방법 논문

포스파티딜이노시톨 인산염 그룹이 독 PLA2의 멤브란트로픽 작용에 미치는 영향을 조사하기 위한 리포솜 막 투과성 분석

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DOI:

10.3791/68594

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2025년 9월 26일

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1Advanced STEM Research Center, Beijing Chaoyang KaiWen Academy, 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, 3Department of Pharmacology, University of Nevada Reno, 4Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, M. V. Lomonosov Moscow State University

이 논문에서

요약

우리는 기존 기술보다 우수한 감도와 분해능으로 리포솜 막 투과성을 평가하는 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 새로운 캡슐화된 리간드 치환 반응을 사용하여 이 기술은 모델 막에서 포스포리파제 A2 유도 변화를 검출합니다. 표준 분석과 쉽게 통합되는 이 접근 가능한 접근 방식은 막 생물물리학 및 독소 상호 작용 연구를 위한 해상도를 향상시킵니다.

초록

우리는 리포좀의 내부 부피에 캡슐화된 리간드를 포함하는 리간드 치환 반응을 기반으로 리포솜 막 투과성을 평가하기 위한 새롭고 비용 효율적이며 매우 민감한 분석을 개발했으며, 이를 가수분해 활성 분석(코엔자임 A 아실화 사용) 및 분자 모델링 시뮬레이션과 결합하여 포스파티딜이노시톨의 이노시톨 고리의 인산염이 비정상적으로 발현된 효소의 손상 효과로부터 막을 보호하는지 여부를 조사했습니다. 포스포리파제 A2 (PLA2)의 비정상적인 발현은 다발성 경화증 및 알츠하이머병의 발병을 유발하는 축삭의 탈수초화로 이어집니다. 비정상적으로 발현된 PLA₂의 효과를 모방하기 위해 독사 독 PLA₂의 기본 서브유닛인 HDP-2P를 사용했습니다. HDP-2P는 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜이노시톨-4-인산염(PI-4-P) 또는 포스파티딜이노시톨-4,5-이인산염(PI-4,5-P2)이 풍부한 포스파티딜콜린(PC) 리포좀에서 테스트되었습니다. HDP-2P는 PC 리포좀에서 최소한의 가수분해 활성과 약간의 투과성 증가만 나타낸 반면, PI로 PC 리포좀을 농축하면 가수분해와 투과성이 모두 향상되었습니다. 놀랍게도 PI-4-P 및 PI-4,5-P₂는 HDP-2P의 가수분해 활성을 극적으로 억제하고 투과성을 완전히 감소시켰습니다. 분자 모델링 시뮬레이션에 따르면 포스파티딜이노시톨에 있는 이노시톨 고리의 인산염은 HDP-2P의 활성 부위에 대한 인지질 접근을 입체적으로 차단하여 가수분해를 방지하는 것으로 나타났습니다. 시험관 내 및 인실리코 데이터 모두 인산화된 포스파티딜이노시톨이 PLA₂ 활성 감소와 관련이 있음을 시사하며, 이는 아마도 세포막을 변성으로부터 보호하는 수단으로 과도한 PLA2 활성을 완화하는 잠재적인 메커니즘을 나타냅니다.

서론

포스파티딜이노시톨(PI)은 인산염기를 통해 헥사하이드록시 6탄소 고리인 이노시톨에 연결된 포스파티드산 백본으로 구성된 음이온성 인지질입니다. 이노시톨은 2, 3, 4, 5 및 6 탄소 위치에서 인산화에 의해 포스포이노시티드로 가역적으로 전환될 수있다1. PI와 포스포이노시티드는 동물, 식물 및 미생물 전반에 걸쳐 다양한 세포의 원형질막과 소기관에서 발견됩니다. Mable과 Lowell Hokin 2,3,4가 발견한 지 70년이 지난 지금도 PI와 포스포이노시티드는 분자 메커니즘과 인간 건강과의 관련성을 이해하기 위한 광범위한 연구의 대상으로 남아 있습니다 5,6,7.

뇌 조직 외에도 포스포이노시티드는 일반적으로 낮은 농도로 존재하며 원형질막 내부 전단지에서 총 지질의 약 0.5-1%를 차지합니다. 발표된 데이터는 PI가 생리학적 조건에서 주요 구조적 역할을 할 가능성이 낮음을 나타냅니다1. 그러나 질병 상태에서는 PI 및 인지질의 수치가 증가하고 원형질막의 외부 전단지로 플립플롭되어 이러한 인지질이 질병 저항성과 관련이 있을 수 있음을 나타냅니다1. PI가 포스포이노시타이드에 비해 덜 중요한 생리학적 역할을 한다고 오랫동안 생각되어 왔지만, 새로운 증거는 다양한 생리학적 과정에서 PI-4-P 및 PI-4,5-P2의 중요성을 강조합니다1. 이러한 과정에는 세포내 신호 전달, 세포간 신호 전달 8,9,10, 막 수송 11,12,13, 유전자 발현 조절 1, 세포 증식 14 및 생존1이 포함됩니다. 그럼에도 불구하고 PI와 포스포이노시티드가 이러한 과정을 구동하는 분자 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다.

PI 및 포스포이노시티드는 뇌 조직 세포에 풍부하며, 전체 인지질의 약 10%를 구성하지만, 이들의 수준은 뇌 질환의 초기 단계에서 일시적으로 증가할 수 있으며, 이는 포스포이노시티드가 비정상적인 PLA2s 활동으로 인한 축삭 탈수초화에 의해 유발되는 다발성 경화증 및 알츠하이머병과 같은 신경학적 병리1의 발달을 상쇄할 수 있음을 시사합니다15, 16,17. 이들 효소는 그룹 IIA 분비성 포스포리파제 A2(sPLA2)15를 포함한 다양한 클래스 및 그룹에 속합니다. 이 그룹의 효소 수치가 높아지는 것은 다발성 경화증 및 알츠하이머병 환자의 뇌척수액에서 발견되며, 여기서 미엘린 막의 파괴에 기여하여 탈수초화를 유발합니다15. 또한 뱀 독의 sPLA2s는 신경근 시냅스18,19에서 전달을 억제하여 중추신경계 장애를 유발하고 말초 신경근계에 악영향을 미치는 것으로 보고되었습니다20.

본 연구에서는 PI와 포스포이노시티드가 비정상적으로 발현된 sPLA2 효소의 영향으로부터 모델 인지질막을 보호할 수 있는지 여부를 조사하였다. 모델 막은 모든 포유류 세포막에서 가장 풍부한 인지질인 포스파티딜콜린(PC)로 만들어졌으며21, PI, PI-4-P 또는 PI-4,5-P2의 몰비 20%로 농축되었다. 모델 막에 대해 비정상적으로 발현된 sPLA2 효소의 효과를 모방하기 위해 우리는 이전에 모델 미엘린 막에서 가수분해 활성이 연구된 그룹 IIA 분비성 독사 독 신경독성 PLA2 효소22의 기본 서브유닛 HDP-2P를 사용했습니다23.

이 작업을 위해 우리는 HDP-2P의 영향을 받는 리포솜 막의 투과성 변화를 조사하기 위한 새로운 접근 방식을 개발했습니다. 새로운 방법은 리포좀 내부에 갇힌 NH3 리간드를 포함하는 리포좀 외부의 CuSO4 용액에서 리간드 치환 반응을 기반으로 합니다. HDP-2P 유도 막 투과성이 리포좀에서 NH3 누출을 허용하는 경우, 방출된 암모니아는 반응을 통해 수화 구리 이온의 4개의 물 분자를 정량적으로 대체합니다: [Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) [ figure-introduction-1 Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (aq) + 4H2O(엘). 이 리간드 교환은 분광 광도법(λ = 600nm)으로 측정 가능한 용액 광학 밀도의 특징적인 증가를 생성하여 막 투과성 변화에 대한 정량적 판독 역할을 합니다. 당사의 리간드 치환 기반 접근 방식은 1H-NMR 23,24,25,26,27,28 및 이온 수송 분석(29)과 같은 기존 기술에 비해 막 투과성 평가에 탁월한 감도를 보여주는 동시에 값비싼 기기가 필요하지 않다는 추가적인 이점을 제공합니다. HDP-2P 가수분해 활성 측정 및 HDP-2P의 분자 표면에 결합하는 PI, PI-4-P 및 PI-4,5-P2의 인실리코 시뮬레이션과 함께 적용된 이 간단하고 비용 효율적인 방법은 PI에서 이노시톨 고리의 인산염이 PI-4-P 또는 PI-4가 풍부한 PC 막에 대한 HDP-2P의 파괴 효과를 제거한다는 결론을 내릴 수 있었습니다. 5-P2. 이 발견이 추가 연구에서 확인된다면, 비정상적으로 작용하는 세포 단백질의 유해한 영향으로부터 보호하는 PI의 이노시톨 고리 인산염의 능력은 비정상적인 단백질 활성과 관련된 질병 상태에서 막 안정성에 잠재적으로 기여하며, 알츠하이머병 및 다발성 경화증과 같은 신경 장애 치료를 위한 새로운 의약품 개발의 길을 열어줄 수 있습니다.

프로토콜

1. 분자 모델링 소프트웨어를 사용한 HDP-2P PI 및 포스포이노시티드와의 상호 작용의 인실리코 시뮬레이션

  1. 소프트웨어 설치 및 준비
    1. 보충 파일 1-보충 그림 S1A와 같이 리간드 분자를 구성하기 위해 참조된 화학 도면 편집기를 설치합니다.
    2. 리간드와 수용체의 분자 도킹을 위한 분자 모델링 소프트웨어를 설치합니다.
    3. 리간드 및 수용체 준비를 위한 자동 도킹 도구를 설치합니다.
    4. 분자 모델링 시뮬레이션 소프트웨어는 Python 환경에 따라 달라지므로 Python을 설치하십시오.
  2. 리간드 준비
    1. 먼저 화학 도면 편집기를 사용하여 PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, 카디오리핀 및 포스파티딜세린의 분자 구조에 대한 원자 좌표를 작성합니다.
      참고: 리간드 준비의 다음 단계에 있는 예제 프로토콜은 PI에 대한 단계만을 설명합니다.
    2. 보충 파일 1-보충 그림 S1B에 표시된 대로 화학 도면 편집기를 사용하여 PI의 분자 구조를 구축하고 보충 파일 1-보충 그림 S2와 같이 파일을 PDB 형식으로 저장합니다.
    3. PDB 파일을 엽니다 자동 도킹 도구 소프트웨어에서 보 충 파일 1-보충 그림 S3A와 같이 .
    4. 보충 파일 1-보충 그림 S3B에 도시된 대로 수소 원자를 추가하고, 보충 파일 1-보충 그림 S4A에 도시된 대로 극성 또는 모든 수소 원자를 선택한다.
      참고: HDP-2P와의 PI 도킹을 완료한 후 극성 또는 수소 결합의 시각화를 단순화하기 위해 극성 수소 원자만 선택합니다.
    5. 보충 파일 1-보충 그림 S4B에 표시된 대로 PI 분자를 자동 도킹 도구 소프트웨어의 리간드로 설정합니다.
    6. 보충 파일 1-보충 그림 S5A에 표시된 대로 리간드를 PDBQT 파일로 저장합니다. 모든 본드를 회전 가능하게 만들어야 합니다.
  3. 수용체 준비
    1. 포스포리파제 A2 HDP-2(PDB 코드 2I0U)의 PDB 파일을 다운로드하며, 하나는 산성, 효소 비활성, A, 다른 하나는 염기성, 효소 활성, E로 구성됩니다. 효소적으로 불활성인 단량체 A를 삭제하려면 2I0U 파일을 분자 모델링 소프트웨어(보충 파일 1-보충 그림 S5B)로 가져오고 단량체 A의 모든 원자를 선택하고(보충 파일 1-보충 그림 S6A)를 선택한 다음 단량체 A의 모든 원자를 편집 하고 삭제합니다(보충 파일 1-보충 그림 S6B). 현재 수용체로 지정된 효소 활성 단량체 E를 유지하십시오.
    2. 보충 파일 1-보충 그림 S7과 같이 자동 도킹 도구 소프트웨어에서 HDP-2P 수용체 PDB 파일을 엽니다.
    3. 보충 파일 1-보충 그림 S8A에 표시된 대로 모든 물 분자를 제거합니다.
    4. 보충 파일 1-보충 그림 S8B에 표시된 대로 수소 원자를 추가합니다. PI와의 HDP-2P 도킹이 완료된 후에는 극성 및 수소 결합의 시각화를 단순화하기 위해 극성 수소만 선택해야 합니다.
    5. 보충 파일 1-보충도 S9A와 같이 HDP-2P를 수용체로 설정하고 PDBQT 파일로 저장한다. 수용체가 회전 가능한 결합 없이 설정되었는지 확인하십시오.
  4. 도킹 매개변수 설정
    1. 리간드와 수용체 PDBQT 파일을 모두 엽니다.
    2. 보충 파일 1-보충 그림 S9B와 같이 그리드 박스 설정 인터페이스를 입력하고 그리드 박스 크기(크기 x = 44.644; 크기 y = 74.939; 크기 z = 43.050) 및 중심(중심 x = 25.626; 중심 y = 9.582; 중심 z = 41.825) 좌표를 정의하여 보충 파일 1-보충 그림 S10A와 같이 수용체 분자의 전체 표면을 완전히 둘러싸고 있습니다.
    3. 보충 파일 1-보충 그림 S10B에 표시된 대로 현재 설정으로 그리드 박스 설정 인터페이스를 닫고 보충 파일 1-보충 그림 S11A와 같이 도킹 매개변수를 config.txt 파일에 저장합니다.
  5. 분자 도킹 소프트웨어 실행
    1. 보충 파일 1-보충 그림 S11B에 표시된 대로 config.txt 파일을 사용하여 분자 도킹 소프트웨어를 실행합니다.
    2. 도킹 계산을 실행합니다(~30-90분; 보충 파일 1-보충 그림 S12).
    3. docking_log.txt 파일을 확인하여 도킹 점수(바인딩 선호도)를 검토합니다.
    4. 에너지 형태가 가장 낮은 도킹 결과를 선택합니다.
  6. 도킹 데이터 분석
    1. 자동 도킹 도구 소프트웨어를 사용하여 도킹 결과 PDBQT 파일을 엽니다.
    2. 이온성, 이온-극성, 극성 및 수소 결합 상호 작용을 포함하여 수용체의 활성 중심 및 분자 간 상호 작용에 초점을 맞춰 리간드-수용체 결합 부위를 분석합니다. 수용체의 활성 부위와 상호 작용하는 PI 및 포스포이노시티드에 대한 표를 만들어 kcal/mol 단위의 결합 부위 친화도, PI/포스포이노시티드 극성 헤드의 하전 및 극성 부분, 분자 간 결합에 관여하는 HDP-2P 잔기 및 표 1 및 표 2에 표시된 바와 같이 결합 유형을 설명합니다. 각 수용체-리간드 쌍에 대해 도킹을 3회 반복하여 결합 부위, 결합 친화도, PI/포스포이노시티드 및 HDP-2P 잔기의 전하 및 극성 부분, 결합 유형에 편차가 없는지 확인합니다.

2. 유리 지방산으로 아실화된 코엔자임 A를 사용하여 모니터링한 PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 , PS 또는 CL이 풍부한 PC 리포좀에서 HDP-2P의 가수분해 활성

참고: 클로로포름, 메탄올, NH3 및 CuSO4 는 위험합니다. 항상 니트릴 장갑, 고글 및 실험실 가운을 사용하십시오. 연 후드 아래에서 이러한 시약을 사용하여 모든 프로토콜을 처리하십시오. 클로로포름을 호박색 유리병에 보관하십시오. 메탄올은 산화제에서 멀리 떨어진 가연성 캐비닛에 보관하십시오. 메탄올을 화염과 스파크로부터 멀리 두십시오. 이러한 시약에 대한 모든 폐기물 용기에 라벨을 붙이고 현지 유해 폐기물 처리 규정에 따라 폐기하십시오.

  1. 5.55mg의 CaCl2 를 0.10M Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 용해시켜 HDP-2P 촉매 인지질 가수분해를 위한 완충액 100mL를 준비합니다.
  2. 7.31g의 EDTA를 탈이온화 증류수(ddH2 0)에 녹여 50mL의 1.0 M EDTA 원액을 준비합니다.
  3. 0.10M Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 0.54mM HDP-2P 원액을 준비합니다. HDP-2P의 몰 질량은 13.827kDa입니다.
  4. 클로로포름/메탄올 혼합물(2 내지 1 부피)에서 농도 10.0 M의 인지질의 다음 원액 용액을 제조한다: 달걀 노른자 L-α-포스파티딜콜린 (PC), 소 심장 카디오리핀 (CL), 소 뇌 L-α-포스파티딜-L-세린 (PS), PI, PI-4-P 및 PI-4,5-P2. PC, CL, PS, PI, PI-4-P 및 PI-4,5-P2의 몰 질량은 아래에 자세히 설명된 바와 같이 각각 768 Da, 1,466 Da, 792 Da, 867 Da, 962 Da 및 1,057 Da입니다.
  5. PC 리포좀 샘플 5개를 준비합니다. PC 리포좀 샘플을 준비하려면 75μL의 PC의 클로로포름/메탄올 원액을 유리 시험관에 첨가하고 지질 막이 형성될 때까지 10Pa 진공 하에서 25°C에서 1시간 동안 건조시킵니다. 온도 조절 장치에서 25°C에서 인지질 가수분해를 위한 완충액 15mL로 지질 필름을 1시간 동안 수화시킵니다. 그런 다음 100-150W 초음파 디스펜서의 티타늄 권총을 얼음 욕조에 놓인 유리 시험관의 지질 현탁액에 삽입하고 현탁액을 22kHz 주파수에서 10분 동안 최대 출력의 50%를 초과하지 않도록 초음파 처리합니다. 티타늄 '먼지' 입자를 제거하려면 리포좀을 실온에서 200 × g (10cm 로터의 경우 1,270rpm)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  6. 클로로포름/메탄올인지질 원액-60μL의 PC와 15μL의 CL, PS, PI, PI-4-P 또는 PI-4,5-P 2-유리관에 혼합하여 PC 및 기타 지질 몰비 4:1에서 CL, PS, PI, PI-4-P또는 PI-4,5-P2가 풍부한 PC 리포좀의 샘플을 준비합니다. 그런 다음 지질을 10 Pa 진공 또는 실온에서 3 시간 동안 건조시키고, 인지질 가수분해를 위한 완충 용액에 지질 필름을 수화시키고, 상술한 바와 같이 초음파로 초음파 처리한다.
    참고: 각 유형의 리포좀에 대해 5개의 샘플을 준비합니다.
  7. 상술한 각 유형의 리포좀으로부터 5개의 샘플에서 1.0 mL를 별도의 튜브에 넣고 NEFA 키트의 무색 코엔자임-A 용액 10 μL를 각 튜브에 첨가한 다음 0.00, 0.93, 1.86, 2.79 또는 3.72 μL의 0.54 mM HDP-2P 원액을 별도의 튜브에 첨가하여 리포솜 샘플에서 HDP-2P/인지질 몰비의 0.000을 얻고, 각각 0.001, 0.002, 0.003 및 0.004입니다.
  8. HDP-2P를 리포좀에 첨가한 직후, 온도 조절기에서 37°C에서 15분 동안 리포솜 샘플을 배양한 다음 100μL의 스톡 EDTA 용액을 첨가하여 HDP-2P에 의해 유도된 인지질 가수분해를 중지합니다. 그 후 샘플을 1분 동안 소용돌이치게 합니다.
  9. 분광 광도계를 사용하여 550nm에서 리포솜 샘플의 광학 밀도를 측정하여 HDP-2P의 가수분해 활성을 정량화하며, 이는 무색 조효소-A 용액이 유리 지방산으로 아실화될 때 보라색으로 변하는 정도를 측정합니다.
  10. 위의 절차를 두 번 더 반복하여 평균 광학 밀도 값이 세 번의 독립적인 시도에서 도출되도록 합니다.
    참고: 이 실험 시험에서 얻은 각 데이터 포인트는 광학 밀도의 평균값입니다. 이상적으로는 실험 데이터 포인트의 표준 편차가 평균의 ±5% 이내여야 합니다.

3. 리포좀 내부에 갇힌 NH3 리간드를 포함하는 CuSO4 용액에서 리간드 치환 반응으로 측정한 PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS 또는 CL이 풍부한 PC 리포솜막의 투과성에 대한 HDP-2P의 효과

참고: 클로로포름, 메탄올, NH3 및 CuSO4 는 위험합니다. 항상 니트릴 장갑, 고글 및 실험실 가운을 사용하십시오. 연 후드 아래에서 이러한 시약을 사용하여 모든 프로토콜을 처리하십시오. 클로로포름을 호박색 유리병에 보관하십시오. 메탄올은 산화제에서 멀리 떨어진 가연성 캐비닛에 보관하십시오. 메탄올을 화염이나 스파크로부터 멀리 두십시오. 이러한 시약에 대한 모든 폐기물 용기에 라벨을 붙이고 현지 유해 폐기물 처리 규정에 따라 폐기하십시오.

  1. 클로로포름/메탄올(2 대 1 부피)에서 6가지 인지질(PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2)에 대해 각각에 대해 0.03 M 원액 20mL를 준비합니다. PC, CL, PS, PI, PI-4-P, PI-4,5-P2 의 분자량은 각각 768, 1466, 792, 867, 962 및 1057 Da입니다.
  2. 0.05 M CuSO4의 최종 농도로 100 mL의 0.10 M Tris-HCl(pH 7.4) 완충액을 준비합니다.
  3. 0.05 M CuSO4, 0.10 M Tris-HCl(pH 7.4) 완충액에 1.5 × 10-3 M HDP-2P 스톡 4mL를 준비합니다. HDP-2P의 몰 질량은 13.827kDa입니다.
  4. 0.5M NH3 용액 100mL를 준비하려면 25% NH3 용액(밀도 905g/L30, 13.30M[905g/L × 0.25M ÷ 17.00g/L = 13.30M])을 사용합니다. 따라서, 100mL의 0.5 MNH3를 제조하기 위해, 3.76 mL의 25% NH3 용액을 사용한다: (0.5 M × 1,000 mL ÷ 13.30 M) ÷ 10 = 3.76 mL의 25% NH3 용액. 3.76mL의 25% NH3 용액을 100mL 부피 플라스크에 넣고 0.10M Tris-HCl(pH 7.4) 완충액으로 부피를 100mL로 만듭니다.
  5. 리포좀의 내부 부피에 NH3 가 있는 리포좀을 제조하려면 12.5mL의 0.03M 스톡 인지질 용액을 클로로포름/메탄올에 튜브에 넣고 인지질을 10Pa 진공 또는 실온에서 3시간 동안 건조시킵니다. 온도 조절 장치에서 25°C에서 12.5mL의 0.5MNH3, 0.10M Tris-HCl(pH 7.4)으로 인지질 필름을 1시간 동안 수화시킵니다. 그런 다음 단계 2.5에 설명된 대로 22kHz 주파수에서 지질 현탁액을 초음파 처리하여 초음파 처리된 리포좀을 생성합니다.
    참고: 초음파 처리된 리포좀이 있는 용액에서 NH3 는 리포좀 내부와 외부에 위치합니다.
  6. 리포좀 외부의 NH3 를 제거하려면 자기 교반기를 사용하여 0.10 M Tris-HCl(pH 7.4)에 대해 5 hat 실온에 투석막(분자 차단 1.0kDa)을 사용하여 리포좀을 투석합니다.
    참고: 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 완충액 0.5 mL에 투석된 리포좀을 0.5 mL에 첨가하면 NH3 없이 제조되고 동일한 완충액과 혼합된 리포좀의 광학 밀도와 600 nm에서 동일한 광학 밀도를 산출했기 때문에 5시간 동안의 투석은 NH3를 완전히 제거하기에 충분했습니다.
  7. 투석 후, 2.5단계에 설명된 대로 리포좀을 200× g 에서 90분 동안 원심분리하여 리포좀을 펠릿화한다. 상청액을 버리고 리포좀을 5.0mL의 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4) 완충액으로 재현탁한 다음 재현탁된 리포좀을 각각 1.0 mL의 샘플 5개로 나눕니다. 이 5개의 1.0mL 샘플에 0.10 M Tris-HCl, 0.05 M CuSO4 (pH 7.4) 완충액 60, 40, 20 및 0 μL를 개별적으로 추가한 다음 0, 20, 40, 60, 80 μL의 HDP-2P 스톡 완충액을 추가하여 리포솜 샘플에서 HDP-2P/인지질 몰비를 각각 0.000, 0.001, 0.002, 0.003 및 0.004로 조정합니다.
  8. 리포솜 샘플을 37°C의 온도 조절기에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 리포좀 샘플의 광학 밀도를 측정합니다. 6개의 리포좀 샘플 모두에 대해 섹션 3에 설명된 단계를 따르고 3회 반복하여 각 데이터 포인트에 대한 광학 밀도를 세 번 판독합니다.
    참고: 실험 데이터 포인트의 표준 편차는 항상 평균의 ±5% 이내여야 합니다.

결과

HDP-2P PI 및 포스포이노시티드와의 상호작용의 분자 모델링 시뮬레이션
분자 모델링 프로그램은 리간드(작은 분자)의 표적이 되는 수용체(더 큰 분자)의 분자 표면에서 가장 좋은 9개의 결합 부위를 계산합니다. 이러한 부위는 가장 높은 결합 친화력을 가진 부위를 지정하는 9개의 가장 높은 엔탈피의 방출에 의해 결정됩니다. 결합 친화도는 음수 값으로 표현되며, 이는 분자간 결합이 발열 과정임을 나타냅니다. PI와 상호 작용하는 HDP-2P의 경우, 시뮬레이션은 활성 중심 내 HDP-2P의 분자 표면에서 PI에 대한 4개의 결합 부위(#3, #6, #7 및 #8)를 예측했습니다(표 1). 또한 PI에 대한 5개의 결합 부위는 HDP-2P의 활성 중심 외부에서 발견되었습니다. PI의 극성 헤드에 있는 하전 및 극성 부분의 표기법은 그림 1에 나와 있습니다.

HDP-2P의 활성 센터는 Gly30, Gly32, His48, Asp49 및 Lys69의 5가지 주요 아미노산 잔기로 구성되며, 이는 촉매 가수분해를 보장하기 위해 활성 센터에서 인지질 기질의 적절한 정렬을 촉진합니다. 일부 대표적인 도킹 구조는 활성 중심의 일부 아미노산 잔기에 PI의 결합을 보여주는 반면, 결합 부위 #6에서 PI는 이온, 이온-극성 및 수소 결합을 통해 활성 중심의 5가지 주요 아미노산 잔기 모두와 결합합니다(표 1). 그림 2 는 PI가 결합 부위 #6 내에서 HDP-2P의 활성 중심에 있는 5가지 주요 아미노산 잔기 모두와 상호 작용하는 방법을 보여줍니다.

이노시톨 고리의 위치 4에 인산염기를 포함하는 HDP-2P와 PI-4-P 사이의 상호 작용에 대한 도킹 시뮬레이션은 PI-4-P가 HDP-2P의 활성 중심에 결합하는 위치로 결합 부위 #1만을 예측했습니다. 구체적으로, 이 부위에서 PI-4-P는 이온, 이온-극성 및 수소 결합을 통해 활성 중심의 세 가지 주요 아미노산 잔기(Gly30, Gly32 및 Lys69)와 상호 작용합니다(표 2). 그림 3 은 PI-4-P와 HDP-2P의 활성 중심의 상호 작용을 보여줍니다. HDP-2P의 분자 표면에 있는 나머지 8개의 결합 부위에서 PI-4-P는 활성 중심 외부의 위치에 결합합니다.

HDP-2P와 PI-4,5-P₂(이노시톨 고리의 위치 4 및 5에 인산염 그룹 포함)의 상호작용에 대한 분자 도킹 시뮬레이션은 9개의 예측된 결합 부위 모두에서 효소의 활성 중심에 결합하지 않는 것으로 나타났습니다. 대신, PI-4,5-P₂는 활성 중심에 인접한 홈과 같은 공동에 일관되게 결합하여 3개의 HDP-2P 잔기인 Trp31, Gly33 및 Gln34와 이온-극성 및 수소 결합을 형성합니다.

PI-4,5-P₂가 세포 또는 독 PLA2s의 활성 중심 근처의 홈과 같은 공동에 결합하는 것은 이전에 문서화되지 않았지만, 구조적으로 유사한 특징은 pleckstrin 상동성31(PH) 및 엡신 N-말단 상동성32(ENTH) 도메인에서 잘 확립되어 있습니다. 이러한 신호 전달 도메인은 비효소적 특성에도 불구하고 특정 PI-4,5-P2 인식31,32를 위해 유사한 소수성-극성-양이온성 홈 구조를 활용합니다. HDP-2P에 유사한 구조적 모티프의 존재는 HDP-2P에 의한 막 도메인 인식을 용이하게 하기 위해 진화적 모방 또는 수렴 진화의 흥미로운 가능성을 제기합니다. 다른 방법으로 추가로 검증된다면, 이 연구는 포스포이노시티드 인식을 위해 이러한 메커니즘을 활용하는 독 PLA2의 첫 번째 보고된 사례를 나타낼 수 있습니다.

흥미롭게도, HDP-2P와 상호 작용하는 CL 및 PS의 분자 도킹 시뮬레이션은 9개의 결합 부위 중 8개에서 HDP-2P의 활성 중심에 대한 두 인지질의 결합을 예측한 반면, 활성 중심 외부의 CL 및 PS의 유일한 결합 부위는 홈과 같은 공동에 위치하지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한 PI와 마찬가지로 PC는 9개의 결합 부위 중 4개에서 HDP-2P의 활성 중심에 결합하고, CL 및 PS와 같은 PI와 PC 모두 홈과 같은 공동에 결합하지 않는다는 점도 주목할 가치가 있다(데이터는 표시되지 않음). 이러한 발견은 PI의 이노시톨 고리에 있는 인산염기가 활성 중심에 인접한 홈과 같은 공동에 대해 높은 결합 친화력을 갖는다는 것을 시사합니다. 구조 분석은 세포33 및 독34 PLA2 효소 모두에서 촉매 중심 근처에 소수성-극성-양이온성 표면 패치가 있는 유사한 홈과 같은 공동을 확인했습니다. 이러한 구멍에 대한 포스포이노시티드의 결합은 생리학적으로 중요한 형태 변화를 유도하여 잠재적으로 효소 활성을 억제할 수 있습니다. 특히, 포스포이노시티드 중에서 PI-4,5-P2는 특히 열악한 기질 특성을 나타냅니다.-인간 PLA2 이소형(세포질, 칼슘 비의존성 및 분비 유형)은 PI-4,5-P2 35에 대해 최소한에서 검출할 수 없는 가수분해 활성을 나타냅니다. 이는 이러한 보존된 구조적 특징에 결합하는 포스포이노시티드가 PLA2 슈퍼패밀리 전반에 걸쳐 촉매 기능보다는 뚜렷한 생리학적 기능(예: 알로스테릭 억제)을 수행할 수 있음을 시사하며, 이는 향후 실험적 검증이 필요합니다.

유리 지방산으로 아실화된 코엔자임 A를 사용하여 모니터링된 PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS 또는 CL이 풍부한 PC 리포좀에서 HDP-2P의 가수분해 활성
리포솜 샘플에 대한 HDP-2P의 가수분해 활성은 코엔자임 A 용액을 사용하여 평가되었습니다. 조효소 A 용액은 무색이지만 HDP-2P에 의해 촉매되는 인지질 가수분해 중에 방출되는 유리 지방산에 의해 아실화되면 보라색으로 변합니다. 조효소 A 아실화의 정도에 해당하는 광학 밀도의 결과적 증가는 550nm에서 분광 광도계로 측정되었습니다. 따라서 코엔자임 A와 HDP-2P로 처리된 리포솜 시료의 광학 밀도 증가는 HDP-2P의 가수분해 활성에 정비례합니다.

그림 5는 다양한 리포솜 샘플에서 HDP-2P/인지질 몰 비율의 함수로 가수분해 활성 곡선을 나타냅니다. HDP-2P의 가수분해 활성은 550nm에서 측정된 광학 밀도(OD)의 임의의 단위(a.u.)로 표현됩니다. 실험 시험에서 코엔자임 A와 아실-코엔자임 A 합성효소를 함유한 수용액에 첨가했을 때 550nm에서 감지할 수 있는 OD 변화를 일으키지 않는 것으로 나타났기 때문에 유리 지방산의 몰 농도와 a.u. 값을 연관시키기 위한 보량선을 구성하지 않았습니다. 이는 이러한 지방산이 코엔자임 A에 결합하지 않고 미셀을 형성한다는 것을 나타냅니다. 대조적으로, 막 생성 지방산(PLA2 활성에 의해 생성됨)만이 막 관련 조효소 A에 결합하여 측정 가능한 OD 변화를 초래합니다. 분자 표면에 소수성 및 친수성 영역을 모두 갖는 코엔자임 A의 양친성 특성은 PLA2 활성에 의해 생성된 지방산이 코엔자임 A에 결합하는 것을 촉진하는 막-물 계면에 우선적으로 국한성을 부여합니다. 그러나 이러한 분석 조건에서는 지방산의 몰 농도를 결정하는 것이 불가능합니다. 이러한 이유로 코엔자임 A 분석을 사용하는 연구자들은 PLA2 의 가수분해 활성을 550nm에서 측정된 임의의 OD 단위로 표현합니다20.

HDP-2P의 가장 큰 가수분해 활성에 해당하는 광학 밀도의 가장 높은 증가는 CL 또는 PS가 풍부한 PC 리포좀에서 관찰되었습니다. 이 발견은 HDP-2P의 활성 중심에서 CL 및 PS에 대한 가장 많은 수의 결합 부위와 잘 일치합니다. PI가 풍부한 PC 리포좀에서 HDP-2P의 가수분해 활성은 CL 또는 PS가 풍부한 리포좀보다 각각 3.0배 및 2.5배 낮았지만 순수 PC 리포좀보다는 높았습니다. 이는 두 지질이 활성 중심에서 동일한 수의 결합 부위를 갖음에도 불구하고 PI의 HDP-2P의 활성 중심에 대한 결합 친화도가 PC보다 높다는 것을 시사합니다.

이 명백한 불일치는 PI와 PC의 극성 머리 그룹의 구조적 차이로 설명될 수 있습니다. PC는 중성 분자이지만 양이온성 트리메틸암모늄기는 용액 안으로 바깥쪽으로 확장되는 반면, 음이온성 인산염기는 멤브레인의 소수성 영역에 더 가깝게 위치합니다. PC 헤드그룹의 이러한 전하 분포는 기본 HDP-2P에 대해 정전기 반발력을 생성하여 결합 친화력을 감소시킬 수 있습니다. 대조적으로, PI의 산성 특성은 염기성 HDP-2P와의 상호 작용에 더 매력적인 지질 종을 만들며, 이는 순수 PC 리포솜에 비해 더 높은 가수분해 활성을 설명할 수 있습니다.

그림 5와 같이 PI-4-P가 풍부한 PC 리포좀에서 HDP-2P의 가수분해 활성은 인지질의 촉매 가수분해가 최소화되었음을 시사합니다. 놀랍게도, PI-4,5-P가 풍부한 PC 리포좀에서 얻은 광학 밀도 곡선은 이 리포좀 샘플에서 HDP-2P에 의한 가수분해 활성의 완전한 제거를 나타냅니다. 이러한 결과는 HDP-2P의 활성 중심에서 PI-4-P에 대한 하나의 결합 부위를 예측하는 도킹 시뮬레이션과 잘 일치하는 반면, PI-4,5-P2는 활성 중심에 대한 결합 친화력을 전혀 나타내지 않습니다. 이것은 이노시톨 고리에 결합된 인산염기가 HDP-2P의 활성 중심에 대한 인지질의 결합을 방해한다는 것을 시사합니다. 우리는 이노시톨 고리의 인산염기가 용액 속으로 바깥쪽으로 확장되고 이온 및 이온-극성 분자간 상호 작용을 통해 HDP-2P에 결합함으로써 HDP-2P를 멤브레인 표면에서 멀리 유지하여 HDP-2P의 가수분해 활성으로부터 멤브레인을 보호한다고 제안합니다. 이것은 인간 세포질, 칼슘 비의존성 및 분비된 PLA2 효소가 PI-4-P 및 PI-4,5-P2 기질에 대해 거의 검출되지 않거나 가수분해 활성을 나타내지 않았음을 밝힌 최근 연구 결과와 일치합니다35.

PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS 또는 CL이 풍부한 PC 리포솜 막의 HDP-2P 유도 투과성 변화: 캡슐화된 NH₃가 있는 CuSO4 용액에서 리간드 치환 반응을 통한 평가

PI, PI-4-P, PI-4,5-P2, PS 또는 CL이 풍부한 PC 리포좀의 막 투과성에 대한 HDP-2P 가수분해 활성의 영향은 치환 리간드가 리포좀의 내부 부피 내에 캡슐화된 복합 이온 시스템에서 리간드 치환 반응을 사용하여 조사되었습니다. 이 간단하고 신뢰할 수 있는 방법은 복합 이온 [Cu(H2O)6]2+에서 리간드로 작용하는 4개의 물 분자가 NH3에 의한 변위를 기반으로 합니다

[Cu(H2O)6]2+ (aq) + 4NH3 (aq) figure-results-1 [Cu (H2O)2 (NH3)4]2+ (aq) + 4H2O (l)

복합 이온 [Cu(H2O)6]2+에서 NH3가 물 분자를 치환하는 과정에서 [Cu(H2O)6]2+의 옅은 파란색이 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+의 진한 파란색으로 전환됩니다. NH3가 리포좀의 내부 부피 내에 캡슐화되고 [Cu(H2O)6]2+가 외부 용액에 존재하는 시스템에서, 분광 광도계로 모니터링되는 이 색상 변화는 NH3에 대한 리포솜 막 투과성의 증가를 나타냅니다.

이러한 시스템을 확립하기 위해 NH3를 포함하는 Tris-HCl 완충액에서 인지질 분산액을 초음파 처리하여 리포좀 내부 및 외부에 NH₃를 사용하여 초음파 처리 된 리포좀을 형성했습니다. 외부 NH3 를 투석에 의해 제거한 후 CuSO4 용액을 내부 부피에 NH3 를 포함하는 리포솜 샘플에 첨가했습니다. 그런 다음 리포좀을 HDP-2P로 처리하고 광학 밀도의 변화를 분광 광도법으로 모니터링했습니다.

광학 밀도 변화를 측정하기 위한 최적의 파장을 결정하기 위해 500nm에서 900nm 범위의 가시광선을 사용하여 0.025M CuSO4, 0.100M NH3 용액에서 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ 및 0.025M CuSO4 용액에서 [Cu(H2O)6]2+의 흡광도 스펙트럼을 기록했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 600nm에서의 조사는 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+에 대한 최대 흡광도와 [Cu(H2O)6]2+에 대한 최소 흡광도를 산출하여 막 투과성 실험을 위한 최적의 파장으로 600nm를 선택했습니다.

그림 7은 NH₃에 대한 막 투과성이 음이온성 CL 및 PS가 풍부한 PC 리포좀에서 가장 높다는 것을 보여줍니다. 이 관찰은 그룹 IIA PLA2인 HDP-2P가 음이온성 인지질 팔미토일올레오일-글리세로포스포글리세롤과 효율적으로 상호 작용하여 기질 가수분해를 유도한다는 것을 보여주는 이전에 보고된 데이터와 일치합니다. 일반적으로, 대부분의 그룹 IIA PLA2 효소는 음이온성 인지질에 대해 유의하게 더 높은 가수분해 활성을 나타냅니다 33,37,38. PC+PI 리포좀의 투과성은 PC+CL 및 PC+PS 리포좀보다 낮지만 순수 PC 리포좀보다 높습니다. 이러한 결과는 도킹 시뮬레이션 및 HDP-2P 가수분해 활성 분석의 결과와 잘 일치합니다. 즉, 낮은 투과성을 보이는 리포솜 샘플은 분자 도킹 데이터에 의해 예측된 바와 같이 HDP-2P가 인지질을 가수분해할 수 없고 HDP-2가 PI 및 포스포이노시타이드에 결합하는 친화력이 낮기 때문에 구조적으로 안정적일 것으로 예상됩니다(그림 2, 그림 3 및 그림 4). 따라서 HDP-2P에 의한 효소 가수분해 활성(그림 5)과 막 투과성은 그림 7과 같이 양의 상관관계가 있어야 합니다.

그러나 PC+PI-4-P 및 PC+PI-4,5-P2 리포좀에서는 HDP-2P로 처리해도 투과성이 증가하지 않았다. PC+PI-4,5-P2 리포좀의 투과성 결과는 동일한 리포좀에 대한 도킹 시뮬레이션 및 HDP-2P 가수분해 활성 데이터와 잘 상관관계가 있지만, PC+PI-4-P 리포좀에서 증가된 투과성의 부재는 이러한 리포좀에서 약간의 가수분해 활성이 기록되었기 때문에 가수분해 활성 결과와 완전히 일치하지 않습니다. 이러한 발견은 PC+PI-4-P 리포좀에서 가수분해 활성의 약간의 국부적 증가가 NH3에 대한 막 투과성을 변화시킬 정도로 인지질의 이중층 패킹을 방해하지 않음을 시사합니다.

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그림 1: 포스파티딜이노시톨의 극성 머리의 하전 및 극성 부분의 표기법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 분자 도킹 소프트웨어에 의해 결합 부위 #6에 대해 예측된 HDP-2P의 활성 중심과 PI의 상호 작용. PI는 스틱 표현으로 제공되고 HDP-2P는 선(왼쪽 다이어그램) 및 분자 표면(오른쪽 다이어그램) 표현으로 제공됩니다. 막대기 표현의 경우 에메랄드는 탄소, 주황색은 인, 빨간색은 산소, 흰색은 수소를 나타냅니다. 분자 표면과 선의 경우 녹색은 탄소, 파란색은 질소, 빨간색은 산소, 흰색은 수소, 노란색은 황을 나타냅니다. 노란색 파선은 분자 간 결합을 식별합니다. 화살표는 활성 중심의 아미노산 잔기를 가리킵니다. 약어: PI = 포스파티딜이노시톨; HDP-2P = 독사 독 포스포리파아제의 기본 서브유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 분자 도킹 소프트웨어에 의해 결합 부위 #1에 대해 예측된 HDP-2P의 활성 중심과 PI-4-P의 상호 작용. PI-4-P는 스틱 표현으로 제공되고 HDP-2P는 선(왼쪽 다이어그램) 및 분자 표면(오른쪽 다이어그램) 표현으로 제공됩니다. 막대기의 경우 에메랄드는 탄소, 주황색은 인, 빨간색은 산소, 흰색은 수소를 나타냅니다. 분자 표면과 선의 경우 녹색은 탄소, 파란색은 질소, 빨간색은 산소, 흰색은 수소, 노란색은 황을 나타냅니다. 노란색 파선은 분자 간 결합을 식별합니다. 화살표는 활성 중심의 아미노산 잔기를 가리킵니다. 약어: PI-4-P = 포스파티딜이노시톨-4-인산염; HDP-2P = 독사 독 포스포리파아제의 기본 서브유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 분자 도킹 소프트웨어에 의해 결합 부위 #6에 대해 예측된 HDP-2P의 분자 표면과 PI-4,5-P2 의 상호 작용. PI-4,5-P2 는 HDP-2P의 활성 중심 아래에 위치한 홈과 같은 동굴에 결합합니다. 활성 중심에 있는 5개의 주요 아미노산 잔기는 세 글자 표기법으로 제공됩니다. PI-4,5-P2 는 스틱 표현으로 제공되고 HDP-2P는 선(왼쪽 다이어그램) 및 분자 표면(오른쪽 다이어그램) 표현으로 제공됩니다. 막대기의 경우 에메랄드는 탄소, 주황색은 인, 빨간색은 산소, 흰색은 수소를 나타냅니다. 분자 표면과 선의 경우 녹색은 탄소, 파란색은 질소, 빨간색은 산소, 흰색은 수소, 노란색은 황을 나타냅니다. 약어: PI-4,5-P2 = 포스파티딜이노시톨-4,5-이인산염; HDP-2P = 독사 독 포스포리파아제의 기본 서브유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 다양한 HDP-2P/인지질 몰 비율에서 리포좀 샘플의 가수분해 활성 곡선. PC+CL(짙은 녹색), PC+PS(주황색), PC+PI(진한 파란색), PC+PI-4-P(파란색), PC+PI-4,5-P2 (녹색) 및 PC(보라색)로 구성된 리포솜. 임의의 단위의 광학 밀도 값은 550nm에서 삼중 판독값의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 삼중 판독값의 SD를 나타냅니다. 리포솜 샘플 간의 광학 밀도 값 차이의 통계적 유의성은 ANOVA를 사용하여 평가되었으며, 모든 p-값은 0.05보다 훨씬 낮은 것으로 나타났습니다. 약어: PC = 포스파티딜콜린; CL = 소 심장 카디오리핀; PS = 포스파티딜세린; PI = 포스파티딜이노시톨; PI-4-P = 포스파티딜이노시톨-4-인산염; PI-4,5-P2 = 포스파티딜이노시톨-4,5-이인산염; a.u. = 임의의 단위; HDP-2P = 독사 독 포스포리파아제의 기본 서브유닛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 6: 구리 복합체 수용액의 흡광도 스펙트럼. 구리 복합체 [Cu(H2O)6]2+ (주황색 선) 및 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ (파란색 선)는 500nm에서 900nm 범위의 가시광선으로 조사됩니다. 구리 복합체 [Cu(H2O)6]2+ 는 0.025 M CuSO4 용액에서 만들어졌고, 구리 복합체 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+ 는 0.100 M NH3를 포함하는 0.025 M CuSO4 용액에서 만들어졌습니다. 각 데이터 포인트에 대한 이 그림의 흡광도 값은 삼중으로 수행된 흡광도 판독값의 평균입니다. 오차 막대는 삼중 판독값의 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 7: 리포좀 샘플의 막 투과성 곡선. 다양한 HDP-2P/인지질 몰비에서 PC+CL(보라색), PC+PS(파란색), PC+PI(진한 파란색), PC+PI-4-P(진한 녹색), PC+PI-4,5-P2 (주황색) 및 PC(녹색)로 구성된 리포솜. 막 투과성 값은 600nm에서 측정된 임의의 단위(a.u.)의 광학 밀도 값으로 표현됩니다. 각 데이터 포인트는 삼중 판독값의 평균을 나타냅니다. 오차 막대는 삼중 판독값의 SD를 나타냅니다. 리포솜 샘플 간의 광학 밀도 값 차이의 통계적 유의성은 ANOVA를 사용하여 평가되었으며, 모든 p-값은 0.05보다 훨씬 낮은 것으로 나타났습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: HDP-2P와 PI의 후보 분자 복합체에 대한 예측된 친화성 결합 에너지. 분자 모델링 시뮬레이션을 사용하여 결합 및 결합 부위 친화도의 유형뿐만 아니라 포스파티딜이노시톨 헤드그룹과 분자 간 상호 작용에 참여하는 HDP2P 아미노산 잔기의 전하 및 극성 부분을 예측했습니다. 포스파티딜이노시톨의 하전 및 극성 그룹은 그림 1에 강조 표시되어 있습니다. NHpbδ+ 의 Pb는 펩타이드 결합을 나타냅니다. 약어: PI = 포스파티딜이노시톨; HDP-2P = 독사 독 포스포리파아제의 기본 서브유닛. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

표 2: HDP-2P와 PI-4-P의 후보 분자 복합체에 대한 예측 친화성 결합 에너지. 분자 모델링 시뮬레이션을 사용하여 결합 유형 및 결합 부위 친화도뿐만 아니라 포스파티딜-이노시톨-4-인산(PI-4-P) 헤드그룹과 분자 간 상호 작용에 참여하는 HDP2P 아미노산 잔기의 전하 및 극성 부분을 예측했습니다. NHpbδ+ 의 Pb는 펩타이드 결합을 나타냅니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 1: 분자 도킹 워크플로우. PI-HDP-2P 상호 작용을 예측하기 위한 리간드 구성, 수용체 준비, 그리드 박스 설정 및 도킹 시뮬레이션 실행을 포함하여 AutoDock을 사용한 분자 도킹 절차에 대한 개요입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

본 연구에서는 포스파티딜이노시톨(PI)의 이노시톨 고리에 공유 결합된 인산기가 포스포리파제A2 (PLA2) 효소에 의한 인지질막의 분해를 방지할 수 있는지 여부를 조사하였다. PLA2의 가수분해 활성으로 인한 인지질 막 분해의 진행을 평가하기 위해 구조적 열화가 진행됨에 따라 증가해야 하는 막 투과성의 변화를 측정하는 간단하면서도 매우 민감하고 정확한 방법을 설계했습니다.

이 방법은 인지질 리포좀 외부의 수성 환경에 현탁하는 육아구리(II) 복합체[Cu(H2O)6]2+를 포함하는 리간드 치환 반응을 기반으로 하며, 암모니아(NH3)는 리포좀 내부에 캡슐화되어 있습니다. 암모니아는 물 분자보다 Cu2+에 대한 친화력이 더 높지만 NH3는 리포솜 막을 통해 침투하여 외부 수성상에 접근해야 하며, 여기서 H2O 분자를 [Cu(H2O)6]2+로 대체합니다. PLA2 촉매 인지질 가수분해로 인해 리포솜 막의 구조적 완전성이 손상되는 경우, NH3에 대한 막 투과성이 증가하면 리간드 치환이 촉진되어 [Cu(H2O)6]2+의 옅은 파란색에서 [Cu(H2O)2(NH3)4]2+의 진한 파란색으로 색상이 변경됩니다. 우리는 600nm에서 광학 밀도의 변화를 기록하기 위해 분광 광도법을 사용하여 이 변환을 정량적으로 모니터링했습니다.

우리는 이전에 HDP-2P24 및 코브라 독 카디오톡신 24,25,26,27,28,39에 의해 영향을 받는 막 투과성의 변화를 연구하기 위해 상자성 이온 페로시안화물 [Fe(CN)6]3-과 함께 1H-NMR을 사용했습니다. 우리는 또한 다양한 형광 및 인광 프로브를 사용하여 코브라 독 심장 독소가 리포솜 막의 투과성에 미치는 영향을 연구했습니다 20,23,40. 그러나 페로시안화물 및 형광/인광 프로브는 막 무결성이 크게 손상될 때 지질막을 관통하는 큰 비생리학적 분자 실체입니다. 대조적으로, 우리의 새로운 리간드 치환 분석은 미묘한 지질 패킹 교란에서 지질막을 투과할 수 있는 작은 천연 세포 대사산물인 NH₃를 활용합니다. 당사의 새로운 막 투과성 방법의 이러한 향상된 감도는 ¹H-NMR/페로시안화물 검출에 필요한 0.004에 비해 HDP-2P/지질 몰 비율 0.001에서 막 투과성의 변화를 감지하는 능력으로 입증됩니다23.

같은 연구에서 우리는 시험 샘플(τn)의 에리스로신 수명 비율과 대조군 샘플(τ0)의 비율 변화로 평가한 막간 지질 교환에 대한 HDP-2P의 효과를 조사하기 위해 페로센에 의한 에리스로신 인광 소멸을 사용했습니다23. HDP-2P/지질 몰 비율이 0.004일 때, τn/τ0 값은 0.423으로 감소하여 2가 양이온에 투과할 수 있는 막 유동성 상태를 나타냅니다24. 따라서 당사의 NH₃ 기반 리간드 치환 분석은 HDP-2P/지질 몰 비율 0.001에서 막 투과성을 검출하는 반면, 기존 분석(1H-NMR/페로시안화물 및 인광 프로브 담금질)은 몰비 0.004에서만 막 투과성을 검출합니다. 이는 당사의 NH3 기반 분석이 기존 분석보다 4배 더 민감하다는 것을 보여줍니다.

NH3 기반 분석의 탁월한 민감도는 가수분해 활성 측정과 밀접한 상관관계가 있는 투과성 데이터를 산출했으며, 단 한 가지 명백한 불일치가 있었습니다: PC+PI-4-P 리포좀은 투과성 변화 없이 미미한 가수분해를 보였으며, 이는 최소한의 국소 리소인지질/지방산 생산이 막 구조적 무결성 및 투과성에 영향을 미치지 않는 전체 지질 패킹에 영향을 미치지 않음을 시사합니다. 따라서 본 연구는 리포좀의 내부 부피 내에 캡슐화된 리간드를 포함하는 복합 이온계에서의 리간드 치환 반응이 HDP-2P의 가수분해 활성 데이터와 훌륭하게 일치하는 결과를 생성했음을 입증했습니다. 이러한 발견은 차례로 HDP-2P의 분자 표면에 대한 PI 및 포스포이노시티드의 결합에 대한 인실리코 연구와 강력하게 일치했습니다.

전반적으로, 본 연구의 AutoDock 시뮬레이션은 PI가 확인된 9개의 결합 부위 중 4개에서 활성 중심에 결합하는 반면, PI-4-P는 9개의 예측 부위 중 하나에서만 활성 중심에 결합하는 것으로 나타났습니다. PC+PI-4-P 리포좀에서 HDP-2P의 가수분해 활성은 PC+PI 리포좀보다 약 5배 낮았습니다. 또한, 인실리코 연구에서는 PI-4,5-P2가 HDP-2P의 활성 중심에 결합하지 않을 것으로 예측했습니다. 일관되게 PLA2 활성 분석 및 리간드 치환 반응 실험에서 PI-4,5-P2는 인지질 가수분해와 막 투과성 증가를 모두 완전히 억제하는 반면, PI-4-P는 더 적고 유의하지 않은 가수분해 활성을 나타내고 막 투과성 변화를 완전히 방지하는 것으로 나타났습니다. 이러한 관찰은 PI, PI-4-P 및 PI-4,5-P에 대한 인간 세포질, 칼슘 비의존성 및 분비된 PLA2 효소의 시험관 내 활성 연구와 잘 일치합니다235. 이러한 연구는 그룹 IVA 세포질 PLA2만이 PI 및 PI-4-P에 대해 상대적으로 높은 촉매 활성을 나타낸 반면 PI-4,5-P2에 대한 활성은 거의 검출되지 않음을 보여주었습니다. 다른 모든 테스트된 PLA2 효소는 PI-4,5-P에 대해 활성을 나타내지 않았습니다 2 35. 이러한 활성 부족은 이노시톨 고리의 친수성이 높은 인산염 그룹에 기인하며, 이는 막 표면과 PLA2 효소 사이의 생산적인 상호 작용을 방해합니다35. 우리는 이노시톨 고리의 인산염기가 용액 안으로 바깥쪽으로 확장되고 HDP-2P의 홈과 같은 공동의 잔기와 이온-극성 및 수소 결합을 형성하는 능력이 HDP-2P가 가수분해 활성을 발휘할 수 있을 만큼 막 표면에 가깝게 접근하는 것을 방지하여 막을 안정화하고 세포 사멸 경로를 활성화하여 세포에 해로울 수 있는 HDP-2P에 의한 인지질 막의 분해를 감소시킬 수 있다고 제안합니다. 이 메커니즘은 비정상적인 효소 활성과 관련된 질병 상태에서 포스포이노시티드의 잠재적인 보호 역할과 일치하는 것으로 보입니다.

막 투과성 분석, 가수분해 활성 측정 및 인실리코 분자 도킹 연구에서 얻은 결과 간의 강한 상관관계는 리간드 치환 반응 방법의 신뢰성을 강조합니다. 리포좀 내에 캡슐화된 리간드를 활용하는 이 접근법은 인지질의 안정적인 이중층 조직의 구조적 교란으로 인한 막 투과성 변화를 평가하기 위한 정확하고 효과적인 도구임이 입증되었습니다. 우리는 이 논문에 제시된 AutoDock을 사용한 분자 도킹 연구가 인지질이 역동적이고 종단적인 방식으로 HDP-2P와 어떻게 상호 작용할 수 있는지에 대한 철저한 이해를 제공하지 않는다는 것을 인정하지만, HDP-2가 다양한 인지질로 구성된 인지질 이중층을 어떻게 투과시킬 수 있는지에 대한 추가 분자 메커니즘을 식별하기 위해 향후 분자 역학 연구를 수행해야 합니다. 분자 역학 연구를 수행하려면 고성능 컴퓨터 및 클러스터와 같은 높은 계산 리소스가 필요하며, 이는 자원과 연구 자금이 제한된 많은 교육 기관에서 사용할 수 없다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 우리는 본 기술 논문에서 경질 수용체(HDP-2P)의 사용과 용매/막 환경의 부족을 인정합니다. 그러나 우리는 경직된 수용체를 사용하여 다양한 인지질과 HDP-2P의 분자 도킹을 수행하는 것이 기질에 결합하는 촉매 측 내의 중요한 아미노산 잔기가 유연하게 렌더링될 수 있는 분자 영역에 초점을 맞추기 위해 향후 유연한 수용체로 후속 조치를 취할 수 있는 도킹된 후보 구조의 첫 번째 패스를 식별하기 위한 초기 도킹 연구를 수행하는 기존의 접근 방식임을 강조하고 싶습니다. 분자 도킹 연구를 따르고 용매화된 환경에서 수행하십시오. 따라서 더 많은 자원을 보유한 다른 기관과의 협력을 활용하면 AutoDock이 제공하는 초기 연구 결과 중 일부를 확증하고 기질-효소 상호 작용의 추가 분자 메커니즘을 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

결론적으로, 본 연구 결과는 리포좀 내에 캡슐화된 리간드를 활용한 리간드 치환 반응 방법이 다양한 막 매개 과정에서 막 투과성 연구에 효과적으로 적용될 수 있음을 보여줍니다. 여기에는 리간드-수용체 상호작용, 지질-단백질 상호작용, 막간 교환, 막 융합 및 분열, 신경근 수축 등이 포함됩니다. 또한, 이 접근 방식은 멤브란트로픽 의약품을 조사하는 데 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 동시에, 우리는 모델 멤브레인의 새로운 방법이 멤브레인 상호 작용의 특정 메커니즘을 해부하는 데 매우 중요하지만, 고유한 단순화로 인해 생체 내에서 생물학적 멤브레인의 구조적, 구성 및 기능적 복잡성을 완전히 복제하는 능력이 제한된다는 것을 인식합니다. 따라서 모델 시스템의 데이터를 신중하게 해석하고 가능한 한 세포 또는 유기체 모델을 사용하여 결과를 검증하는 것이 중요합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 기사의 연구는 Beijing Chaoyang KaiWen Academy(ESG)의 창업 보조금과 SEPA Award, NIH 5R25MD019151-03(R.K.D.)의 지원을 받았습니다. HDP-2 준비와 관련된 작업은 러시아 과학 재단 No. 24-15-00280(YNU)의 보조금으로 지원되었습니다. 저자는 이 연구 논문 출판 이후에 준비된 분자 도킹 시뮬레이션의 적용에 대한 대본을 작성하고 비디오를 개발한 Maryam Barancheshmeh 박사에게 감사를 표하고 싶습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
V. nikolskii 독사 독 PLA2의 기본 소단위 HDP-2P, HDP-2, 순도 98.5%  모스크바 유기화학 연구소PMID:18083205의 포토콜에 따라 HDP-2가 분리되었습니다. HDP-2에서 DEAE 세파덱스 A-50 에 의해 정제된 HDP-2P; 그리고 nbsp;
카디오리핀(심장, 소) (나트륨 소금), >99%맥클린C916138
코엔자임 A, 후지필름 와코' s NEFA 키트 & nbsp;미국 매사추세츠주 렉싱턴
투석관 셀룰로오스 막 분자량 컷오프 1.0 kDa시그마 올드리치 트레이딩 컴퍼니(Sigma Aldrich Trading Co. Ltd.), 상하이, 중국;
디지털 제어 물탱크 온도 조절기;영광명의료기기 유한회사, 베이징, 중국  
전자 고정밀 분석 저울(FA2004 );상하이 마이이 유한회사, 중국
징화 752 자외선 가시광선 분광광도계 및 nbsp;상하이 징화 인스트루먼트 유한회사, 상하이, 중국
L-α-포스파티딜콜린(계란, 닭고기)...ge; 95%맥클린L799415
L-&α;-포스파티딜리노시톨(간, 소) (나트륨 염), ≥ 99%맥클린L780292
L-&알파;-인산틸리노시톨-4,5-비스포스페이트 (뇌, 돼지) (암모늄 염), ≥ 99%맥클린L996223
L-&알파;-인산염-4-인산염 (뇌, 돼지) (암모늄 염), 99%맥클린L970250
L-&알파;-인산지세린 (뇌, 돼지) (나트륨염), >99%맥클린L864755
자기 교반기 JB-3 상하이 레이시 JB-3
pH 측정기 PHS-3C 상하이 INESA 과학기기 유한회사, 중국
TGL-16B 미세원심분리기;상하이 3안팅 컴퍼니, 상하이, 중국
초음파 디스펜서 Yt-JY96-IIN 상하이 예투오 기술 유한회사, 중국
진공 펌프 TW-1M팅웨이 주식회사, 중국 원링

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