여기에서는 비교를 통해 골관절염 쥐 모델의 확립 및 평가 방법을 체계적으로 설명하는 프로토콜을 제시하여 급성 기계적 손상 유발 골관절염과 만성 대사/환경 요인 유발 골관절염 사이의 병인이 다르다는 과학적 증거를 제공합니다. ACLT 모델은 EP4-Ca2+-미토콘드리아 기능 장애 신호 전달 경로의 변화를 강조하는 주요 초점입니다.
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여기에서는 비교를 통해 골관절염 쥐 모델의 확립 및 평가 방법을 체계적으로 설명하는 프로토콜을 제시하여 급성 기계적 손상 유발 골관절염과 만성 대사/환경 요인 유발 골관절염 사이의 병인이 다르다는 과학적 증거를 제공합니다. ACLT 모델은 EP4-Ca2+-미토콘드리아 기능 장애 신호 전달 경로의 변화를 강조하는 주요 초점입니다.
외상 후 골관절염(PTOA)은 외상이나 강렬한 기계적 스트레스로 인해 유발되는 퇴행성 관절 질환으로 관절 연골 변성 및 기능 장애를 유발합니다. 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 연골세포막에서 수용체인 프로스타글란딘 E 수용체 4(EP4)를 활성화하여 기계적 손상 후 연골 분해에 크게 기여합니다. 관절 연골의 항상성은 주로 연골 분해와 복구 사이의 동적 균형에 의존하며, 이는 연골 세포에 의해 미세하게 조절되는 과정입니다. Ca2+/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II(CAMKII) 신호 전달 경로는 연골 세포 기능 회복을 매개하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 이 연구에서 우리는 인터루킨-1 베타(IL-1β) 자극 연골 세포에서 EP4, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체(IP3R) 및 인산화된 CaMKII의 발현 증가를 관찰하여 EP4 신호 전달과 칼슘 조절 장애 사이의 가능한 연관성을 시사합니다. 그러나 PTOA에서 EP4-Ca2+/CaMKII 축의 관여를 확인하는 직접적인 증거는 아직 부족합니다. 이 잠재적 메커니즘을 명확히 하기 위해서는 유전적 또는 약리학적 개입을 사용한 추가 조사가 필요합니다. 이러한 발견은 PTOA 치료의 표적으로서 칼슘 항상성 및 EP4 신호 전달을 탐색하기 위한 예비 기초를 제공합니다.
신체 활동은 건강상의 이점을 위해 널리 홍보되고 있지만 여전히 하지 근골격계 부상의 주요 원인으로 남아 있어 다양한 부작용을 초래할 수 있습니다1. 이 중 PTOA는 어린 나이에 관절 부상을 경험하는 청소년 및 청년에게 점점 더 큰 부담이 되고 있습니다2. 놀랍게도 스포츠 관련 관절 부상을 입은 개인의 약 48-52%가 11-17년 이내에 PTOA가 발생합니다 3,4. 청소년 스포츠 및 레크리에이션 활동에서 가장 자주 부상을 입는 관절 중 하나인 무릎 관절은 관절 손상에서 PTOA로 진행되는 데 특히 취약합니다. 전향적 연구에 따르면 무릎 부상을 입은 개인은 부상을 입지 않은 개인에 비해 부상 후 12-20년 후에 방사선학적으로 확인된 무릎 골관절염 발병 위험이 10배 더 높다고 보고했습니다5. 더욱이, 젊은 성인의 경우 방사선학적 평가에 따르면 전방십자인대 절개(ACLT) 부상을 입은 여자 축구 선수는 12년 이내에 PTOA가 발생할 위험이 51%인 반면, 남자 선수는 14년 이내에 41%의 위험이 ....
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동물과 관련된 모든 실험 절차는 광동성 한의학 병원의 동물 윤리 위원회(윤리 승인 번호: 2024014-2)의 검토 및 승인을 받았습니다. 이 연구는 중화인민공화국 국무원이 규정한 실험동물의 윤리적 사용에 관한 규정에 따라 수행되었습니다.
1. 동물
2. 동물 모델 구축 및 개입
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ACLT 유발 PTOA는 FD 유발 만성 KOA에 비해 조기 연골 파괴 및 행동 결함을 나타냅니다(그림 2 및 그림 3)
관절 공간 협착과 연골 변성은 골관절염의 주요 결과입니다. 이전 연구에서는 과체중 및 환경 요인(예: 습한 기후)이 OA 발병의 잠재적 원인으로 확인되었으며12,13, 이는 노화와 직접적인 관련이 있고 노년기에 OA 발병으로 이어질 수 있습니다. 본 연구에서는 스포츠 관련 외상이 골관절염 진행을 가속화할 수 있는지 알아보기 위해 ACLT 유발 외상군을 PTOA 모델로, FD 모델을 만성 골관절염에 대한 양성 대조군으로 설정하였다. 쥐의 관절 표면 형태, 조직병리학적 변화 및 연골하 뼈 미세 구조를 검사하여.......
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환경 및 식이 요인에 의해 유발된 만성 OA에 비해 ACLT 유발 관절 외상은 질병의 더 빠른 진행으로 이어집니다. 관절 부종, 뒷다리 악력, 보행 분석을 포함한 행동 평가를 기반으로 한 결과, 환경 및 식이 요인에 의해 유발된 대조군, PTOA 그룹 및 양성 대조군 간에 유의미한 차이가 나타났습니다. 개입 12주 후, PTOA군에서 뒷다리 악력의 현저한 감소와 불안정한 보행을 동반한 과도한 관절 부종이 관찰되어 검체 채취에 적합한 시점을 나타냈다. 두 개입 모델에서 OA 진행에 대한 추가 평가는 H&E 염색, SOFG 염색 및 마이크로 μCT 분석을 통해 수행되었습니다. 조직학적 검사 결과 PTOA 그룹은 관절 공간 협착과 연골 얇아짐이 더 뚜렷한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, FD 그룹의 OA 병리는 초기 행동 변화에 비해 이 단계에서 덜 분명했습니다. 또한 조직학적 소견과의 상관관계를 강화하기 위해 micro-μCT 분석을 수행한 결과, 거의 모든 측정된 매개.......
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이 연구는 중국 국가자연과학재단(No. 82205147; 62472046번); 광동성 체육국 과학연구프로젝트(GDSS2024N038); 광저우 중의과대학(GZYFT2024G08)의 대학-병원 공동 기금 프로젝트.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2% 콜라게나제 II | Sigma-Aldrich, 미국 | CAS 번호: 9001-12-1 | 일차 연골 세포 분리 및 배양 |
| 0.2% 트리톤 X-100 | Beyotime, 중국 | ST795 | 면역형광 |
| 0.25% 트립신-EDTA | 우한 보스터 생물학적 기술 Co., Ltd. | AR1071 | 석회질 제거 |
| 0.25% 트립신-EDTA | Gibco, 미국 | 25200072 | 일차 연골 세포 분리 및 배양 |
| 4% 파라포름알데히드 고정액 | Biyuntian, 중국 | P0099-3L | 조직 고정 |
| 항-CaMKII 항체 | Huabio, 중국 | ET1608-47 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-콜라겐 II 항체 | Abcam, 영국 | AB34712 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-COX2 항체 | Abcam, 영국 | AB179800 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-Cyt-C 항체 | Selleck, 중국 | F2534 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-IP3R 항체 (B-2) | 미국 산타크루즈 | SC-377518 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-MMP9 항체 | Abcam, 영국 | AB76003 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-p-CaMKII 항체 | Selleck, 중국 | F0342 | 웨스턴 블롯(1:1000) |
| 항-&-액틴 항체 | 미국 세포 신호 전달 기술(CST) | 8시간 10일 10일 | 웨스턴 블롯 (1:2000) |
| BSA 차단 솔루션 | 시그마 알드리치, 미국 | 해당 사항 없음 | 웨스턴 블롯 차단을 위한 5% BSA |
| 원심분리기(5424 R) | Eppendorf, 독일 | 해당 사항 없음 | 755 &회; g 원심분리 속도 |
| 클로로포름 | 시그마 알드리치, 미국 | 해당 사항 없음 | PA용 용매 |
| 온도 조절 챔버(RXZ-158A) | 국내 제조업체, 중국 | 해당 사항 없음 | 습한 환경 모델 |
| 컬러 역전사 키트 | Invitrogen, 쑤저우, 중국 | 해당 사항 없음 | cDNA 합성 |
| CTAn 소프트웨어 | 브루커 | 버전 1.9 및 4.1 | 정량적 형태 측정 분석용 |
| CTVol 소프트웨어 | 브루커 | 버전 2.0 | 정성적 및 3차원 시각화를 위해 |
| DAPI 염색 솔루션 | Beyotime, 중국 | 해당 사항 없음 | 핵 염색(5 & micro; g/mL) |
| 디지털 악력 측정기 | 푸신 악기 | 해당 사항 없음 | 뒷다리 악력 측정 |
| DMEM/F12 미디엄 | 코닝, 미국 | 해당 사항 없음 | 세포 배양 배지 |
| EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산) | 알라딘 | 해당 사항 없음 | 뼈 조직의 석회질 제거 |
| PGE2용 ELISA 키트 | Elabscience, 우한, 중국 | PGE2E-EL-0034 | ELISA 검출 |
| 강화된 화학발광 키트 | Millipore, 미국 | WBKLS0500 | 웨스턴 블롯 검출 |
| 에탄올 | 광동 광시 시약 기술 유한 회사 | CAS: 64-17-5 | 조직 탈수 |
| 태아 소 혈청(FBS) | 코닝, 미국 | 해당 사항 없음 | 배양용 농도 10% |
| FITC 표지 염소 항토끼 IgG | Beyotime, 중국 | P0179 키트 | 면역형광(1:500) |
| 그래프패드 프리즘 | GraphPad 소프트웨어, 미국 | 버전 8.0.2 | 데이터 분석 |
| 헤마톡실린 및 에오신(H& E) 염색 키트 | Servicebio, 우한 | 지1005 | 조직학 |
| IL-1&베타; | PeproTech, 미국 | 400-01B | PTOA 세포 모델의 경우 10 ng/mL |
| 이미지J | 미국 NIH | 버전 1.48v | 이미지 분석 |
| Image-Pro Plus 소프트웨어 | 미디어 사이버네틱스 | 버전 6.0 | 스캔한 발자국에서 정량적 보행 분석 |
| 이소플루란 | 상하이 야지 생물학 | YS1412C | 동물 수술용 마취 |
| 라이카 임베딩 센터 | 라이카 마이크로시스템즈 | EG1160 | 파라핀 포베딩 |
| 라이카 마이크로톰 | 라이카 마이크로시스템즈 | 2235 링깃 | 파라핀 포매 조직 절편 |
| 라이카 워터 배스 | 라이카 마이크로시스템즈 | 하이1210 | 플로팅 파라핀 섹션 |
| 광학 현미경(ECLIPSE Ti2-E) | Nikon, 일본 | 해당 사항 없음 | 조직학적 관찰 |
| 마이크로 CT 스캐너(ZKKS-MCT-Sharp) | 국내 제조업체, 중국 | 해당 사항 없음 | 뼈 영상 |
| 마우스-HRP 2차 항체 | 미국 세포 신호 전달 기술(CST) | 7076 | 1:2000 희석 |
| NIS-Elements 이미징 소프트웨어 | 니콘 | 해당 사항 없음 | 현미경 이미지 캡처 및 분석 |
| NRecon 소프트웨어 | Bruker, 독일 | 버전 1.6 | CT 재구성 |
| 팔미트산(PA) | 시그마 알드리치, 미국 | P0500 | 500 & 마이크로; FD 셀 모델용 M 재고 |
| 절편용 파라핀 왁스, 병리학 등급, 녹는점 52-54 &g; C | 광동 광시 시약 기술 유한 회사 | Y258797-500g | 조직 처리 중 파라핀 포매에 사용 |
| 절편용 파라핀 왁스, 병리학 등급, 녹는점 56-58 &g; C | 광동 광시 시약 기술 유한 회사 | Y258799-500g | 조직 절편에서 최종 하드 왁스 포매에 사용됩니다. |
| PBS(인산염 완충 식염수) | Gibco / 써모 피셔 | C10010500BT | 세포 세척 및 조직 헹굼 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | 코닝, 미국 | 해당 사항 없음 | 세포 배양용 1% |
| PVDF 멤브레인(0.45 & micro; m) | Millipore, 미국 | IPVH00010 | 웨스턴 블롯 멤브레인 |
| Rabbit-HRP 2차 항체 | 미국 세포 신호 전달 기술(CST) | 7074 | 1:2000 희석 |
| 빨간색 잉크 | 영웅 | 영웅 204 | 보행 분석의 발자국 추적 |
| RIPA 용해 완충액 | Keygen, 중국 | 해당 사항 없음 | 단백질 추출 |
| 사프라닌 O– 빠른 녹색 염색 키트 | Servicebio, 우한 | 지1053 | 조직학적 염색 |
| 나선형 마이크로미터(버니어 캘리퍼스) | 황산, 중국 | 해당 사항 없음 | 관절 폭 측정 |
| 연골하 뼈 분석 소프트웨어(CTAn) | Bruker, 독일 | 버전 1.9 및 4.1 | 형태 측정 분석 |
| SYBR 그린 PCR 마스터 믹스 | AG Scientific, 중국 | 해당 사항 없음 | qPCR 분석 |
| 웨스턴 블롯 시약(RIPA 완충액, SDS-PAGE 겔 성분, 로딩 완충액, TBST 등) | 비요타임 바이오테크놀로지(중국) | N/A(그룹 항목으로 사용) | 웨스턴 블로팅 절차에 사용되는 모든 일상적인 시약 |
| 자일렌 | 광동 광시 시약 기술 유한 회사 | CAS: 1330-20-7 | 조직 청소 |
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