트레스를 최소화하기 위해 이 단계를 신중하지만 신속하게 수행하십시오.
        알림: 화학 고정제와 같은 암성 물질, 돌연변이 유발성 또는 재생독성(CMR) 물질이 포함된 검체의 경우 노출을 최소화하기 위해 HPF 홀더를 연기 후드 아래에 로드하십시오.
      4. 동결 프로세스를 시작합니다. HPF 홀더를 고압 냉동고에 빠르게 삽입하고 제조업체의 지침에 따라 잠근 후 냉동 과정을 시작합니다.
    7. HPF 홀더에서 유리화된 샘플을 제거합니다. 현재 얼어붙은 사파이어 디스크를 운반하는 HPF 홀더의 끝을 예식된 LN 상자로 빠르게 옮깁니다. HPF 홀더에서 LN 상자의 중앙 홈통으로 디스크를 조심스럽게 제거합니다( 그림 2F의 점선). 그런 다음 다음 샌드위치 조립을 시작하기 전에 HPF 홀더를 예열하고 잔여 에탄올 또는 헥사데센을 제거합니다.
      알림: 이제부터 디스크에 닿는 모든 것이 액체 질소로 예식되었는지 확인하십시오. 질소 분위기에서 이송 단계를 신속하게 수행하고 시편이 해동되지 않도록 디스크를 액체 질소에 보관하십시오. 원활하고 빠른 전환을 보장하기 위해 HPF에서 LN 상자로 홀더를 옮기는 방법을 미리 연습하십시오. 홀더의 온난화 과정은 헤어드라이어를 사용하여 냉동 후 속도를 높일 수 있습니다(그림 2E의 2).
    8. 홀더에서 사파이어 디스크를 제거한 후 동결 대체 장치로 옮기거나 추가 처리까지 액체 질소 저장을 위해 라벨이 붙은 용기에 넣습니다. HPF 후 사파이어 디스크가 서로 촘촘하게 쌓여 있는 경우 동결 대체 전에 메스를 사용하여 사파이어 디스크를 분리합니다.
      알림: 디스크가 부러지지 않도록 주의하고 전단력을 피하십시오. 이 단계를 위한 충분한 시간을 계획하십시오.
  2. 동결 대체
    1. 제조업체의 지침에 따라 동결 대체 장치를 설정하십시오. 액체 질소 듀어를 채우고 시료 챔버를 -90°C로 예냉하는 프로그램을 시작합니다. 전체 대체 공정에 충분한 액체 질소가 있는지 확인하십시오.
      알림: 관련된 화학 물질은 위험합니다. 흄 후드 아래에서 모든 단계를 수행하고 현지 환경, 보건 및 안전(EHS) 지침을 준수합니다.
    2. 0.1%(w/v) 우라닐 아세테이트, 0.2%(w/v) 사산화오스뮴(OsO4) 및 5%(v/v)의 물을 아세톤에 함유한 동결 치환 용액을 준비합니다. 6mL의 부피(여기에 사용된 치환 장치의 최대 용량과 동일한 24개의 cryovials를 채우기에 충분함)를 준비하려면 다음 단계를 따르십시오.
      1. 뚜껑이 단단히 닫힌 유리 용기에 6mg의 우라닐 아세테이트의 무게를 잰다.
      2. 물에 4%(w/v) 사산화오스뮴 300μL를 첨가합니다.
      3. 용기를 닫고 5 분 동안 초음파 처리하여 우라닐 아세테이트를 용해시킵니다.
      4. 5.7mL의 아세톤을 첨가하고 혼합한 후 동결 치환 장치와 호환되는 냉동 바이알에서 용액을 고르게 나눕니다.
    3. 동결 치환 용액이 들어 있는 밀폐된 냉동 바이알을 -90°C에서 예냉된 동결 치환 장치에 넣고 용액도 -90°C로 냉각될 때까지 기다립니다(약 20분 동안).
    4. LN 상자에 액체 질소를 채웁니다. 사파이어 디스크를 동결 치환 장치로 옮기려면 핀셋, 메스, 펜치(또는 큰 핀셋)를 액체 질소에 예식시킵니다.
    5. 예냉된 큰 핀셋을 사용하여 고압 냉동 샘플이 담긴 저장 캡슐을 저장 탱크에서 LN 상자로 옮깁니다.
      알림: 샘플의 해동을 방지하기 위해 신속하게 작업하십시오. 고압 냉동 후 직접 샘플을 처리하는 경우 이 단계를 건너뛸 수 있습니다.
    6. 고압 냉동 샘플을 동결 대체 장치로 옮깁니다. 사파이어 디스크를 액체 질소에 보관하면서 하나씩 분리합니다. 각 디스크를 동결 대체 용액이 포함된 냉동 용액으로 개별적으로 빠르게 옮겨 디스크가 완전히 잠기도록 합니다. 냉동 보관소를 닫고 즉시 동결 대체 장치에 다시 넣습니다.
      알림: 이송하는 동안 치환 용액이 예열되는 것을 방지하기 위해 극저온 질소를 액체 질소 분위기에 보관하되 얼지 않도록 액체 질소에 보관하지 마십시오. 대체 용액이 따뜻해지지 않도록 손가락으로 뚜껑에 가까이 다가가 바이알을 잡습니다. 대체 용액에는 독성 물질이 포함되어 있으므로 주의해서 다루십시오.
    7. 모든 디스크가 대체 장치로 전송되면 고정 대체 프로세스를 시작합니다. 16시간 동안 온도를 -90°C에서 0°C로 점진적으로 올리고, 0°C에서 1시간 배양 단계를 거친 후 1시간에 걸쳐 20°C까지 점진적으로 상승하도록 장치를 설정합니다.
    8. 샘플이 20°C에 도달하자마자 100% 아세톤으로 3 x 30분 동안 샘플을 직접 세척합니다.
      알림: 디스크의 셀이 건조되지 않도록 하십시오. 흄 후드 아래에서 모든 후속 단계를 수행합니다. 모든 폐기물을 적절한 용기에 모아 현지 EHS 규정에 따라 폐기하십시오.
  3. 포함
    1. 제조업체의 지침에 따라 에폭시 수지를 새로 준비하십시오.
      알림: 흄 후드 아래에서 에폭시 수지를 사용하여 모든 단계를 수행합니다. 점도가 낮아 시료 침투가 더 좋기 때문에 각 매립 절차에 대해 새로운 수지를 준비하는 것이 좋습니다.
    2. 샘플을 미리 포매하려면 1/3 에폭시 수지와 2/3 아세톤이 포함된 용액에서 샘플을 1시간 동안 배양합니다. 용액을 2/3 에폭시 수지 및 1/3 아세톤으로 교체하고 3시간 동안 배양합니다. 용액을 100% 에폭시 수지로 교환하고 바이알 뚜껑을 연 상태에서 밤새 배양하여 남은 아세톤이 증발할 수 있도록 합니다.
    3. 다음날, 사파이어 디스크를 새로 준비된 에폭시 수지로 채워진 새로운 라벨 반응 튜브로 옮깁니다. 반응 튜브의 벽에 의해 지지되는 디스크를 수평으로 배치하고 세포가 있는 면이 반응 튜브에서 위를 향하도록 합니다("2"는 실체 현미경으로 읽을 수 있음). 뚜껑을 연 상태에서 반응 튜브를 60°C의 오븐에 넣고 에폭시 수지를 최소 48시간 동안 중합시킵니다.
      참고: 사파이어 디스크 조각을 매립해야 하는 경우 이전 실험의 레진 블록의 중합 팁을 사용하여 매립합니다. 팁을 반응 튜브에 넣고 튜브에 새 레진을 채운 다음 깨진 디스크를 중합 팁 위에 올려 놓습니다.
      에폭시 수지로 오염된 일회용 소모품은 폐기 전에 수지가 완전히 중합되도록 60°C의 오븐에 넣어야 합니다. 핀셋 및 기타 품목은 미리 에탄올로 닦을 수 있습니다.
    4. 닫힌 반응 튜브의 끝을 액체 질소에 약 10초 동안 담급니다. 그런 다음 테이블 위의 반응 튜브를 쳐서 반응 튜브에서 레진 블록을 제거합니다. 사파이어 디스크는 내장된 셀 위에 남아 있는 탄소 코팅에서 쉽게 분리됩니다.
      알림: 포매 배지가 액체 질소 처리로 인한 온도 변화를 견딜 수 있는지 확인하십시오.
  4. STEM 단층 촬영 절편 준비
    1. TEM 이미징을 위해 초박형 절편보다 훨씬 두꺼운 절편을 준비합니다(일반적으로 800nm에서 1μm 사이).
      참고: STEM 단층촬영을 위한 절편 준비는 기존의 초미세절개술과 약간 다릅니다. STEM 단층 촬영 섹션의 준비를 설명하는 자세한 프로토콜은 Walther et al.15 및 Villinger et al.10을 참조하십시오.
      STEM 단층 촬영 절편 준비를 계속하기 전에 세포의 품질이 양호한지 확인하십시오. 이를 위해 초박형 절편(~70nm) 및 TEM 분석을 수행합니다(그림 3D,E).
    2. 평행 막대 구리 그리드에 섹션을 수집하여 샘플을 높은 각도로 기울일 때 그리드 막대가 전자빔을 차단하지 않도록 합니다. 더 나은 단면 부착을 위해 그리드를 0.01% 폴리-L-라이신으로 처리하십시오: 0.1% 원액에서 0.01% 폴리-L-라이신의 작은 분취량을 준비하고 그리드를 분취량에 담그고 그리드의 가장자리를 여과지 위로 드래그하여 조심스럽게 건조시킵니다. 그리드를 글로우 방전하고 이를 사용하여 섹션을 수집합니다.
    3. 틸트 시리즈 정렬을 위한 기준 마커로 콜로이드 금으로 섹션을 처리합니다(섹션 3 참조).
    4. 섹션에 카본 코팅을 적용하여 안정화하고 전도성을 높입니다.

figure-protocol-2
그림 3: 포매, 트리밍 및 초박형 절편 후 세포의 TEM 다른 모양에 의한 품질 관리. (A) SD를 제거한 후 에폭시 수지 포매 셀. 긁힌 '2'가 있는 탄소층은 수지 내장 셀에 남아 있으며 명확하게 보입니다. 거의 투명한 셀은 블록 면에 고르게 분포되어 있습니다. (B) 미세절개술 전에 트리밍된 블록 표면. 긁힌 2의 일부는 레진 블록 표면에 여전히 보입니다. (C) TEM 그리드에 장착된 70nm 얇은 섹션. (D) 하나의 전체 초박형 절편에 대한 TEM 개요. 불완전한 수지 침투로 인해 발생하는 섹션의 구멍(흰색 화살촉)에 주목하고 일반적인 아티팩트입니다. (E) (D)에서 흰색 직사각형으로 표시된 선택한 셀의 확대 보기. (D)와 유사하게 원형질막(흰색 화살촉)에서 불완전한 매립이 보입니다. 그러나 세포의 나머지 부분은 보존 및 포매가 양호합니다. 스케일 바 = 100 μm (D), 10 μm (E). 약어: SD = 사파이어 디스크; TEM = 투과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. 이미징

  1. STEM 틸트 시리즈 획득
    1. 제조업체의 지침에 따라 현미경을 설정하십시오. 적절한 빔 정렬을 확인하십시오.
    2. 현미경에서 액체 질소 듀어를 조심스럽게 채웁니다.
    3. 현미경 작동 소프트웨어에서 올바른 단층 촬영 홀더를 선택하십시오.
    4. 그리드를 홀더에 삽입합니다. 그리드의 막대는 높은 기울기 각도에서 막대가 전자빔을 차단하는 것을 방지하기 위해 기울기 축에 수직으로 향해야 합니다.
    5. 홀더를 현미경에 삽입합니다.
    6. 다음 단계를 수행하여 빔을 정렬합니다.
      1. 제조업체에서 제공한 정렬 파일을 로드합니다. 빔 밸브를 열고 지금은 TEM 모드에서 작업하십시오. 배율을 약 20,000배 로 설정하고 STD Focus를 눌러 표준 초점을 설정합니다.
      2. 샘플에서 구멍을 검색합니다. 이것은 저배율 모드( LowMag 누르기)에서 더 쉽습니다.
      3. 조리개가 삽입되어 있지 않은지 확인하십시오. 스폿 크기를 1로 설정하고 알파를 3으로 설정합니다. 밝기 버튼을 시계 반대 방향으로 돌려 화면의 빔을 최소화하고 빔 시프트 버튼으로 중앙에 배치합니다.
      4. 올바른 건 정렬: 현미경 작동 소프트웨어의 정렬 패널에서 건 및 양극 워블러를 선택합니다. DEF/STIG 버튼으로 빔의 대칭을 조정합니다. 형광 스크린에서 빔의 움직임이 균일한지 확인하십시오. SHIFT 버튼을 사용하여 가장 밝은 지점을 화면 중앙으로 이동합니다. 완료되면 모두 선택 취소합니다.
      5. 콘덴서 스티그메이터 수정: 동일한 정렬 패널에서 CLA 및 HT 워블러를 선택합니다. DEF/STIG 버튼으로 조정하여 균일한 움직임을 달성합니다.
      6. 콘덴서 렌즈 조리개 설정: 밝기 버튼을 시계 방향으로 돌려 형광 스크린의 빔을 최대화합니다. 가장 작은 콘덴서 렌즈 조리개를 삽입하고 밝기를 번갈아 가며 빔에 올바르게 정렬되었는지 확인합니다. 빔이 비대칭으로 움직이는 경우 보기 화면, 수동 조리개 드라이브를 사용하여 수동으로 조리개를 조정하십시오. 형광 스크린에서 조리개가 왜곡된 것처럼 보이면 DEF/STIG로 콘덴서 낙인 CLA를 다시 수정합니다(이전 단계 3.1.6.5).
      7. STEM 모드로 전환합니다(ASID 선택).
        알림: 5-10초 후에 렌즈 이완 대화를 중단할 수 있습니다.
      8. 스테이지를 샘플의 얇고 대비가 풍부한 영역으로 이동합니다. STD 초점을 누르고 모든 조리개를 제거합니다. 스팟 크기 1.5nm에서 25,000배율로 변경하고 카메라 길이를 80cm에서 120cm 사이로 설정한 다음 스팟 모드를 선택합니다.
      9. 보기 화면에 론키그램이 보일 때까지 각도계의 z-값을 변경합니다. 론키그램이 희미한 경우 카메라 길이를 변경하십시오. 둥글지 않으면 COND Stig 버튼을 사용하여 조정합니다.
      10. 가장 작은 콘덴서 렌즈 조리개를 삽입합니다. 수동 조리개 드라이브를 사용하여 조리개를 론키그램 주위의 중앙에 놓습니다.
    7. 적절한 감지기를 삽입합니다. 연구 질문에 따라 명시야 검출기 및/또는 암시야 검출기를 사용하십시오. 스캔 모드를 활성화하고 샘플의 첫 번째 테스트 이미지를 획득합니다.
    8. 단층 촬영에 원하는 배율보다 큰 배율( 800,000배 이상)을 선택합니다. 초점 및 난시 수정: 중요한 샘플 영역에 대한 빔 손상을 방지하기 위해 관심 영역(ROI) 근처에서 직접 수행하지 마십시오.
      참고: 금색 기준 마커를 사용하면 이 단계를 더 쉽게 수행할 수 있습니다.
    9. ROI가 전체 기울기 범위(즉, -72°에서 72°)에 걸쳐 중앙에 유지되도록 유심 높이를 설정합니다. ROI 근처의 피처를 선택하고 중앙으로 가져와 초점을 맞추고 난시를 보정한 다음 스테이지를 단계적으로 -72°로 기울입니다. 홀더의 z 위치를 조정하여 피처를 중앙에 유지하고 필요한 경우 대비와 밝기를 조정합니다. 필요한 경우 +72°로 단계적으로 기울여 이 작업을 반복합니다.
    10. ROI로 돌아가서 시야를 선택하고 초점을 맞추고 개요 이미지를 획득합니다(그림 4). 틸트 시리즈 획득에 대해 원하는 배율을 설정합니다.
    11. -72°에서 +72°까지의 이미지 자동 틸트 시리즈 획득과 1.5°마다 이미지를 수집합니다.
    12. 스테이지 틸트 방향을 전환할 때 발생하는 기계적 효과를 상쇄하려면 이미징을 시작할 각도보다 더 큰 각도로 틸트 시리즈를 시작합니다. -72°에서 72°로 이미징하는 경우 먼저 스테이지를 0°에서 -74°로 기울인 다음 +72°로 이동하는 도중에 이미지 획득을 시작하여 -72°에서 첫 번째 이미지를 획득합니다.
    13. 자동 틸트 시리즈 획득을 시작합니다. 획득 소프트웨어에서 동적 초점을 활성화해야 합니다.
      알림: 틸트 시리즈 획득이 조기에 종료되면 유심 높이를 수정하십시오. 특히 더 높은 배율에서는 ROI가 시야 밖으로 이동하기 때문에 자동 틸트 시리즈 획득에 문제가 발생할 수 있습니다.
      STEM 및 TEM 단층 촬영에 일반적으로 사용되는 소프트웨어는 SerialEM입니다. Kirchweger et al.20 은 실온 STEM 단층 촬영에 쉽게 적용할 수 있는 SerialEM을 사용한 Cryo-STEM 단층 촬영을 위한 비디오 프로토콜을 발표했습니다.

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그림 4: 틸트 시리즈 획득. (A) 200kV STEM. (B) 에폭시 수지에 포매된 고압 동결 동결 치환 세포의 STEM 개요. (CE)에 표시된 틸트 시리즈는 흰색 직사각형으로 표시된 위치에서 획득되었습니다. (CE) -72°에서 +72°까지 획득한 틸트 시리즈의 선택된 이미지. 섹션 양쪽의 금 기준점은 전산 단층 촬영 재구성에 사용됩니다. 흰색 타원으로 표시된 것과 같은 클러스터형 기준점은 단층 촬영의 재구성에 사용할 수 없지만 높은 기울기 각도에서 잘 인식할 수 있습니다. 관심 영역 외부의 이러한 구조 또는 유사한 구조는 유심 높이를 설정하는 데 유용합니다. 스케일 바 = 1 μm (B). 약어: STEM = 주사 투과 전자 현미경. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. 단층촬영 재구성 및 분할

  1. 단층 촬영 재구성을 수행합니다(예: IMOD 소프트웨어 패키지23의 Etomo 소프트웨어 사용).
    1. 틸트 시리즈의 첫 번째 정렬을 수행하고 가중치 백 프로젝션을 사용하여 단층 촬영을 재구성합니다.
      참고: 자세한 프로토콜은 IMOD 웹사이트(IMOD 단층 촬영 가이드(https://bio3d.colorado.edu/imod/doc/tomoguide.html)에서 찾을 수 있습니다. 암시야 검출기로 획득한 이미지의 처리는 이전에 발표된 작업11,13을 참조하십시오.
  2. 셀룰러 구조를 분할합니다(예: IMOD 패키지의 3DMOD와 같은 소프트웨어 또는 AI 기반 솔루션).

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM 단층 촬영은 나노미터 범위의 등방성 분해능으로 TEM 단층 촬영보다 두꺼운 단면을 이미지화할 수 있는 가능성을 제공하며 FIB-SEM 단층 촬영과 비교하여 상대적으로 시간 효율적인 이미징 워크플로를 제공합니다. 바이러스학에서 이것은 3D의 통계 분석을 위해 또는 희귀 사건을 검색할 때 많은 수의 초미세 구조 특징을 이미징할 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 여기에서는 이 두 가지 측면과 관련하여 STEM 단층 촬영이 어떻게 사용될 수 있는지 보여주는 두 가지 대표적인 결과를 보여줍니다.

신아 재조합 VSV 비리온의 시각화

다양한 모양과 크기의 입자를 형성하는 바이러스는 매우 다양합니다. 바이러스 현탁액에서 비리온의 모양을 분석하려면 종종 음성 염색 TEM과 같은 간단한 방법으로 충분합니다. 세포 맥락에서 비리온의 형태를 특성화하는 것은 더 어렵습니다. 이것은 라브도바이러스과와 같이 이방성 형태를 가진 입자를 형성하는 바이러스에 특히 해당됩니다. VSV는 길이가 ~180nm인 총알 모양의 비리온을 형성하는 랩도바이러스입니다. 부유 세포에서 비리온은 무작위로 배향되어 있어 2D 이미지에서 총알 모양을 항상 식별하기 어렵습니다(그림 5A-C). 샘플에 있는 모든 재조합 VSV 비리온의 총알 모양을 적절하게 정의하려면 등방성 해상도를 가진 3D 방법이 필요하며, 충분히 넓은 샘플 영역에 걸쳐 체적 정보를 제공할 수도 있습니다. STEM 단층 촬영은 단일 데이터 세트에 많은 완전한 비리온을 포함할 수 있습니다(그림 5D,E). 따라서 세포당 하나의 단층촬영만 획득하더라도 통계 분석을 위해 많은 수의 비리온을 이미지화할 수 있습니다. 이에 비해 200nm 두께의 절편의 TEM 단층 촬영은 몇 개의 완전한 재조합 VSV 비리온만 캡처합니다(그림 5E에 표시됨).

figure-results-1
그림 5: 재조합 VSV 출아 부위의 STEM 단층 촬영. (A-C) 800nm 두께의 단면에서 얻은 STEM 단층 촬영의 가상 섹션의 세부 사항은 (A,B) 비리온의 다른 방향으로 인해 총알 모양이 항상 보이는 것은 아니라는 것을 보여줍니다. (C) 시야면과 평행하게 방향화된 비리온만 잘 정의된 총알로 존재합니다. (D) 재조합 VSV의 발아 부위는 선호되는 방향이 없는 큰 비리온 클러스터와 유사합니다. (E) 단층촬영의 측면도는 STEM 단층촬영을 사용하여 한 섹션에서 많은 완전한 재조합 VSV 비리온을 캡처하는 능력을 보여줍니다. 가상 이미지 스택은 이 위치에서 약 600nm의 두께를 갖습니다. 점선은 TEM 단층 촬영(200nm)을 위한 단면의 대략적인 두께를 나타내며, 여기에는 몇 개의 완전한 총알 모양의 비리온만 포함됩니다. 스케일 바 = 500nm(D). 약어: STEM = 주사 투과 전자 현미경; VSV = 수포성 구내염 바이러스. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

EF-C 펩타이드 나노피브릴의 분해

유전자 치료의 맥락에서 형질도입 강화 펩타이드 나노원섬유가 관심의 주제가 되었습니다. 최근 발표된 연구24에서 FRET(Foerster Resonance Energy Transfer) 이미징 및 STEM 단층 촬영(FRET-3D-CLEM)을 사용한 상관 이미징을 사용하여 EF-C 펩타이드 나노 피브릴의 흡수 및 분해를 조사했습니다. 서로 가까운 FRET 쌍에 해당하는 높은 FRET 효율은 조립된 원섬유에 해당하는 적색 형광을 방출합니다. 서로 멀리 떨어져 있는 FRET 쌍에 해당하는 낮은 FRET 효율은 분해된 원섬유를 나타내는 녹색 형광을 방출합니다. 두 신호 모두 세포가 EF-C 펩타이드 나노피브릴을 흡수하고 분해하는 과정에 있을 때 세포에 나타납니다. 높은 FRET 효율과 낮은 FRET가 발견되는 영역은 노란색으로 나타납니다(그림 6A).

figure-results-2
그림 6: 상관 FRET 이미징 및 STEM 단층 촬영(FRET-3D-CLEM)에 의한 EF-C 펩타이드 나노 섬유질 분해 이미징. (A) FRET 쌍으로 표지된 EF-C 나노피브릴과 함께 배양된 세포의 공초점 현미경. 녹색 신호는 분해된 것으로 추정되는 원섬유에 해당합니다. 빨간색은 추정되는 온전한 원섬유에 해당합니다. 노란색은 빨간색과 녹색 신호가 혼합된 영역에 해당합니다. 뉴 핵. (B) 동일한 셀에서 800nm 두께의 절편에 대한 STEM 개요. (C) 단층촬영의 위치가 표시됩니다. 이미지는 서로 다른 섹션에서 획득한 두 이미지의 합성으로, 셀이 섹션 중 하나의 막대 그리드에 의해 부분적으로 차단되었기 때문입니다. 핵은 A, B 및 C에 Nu로 표시됩니다. (C) 단층 촬영의 가상 섹션. 빨간색 화살촉은 빨간색 형광 신호와 겹치는 영역을 표시합니다. STEM 단층 촬영은 온전한 원섬유의 존재를 확인합니다. 녹색 화살촉은 원섬유가 분해된 영역을 가리킵니다. (D) 단층촬영의 분할. 엔도사이토시스된 사상체가 소포막을 꼬집고 있습니다(흰색 화살표). STEM 단층촬영(여기서는 대략 7μm x 7μm x 550nm)으로 조사할 수 있는 대용량으로 인해 이러한 드문 사건을 더 쉽게 관찰할 수 있습니다. (E) 단층촬영의 가상 섹션 19, 24 및 29. 6.8nm의 픽셀 크기에서 섹션은 각각 27.2nm 떨어져 있습니다. 이 그림은 Rauch-Wirth et al.24 가 발표한 데이터에서 재현되었습니다. 스케일 바 = 5 μm (A), 1 μm (C). 약어: STEM = 주사 투과 전자 현미경; FRET = 포스터 공명 에너지 전달. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

EF-C 원섬유가 세포에 흡수되어 이후에 분해되는 것을 확인하기 위해 이 상관 접근법에 의해 시각화를 수행했습니다. 광학 현미경을 사용하면 빨간색 및 녹색 신호를 제공하는 전자 현미경용 세포를 선택하여 다양한 형광 신호와 상관 관계가 있는 미세 구조 모양을 비교할 수 있습니다. 동일한 세포의 STEM 단층 촬영은 적색 신호가 아직 세포 외부에 있는 원섬유에서 유래하거나 거대식생세포작용에 의해 새로 내재된 것처럼 보일 수 있음을 보여줍니다(그림 6C). 또한, CLEM은 녹색 신호가 실제로 분해된 원섬유에서 비롯되었음을 확인했습니다(리소좀에서 발견될 수 있는 그림 6B,C(그림 6C, 가장 큰 소포). STEM 단층 촬영과 구조의 3D 시각화로 접근할 수 있는 대용량으로 인해 광학 현미경의 신호를 초미세 구조 특징과 연관시키고 해석하는 것이 더 쉽습니다. 또한, 리소좀 내부의 모집 사상체(그림 6D,E, 흰색 화살표)와 같은 드문 사건을 이 접근법으로 감지할 수 있습니다.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

STEM 단층 촬영은 최대 1μm 두께의 부피를 조사할 수 있는 기능과 결합된 TEM 단층 촬영에 필적하는 해상도를 제공합니다. 따라서 우리는 막 리모델링 4,6,25, 비리온의 발아 7 또는 엔도사이토시스5와 같은 세포 내 구조의 바이러스 유발 변화를 이미징하는 데 이상적이라고 생각합니다. 연구 질문에 따라 다른 VolumeEM 기술이 고려될 수 있습니다. 비슷한 해상도로 더 넓은 시야를 제공하는 기술의 경우 FIB-SEM 단층 촬영을 권장합니다. FIB-SEM 단층촬영은 해상도가 증가하면 이미징 시간이 증가하기 때문에 유사한 해상도로 유사한 부피를 이미징할 때 STEM 단층 촬영보다 느립니다. 종종 이것은 더 작은 시야를 이미징하여 반대 측정됩니다. 또한 6.8nm의 z 분해능(그림 6)은 이온 빔 밀링에서 기술적으로 어려울 것입니다. 따라서 FIB-SEM은 일반적으로 수십 나노미터의 (등방성) 픽셀 크기를 갖지만 전체 세포및 조직 9,10,26,27과 같은 더 큰 구조를 이미징하는 데 최적입니다. 또한 FIB-SEM 단층촬영은 틸트 시리즈에서 재구성된 단층촬영에서 일반적으로 나타나는 "누락된 쐐기" 효과를 나타내지 않습니다. 또한 플라즈마 FIB 기계의 개발로 더 빠르고 정밀한 밀링을 제공하는 대안이 현재 현장에 도입되고 있습니다.

z의 고해상도가 중요하지 않은 경우, 직렬 절편의 TEM 또는 SEM 이미징은 짧은 시간에 매우 넓은 시야를 조사할 수 있는 대안이 될 수 있지만28,29, 일반적으로 이방성 해상도를 가지고 있습니다. TEM 단층 촬영에서는 연속 두꺼운 절편에서 다른 단층 촬영을 결합할 수 있습니다30,31. STEM 단층 촬영에서도 마찬가지입니다. 그러나 조사할 수 있는 절편의 두께를 감안할 때 여러 단층 촬영을 결합할 필요성이 적습니다. 바이러스학에서 TEM 단층 촬영은 바이러스 유도 막 리모델링을 특성화하는 데 자주 사용됩니다 32,33,34,35. TEM 단층 촬영 자체는 바이러스의 복제 주기에 대한 귀중한 통찰력을 제공하지만 대부분의 사용 사례는 더 두꺼운 부피를 이미지화하는 STEM 단층 촬영 기능의 이점을 누릴 수 있습니다. 이것은 특히 횡탄 바이러스과와 같은 이방성 형태를 가진 비리온에 해당되며, 여기서 TEM 단층 촬영은 하나의 단층 촬영(35)에서 몇 개의 완전한 비리온만 포착할 수 있거나 인간 거대세포 바이러스(HCMV)4의 세포질 바이러스 조립 복합체(cVAC)의 크기를 가진 복제 구획에서 여러 개의 외피 비리온을 이미징하는 데 해당됩니다.

극저온 조건에서의 STEM 단층 촬영은 추가 기능적 통찰력19 을 제공하며 비디오 프로토콜을 사용할 수 있습니다20. 우리의 프로토콜은 샘플을 천연 상태로 보존하는 대신 거의 천연 미세 구조 보존을 제공하는 샘플 준비 워크플로우가 다릅니다. 고압 냉동, 동결 치환 샘플의 STEM 단층 촬영은 극저온 EM에서 볼 수 있는 미세 구조 보존 및 원자 분해능을 달성할 수 없지만 더 간단한 장비, 더 안정적인 표본 및 더 높은 처리량의 이점을 누릴 수 있습니다.

다음 단계는 방법의 성공에 매우 중요합니다.

첫째, 이미징 실험의 명확한 목표입니다. 기술의 노동 집약적 특성으로 인해 이미징에 대한 명확한 목표를 가진 잘 계획된 실험이 필요합니다. 모델 시스템(세포주 및 바이러스)에 대한 자세한 지식은 수행하기 덜 어려운 다른 방법을 사용하여 미리 생성해야 합니다. 따라서 광학 현미경 기반 사전 실험에서 감염률을 최적화하고 생물학적 시스템에 맞게 실험 조건을 조정하는 것이 좋습니다. 최적화 매개변수에는 세포 수, 감염 다중도(MOI), 바이러스 및 이미징할 이벤트를 기반으로 하는 시점이 포함됩니다. 이렇게 하면 샘플에서 평가 가능한 세포의 높은 비율이 보장됩니다.

둘째, 고품질 샘플 준비. 우리는 고품질 샘플 준비의 중요성을 강조합니다. 현재 우리는 고압 냉동에 의한 유리화를 세포와 같은 두꺼운 표본의 황금 표준으로 간주합니다. 실온에서의 동결 치환, 매립 및 후속 이미징은 STEM 단층 촬영과 결합할 때 고품질 결과를 얻을 수 있는 강력한 방법입니다. 따라서 샘플 준비를 위한 안정적인 루틴을 확립하는 것이 중요합니다. 이를 위해 고압 냉동14,21에 관한 문헌을 강조하고 싶습니다. 독성이 적은 동결 치환 용액을 사용해야 하는 경우 Schauflinger et al.36에 설명된 대로 사산화오스뮴 대신 과망간산칼륨을 사용하는 것이 좋습니다.

마지막으로, 잘 정렬된 현미경을 포함하여 틸트 시리즈 획득을 위한 원활하게 실행되는 워크플로우는 STEM의 사용자 지침에 따라 설정되어야 하며 현미경마다 다릅니다. 원활한 작업 흐름을 설정하는 것은 스캔 생성기와 이미지 획득 소프트웨어에 달려 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JGW, RH, EP, JSR 및 MD는 바이러스 기반 제품 개발 및 생산에 관심이 있는 제약 회사인 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG 의 직원입니다. 이것은 신문의 디자인에 영향을 미치지 않았습니다. 따라서 이해 상충은 보고되지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 간행물은 글로벌 개발 기술 전략의 일부이며 Boehringer Ingelheim Development CMC Biologicals의 글로벌 기술 관리의 지원을 받았습니다. 시료 준비에 관한 탁월한 기술 지원과 유용한 토론을 해주신 Renate Kunz와 Jana Apolloni에게 감사드립니다. 기술 문제 및 장치 유지 보수와 관련하여 탁월한 지원을 해주신 Reinhard Weih에 감사드립니다. 유용한 토론과 현미경 설치에 도움을 준 Torsten Friedrich에게 감사드립니다. Clarissa Read, Julia LaRoche 및 Jan Münch의 연구는 독일 연구 재단(SFB1279)의 협력 연구 센터 보조금으로부터 자금을 지원받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-헥사데센머크 KGaA8220640500
평행 막대가 있는 200 구리 격자플라노 GmbHG2014C
37 & deg; C 건조실바인더 GmbH9010-0323
아세톤VWR 인터내셔널 GmbH20066330
DDSA전자현미경 과학13710
다이아몬드 나이프다이아톰 주식회사https://www.diatomeknives.com/ultra-35
DMP-30전자현미경 과학13600
Embed-812 레진전자현미경 과학14900
EM 공구TVIPS GmbHTVIPS 소프트웨어: EM-Tools; https://www.tvips.com/imaging-software/em-tools/
에탄올 100%머크 KGaA1.00983.2511
여과지VWR 인터내셔널 GmbH516-0812
플라셴 미트 슈나프데켈글라스 11 mLVWR 인터내셔널 GmbH548-0625
폼바르전자현미경 과학15830-25
라이카 EM AFS2 동결 대체 장치라이카 마이크로시스템즈 GmbHhttps://www.leica-microsystems.com/products/sample-preparation-for-electron-microscopy/p/leica-em-afs2/
글로드 솔 25 nmAURION 면역 골드 시약 및 액세서리425.011
금색 파인홀과 오슬래시; 2000년 & 뮤; m과학 서비스 GmbHGA2000-Au
Graiticules Buchstaben-Netzchen Kupfer플라노 GmbHNH6C
가열판메닥스 GmbH & KG 중대12501
고진공 증발 시스템 BAF 300발텍 AG
고압 냉동고 Wohlwend HPF 컴팩트 01M. 볼벤트 GmbH 엔지니어링 오브https://www.wohlwend-hpf.ch/index.html
액체 질소 탱크H.에르벤 GmbH94500
질소(유체)VWR 인터내셔널 GmbH-
NMA전자현미경 과학19000
오스뮴 테트록사이드ChemPur Feinchemikalien und Forschungsbedarf GmbH006051
오븐 120 & 배수; C바인더 GmbH9010-0194
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참고문헌

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