특정 부위에서 번역 후 변형 수준의 신속한 체외 하향 조절을 위한 억제 펩타이드의 설계 및 응용

요약

여기에서는 번역 후 변형 억제 펩타이드인 TAT-PIP의 설계 사양, 품질 관리 표준 및 기능 검증 시스템을 개략적으로 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

단백질은 생명 활동의 주요 실행자이며 전사, 번역 및 번역 후 변형(PTM) 수준에서 조절됩니다. 더욱이, PTM은 단백질이 일반적으로 다양한 유형의 PTM과 특정 PTM에 대한 여러 부위를 가지고 있기 때문에 단백질 활성을 조절하기 위한 보다 복잡한 메커니즘을 나타냅니다. 플라스미드 형질주입 또는 렌티바이러스 및 아데노바이러스는 확인된 모든 부위 중에서 기능적으로 중요한 PTM 부위의 초기 스크리닝에 사용될 수 있습니다. 그러나 이러한 방법은 항상 세포 및 조직 진입의 낮은 효율성, 시간 소모적이고 높은 비용, 잠재적인 면역 반응 등과 같은 문제에 직면해 있습니다. 이 문제를 해결하기 위해 최근 TAT-PIP, TAT-conjugated PTM inhibitory peptide라는 재조합 펩타이드 유형을 개발하여 성공적으로 채택했습니다. TAT-PIP는 세포 및 조직 진입을 용이하게 하는 TAT 모듈과 경쟁 결합을 통해 표적 부위에서 PTM을 특이적으로 하향 조절하는 PIP 모듈로 구성됩니다. 여기에서는 TAT-PIP의 설계 사양, 품질 관리 표준 및 기능 검증 시스템을 간략하게 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 디자인 섹션에서는 TAT-PIP의 일관성, 선택적 길이, 특이성 및 보존에 대해 설명합니다. 다음으로 효능과 안전성을 보장하는 TAT-PIP의 품질 테스트 요구 사항을 소개합니다. TAT-PIP 부분의 적용에서는 TAT-PIP의 농도 구배 테스트, 테스트된 세포의 배양 과정 및 후속 표현형 검출을 소개했습니다. 요약하면, 특정 부위를 선택적으로 knockdown하고 결과 표현형을 관찰하여 그 기능을 추론함으로써 PTM 부위를 스크리닝하는 효과적인 방법을 설명합니다. 합성 비용이 낮고 효율성이 높기 때문에 이 방법은 플라스미드 transfection과 같은 기존 기술의 한계를 극복합니다.

서론

단백질은 생명 활동의 주요 실행자이며, 단백질의 생물학적 조절 과정은 유전자 발현 조절의 두 가지 핵심 측면인 유전자 전사와 mRNA 번역을 포함합니다. 그러나 지난 수십 년 동안 PTM(post-translational modification)은 세포 기능을 조절하는 데 없어서는 안 될 또 다른 메커니즘이 되었습니다¹. 연구자들에게 가장 잘 알려진 PTM인 인산화는 생리적 기능에서 특히 중요한 역할을 합니다. 예를 들어, 세포외 신호 조절 키나아제(ERK)가 Thr202 및 Tyr204 부위에서 MEK 키나아제에 의해 인산화된 후 형태가 변경되어 활성 부위가 노출되어 전사 인자²와 같은 다운스트림 표적 단백질을 활성화합니다. 대조적으로, GSK-3β의 N-말단 Ser9가 Akt/PKB 키나아제에 의해 인산화되면 기질 결합 포켓이 막혀 키나아제 활성이 손실됩니다³. 유비퀴틴화(Ubiquitination)는 유비퀴틴 분자가 기질 단백질에 공유 결합(covalent)으로 부착되어 다양한 세포 과정을 조절하는 또 다른 중요한 PTM입니다. 유비퀴틴은 7개의 라이신 잔기(K6, K11, K27, K29, K33, K48, K63)와 N-말단 메티오닌(M1)을 함유하고 있습니다. 서로 다른 부위에서 유비퀴틴 사슬의 연결은 기질 단백질에 다른 운명을 부여합니다. K48 연결 유비퀴틴화의 주요 기능은 프로테아솜에 의한 분해를 위해 기질 단백질을 표시하는 것입니다⁴. 반대로, K63 연관 유비퀴틴화의 주요 기능은 DNA 손상 복구, 염증 반응 및 세포내이입과 같은 비분해적 신호 전달에 참여하는 것입니다⁵. 최근 몇 년 동안 단백질체학 기술의 급속한 발전으로 새로운 PTM의 수가 증가하고 있습니다. 고전적인 아세틸화(acetylation)를 넘어서, 프로피오닐화(propionylation), 크로토닐화(crotonylation), 글루타릴화(glutarylation)와 같은 새로운 아실화(acylation)가 확인되었다⁶. 히스톤 변형 분야에서, 히스톤 락토실화는 RNA m⁶A 변형 및 면역 미세환경⁷의 항상성을 방해합니다. 비히스톤 변형 분야에서, ATP5O 크로토닐화의 감소는 인지질 대사의 하향 조절에 주요 해로운 요인이다⁸.

PTM에 대한 연구를 수행하기 위해서는 PTM 단백질체⁹의 분석을 체계적으로 진행해야 합니다. 이 분야는 두 가지 주요 연구 방향, 즉 전체 단백질체 수준에서 PTM 프로파일을 분석하고 특정 단백질의 PTM 부위를 포괄적으로 식별하는 것을 포함합니다. 현대의 질량분석법은 다양한 유형의 PTM과 특정 부위를 효과적으로 식별할 수 있지만, 주요 기능 부위의 스크리닝 및 검증은 연구 진행을 제한하는 핵심 과학적 과제로 남아 있습니다. 효율적인 시험기관 스크리닝 전략을 수립하는 것은 주요 규제 기관의 기능을 해결하기 위한 첫 번째 단계입니다. 전통적인 방법으로는 특정 부위에 대한 돌연변이 플라스미드를 구축하고(돌연변이 비활성화, 돌연변이 활성화), 체외 형질주입 기술을 통해 표적 세포에 도입, 세포 증식, 세포사멸 및 산화 스트레스와 같은 표현형 지표의 변화를 체계적으로 평가하는 방법이 있습니다. 그러나 이 전략은 난모세포 및 1차 조직 배양 시스템과 같은 전사 침묵 세포 모델에서 상당한 기술적 장애물에 직면해 있습니다. 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 형질도입 시스템은 형질주입 효율 문제를 부분적으로 극복할 수 있지만, 그 응용 분야는 높은 경제적 비용과 체외 조직 모델의 낮은 침투 효율이라는 두 가지 문제에 직면해 있습니다. 돌연변이 넉인 마우스를 만드는 전략은 매우 오래 지속되고 비용이 많이 듭니다. 전반적으로 기능적으로 중요한 PTM 현장의 초기 스크리닝을 위해 경제적이고 효율적인 전략을 개발하는 것이 시급합니다.

최근 몇 년 동안 우리 팀은 폴리펩티드 경쟁 억제를 기반으로 하는 TAT-PIP, TAT-conjugated PTM inhibitory peptide라는 신속한 PTM 하향 조절 기술을 성공적으로 개발하고 채택했습니다. 핵심 이점은 기능적으로 중요한 PTM 부위에 대한 예비 스크리닝을 수행하기 위한 보편성과 높은 효율성이며, 이는 주요 PTM 부위의 분자 메커니즘에 대한 심층 분석을 위한 중요한 기반을 제공합니다. 본 연구는 TAT-PIP의 주요 프레임워크와 실행 과정을 체계적으로 규명하고, 대표적인 실험 데이터를 통해 특정 현장의 PTM 수준을 조절하는 효과를 입증하였다.

프로토콜

1. TAT-PIP 시퀀스 설계

참고: TAT-PIP는 펩타이드의 두 부분으로 구성됩니다(그림 1): N-말단 부분은 TAT, CYGRKKRRQRRR이며, 이는 모든 TAT-PIP에 대해 변경되지 않고 체외 배양 세포 또는 생체 내 조직에 효율적으로 진입하는 데 도움이 될 수 있습니다. C-말단 부분은 대상 단백질의 특정 PTM 부위(그림 1, 일반적으로 기호 "K"의 라이신, 빨간색으로 강조 표시됨) 주변의 폴리펩티드 서열입니다. PIP의 길이는 약 10-15개의 AA 잔기입니다(길면 비용이 증가하고 짧으면 특이성이 크게 감소함).

1. 폭발 분석을 통해 PIP 시퀀스를 최적화합니다(그림 2).
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 에 로그인하고 blastp에서 단백질 염기서열을 검색합니다.
   2. 타겟 단백질 염기서열을 Enter the query sequence 창에 복사합니다.
   3. 검색 선택에서 표준 데이터베이스 옵션을 선택합니다. 프로그램 선택에서 blastp(protein-protein BLAST) 옵션을 선택합니다. 마지막으로 BLAST 버튼을 클릭합니다(그림 2B).
   4. 특이성이 가장 높은 펩타이드 세그먼트를 후보 PIP로 선택합니다.
2. 최종 PIP를 위해 인간과 마우스 간의 상동성 비교를 수행합니다.
   1. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 에 로그인하고 blastp에서 단백질 염기서열을 검색합니다.
   2. 인간과 마우스 종 모두에서 단백질의 염기서열을 복사하여 입력 염기서열 상자에 붙여넣습니다.
   3. 제출 버튼을 클릭하여 결과를 가져옵니다.
   4. 인간과 생쥐 간에 100% 상동성을 가진 PIP를 선택합니다(그림 2C).
3. N-단자 TAT와 C-단자 PIP로 구성된 TAT-PIP의 구성을 결정합니다.

2. TAT-PIP의 종합 및 품질 검증

1. 질량 분석법으로 98% 이상의 펩타이드 순도를 보장하고 후속 실험에 영향을 줄 수 있는 불순물을 방지할 수 있는 광범위한 프로젝트 경험을 가진 회사를 선택하십시오.
   참고: 폴리펩티드의 내독소 수치는 ≤10이어야 하며 병원체가 없어야 합니다.

3. TAT-PIP의 적용

1. 병원균이 없는 초순수를 사용하여 TAT-PIP를 용해시켜 10mg/mL의 스톡 농도를 달성합니다. 부분적인 변성을 유발할 수 있는 반복적인 동결-해동 주기를 피하기 위해 스톡을 작은 튜브에 분배하십시오.
   참고: 1% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 첨가하면 TAT-PIP의 구조를 보호하는 데 도움이 됩니다.
2. TAT-PIP로 세포를 치료합니다.
   1. 표준 배양 조건(37°C, 5% CO₂)에서 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle's Medium에서 인간 배아 신장 293T 세포를 배양합니다.
      참고: 파종 후 세포를 약 12시간 동안 배양하고 포화도가 약 70%에 도달했을 때 TAT-PIP 처리를 수행했습니다.
   2. PBS를 사용하여 용해된 TAT를 1mg/mL로 희석한 다음 24시간 동안 적절한 용량(배양 배지의 권장 최종 농도: 0.05mg/mL, 0.1mg/mL, 0.2mg/mL, 0.4mg/mL)으로 세포 배양 배지에 직접 첨가합니다.
   3. 원래 배양 배지로 세포를 3 회 세척합니다.
   4. 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 PTM의 하향 조절 정도를 확인합니다.
      참고: 경험과 후속 실험 결과를 바탕으로 TAT-PIP의 최적 최종 농도는 0.1mg/mL입니다.

4. 웨스턴 블롯

1. 세포 단백질 샘플을 준비합니다.
   1. 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 3회 세척하고, 세포 펠릿에 200μL의 강력한 방사성 면역침전 분석(RIPA) 용해 완충액(페닐메틸설포닐 플루오라이드[PMSF]-프로테아제 억제제 첨가)을 첨가하고, 예비 용해를 위해 5분 동안 배양한 후 세포 스크레이퍼로 긁어냅니다.
   2. 초음파 분쇄기를 사용하여 12 % 에너지 강도에서 5 초 동안 혼합물을 초음파 처리합니다.
   3. 세포 용해물을 얼음에서 30분 동안 식힌 다음 13400g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
   4. 단백질이 포함된 상등액을 사전 냉각된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 1/4 부피의 5x 샘플 버퍼를 상층액에 추가합니다(최종 농도 1x).
   5. 혼합물을 소용돌이치고 건조 온도 조절기에서 95°C에서 5분 동안 가열한 다음 얼음에서 2분 동안 식힙니다.
   6. Nanodrop에서 Bradford 분석을 사용하여 총 단백질 농도를 측정합니다.
2. sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 수행합니다.
   1. SDS-PAGE에는 12% 리졸빙 젤과 4% 스태킹 젤을 사용합니다.
   2. 단백질 샘플을 지정된 부피에 따라 웰에 피펫팅합니다.
   3. 전기영동 장치를 켜고 먼저 80V, 300mA에서 30분 동안 실행하여 스태킹 겔과 분리겔 사이의 계면에서 밴드를 정렬합니다. 그런 다음 120V, 300mA에서 45분 동안 실행하여 단백질을 분해합니다.
   4. 빠른 전달 장치를 사용하여 겔에서 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달합니다.
3. 차단, 항체 배양 및 시각화를 수행합니다.
   1. 0.1% Tween 20(TBST)을 함유한 Tris-buffered saline의 5% 탈지유에 PVDF 멤브레인을 막고 실온(RT)에서 1시간 동안 배양합니다.
   2. 1차 항체를 5% 탈지유/PBST에 1:1000으로 희석한 1차 항체를 4°C에서 4°C로 하룻밤 동안 로테이터에서 배양합니다.
   3. TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다(각 10분).
   4. 2차 항체를 5% 탈지유/TBST에 1:1000으로 희석한 2차 항체와 함께 RT에서 1시간 동안 멤브레인을 배양합니다.
   5. TBST로 멤브레인을 세 번 세척합니다(각 10분).
   6. 멤브레인을 시계열(5초, 10초, 20초, 30초, 60초, 120초)로 노출시켜 전기 생성 화학발광(ECL) 장치에서 최적의 이미지를 얻을 수 있습니다.

5. 체외배양세포에서 TAT-PIP의 기능적 검증

1. 세포 반응성 산소종(ROS) 수준을 감지합니다.
   1. 24웰 배양 플레이트에서 1 x 10⁵ cells/well의 최적 밀도로 293T 세포를 플레이트화합니다.
   2. TAT-conjugated Histone3 lysine 116 Crotonylation inhibitory peptide (THCIP) (0.1 mg/mL)로 세포를 24시간 동안 처리한 다음 PBS로 세포를 세척합니다.
   3. 10μM 디클로로-디하이드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 37°C의 암흑 속에서 20분 동안 배양합니다.
   4. 도립 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ의 측정 기능을 사용하여 형광 강도를 측정합니다.
      참고: FITC 필터 세트는 465-495nm의 방출 필터, 이색성 미러 505A 및 512-550nm의 두 번째 방출 필터와 함께 사용되었습니다.
2. 세포 증식 분석
   1. 24웰 배양 플레이트에서 웰당 1 x 10⁵ 개의 세포의 최적 밀도로 293T 세포를 시딩합니다.
   2. 각 웰에 10μL의 CCK-8 시약을 추가합니다.
   3. 세포를 37°C에서 2시간 동안 배양합니다.
   4. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 기록하고 블랭크 웰(매체 + CCK-8)에서 배경 신호를 뺍니다.
   5. 데이터를 정규화하여 세포 생존율을 계산합니다.
3. 세포 ATP 수치 검출
   1. 용해 완충액으로 세포를 용해합니다. 용해물을 12,000 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오. 후속 분석을 위해 상층액을 수집합니다.
   2. ATP 표준물질 용액을 용해 완충액으로 희석하여 0.5μM, 1μM, 2μM, 3μM, 4μM 및 5μM의 농도 구배를 생성합니다.
   3. 세포 상층액 또는 ATP 표준물질을 포함하는 각 웰에 20μL의 ATP 검출 용액을 추가합니다.
   4. 즉시 마이크로플레이트 리더를 사용하여 발광 신호를 측정합니다.
      1. Plate Layout(플레이트 레이아웃)을 클릭하고 Change Plate Template(플레이트 템플릿 변경)에서 해당 플레이트 템플릿을 선택하여 샘플(표준물질 및 샘플)을 설정합니다.
      2. 그런 다음 왼쪽의 Protocol(프로토콜 )을 클릭하고 Chemiluminescence(화학발광) 버튼을 선택한 다음 Start(시작 )를 클릭하여 감지를 시작합니다.
   5. ATP 표준물질의 발광 신호로부터 표준 곡선을 생성하고 이를 사용하여 세포 상층액의 ATP 농도를 정량화할 수 있습니다.

결과

본 연구는 TAT-PIP를 이용하여 경쟁적 억제를 기반으로 특정 부위에서 표적 단백질의 PTM 수치를 하향 조절하는 전략을 설명한다. 일반적인 예에서 TAT-PIP는 구체적으로 THCIP로 이름이 바뀝니다. 그것은 두 가지 기능 모듈로 구성됩니다 : (1), THCIP가 세포를 관통 할 수 있도록하는 N- 말단 세포 침투 펩타이드 TAT (CYGRKKRRQRRR); (2) H3의 K116 주위의 C-말단 서열, AIHAKRVTIMPKD, K116에서 크로토닐화되는 내인성 H3와 특이적으로 경쟁합니다(그림 2A). 이 부위에 대한 특이 항체는 H3crHS(H3 lysine crotonylation antibody at the hundred and six site)로 명명되었습니다.

THCIP의 설계 과정은 다음과 같습니다: 표적 PTM 부위의 측면 염기서열에서 15-20개의 아미노산을 기능적 도메인으로 선택하고 다음 생물정보학 ...

토론

이 프로토콜에서는 다음 단계가 중요합니다. 첫째, TAT-PIP 설계는 펩타이드의 특이성을 다룹니다. 둘째, 응용 프로그램 및 최종 농도를 최적화합니다. 효율적이고 신속한 녹다운을 달성하기 위해 최적화된 농도를 신중하게 테스트해야 합니다. 셋째, TAT-PIP의 효과를 검증하기 위해서는 추가적인 효과를 확인하기 위해 단일 실험에 의존하는 것보다 여러 실험을 권장한다.

기존 방법을 비교하면 이 방법은 주로 세 가지 장점을 보여줍니다: 첫째, 플라스미드 트랜스펙션 및 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 감염과 비교하여, TAT-PIP는 모든 세포 및 조직에 침투하는 데 지속적으로 높은 효율성을 보여줍니다. 둘째, TAT-PIP는 기능적으로 중요한 PTM 부위의 초기 스크리닝에서 다른 전략보다 우세합니다. 셋째, TAT-PIP는 키나아제 활성을 억제한다는 점에서 억제제보다 더 특이적입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
자동 다기능 이미징 시스템	Tanon	4600	노출계는 개발 처리 후 멤브레인에서 형광 또는 화학발광 신호를 감지하여 대상 단백질 밴드를 식별하고 시각화합니다.
Cell counting kit-8	GLPBIO	GK10001	세포 대사 생존율과 세포 수 간의 상관 관계를 기반으로 이 방법은 CCK-8 시약 Dulbecco'에 대한 세포의 환원 능력을 측정하여 세포의 증식 능력을 평가합니다
. 의 변형된 독수리' s 배지(DMEM)	Gibco	11995065	Dulbecco의 변형 독수리 배지(DMEM)는 다양한 포유류 세포의 성장을 지원하기 위해 널리 사용되는 기초 배지입니다.
ECL 화학발광 기질	Biosharp	BL520B	ECL 기질은 화학발광 반응을 통해 특정 단백질 또는 핵산을 검출할 수 있는 광 신호를 생성합니다.
전기영동 장치	Tanon	EPS600	전기영동 장치의 주요 역할은 생물학적 거대분자를 분리하고 분석하는 것입니다.
향상된 ATP 분석 키트	Beyotime	S0027	이 키트는 샘플의 ATP 수준을 효과적으로 감지할 수 있습니다
소태아(FBS)	Gibco	16000-044	소태아 혈청(FBS)은 세포 유지 및 성장에 필수적인 영양소와 성장 인자를 제공합니다.
GenScript eBlotL1	GenScript	L00686	이 장치는 매우 효율적이며 15분 이내에 폴리아크릴아미드 겔에서 PVDF 멤브레인으로 단백질 전달을 빠르게 달성할 수 있습니다
도립 형광 현미경	Olympus Corporation	IX73	형광 현미경은 자외선을 광원으로 사용하여 검사 대상에 방사선을 조사하여 형광을 방출하도록 한 다음 그 아래 물체의 모양과 위치를 관찰합니다. 현미경.
NanoDrop2000 미량 UV-Vis 분광 광도계	Thermo	Scientific 2000	NanoDrop은 DNA 또는 RNA
PVDF 멤브레인	BioRAD	1620177	이 유형의 PVDF 멤브레인은 우수한 내화학성과 높은 단백질 결합 능력을 가지고 있습니다
ROS 분석 키트	Beyotime	S0033S	이 키트는 세포
내 활성 산소 종의 수준을 정확하게 감지할 수 있습니다.TAT-conjugater H3K16 Crotonylation 억제 펩타이드	Nanjing Taopu Biotechnology Co. Ltd	CN218107533U	그것은 K16 에서 크로토닐화되는 내인성 H3와 특별히 경쟁할 수 있습니다;
TBST	Biosharp	BL602A	TBST는 멤브레인에서 관련 없는 물질을 청소하고 실험 오류를 줄이며 실험 결과의 정확성을 보장할 수 있습니다.
초음파 크러셔	LICHEN	LC-AUD-150P	장치의 주요 기능에는 세포 단편화, 입자 분산 및 유화가 포함됩니다
Varioskan LUX	Thermo Fisher	VL0000D0	Microplate 리더는 마이크로플레이트에서 샘플의 광학 신호(예: 흡광도, 형광 또는 발광)를 감지하여 생물학적 샘플의 고처리량 정량 분석을 달성할 수 있습니다.