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방법 논문

심부전 환자의 혈장 및 대변 대사산물과 관련된 신장 동맥 기능 및 조직병리학

546 조회수

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DOI:

10.3791/68583

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2025년 9월 9일

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1Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 2Institute of Cardiovascular Sciences, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center; State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University, 3Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 4Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, Haihe Laboratory of Cell Ecosystem, 5Department of Cardiology, State Key Laboratory of Complex Severe and Rare Diseases, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, 6Department of Urology, Peking University First Hospital; Institute of Urology, Peking University; Beijing Key Laboratory of Urogenital Diseases (Male) Molecular Diagnosis and Treatment Center, National Urological Cancer Center, 7Institute of Cardiovascular Diseases, First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, 8Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 심신증후군에서 심장 대사산물 유발 신장 혈관 기능 장애를 밝히기 위한 다중 모드 플랫폼을 개발하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

장내 미생물군과 관련 숙주-미생물 공동 대사 산물은 특히 심신 증후군의 맥락에서 전신 대사 균형 및 심신 축의 주요 조절자로 점점 더 인식되고 있습니다. 임상적 증거는 심장 기능 장애가 신장 병리학적 변화를 시작하거나 악화시킬 수 있음을 나타내지만, 심신축을 매개하는 주요 대사 신호 분자와 그 기본 메커니즘은 여전히 파악하기 어렵습니다. 이 연구는 심장 대사 시그니처와 신장 혈관 기능 분석을 통합하는 새로운 체계적 연구 플랫폼을 구축합니다. (2) 생체 외 신장 혈관 분리 및 1차 배양 기술; (3) 혈관 기능 분석, 신혈관 손상 마커에 대한 분자 생화학적 검사 및 조직병리학적 분석을 통합한 심신장 대사 상호 작용에 대한 다중 모드 평가 프레임워크. 건강한 대조군과 비교하여 심부전 환자의 대사산물은 신혈관 기능을 손상시키고 염증 반응을 유발하여 심신증후군의 기능적 바이오마커로서의 잠재력을 강조했습니다. 이 연구는 특정 대사 산물에 초점을 맞추지 않습니다. 따라서 병원성 효과를 발휘하는 특정 유형의 대사산물에 대한 추가 식별 및 검증은 LC-MS/MS 및 NMR과 같은 분석 기술을 사용한 향후 연구에서 필요할 것입니다. 이 플랫폼을 적용하면 심장 질환 관련 대사산물이 신장 혈관 기능과 항상성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 발견은 심신장 상호 작용의 대사 동인에 대한 기계론적 통찰력을 제공하고 새로운 바이오마커 및 치료 표적을 식별하기 위한 번역 도구를 제공합니다.

서론

심신증후군(CRS)은 심장과 신장 사이의 양방향 손상을 특징으로 하는 복잡한 병리학적 상태입니다. 이 두 기관 사이의 복잡한 상호 의존성은 1836년 진행성 신장 질환과 관련된 심장의 중요한 구조적 변화를 체계적으로 문서화한 로버트 브라이트(Robert Bright)에 의해 처음 기술되었습니다1. CRS의 유병률은 심혈관 질환(CVD)과 만성 신장 질환(CKD)의 공존과 밀접한 관련이 있습니다. 연구에 따르면 심부전 환자의 약 30%가 CKD를 앓고 있는 반면, CKD 환자 사망의 44%-51%는 심혈관 사건에 직접적으로 기인합니다2.

CRS 관리에는 몇 가지 중요한 과제가 있습니다. 첫째, 임상 치료는 학제간 조정 및 조기 경고 메커니즘이 부족하여 파편화된 상태로 남아 있어 보상부전3단계 동안 개입이 지연되는 경우가 많습니다. 둘째, 현재의 치료 전략은 역설적인 딜레마에 직면해 있습니다. 이뇨제 및 레닌-안지오텐신-알도스테론 시스템(RAAS) 억제제와 같은 기존 요법은 심부전 증상을 완화할 수 있습니다4; 그러나 장기간 또는 고용량 사용은 RAAS 및 교감신경계(SNS)를 활성화하여 신장 저산소증 및 섬유증을 악화시켜 궁극적으로 이뇨제 저항성을 유발하고 신장 기능을 악화시킬 수 있습니다5. 유사하게, 안지오텐신 전환 효소 억제제(ACEI) 및 안지오텐신 수용체 차단제(ARB)는 심신 손상을 완화할 수 있지만 혈청 크레아티닌 상승 또는 고칼륨혈증에 대한 우려로 인해 임상 사용이 제한되는 경우가 많으며 환자의 30%-40%만이 장기 치료를 견딜 수 있습니다6.

이러한 과제를 감안할 때 효과적인 초기 바이오마커를 식별하고 CRS 병인에 대한 더 깊은 이해를 달성하여 새로운 치료 표적의 발견을 촉진하는 것이 시급합니다. 그러나 심신 누화의 실행 가능한 매개체, 특히 심장 기능 장애를 신혈관 손상과 직접 연결하는 질병 특이적 대사 산물을 식별하는 데 있어 현재의 한계는 이러한 충족되지 않은 임상 요구 사항을 해결하는 데 있어 진전을 방해합니다. 새로운 증거는 심장 질환 관련 대사산물이 신장 혈관 항상성을 재프로그래밍함으로써 CRS의 진단 바이오마커 및 기계론적 동인 역할을 할 수 있음을 시사하지만, 신장 손상을 시작하거나 증폭시키는 시공간적 역할은 여전히 제대로 특성화되지 않았습니다 7,8,9. 최근 연구에서는 세라마이드와 같은 내인성 대사산물이 특히 심신 상태에서 혈관 염증 및 리모델링을 적극적으로 악화시킬 수 있음을 입증했으며, 이는 혈관 병리학에서 대사산물 감지의 광범위한 관련성을 강조합니다10.

CRS의 영향을 받는 신장 구획 중에서 맥관 구조는 점점 더 주요 및 초기 손상 대상으로 인식되고 있습니다. 산화질소 생체이용률 장애, 산화 스트레스, 전염증성 및 전성 전혈전 매개체의 발현 증가로 특징지어지는 신장 미세순환의 내피 기능 장애는 미세혈관 희박화, 혈관 투과성 증가 및 국소 저산소증에 기여합니다11. 동시에 동맥 긴장도와 순응도를 조절하는 데 필수적인 혈관 평활근 세포(VSMC)도 CRS에서 대사 조절 장애에 취약합니다. 축적된 증거는 질병 관련 대사산물이 VSMC 수축성을 방해하고 부적응 리모델링을 촉진하며 혈관 경직 증가 및 신장 관류 장애에 기여할 수 있음을 나타냅니다. 근본적인 역할에도 불구하고 혈관 기능 장애의 평활근 기반 메커니즘은 현재 CRS 모델 8,12에서 충분히 탐구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 이러한 병태생리학적 변화는 신장 손상을 악화시킬 뿐만 아니라 부적응 신경호르몬 활성화 및 전신 혈역학적 장애를 촉진하여 심장 기능을 더욱 손상시키고 CRS 진행을 영속시킵니다13. 따라서 신혈관 손상을 표적으로 삼는 것은 CRS의 초기 병인에 대한 기계적으로 유익한 창을 제공하고 심장-신장 대사 상호 작용을 조사하기 위한 합리적인 초점을 제공합니다.

이러한 격차를 해소하기 위해 본 연구는 CRS 진행의 중앙 조절자로서 심부전 관련 대사산물의 체계적인 식별 및 기능적 검증을 우선시합니다. 이 연구는 이러한 대사산물이 어떻게 신장 혈관 기능 장애를 유도하고, 염증 캐스케이드를 활성화하고, 조직 복구 메커니즘을 손상시키는지 설명함으로써 관찰 바이오마커 발견과 기계론적 병인 연구 사이의 중요한 단절을 해소합니다. 동물 모델, 시험관 내 세포 배양 및 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 오가노이드를 포함하여 CRS를 연구하는 데 사용되는 전통적인 모델에는 각각 한계가 있습니다14. 동물 모델은 임상적 관련성을 제한하는 종간 차이로 인해 어려움을 겪습니다. 시험관 내 배양은 장기 수준의 통합이 부족한 반면, iPSC 유래 오가노이드는 심근세포-세뇨관 상피 세포 상호작용을 모델링할 수 있지만 기능적으로 미성숙한 상태로 남아 있으며 초기 발달 단계로 제한됩니다15. 또한, 현재의 혈관 오가노이드 시스템은 주로 내피 단층 또는 원시 미세혈관으로 구성되며, 대사 손상에 대한 혈관 수준 반응을 평가하는 데 필요한 수축성 평활근층 및 기능적 판독값이 부족합니다16.

대조적으로, 당사의 플랫폼은 인간 유래 심장 대사산물과 생체 외 인간 신장 맥관 구조를 사용하여 생리학적으로 관련성이 있고 구조적으로 온전한 생 체 외 인간 신장 동맥을 허용하여 혈관 인터페이스에서 심장 신장 대사 상호 작용에 대한 생리학적으로 관련성이 있고 기계적으로 유익한 분석을 가능하게 합니다. 이는 심신증후군 진행의 기초가 되는 장기 간 대사 통신을 모델링하는 데 고유한 이점을 제공합니다. 당사의 선구적인 통합 심신장 연구 플랫폼은 심부전 유래 혈장/분변 대사산물의 대사체 프로파일링, 생체 외 신혈관 분리/배양 시스템, 다중 모드 기능-분자-조직병리학적 평가라는 세 가지 핵심 혁신을 시너지 효과를 발휘합니다. 이 플랫폼의 각 구성 요소는 샘플당 200μL의 혈장 또는 0.1g의 대변 물질 사용, 최대 24시간 동안 5% CO2 와 함께 37°C에서 2mm 인간 신장 동맥 분절의 배양, 혈관 손상 마커의 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR) 기반 검출을 포함하여 재현성 및 번역 관련성을 위해 최적화되었습니다. 이 시스템은 대사산물 시그니처의 진단 가능성을 해독할 뿐만 아니라 인과적 기여를 CRS 병리학에 직접 연결하여 장기 간 대사 조절 장애의 분자 수준 매핑을 통해 치료 표적 식별을 가능하게 합니다. 기계론적 발견과 임상 번역을 연결함으로써 이 이중 초점 패러다임은 CRS 관리를 반응성 증상 제어에서 사전 예방적 바이오마커 기반 개입으로 전환합니다.

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프로토콜

본 연구에 사용된 실험 프로토콜 및 사례 방법론은 북경대학교 제1병원 비뇨기과(윤리심사코드: 2023yan500-002)와 북경연합의과병원(승인번호 I-23PJ585)의 윤리적 승인을 받았으며, 헬싱키 선언에 명시된 원칙을 엄격히 준수합니다. 본 연구에서는 2019년 7월부터 북경연합의과대학병원(PUMCH)에 입원한 남성 또는 여성 환자를 모집하여 최소 2명의 숙련된 심장 전문의로부터 심부전(HF) 진단을 받았습니다. 총 4명의 HF 환자(HF1-HF4)가 혈장 및 분변 대사산물 추출을 위해 포함되었습니다. 연구에 포함되기 전에 모든 피험자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 실험 장치 및 시약은 재료표에 나와 있습니다.

1. 혈장 및 대변 샘플 처리 - 극성 대사산물 추출

  1. 샘플 수집
    1. 멸균되고 예냉된 수집 튜브에 모든 혈장 및 대변 샘플을 수집하고 수집 후 즉시 액체 질소에서 급속 냉동합니다. 처리될 때까지 샘플을 -80°C에서 보관하십시오.
    2. 대사산물 안정성을 보장하려면 모든 샘플을 한 번의 동결-해동 주기 내에 처리하고 샘플 수집과 추출 사이의 시간 간격이 2주를 초과하지 않도록 하십시오.
      참고: 이러한 조치는 대사산물 분해를 최소화하고 다운스트림 대사체 분석에서 재현성을 보장하기 위해 취해졌습니다.
    3. 프로토콜 단계 1.3 또는 1.4에 따라 각각 대변 및 혈장 샘플에서 대사 산물을 추출합니다.
  2. 연구 인구
    1. 기본 혈압을 측정하고 모든 참가자의 투약 이력을 기록합니다.
    2. 대사 분석에서 교란 요인을 최소화하기 위해 주요 대사 동반 질환(예: 당뇨병, 원발성 고혈압)이 있는 개인을 제외하고 급성 임상 악화 전에 환자 샘플을 수집합니다(보충 표 S1).
    3. 표준 절차를 사용하여 각 피험자에 대한 임상 정보를 얻습니다.
  3. 플라즈마 추출
    1. 원료 혈청을 14,000 × g 에서 10분(4-8°C) 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다.
    2. 냉각된(-80°C) HPLC 등급 메탄올을 첨가하여 80%(v/v) 메탄올 농도를 달성합니다. 반전으로 부드럽게 혼합하고 -80°C에서 6-8시간 동안 배양합니다.
    3. 14,000 × g 에서 10분(4-8°C) 동안 원심분리합니다. 대사체 프로파일링을 위해 메탄올 상청액을 새 튜브로 옮깁니다.
      참고: 수집 후 혈장 샘플을 -80°C 냉동고에 2시간 이내에 넣고 동결-해동 주기를 최소화하여 대사산물 안정성을 보장합니다.
  4. 대변 추출
    1. 500μL의 HPLC 등급 메탄올(-80°C로 예냉)을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 신선 또는 냉동 대변 샘플에 첨가합니다. 드라이아이스에서 마이크로 유봉/조직 균질화기를 사용하여 1-2분 동안 균질화한 후 소용돌이(4-8°C에서 1분) -80°C에서 4시간 동안 배양합니다.
    2. 냉장 원심분리기를 사용하여 14,000 × g 에서 10분(4-8°C) 동안 원심분리합니다. 상청액을 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 단계 1.4.4까지 -80°C에서 보관합니다.
    3. 400μL의 사전 냉각된(-80°C) HPLC 등급 메탄올로 펠릿을 재현탁합니다. 철저하게 소용돌이치고(4-8°C에서 1분) -80°C에서 30분 동안 배양합니다.
    4. 원심분리를 반복합니다(14,000 × g, 10분, 4-8°C). 두 추출 단계의 상청액을 결합합니다.
    5. 최종 정화 원심분리(14,000× g, 10분, 4-8°C)를 수행합니다. 다운스트림 분석을 위해 정제된 상청액을 멸균 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
      참고: 대변 샘플은 수집 후 2시간 이내에 -80°C 냉동고에 넣고 동결-해동 주기를 최소화하여 대사 산물 안정성을 보장합니다.

2. 신장 동맥 격리

  1. 참가자 선택 및 조직 수집
    1. 신세포암에 대해 근치적 신절제술을 받는 환자를 선별합니다. 대사 동반 질환(예: 원발성 고혈압, 당뇨병)이 없는 18세 ≥의 사람만 포함합니다. 수술 중 종양 가장자리에서 최소 3cm 떨어진 조직학적으로 정상적인 신장 실질을 수집합니다.
    2. 수확한 검체를 산소화 Krebs-Henseleit 완충액(4°C, pH 7.4; mM 조성: 119.0 NaCl, 4.7 KCl, 2.5 CaCl2, 1.0 MgCl2, 25.0 NaHCO3, 1.2 KH2PO4, 11.0 포도당)에 즉시 담그십시오. 수술 후 6시간 이내에 격리 절차를 완료하십시오.
  2. 신장 조직 준비
    1. 4°C Krebs 완충액에서 관상 절편을 수행하여 온전한 폐문 구조를 포함하는 반골 표본을 얻습니다. 입체 현미경 시스템(40배 배율)을 사용하여 미세 해부를 수행하여 신장 아치형 동맥 가지를 노출시키고 아치형 동맥을 식별합니다.
  3. 미세혈관 해부
    1. 미세 각막 가위를 사용하여 혈관 주위 외막 조직을 순차적으로 제거하여 동맥 분절을 정밀하게 분리합니다.
    2. 직경이 약 500μm인 동맥 분절을 보존합니다.
    3. 마이크로 겸자를 사용한 장력 없는 조작을 통해 내피 전단 응력을 최소화합니다. 생리적 pH 및 이온 항상성을 보존하기 위해 15분마다 갱신된 Krebs 완충액으로 저체온 조건(4°C)에서 해부를 수행합니다.
      참고: 동맥 치수 및 완충액 구성의 명시적 정량화, 조달(4°C)에서 처리(4°C)까지 열적으로 조절된 워크플로우, 검체 수집 후 6시간 이내에 완전한 미세혈관 해부는 최적의 조직 생존력과 기능적 무결성을 보장합니다.

3. 심장 손상 대사산물을 사용한 신장 동맥 배양

  1. 혈관 조직 준비: 무균 상태에서 미세외과적으로 신장 동맥을 해부하고 미세한 안과 겸자를 사용하여 부착된 혈관 주위 결합 조직을 꼼꼼하게 제거합니다. 후속 기관형 배양을 위해 멸균 미세가위를 사용하여 분리된 신장 동맥을 2mm 세그먼트로 절편합니다.
  2. 항생제 오염 제거: 미생물 오염을 최소화하고 대사 산물 노출 전에 무균성을 보장하기 위해 삼중 항생제/항진균제 칵테일이 보충된 인산염 완충 식염수(PBS)로 혈관 분절을 3 x 5분 동안 세척합니다.
  3. 실험 그룹화: 혈관 세그먼트를 4개의 실험 코호트에 무작위로 할당하고 웰당 500μL의 Dulbecco's Modified Eagle 배지를 포함하는 24웰 배양 플레이트로 옮깁니다.
  4. 대사산물 개입
    1. 다음 그룹의 대사산물을 추가합니다: 1) 건강한 대조군 혈장 유래 대사산물(HC-P); 2) 심부전 환자의 혈장 유래 대사산물(HF-P); 3) 건강한 대조군 대변 유래 대사산물(HC-F); 4) 심부전 환자의 대변 유래 대사산물(HF-F).
    2. 대사산물 추출물을 메탄올(HPLC 등급)으로 재구성하고 각 추출물 10μL를 500μL의 Dulbecco's Modified Eagle 배지 및 신장 동맥 분절(최종 용매 농도 2%(v/v))이 포함된 24웰 배양 플레이트의 해당 웰에 투여합니다. 등가량 비히클(메탄올/PBS 혼합물)을 대조군 웰에 추가합니다.
  5. 배양 조건: 가습 인큐베이터를 사용하여 표준 세포 배양 조건(37°C, 5% CO2, 95% 습도)에서 플레이트 어셈블리를 24시간 동안 배양합니다.

4. 신장 동맥 고리 분석

  1. 신장 동맥 고리 현탁 및 고정
    1. 와이어 준비: 광학 현미경 검사에서 동맥 내강을 통해 두 개의 평행한 2cm 스테인리스 스틸 와이어(크렙스에서 사전 평형, 95% O2/5% CO2)를 끼워 양쪽 끝에서 동일한 와이어 돌출을 보장합니다.
    2. 근층 그래프 장착: 난방 시스템과 가스를 켜서 생리적 온도와 산소 공급을 유지합니다. 온도 조절 와이어 근 그래프 수조(Krebs, 95% O2/5% CO2)에 와이어를 수평으로 고정합니다. 자연스러운 혈관 이완을 유지하기 위해 나사 손잡이를 조정하십시오.
  2. 혈관별 정규화를 통한 최적의 초기 장력 결정
    참고: 휴식 긴장은 기준선 조건을 표준화하고 혈관 반응성을 최적화하며 재현성을 보장하기 위해 정규화 절차를 사용하여 조정되었습니다. 정규화를 진행하기 전에 30분 동안 평형을 유지합니다.
    1. 다음 매개변수를 사용하여 DMT 메뉴에서 정규화 설정을 선택합니다: 접안렌즈 보정: 1mm/div; 목표 압력: 13.3kPa; IC1/IC100 비율: 0.9C; 온라인 평균: 3초; 지연 시간: 60초.
      참고: 추가 배경 및 시스템 구성 세부 정보는 참조된 문서17에 나와 있습니다.
    2. 선박을 정규화하려면 관심 있는 채널 을 선택하고 정규화 화면을 데이터로 채웁니다. 마이크로미터 판독값과 40μm의 와이어 직경을 기반으로 조직 종점을 설정합니다.
    3. 패시브 스트레칭을 적용하고 3분 동안 기다립니다. 칼륨 매개 수축을 유도하기 위해 60K+ 를 투여하고 수축이 정체기에 도달할 때까지 기다립니다. 제제를 Krebs 용액으로 3 x 5분 헹구어 60K+를 씻어냅니다. 트레이스에 기록된 칼륨 유도 힘에서 각 스트레치 레벨의 수동 힘을 빼서 활력을 계산합니다.
    4. 최대 활동력에 도달할 때까지 4.2.3단계를 반복합니다. 최적의 휴식 긴장을 각 동맥에서 최대 활성 장력을 산출하는 수준으로 정의하고 높은 K+ 에 대한 피크 반응을 기준 수축으로 사용합니다.
    5. 추가 실험 전에 10분 동안 동맥 고리를 평형을 유지합니다.
      참고: 혈관 등급, 두께 및 기원의 상당한 개인 간 가변성으로 인해 재현성을 보장하기 위해 각 혈관을 개별적으로 정규화하십시오. 와이어 근 그래프 시스템의 정규화 모듈을 사용하여 각 혈관의 수동 직경과 기계적 특성을 기반으로 적절한 기준선 장력을 결정합니다. 기능 테스트 전에 모든 샘플에 절차를 일관되게 적용하십시오.
  3. 신장 동맥 링의 반응성 검출
    1. 다양한 대사산물이 혈관 수축성에 미치는 영향을 조사하기 위해 건강한 지원자와 HF 환자로부터 추출한 혈장 및 대변 대사산물과 함께 12시간 동안 배양된 신장 동맥을 사용하여 혈관 수축 기능 검사를 수행합니다. 자세한 내용은 섹션 3을 참조하십시오.
    2. 60K+ 를 사용하여 칼륨 매개 수축을 유도합니다. 각 챔버에 5mL 크렙스 용액이 있는지 확인하십시오.
    3. 동맥 고리에서 페닐에프린(Phe) 유도 농도 의존적 수축을 결정하려면 10-9에서 10-4M 까지 반로그 증분으로 Phe를 추가합니다. 가장 낮은 Phe 농도로 시작하여 챔버에 도입하고 꾸준한 수축을 기다립니다.
    4. 꾸준한 수축에 도달하는 지점을 표시한 다음(즉, 고원에서 장력 값을 기록) 다음 농도로 넘어갑니다. 최종 농도가 성공적으로 추가될 때까지 반복합니다.
    5. 실험이 끝나면 데이터 파일을 저장하고 동맥 고리를 제거합니다. 8% 아세트산 용액으로 챔버를 잘 세척한 다음 3분 동안 배양합니다.
    6. 가스를 끄기 전에 난방 시스템과 가스를 끄고 모든 액체가 제거되었는지 확인하십시오.

5. 신동맥의 조직병리학적 검사: 헤마목실린-에오신 염색

알림: 유해 시약 및 생물학적 폐기물은 기관의 생물 안전 및 화학 위생 프로토콜에 따라 폐기하십시오. 특히, 자일렌과 파라포름알데히드는 라벨이 부착된 밀봉 가능한 화학 폐기물 용기에 수집하고 인증된 유해 폐기물 처리자가 폐기하기 전에 지정된 흄 후드 구역에 보관해야 합니다. 근 검사 챔버 청소에 사용되는 아세트산은 표준 산성 폐기물 처리 절차에 따라 중화 및 폐기해야 합니다. 이러한 시약을 실험실 싱크대에 배출하지 마십시오.

  1. 차가운 PBS로 동맥을 세척하고 밤새 4% 파라포름알데히드(pH 7.4)에 고정합니다. 4μm에서 연속 절편을 절단하고 조직학을 처리합니다.
  2. 유리 슬라이드에 장착된 조직 절편을 슬라이드 건조기에서 60°C에서 1시간 동안 배양한 다음 즉시 자일렌으로 옮깁니다. 절편을 자일렌에 담그십시오(3 x 5분).
  3. 절편에 등급별 에탄올 수화: 100% 에탄올(2 x 5분), 95% 에탄올(1 x 5분), 90% 에탄올(1 x 5분), 80% 에탄올(1 x 5분), 70% 에탄올(1 x 5분), 초순수로 헹굽니다(1 x 5분).
  4. 헤마톡실린(0.5% w/v)으로 5분 동안 염색합니다. 그런 다음 흐르는 물에 헹굽니다.
  5. 1% 산성 알코올(HCl-에탄올)으로 5-10초 동안 구별하고 흐르는 물에 헹굽니다.
  6. 0.6% 암모니아 물로 섹션을 파란색으로 바르고 흐르는 물에 헹굽니다.
  7. 절편을 에오신 용액(1% w/v)에 2분 동안 담급니다.
  8. 95% 에탄올(2 x 5분), 100% 에탄올(2 x 5분) 및 자일렌(2 x 5분)에서 절편을 탈수하고 제거합니다.
  9. 광학적 투명성이 달성될 때까지 잠시 자연 건조한 후 마운팅 매체에 장착하고 커버슬립으로 덮고 커버슬립을 중성 마운팅 매체로 밀봉합니다.
  10. 명시야 이미징 및 조직형태학적 평가를 수행합니다.

6. 신장 손상 관련 분자 바이오마커의 검출

  1. 신장 동맥 mRNA 추출
    1. 액체 질소에 동결 보존된 혈관 조직을 RNA 추출 시약 1mL에 첨가하고 완전한 균질화를 위해 예냉된 조직 균질화기로 옮깁니다.
    2. 추출 시약 100μL당 250μL의 클로로포름을 첨가하고 30초 동안 격렬하게 소용돌이치고 25°C에서 10분 동안 배양합니다.
    3. 12,000 × g (10분, 4°C)에서 원심분리하고 수성을 새 튜브로 옮깁니다.
    4. 500μL의 이소프로판올을 수성상에 첨가하고 반전하여 혼합한 다음 25°C에서 20분 동안 배양합니다.
    5. 12,000 × g (10분, 4°C)에서 원심분리하고 상층액을 버립니다.
    6. 펠릿을 75% 에탄올 1mL(2 x 5분)로 세척하고 RNA 펠릿을 자연 건조시킨 다음 DEPC-H2O(0.1% v/v)에 재현탁합니다.
      참고: RNA 순도(OD260/OD280 = 1.9-2.0)를 확인하고 온전한 28S/18S rRNA 밴드를 확인합니다.
  2. cDNA 합성
    1. mRNA 2μg + 올리고(dT) 프라이머 1μL를 혼합하고 DEPC-H2O(0.1% v/v)로 8μL로 조정한 다음 70°C에서 5분 동안 가열한 다음 얼음 위에서 5분 동안 급식시킵니다.
    2. 역전사 마스터 믹스를 2x TS 반응 믹스 10 μL, RT/RI 효소 믹스 1 μL 및 gDNA 제거제 1 μL로 준비합니다. 6.2.1단계의 8μL의 RNA/프라이머 혼합물에 12μL의 마스터 믹스를 첨가하여 총 반응 부피 20μL를 달성합니다.
    3. 6.2.2단계의 혼합물을 가열합니다. 42°C에서 60분 동안 공정을 종료하고 85°C에서 5분 동안 가열하여 공정을 종료합니다.
    4. 80μL의 뉴클레아제가 없는H2O를 첨가하여 역전사 반응 20μL를 희석하여 최종 부피를 100μL(4x 희석)로 만듭니다. 희석된 cDNA를 정량적 PCR의 주형으로 사용합니다.
  3. 정량적 PCR 분석
    1. 2.0 μL의 cDNA 주형, 0.5 μL의 순방향 프라이머(10 μM), 0.5 μL의 역방향 프라이머(10 μM), 10 μL의 SYBR Green 마스터 믹스(2x) 및 7 μL의 ddH2O를 혼합하여 반응을 설정합니다.
    2. 다음 설정을 사용하여 PCR을 수행합니다: 초기 변성: 95°C/3분; 40 사이클: 95 °C/30 초; Tm-5°C/30초; 72°C/30초; 용융 곡선: 65-95°C(+0.5°C/5초).
    3. 2-ΔΔct 방법으로 유전자 발현을 분석합니다. 프라이머 서열은 보충 표 S2에 도시되어 있다.

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결과

코호트는 여성 2명과 남성 2명으로 구성되었으며 연령 범위는 46세에서 73세(평균 연령: 64.0세)였습니다. 기준선 혈압 측정은 수축기 혈압이 109에서 168mmHg 사이이고 이완기 혈압이 68에서 115mmHg 사이인 것으로 나타났습니다. 모든 심부전 환자는 베타 차단제, 스타틴 및 항혈소판제와 같은 일반적인 심장 보호제를 포함하여 레닌-안지오텐신 시스템 억제제 및 이뇨제의 개인차와 함께 약물 이력을 기록했습니다. 대조군의 경우, 의사 상담, 신체 검사 및 실험실 검사로 확인된 바와 같이 심장 질환이나 HF 관련 증상 또는 징후가 없는 4명의 피험자를 모집했습니다.

본 연구는 심부전 환자의 심근 손상에서 유래한 순환 대사산물에 의해 유발된 신장 손상의 기저 기전을 체계적으로 평가하는 것을 목표로 하며, 주로 장 장벽 기능 장애로 인한 혈장 및 장 유래 대사산물에 분포합니다. 이를 위해 형태학적, 분자생물학적, 기능적 평가를 통합한 종합 평가 시스템을 구축했습니다(

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토론

CRS에 대한 최근 연구에서는 대사 재프로그래밍이 신장 혈관 항상성을 조절하는 대사 산물과 함께 주요 병리학적 메커니즘으로 확인되었습니다 7,8,9. VSMC는 CRS에서 혈관 긴장도와 순응도를 조절하는 데 중요한 역할을 하지만, 본 연구는 심장 손상 관련 대사산물이 혈관 평활근 수축성과 구조적 완전성을 손상시킨다는 직접적인 증거를 제공합니다. 구체적으로, 우리의 연구 결과는 만성 심부전(CHF) 환자의 혈장 및 장 유래 대사산물이 신장 동맥 중간층에서 VSMC 증식을 촉진하고 혈관 수축성을 손상시킨다는 것을 보여줍니다. 혈관 평활근 세포의 밀도 증가로 특징지어지는 관찰된 중간층 리모델링은 대사 스트레스로 인한 만성 염증에서 발생할 가능성이 높습니다. 혈관 수축성 평가는 HF 환자의 혈장 및 대변 대사산...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2021YFF0501401, 2018YFA0800501 to Y. Z., 2021YFF0501404 to Y. L.), 중국 국가자연과학재단(82325004 및 92168114 to Y. Z., 82300286 to J. Z., 92168113 to E. D., 82170422 to Y. L.), 세포 생태계 혁신 기금 하이허 연구소(No. HH22KYZX0047 to E. D), 중국 박사후 과학 재단(BX20220023, 2022M720288 to JZ), 베이징 자연 과학 재단(7252157 to JZ). 베이징시 자연과학재단(7232096 to Y.L.), 혈관 항상성 및 리모델링 국가 핵심 실험실의 북경대학교 제3병원 연구 프로젝트(북경대학교; 2024-VHR-SY-07 to Y.Z.). 그림 1은 승인된 라이센스가 있는 Biorender.com 로 작성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM 고포도당깁코고양이 # 06-1055-57-1-ACS
PBS솔라바이오고양이 # P1010
페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B써모 피셔 사이언티픽고양이 # 15240062
페닐에프린MCE고양이#HY-B0769
역전사 시스템프로메가고양이 # A5001
입체 현미경 시스템라이카M80
SYBR 그린 마스터 믹스써모 피셔 사이언티픽고양이 # 4309155
혈관 장력 측정 시스템DMT620미터

참고문헌

  1. Cases and observations illustrative of renal disease, accompanied with the secretion of albuminous urine. Med Chir Rev. 25 (49), 23-35 (1836).
  2. Schefold, J. C., Filippatos, G., Hasenfuss, G., Anker, S. D., von Haehling, S. Heart failure and kidney dysfunction: epidemiology, mechanisms and management. Nat Rev Nephrol. 12 (10), 610-623 (2016).
  3. KDIGO 2020 clinical practice guideline for diabetes management in chronic kidney disease. Kidney Int. 98 (4S), S1-S115 (2020).
  4. Amatruda, J. G., et al. Reninangiotensinaldosterone system activation and diuretic response in ambulatory patients with heart failure. Kidney Med. 4 (6), 100465(2022).
  5. Valente, M. A., et al. Diuretic response in acute heart failure: clinical characteristics and prognostic significance. Eur Heart J. 35 (19), 1284-1293 (2014).
  6. Damman, K., et al. Renal effects and associated outcomes during angiotensinneprilysin inhibition in heart failure. JACC Heart Fail. 6 (6), 489-498 (2018).
  7. Curaj, A., et al. Cardiovascular consequences of uremic metabolites: an overview of the involved signaling pathways. Circ Res. 134 (5), 592-613 (2024).
  8. Wang, J., et al. New insights into the pathophysiological mechanisms underlying cardiorenal syndrome. Aging (Albany NY). 12 (12), 12422-12431 (2020).
  9. Zou, D., Li, Y., Sun, G. Attenuation of circulating trimethylamine Noxide prevents the progression of cardiac and renal dysfunction in a rat model of chronic cardiorenal syndrome. Front Pharmacol. 12, 751380(2021).
  10. Zhang, S., et al. Sensing ceramides by CYSLTR2 and P2RY6 to aggravate atherosclerosis. Nature. 641 (8062), 476-485 (2025).
  11. Zhang, J., Bottiglieri, T., McCullough, P. A. The central role of endothelial dysfunction in cardiorenal syndrome. Cardiorenal Med. 7 (2), 104-117 (2017).
  12. Guo, J., et al. Vasculopathy in the setting of cardiorenal syndrome: roles of proteinbound uremic toxins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 313 (1), H1-H13 (2017).
  13. Khandait, H., Sodhi, S. S., Khandekar, N., Bhattad, V. B. Cardiorenal syndrome in heart failure with preserved ejection fraction: insights into pathophysiology and recent advances. Cardiorenal Med. 15 (1), 41-60 (2025).
  14. Gabbin, B., et al. Toward human models of cardiorenal syndrome in vitro. Front Cardiovasc Med. 9, 889553(2022).
  15. Gabbin, B., et al. Heart and kidney organoids maintain organspecific function in a microfluidic system. Materials Today Bio. 23, 100818(2023).
  16. Wimmer, R. A., et al. Human blood vessel organoids as a model of diabetic vasculopathy. Nature. 565 (7740), 505-510 (2019).
  17. Guo, P., et al. Standardized rat coronary ring preparation and realtime recording of dynamic tension changes along vessel diameter. J Vis Exp. (184), e64121(2022).
  18. Lai, Y., et al. Gut microbiotaderived metabolites: potential targets for cardiorenal syndrome. Pharmacol Res. 214, 107672(2025).
  19. Brunt, V. E., et al. TrimethylamineNoxide promotes agerelated vascular oxidative stress and endothelial dysfunction in mice and healthy humans. Hypertension. 76 (1), 101-112 (2020).
  20. Wang, B., Qiu, J., Lian, J., Yang, X., Zhou, J. Gut metabolite trimethylamineNoxide in atherosclerosis: from mechanism to therapy. Front Cardiovasc Med. 8, 723886(2021).
  21. Seldin, M. M., et al. Trimethylamine Noxide promotes vascular inflammation through signaling of mitogenactivated protein kinase and nuclear factorκB. J Am Heart Assoc. 5 (2), 002767(2016).
  22. Watanabe, H., et al. pCresyl sulfate, a uremic toxin, causes vascular endothelial and smooth muscle cell damages by inducing oxidative stress. Pharmacol Res Perspect. 3 (1), e00092(2015).
  23. Muteliefu, G., et al. Indoxyl sulfate promotes vascular smooth muscle cell senescence with upregulation of p53, p21, and prelamin A through oxidative stress. Am J Physiol Cell Physiol. 303 (2), C126-C134 (2012).
  24. Kotlyarov, S., et al. Immunology of atherosclerosis: problems and prospects of immunotherapy. Vessel Plus. , (2025).

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