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방법 논문

인간 신장 동맥 가지의 다단계 미세해부 및 기능-구조 프로파일링

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/68579

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2025년 9월 5일

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1Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 3Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, Peking University, 4Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 5Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Peking University

이 논문에서

요약

이 기사에서는 인간 신장 동맥 분지의 분리 및 기능 평가를 위한 단계별 프로토콜을 제시하여 의약품 개발을 위한 전임상 연구를 촉진합니다.

초록

신혈관 기능 장애는 급성 신장 손상, 신장 허혈 및 고혈압을 포함한 여러 임상 상태의 병인에 중요한 역할을 하며, 임상 관리에 심각한 문제를 제시하고 환자 결과에 악영향을 미칩니다. 신장내 동맥의 분리 및 기능적 특성화는 특히 신장 손상과 관련된 신장 혈관 기능 장애의 기저 메커니즘을 밝히고 표적 치료 개발을 안내하는 데 중요합니다. 임상적 중요성에도 불구하고 다양한 분지 수준에 걸쳐 인간 신장내 동맥을 분리하고 기능적으로 평가하기 위한 표준화된 접근 방식은 아직 개발되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 생리학적 및 병리학적 조건 모두에서 기능적 및 구조적 평가를 통합하여 신장내 동맥 분지의 체계적인 격리 및 다중 모드 평가를 위한 포괄적인 프레임워크를 제공합니다. 방법론은 세 가지 주요 구성 요소를 포함합니다: (1) 구조적 확인을 위한 헤마목실린-에오신(H&E) 염색을 동반한 기증자 신장에서 신장 내 동맥의 정확한 해부학적 식별 및 미세 해부; (2) 측정 재현성과 신뢰성을 향상시키기 위한 와이어 근 조영술의 엄격한 정규화 절차; (3) 정밀 와이어 근조영술 기술을 사용한 혈관 운동 반응의 정량적 분석. 정규화는 근육 길이-긴장 관계를 기반으로 하며, 여기서 동맥 분절의 점진적인 스트레칭은 최적의 휴식 장력을 설정하여 액틴-미오신 중첩을 최대화하여 최대 수축 반응을 유도합니다. 와이어 근 조영술에서는 분리된 혈관 세그먼트가 두 개의 평행 와이어 사이에 매달려 혈관 장력을 정확하게 측정할 수 있습니다. 엄격한 정규화 프로토콜을 적용함으로써 이 기술은 다양한 병태생리학적 조건과 약리학적 개입에 걸쳐 혈관 반응성을 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 정량화를 가능하게 합니다.

서론

신장은 대사 노폐물 제거, 전해질 균형 및 체액 조절을 통해 인간의 항상성을 유지하는 중요한 기관으로, 매우 높은 혈류를 요구하는 기능입니다. 생리학적 조건에서 신장은 매분 심장에서 펌핑되는 총 혈액량의 약 25%(심박출량)를 받아 전신 혈류에서 신장의 실질적인 역할과 전반적인 생리적 균형을 유지하는 데 있어 신장 관류의 중요성을 강조합니다1. 신장 동맥계는 전신 혈역학적 변화에 적응하면서 GFR을 유지하기 위해 이러한 대량 혈액 전달을 정확하게 조절합니다. 결과적으로, 신장 관류 장애는 급성 신장 손상 및 신장 허혈과 같은 상태에서 사구체 여과율(GFR) 감소에 기여하는 중요한 병리학적 메커니즘을 나타냅니다. 또한 쇼크, 심장 기능 장애 및 패혈증을 포함하여 신장 혈류를 손상시키는 전신 장애에 이차적으로 자주 발생합니다 2,3,4,5. 신장 동맥은 신장 내에서 순차적인 분기를 거치며, 먼저 수질 피라미드 사이의 신기둥을 통과하는 엽간 동맥으로 분열됩니다. 피질 수질 접합부에 도달하면 이 혈관은 피질과 수질 사이의 경계를 따라 아치형을 그리는 아치형 동맥을 생성합니다. 이러한 곡선 혈관에서 피질 실질로 방사형으로 관통하는 소엽간 동맥이 나타나 궁극적으로 구심성 세동맥을 통해 사구체 모세혈관으로 혈액을 전달하여 개별 네프론을 관류합니다 1,6,7. 엽간, 아치형 및 소엽간 동맥은 신장의 주요 저항 맥관 구조를 구성하며 신장 내 혈역학 및 압력 조절의 주요 조절자 역할을 합니다 1,8. 이러한 혈관의 정확한 분리 및 특성화는 신장 관류 항상성을 지배하는 기본 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다9. 또한, 다양한 병태생리학적 조건에서의 이질적인 혈관 반응성은 신장 보호 잠재력을 가진 새로운 혈관확장제를 개발하기 위한 전략적 틀을 제공합니다10,11.

현재 임상 영상 기술(예: 초음파)은 신장 혈류 변화를 모니터링하는 데 일상적으로 사용됩니다. 그러나 신장 관류의 주요 결정 요인인 신장 혈관 장력을 직접 평가하기 위한 기초 연구의 실험적 방법론은 여전히 제한적입니다 12,13,14,15. 와이어 근 조영술 시스템은 직경이 50μm에서 10mm 16,19,20 범위의 혈관, 기관 16,17,18을 포함하여 시험관 내에서 작은 생물학적 조직의 장력 변화를 측정하는 잘 확립된 실험 플랫폼입니다. 와이어 근조영술은 동물 연구에 널리 적용되었지만 혈관 구조 및 기능의 종 간 차이는 설치류 혈관이 인간 혈관 생리학을 나타낼 수 있는 정도를 제한합니다21. 따라서 다양한 해부학적 수준(엽간, 아치형 및 소엽간)에서 인간 신장내 동맥을 정확하게 식별하고 분리하는 것은 생리학적 특성은 물론 질병 관련 기능 변화 및 병리학적 손상 메커니즘에 대한 포괄적인 시험관 내 조사를 가능하게 하는 데 중요합니다. 다양한 혈관활성 화합물을 사용하는 약리학적 개입과 결합될 때, 이 시스템은 분리된 동맥 고리에서 혈관 수축/혈관 확장 반응의 동적 평가 및 정량적 기록을 가능하게 하여 통제된 실험 조건에서 혈관 반응성을 조사하기 위한 강력한 도구를 제공합니다 19,22,23.

이 프로토콜은 인간 신장 동맥 가지(엽간, 아치형 및 소엽간 동맥)의 정확한 해부학적 위치 파악 및 미세 해부를 위한 포괄적인 방법론을 자세히 설명한 후 체외 혈관 장력 모니터링 시스템을 사용하여 혈관 활성 약물에 대한 차등 반응성을 평가하여 이러한 혈관 세그먼트 간의 구조적 및 기능적 차이를 모두 설정합니다. 해부학적 국소화와 약리학적 반응성 프로파일링 및 조직병리학적 분석을 결합하여 혈관 작용제에 대한 영역 특이적 혈관 반응을 종합적으로 평가할 수 있는 생체 외 플랫폼을 구축합니다.

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프로토콜

여기에 설명된 프로토콜 및 예는 북경대학교 제1병원 비뇨기과(승인 번호 2023yan500-002)에서 검토 및 승인했으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 모든 참가자는 참여 전에 서면 동의서를 제공했습니다.

1. 용액 준비

  1. pH 7.4에서 119.0 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 1.0 mM MgCl2, 25.0 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4 및 11.0 mM D-포도당을 포함하는 Krebs-Ringer 용액(Krebs)을 준비합니다.
  2. pH 7.4에서 64.0mM NaCl, 60mM KCl, 2.5mM CaCl2, 1.0mM MgCl2, 25.0 mM NaHCO3, 1.2 mM KH2PO4 및 11.0 mM D-포도당을 함유한 고칼륨염 용액(60K+)을 준비합니다.

2. 시약 준비

알림: 의약품을 받은 직후 물질안전보건자료(MSDS)에 제공된 세부 사항에 따라 보관하십시오.

  1. 167.21mg의 페닐에프린을 10mL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 녹여 페닐에프린(Phe, 10-1M in stock)을 준비합니다. 원액을 -80°C에서 보관하고, 사용 당일 10-6, 10-5, 10-4, 10-3, 10-2M 로 희석하여 작업농도로 보관한다.
  2. 18.166mg의 아세틸콜린을 10mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 아세틸콜린(ACh, 10-2M in stock)을 준비합니다. 원액을 -80°C에서 보관하고 사용 당일 작동 농도로 10-5, 10-4, 10-3, 10-2M 로 희석하십시오.

3. 신장 조직 수집 및 신장내 동맥 격리

  1. 수술 전 코어 바늘 생검 또는 수술 중 동결 절편으로 조직학적으로 확인된 신장 세포 암종으로 진단된 성인 환자를 모집합니다.
    참고: 근치 신장 절제술이 예정된 환자는 수술 표본이 종양 가장자리 원위에 위치한 온전한 신장내 동맥 분절에 대한 접근을 제공하기 때문에 특별히 선택됩니다. 이러한 분절은 정밀하게 해부되고 분리될 수 있어 악성 조직의 간섭 없이 인간 신장 혈관 생리학에 대한 자세한 연구가 가능합니다. 조직학적 확인은 암종의 정확한 식별과 종양 경계의 명확한 묘사를 보장하여 실험 조사를 위해 정상적이고 종양이 없는 동맥 분절의 선택을 용이하게 합니다.
    1. 혈관 기능에 대한 교란 영향을 피하기 위해 중대한 동반 질환(고혈압, 당뇨병 또는 기타 전신 질환)이 있는 환자를 제외하여 생리학적 평가의 신뢰성과 관련성을 향상시킵니다.
      참고: 이 실험을 위한 샘플은 북경대학교 제1병원에서 근치적 신장 절제술이 예정된 환자들로부터 수집되었습니다.
  2. 근치 신장 절제술 중에 새로 절제된 인간 신장 표본을 수집하고 즉시 얼음처럼 차가운 크렙스 용액에 담가 조직 생존력을 보존합니다. 종양 가장자리의 원위부에 있는 거시적으로 정상적으로 보이는 영역만 동맥 박리를 위해 유지됩니다(그림 1A).
    참고: 최적의 신장내 동맥 격리를 위해 근치 신장 절제술 동안 인접한 건강한 조직을 전층 피질 수질 쐐기로 채취하여 피질 맥관 구조에서 수질 혈관 구조까지 전체 동맥 트리를 보존해야 합니다.
    1. 절제된 조직을 즉시 200mL의 차가운 Krebs 용액에 보관합니다. 용기를 얼음 위에 놓고 수집 후 2시간 이내에 단열 쿨러 백에 담아 실험실로 운반합니다. 후속 해부 및 기능 분석을 위해 생존력과 구조적 무결성을 보존하기 위해 운송 전반에 걸쳐 조직이 완전히 잠긴 상태로 유지되도록 합니다.
      참고: 조직 생존력과 생리학적 기능을 유지하기 위해 4°C에서 Krebs 용액에서 분리 및 후속 보관의 전체 과정은 6시간 이내에 완료되어야 합니다 24,25,26,27. 용액은 산소 공급과 조직 생존력을 유지하는 동시에 혈관 내강에서 혈액 성분의 제거를 촉진하기 위해 시술 중에 정기적으로 교체해야 합니다.
  3. 신문 위치를 찾고 신우와 측면 볼록 경계를 모두 통과하도록 절단을 정렬하여 관상면을 육안으로 식별합니다. 멸균 메스를 사용하여 관상면을 따라 신장을 이등분하여 대칭적인 두 개의 반쪽을 만듭니다. 이 접근법은 신장 피라미드 및 기둥을 포함한 내부 구조를 노출시켜 신장 내 동맥의 정확한 식별 및 후속 해부를 용이하게 합니다(그림 1A).
    참고: 신장 동맥의 분리를 용이하게 하기 위해 신우, 신장 피라미드 및 단면 표면의 지방의 일부를 먼저 제거하여 더 많은 혈관을 노출시켜야 합니다(그림 1B). 혈관이 자르지 않도록 주의하세요.
  4. 입체 현미경 아래에서 10cm 검은 바닥 배양 접시에서 미세 해부 가위와 겸자를 사용하여 엽간, 아치형 및 소엽간 동맥을 꼼꼼하게 분리합니다(그림 1C).
    참고: 인간의 신장에서 소엽간 동맥은 신장 피라미드를 통과하며 평균 직경이 약 1-2mm인 3개의 동맥 분지 1,8 중 가장 두꺼운 혈관벽을 특징으로 합니다. 피질 수질 접합부에서 엽간 동맥은 아치형 동맥으로 전환되어 피질 수질 경계를 따라 평균 직경이 약 500μm인 반원형 호를 형성합니다. 혈관은 소엽간 동맥인 신장 피질로 더 분기되며, 세 가지 중 혈관벽이 가장 얇고 직경이 약 200μm로 가장 작습니다(그림 1C). 또한, 세 가지 혈관 가지를 구별할 때 해부학적 국소화는 절대 혈관 직경 측정보다 더 중요한 정보를 제공합니다 1,8.
    1. 동맥에서 주변 조직과 지방을 부드럽게 제거하고 10cm 바닥이 검은색 배양 접시에 넣어 철저히 세척합니다(그림 1B).
  5. 다음 실험을 위해 분리된 신장 동맥(소엽간, 아치형 및 엽간 동맥)을 사용합니다.
    1. 파라핀 포매 및 조직학적 절편에 적합한 약 3mm의 표준화된 길이로 분리된 조직을 조심스럽게 트리밍하여 조직학적 처리를 위한 동맥 분절을 준비합니다. 조직 형태를 보존하기 위해 실온에서 1시간 동안 2mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)에 각 샘플을 고정합니다. 고정 후, 확립된 조직학적 프로토콜에 따라 후속 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 위한 표준 탈수, 세척 및 파라핀 포매 프로토콜로 처리합니다(그림 2).
      참고: 잠재적인 조직학적 평가를 위해 샘플은 확립된 조직학적 프로토콜28,29에 따라 콜라겐 침착을 평가하기 위해 Masson의 삼색 염색 또는 탄성 섬유 시각화를 위한 Verhoeff-Van Gieson(EVG) 염색을 거칠 수 있습니다.
    2. 혈관 기능 연구의 경우 검사할 때까지 신장 내 고리를 얼음처럼 차가운 크렙스 용액에 보관하십시오. 동맥 고리는 완전히 잠겨야 합니다.
      참고: 웨스턴 블롯/qPCR과 같은 후속 분자 분석의 경우, 해부 후 즉시 신선한 검체를 액체 질소에 급속 냉동한 다음 RNA 무결성을 보존하고 단백질 분해를 방지하기 위해 이전에 발표된 절차에 따라 -80°C에서 보관합니다30,31.

4. 동맥 링 장착

  1. 뚜렷한 해부학적 위치(그림 1C)와 직경 범위(그림 2)로 엽간, 아치형 및 소엽간 동맥을 식별한 다음 혈관 기능 연구를 위해 미세 해부 가위를 사용하여 약 2mm 길이의 고리로 조심스럽게 절단합니다(그림 3A).
    참고: 기능 테스트가 있을 때까지 각 분리된 동맥 고리를 얼음처럼 차가운 Krebs 용액 5mL에 즉시 별도로 보관하십시오. 기능 테스트를 위해 깨끗한 수직 절단으로 길이가 1.5-2.0mm 사이의 분지되지 않은 혈관 고리를 선택하십시오. 장착의 어려움을 방지하기 위해 2.0mm를 초과하는 링이나 불안정한 장력 기록을 방지하기 위해 1.5mm 미만의 링은 제외합니다.
  2. 4.1단계에서 언급한 대로 모든 동맥 링(엽간, 아치형 및 소엽간 동맥에서 별도로)을 준비하고 Krebs 및 60K+ 용액을 모두 실온에 둡니다. 그런 다음 연결된 컴퓨터를 켠 다음 와이어 근계 시스템을 켜서 실험을 진행하기 전에 모든 구성 요소가 올바르게 초기화되었는지 확인합니다.
  3. 와이어 근 검사 챔버에 동맥 링을 장착하기 전에 청결을 보장하고 잔류 물질을 제거하기 위해 5mL의 Krebs 용액으로 각 챔버를 두 번 헹구고 각 챔버에 5mL의 Krebs 용액을 추가합니다.
    1. 근측정기에 내장된 온도 제어 시스템을 사용하여 용액을 37°C로 가열합니다. 동시에 실험 중에 적절한 산소화 및 pH 균형을 유지하기 위해 연결된 가스 라인을 통해 가스(95%O2 및 5%CO2의 혼합물)로 용액을 지속적으로 폭기시킵니다.
  4. 각 동맥 링에 대해 직경 40μm의 3cm 길이 가이드 와이어 2개를 준비하고 분리된 동맥 링을 Krebs 용액이 들어 있는 다른 10cm 검은색 바닥 배양 접시에 조심스럽게 옮깁니다.
    알림: 직경이 다른 혈관에 대해 가이드 와이어의 직경이 다른 것을 선택해야 합니다. 직경이 약 100μm 이하인 동맥 링의 경우 15μm 가이드 와이어가 필요합니다. 직경이 100μm에서 200μm 사이인 경우 25μm 가이드 와이어가 사용됩니다. 직경이 200μm보다 큰 경우 40μm 가이드와이어를 사용할 수 있습니다. 실험의 일관성을 위해 단일 실험 내에서 동일한 유형의 모든 혈관에 동일한 직경을 사용하는 것이 좋습니다. 19.
  5. 첫 번째 가이드 와이어를 접시 내부의 동맥 링에 조심스럽게 삽입하고 가이드 와이어의 한쪽을 90° 구부린 다음 시계 방향 나사 조임을 위해 기기에서 제공하는 특수 나사를 사용하여 클램프형 샘플 홀더에 고정하기 위해 챔버로 옮깁니다(그림 3B).
    알림: 가이드 와이어는 동맥 링을 샘플 홀더에 장착할 때 동맥 링을 전달하는 동안 구조적 지지를 제공하기 위해 삽입되어 취급으로 인한 손상이나 뒤틀림을 최소화합니다.
  6. 홀더에 동맥 링을 고정하기 전에 혈관 길이와 너비를 기록하십시오. 두 홀더 사이에 동맥 링을 놓고(그림 3C) 마이크로미터 눈금을 읽습니다(여기서 1눈금은 10μm를 나타냄). 홀더가 서로 거의 닿지 않을 때 측정된 스케일 값(그림 3D)을 빼서 동맥 링의 길이와 너비를 결정합니다.
  7. 혈관에 다른 가이드 와이어를 끼우고 마지막으로 반대쪽에 고정합니다. 가이드 와이어를 양쪽의 고정 나사 주위에 시계 방향으로 감고 샘플 홀더 표면에 단단히 부착되었는지 확인합니다.
    참고: 전체 고정 과정에서 혈관 내피의 손상을 방지하기 위해 가이드 와이어로 혈관을 당기거나 혈관 내벽을 긁는 것을 피해야 합니다. 가이드 와이어는 겹치지 않고 단일 층으로 고정 나사를 감아야 합니다. 두 개의 가이드 와이어는 동일한 수평면에 있어야 하며 서로 평행해야 하며 서로 교차하지 않아야 합니다. 또한 가이드 와이어를 고정한 후 양쪽의 샘플 홀더를 더 가깝게 조정하십시오. 그러나 그림 3E 와 그림 3F와 같이 힘을 피하기 위해 실제로 접촉하지 않고 서로 가까이 있어야 합니다.
  8. 챔버를 와이어 근 그래프 시스템에 다시 설치합니다. 그런 다음 뚜껑을 덮고 가스를 환기시킵니다. 센서를 연결하고 혈관 장력 테스트를 위한 데이터 수집 소프트웨어를 엽니다.

5. 최적의 초기 장력 결정을 위한 혈관별 정규화

참고: 최대 수축 반응성을 위한 최적의 휴식 장력으로 정의되는 안정적인 기준선 조건을 설정하는 것은 재현 가능한 기능 측정에 중요합니다. 그러나 고유한 개인 간 생리학적 차이로 인해 인간 혈관은 동물 혈관에 비해 기준선 기계적 특성에서 더 큰 가변성을 나타냅니다 32,33,34,35,36. 이러한 요인은 내재적인 혈관 이질성(예: 직경, 벽 두께 및 수축 특성의 구조적 및 기능적 차이)과 결합되어 종합적으로 기준선 장력의 상당한 변화를 초래합니다. 따라서 실험적 재현성을 보장하기 위해 각 혈관을 개별적으로 정상화하는 것이 좋습니다. 와이어 근그래프 시스템에는 전용 정규화 모듈 (normalization module) 이 포함되어 있어 각 선박의 기준선 장력을 정확하게 결정할 수 있습니다.

  1. 4.1-4.8단계에 설명된 대로 챔버에 동맥 링을 장착합니다. 차트 기록을 시작하고 채널을 0으로 설정하고(그림 4A) 최소 30분 동안 안정화를 허용한 다음 정규화를 진행하기 전에 채널을 다시 0으로 설정합니다.
  2. DMT 메뉴(그림 4B)에서 정규화 설정을 선택하고 다음과 같이 매개변수를 설정합니다(그림 4C).
    1. 접안렌즈 보정(mm/div): 1; 목표 압력(kPa): 13.3; IC1/IC100: 0.9; 온라인 평균 시간(초): 3; 지연 시간(초): 60.
      참고: IC1은 최대 활동력 생성 시 내부 혈관 둘레를 나타내고 IC100은 100mmHg 경벽 압력에 해당하는 둘레를 나타냅니다. 인간 신장 동맥은 실험적 결정 및 IC100 비율의 재사용을 위해 일관된 혈관 특성을 갖는 동물 모델과 달리 상당한 표본 간 가변성을 나타내므로 표준화가 필요합니다. 개별 인간 표본 간의 혈관 직경, 벽 두께 및 기계적 특성의 상당한 차이로 인해 각 혈관은 고유한 기본 특성을 확립하기 위해 독립적인 정규화를 거쳐야 합니다. 따라서 0.9의 비율은 여기에서 프로토콜 초기화를 위한 자리 표시자로 설정되었으며 이 프로토콜에서는 실제로 사용되지 않았습니다.
  3. 대상 동맥에 해당하는 채널을 선택하고 DMT 메뉴(그림 4C)에서 정규화 화면을 열고 적절한 데이터로 채웁니다.
    1. 조직 종점: a1 은 0이어야 하고 a2 는 혈관의 길이(mm)여야 합니다. 와이어 직경: 40μm(사용된 와이어의 직경 입력); 마이크로미터 판독: 마이크로미터 눈금의 값, 점 추가 를 클릭하여 점을 기록합니다.
  4. 준비가 되면 점 추가 를 클릭하여 첫 번째 점을 기록하고 정규화 절차를 시작합니다.
  5. 수동 스트레칭을 적용하고 3분 동안 기다린 다음 마이크로미터 판독값을 다음 지점으로 입력한 다음 5mL의 60K+ 를 추가하여 칼륨 매개 혈관 수축을 유도합니다(그림 5).
  6. 수축이 정체기에 도달할 때까지 기다리십시오. 그런 다음 60K+ 용액을 5mL의 크렙스 용액으로 3회 씻어내고 칼륨 활성화력에서 각 스트레칭의 수동 힘을 빼서 트레이스에서 능동력 데이터를 계산합니다(그림 5).
  7. 활동력이 최대에 도달할 때까지 5.5-5.6단계("Stretch-60K+ 자극-Wash" 단계)를 반복한 다음 혈관의 활력력 생성이 최대인 최적의 기준선 장력을 결정합니다(그림 5).
  8. 실험의 다음 단계로 진행하기 전에 10분 동안 챔버에서 동맥 고리를 평형화합니다.

6. 신동맥 고리 반응성 검출

  1. 실험 시작 전에 각 챔버의 크렙스 부피가 5mL인지 확인하십시오.
  2. 페닐에프린 유도 농도 의존적 수축을 평가하기 위해 누적 Phe를 반로그 증분(10-9 내지 10-4 M)으로 적용합니다37.
  3. 가장 낮은 Phe 농도(10-9M )로 시작합니다. 5mL의 Krebs 완충액이 들어 있는 챔버에 5μL의 Phe 스톡(10-6M )을 추가하고, 지속적으로 모니터링하고 수축이 안정화될 때까지 기다린 다음(2-3분 동안 장력이 변하지 않음) 지점을 표시한 다음 다음 농도를 반로그 증분으로 추가합니다. 최종 농도(10-4M )에 도달할 때까지 반복하고 전체적으로 일관된 모니터링을 유지합니다(그림 6).
  4. 추가 약물 테스트를 위해 장력이 기준선으로 돌아가고 최소 10분 동안 안정적으로 유지될 때까지 따뜻한 5mL의 Krebs 용액으로 챔버를 최소 5회 세척합니다.
  5. 아세틸콜린 유도 농도 의존적 혈관 확장을 평가하려면 누적 ACh를 반 로그 증분(10-8 내지 10-5.5M )으로 적용합니다.
    참고: 정상적인 맥관 구조에서 아세틸콜린(ACh)에 대한 반응은 내피 완전성의 기능적 지표 역할을 합니다37,38. ACh에 대한 혈관 확장 반응은 건강한 혈관에서 NO 매개 이완을 통한 내피 기능을 반영합니다. 그러나 병리학적 조건에서 이 반응은 산화질소(NO) 생체이용률 손상 및/또는 수용체 신호 전달 경로 변경으로 인해 약화되거나 폐지될 수 있습니다.
  6. 10-4M Phe로 용기를 미리 수축하고 5mL의 Krebs 완충액이 들어 있는 챔버에 5μL의 Phe 스톡(10-1M)을 추가하고 15분 동안 배양합니다. 가장 낮은 ACh 농도에서 시작하여 5mL의 Krebs 완충액이 들어 있는 챔버에 5μL의 Ach 스톡(10-5M)을 추가하고, 지속적으로 모니터링하고 혈관 확장 반응(지속적인 미량 검출로 확인)을 기다린 다음 지점을 표시한 다음 다음 농도로 진행합니다. 모두 테스트될 때까지 반복합니다(그림 7).
  7. 파일을 저장하고 동맥 고리를 제거하여 실험을 완료합니다. 10mL의 8% 아세트산 용액과 함께 3분 동안 배양한 다음 10mL의 물로 3회 헹구어 챔버를 철저히 청소합니다. 다음으로, 10mL의 95% 에탄올에서 3분 동안 배양하고 10mL의 물로 다시 3회 헹굽니다. 마지막으로 히터와 가스를 모두 끄고 가스를 차단하기 전에 모든 액체가 제거되었는지 확인합니다.

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결과

인간의 신장에서 엽간 동맥은 해당 정맥과 함께 신장 피라미드 사이를 흐릅니다. 상대적으로 두꺼운 혈관벽과 상당한 지방 조직 케이스가 특징인 이 동맥은 특히 주의 깊은 해부가 필요합니다. 분리 절차 중 과도한 힘이 가해지지 않도록 주변 지방 조직을 꼼꼼하게 제거해야 합니다(그림 1C).

아치형 동맥은 해부학적으로 피질 수질 접합부에 위치하여 신장 피라미드의 바깥쪽 가장자리를 따라 특징적인 반원형 아치를 형성합니다. 엽간 동맥에 비해 혈관벽이 더 얇습니다. 격리 중에는 동맥의 구부러진 형태로 인해 주변 실질 조직을 제거할 때 특별한 주의를 기울여야 합니다. 해부는 전체 호 길이를 따라 외막과 말초 실질을 모두 체계적으로 다루어야 합니다. 불완전한 제거로 인해 해제된 동맥이 제거되지 않은 쪽으로 구부러져 잠재적으로 후속 실험 조작을 손상시킬 수 있으므로 양쪽에서 실질 조직을 동시에 완전히 제거하는 데 특별한 주의가 필요합니다(

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토론

신장 관류 안정성은 중요한 치료 표적이자 혈역학적 병태생리학에 대한 창 역할을 합니다39,40. 우리는 신선한 신장 절제술 표본에서 인간 신장 동맥의 계층적 격리 및 기능 평가를 위한 프로토콜을 제시하여 현재 방법론의 상당한 격차를 해결합니다. 사체 표본 또는 동물 모델로 제한된 기존 접근 방식과 달리 당사의 기술은 형태학적 무결성과 생리적 기능을 모두 보존하면서 생존 가능한 신장내 동맥(엽간에서 소엽간까지)을 안정적으로 분리할 수 있습니다. 이러한 발전은 인간 신장 혈관 생물학을 조사하고 잠재적인 치료법을 스크리닝하기 위한 충실도가 높은 실험 플랫폼을 구축합니다.

이 프로토콜의 효율성은 몇 가지 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 근치 신장 절제술에서 얻은 신장 조직을 얼음처럼 차가운 크렙스 용액에 즉시 담근 후...

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공개 사항

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감사의 글

저자는 이 연구에 참여해 주신 자원봉사자들에게 감사를 표하고 신장 조직을 제공한 북경대학교 제1병원 비뇨기과 외과 직원들에게도 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 이 작업은 베이징시 자연과학재단(F251013 YZ, 7232096 YL)의 지원을 받았습니다. 중국 국립과학재단(82325004, 92168114에서 Y.Z., 82170422에서 Y.L.); 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFF0501401, 2018YFA0800501 to YZ, 2021YFF0501404 to YL, 2023YFC2415500 to L. Y.); 혈관 항상성 및 리모델링 국가 핵심 연구소의 북경대학교 제3병원 연구 프로젝트(북경대학교; 2024-VHR-SY-07 to Y.Z.); 2023년 베이징시 위생건강위원회 수도 의료 과학 기술 혁신 성과 전환 우수 진흥 프로그램 프로젝트(YC202301QX0162 L. Y.); 국립 고위급 병원 임상 연구 기금(북경대학교 제1병원 과학기술 성과 전환 인큐베이션 지도 기금 프로젝트, 2024CX24 to L. Y.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아세틸콜린 클로라이드Sigma-Aldrich, Merck, 다름슈타트, 독일A6625
검은 바닥 배양 접시덴마크 Myo Technology, 덴마크 오르후스300412
CaCl2Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A501330
D-포도당Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A610219
Dumont 집게는덴마크 Myo Technology, 덴마크 오르후스300413
Geuder 해부 가위덴마크 Myo Technology, 덴마크 오르후스400431
가이드 와이어덴마크 Myo Technology, 덴마크 오르후스400447직경 40 & 마이크로; m
케이클Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A100395
KH2PO4Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A100781
LabChart Professional 버전 8.3 ADInstruments, 오스트레일리아-
MgCl2· 6H2OSangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A100288
다중 근 그래프 시스템 덴마크 Myo Technology, 덴마크 오르후스620미터
나크롬Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A100241
NaHCO3Sangon Biotech Co., Ltd., 상하이, 중국A100865
페닐에프린Sigma-Aldrich, Merck, 다름슈타트, 독일P6126

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