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방법 논문

외상 후 골관절염에서 PGE 2-EP4-Ca2+ 신호 전달 축의 잠재적 역할

673 조회수

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DOI:

10.3791/68602

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2025년 8월 22일

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1Laboratory of Regenerative Medicine in Sports Science, School of Physical Education and Sports Science, South China Normal University, 2Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Refractory Chronic Diseases, The Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine (Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine), 3Bone and Joint Research Team of Degeneration and Injury, Guangdong Provincial Academy of Chinese Medical Sciences

이 논문에서

요약

여기에서는 비교를 통해 골관절염 쥐 모델의 확립 및 평가 방법을 체계적으로 설명하는 프로토콜을 제시하여 급성 기계적 손상 유발 골관절염과 만성 대사/환경 요인 유발 골관절염 사이의 병인이 다르다는 과학적 증거를 제공합니다. ACLT 모델은 EP4-Ca2+-미토콘드리아 기능 장애 신호 전달 경로의 변화를 강조하는 주요 초점입니다.

초록

외상 후 골관절염(PTOA)은 외상이나 강렬한 기계적 스트레스로 인해 유발되는 퇴행성 관절 질환으로 관절 연골 변성 및 기능 장애를 유발합니다. 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 연골세포막에서 수용체인 프로스타글란딘 E 수용체 4(EP4)를 활성화하여 기계적 손상 후 연골 분해에 크게 기여합니다. 관절 연골의 항상성은 주로 연골 분해와 복구 사이의 동적 균형에 의존하며, 이는 연골 세포에 의해 미세하게 조절되는 과정입니다. Ca2+/칼모듈린 의존성 단백질 키나제 II(CAMKII) 신호 전달 경로는 연골 세포 기능 회복을 매개하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 이 연구에서 우리는 인터루킨-1 베타(IL-1β) 자극 연골 세포에서 EP4, 이노시톨 1,4,5-트리스포스페이트 수용체(IP3R) 및 인산화된 CaMKII의 발현 증가를 관찰하여 EP4 신호 전달과 칼슘 조절 장애 사이의 가능한 연관성을 시사합니다. 그러나 PTOA에서 EP4-Ca2+/CaMKII 축의 관여를 확인하는 직접적인 증거는 아직 부족합니다. 이 잠재적 메커니즘을 명확히 하기 위해서는 유전적 또는 약리학적 개입을 사용한 추가 조사가 필요합니다. 이러한 발견은 PTOA 치료의 표적으로서 칼슘 항상성 및 EP4 신호 전달을 탐색하기 위한 예비 기초를 제공합니다.

서론

신체 활동은 건강상의 이점을 위해 널리 홍보되고 있지만 여전히 하지 근골격계 부상의 주요 원인으로 남아 있어 다양한 부작용을 초래할 수 있습니다1. 이 중 PTOA는 어린 나이에 관절 부상을 경험하는 청소년 및 청년에게 점점 더 큰 부담이 되고 있습니다2. 놀랍게도 스포츠 관련 관절 부상을 입은 개인의 약 48-52%가 11-17년 이내에 PTOA가 발생합니다 3,4. 청소년 스포츠 및 레크리에이션 활동에서 가장 자주 부상을 입는 관절 중 하나인 무릎 관절은 관절 손상에서 PTOA로 진행되는 데 특히 취약합니다. 전향적 연구에 따르면 무릎 부상을 입은 개인은 부상을 입지 않은 개인에 비해 부상 후 12-20년 후에 방사선학적으로 확인된 무릎 골관절염 발병 위험이 10배 더 높다고 보고했습니다5. 더욱이, 젊은 성인의 경우 방사선학적 평가에 따르면 전방십자인대 절개(ACLT) 부상을 입은 여자 축구 선수는 12년 이내에 PTOA가 발생할 위험이 51%인 반면, 남자 선수는 14년 이내에 41%의 위험이 있는 것으로 나타났습니다5. 이러한 발견은 스포츠 관련 관절 부상이 근골격계 건강에 미치는 장기적인 부정적인 영향을 강조합니다. 따라서 PTOA 발달의 기초가 되는 돌이킬 수 없는 병리학적 메커니즘을 이해하는 것은 질병 진행을 완화하기 위한 적절한 개입 전략을 식별하는 데 중요합니다.

Ca2+ 항상성의 조기 조절 장애는 PTOA 시작의 주요 지표 중 하나입니다6. Ca2+ 는 칼모듈린(CaM)에 결합하여 CaMKII와 상호 작용할 수 있는 Ca2+/CaM 복합체를 형성하여 자가억제 형태를 완화하고 키나아제 활성을 조절합니다7. 인간과 쥐 OA 모두에서 인산화된 CaMKII(CaMKII의 활성화된 형태)의 발현이 증가하는 반면, CaMKII 억제제의 사용은 인산화 수준의 이러한 상승을 차단하여 관절 연골 파괴를 유발합니다.8, OA 연골 항상성을 매개하는 Ca2+/CaMKII의 중요한 조절 역할을 입증합니다. 일반적으로 이러한 변화는 PTOA 발달에서 염증 메커니즘의 활성화에 의해 결정적으로 영향을 받습니다. 주요 전염증성 통증 매개체인 높은 수준의 PGE2는 EP4 수용체를 활성화하여 OA의 진행에 영향을 미칩니다. 구체적으로, 관절 연골에서 EP4의 조건부 녹아웃은 연골 형성 및 단백 동화 대사를 향상시키는 동시에 연골 세포 비대 및 이화 작용을 억제하여 섬유 연골 대신 안정적이고 성숙한 관절 연골의 재생을 촉진하고 관절 통증을 완화합니다9. 연골세포 생리학에서 Ca2+/CaMKII 신호 전달 경로의 중요한 역할과 골관절염 진행에 EP4 수용체의 관여가 인식된 점을 감안할 때, 이 연구는 EP4 활성화가 PTOA 발달 중 칼슘 신호 전달 및 미토콘드리아 기능 장애의 변화와 관련이 있는지 여부를 조사하는 것을 목표로 했습니다. EP4와 Ca²⁺ 조절 장애 사이의 인과 관계는 아직 결정되지 않았지만 여기의 데이터는 추가 조사가 필요한 가능한 기계적 연관성을 시사합니다.

이 연구는 PTOA 발달 중 EP4 수용체 활성화와 Ca²⁺ 신호 전달 및 미토콘드리아 기능 장애를 연결하는 잠재적 메커니즘에 초점을 맞춥니다. PTOA 진행을 감지하는 영상 기술과 같은 전통적인 진단 방법과 증상 완화를 위한 비스테로이드성 항염증제(NSAID)와 같은 현재의 치료 접근법과 비교할 때 우리의 접근법은 PTOA 병인에서 초기 세포 내 신호 전달 장애를 밝히는 것을 목표로 합니다. 이러한 기계론적 통찰력은 질병의 발병 및 진행에 대한 보다 정확한 이해를 제공하여 조기 진단 및 표적 개입을 위한 새로운 방법을 제공합니다. 따라서 본 연구에서는 급성 또는 만성 신체 활동 중 운동 조절 장애가 있는 운동선수에게서 흔히 볼 수 있는 기계적 손상을 모방하기 위해 전방십자인대 절개술(ACLT)에 의해 유도된 PTOA 쥐 모델을 확립했습니다. 이 모델은 외상 후 기계적 관절 손상을 최적으로 표현하는 역할을 하며 조직병리학적 변화와 근본적인 분자 메커니즘을 모두 조사할 수 있는 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 고지방 식단과 습한 환경 노출(FD) 그룹은 만성 골관절염과 관련된 대사 및 환경 위험 요인을 시뮬레이션하는 것을 목표로 양성 대조군 역할을 합니다. 전자는 기계적 외상으로 인한 급성 손상을 모델링하는 반면, 후자는 대사 장애 및 환경 요인에 의해 유발된 자연 발생 질병 모델을 나타내지만 이 그룹의 최종 병인은 EP4-Ca²-미토콘드리아 축을 따르지 않을 수 있습니다.

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프로토콜

동물과 관련된 모든 실험 절차는 광동성 한의학 병원의 동물 윤리 위원회(윤리 승인 번호: 2024014-2)의 검토 및 승인을 받았습니다. 이 연구는 중화인민공화국 국무원이 규정한 실험동물의 윤리적 사용에 관한 규정에 따라 수행되었습니다.

1. 동물

  1. Sprague-Dawley(SD) 근친 교배 SPF 쥐를 사용하여 발정 주기와 관련된 잠재적인 교란 효과를 줄입니다. 이 실험을 위해 생후 4주, 체중이 90g에서 100g 사이인 총 9마리의 수컷 SD 쥐를 선택합니다.
    참고: 이 쥐는 중국의 허가된 실험 동물 공급업체(인증서 번호: 20240410Aazz0619000774)로부터 공급되었습니다.
  2. 모든 동물을 특정 병원균이 없는(SPF) 환경에서 유지하십시오. 평균 습도 60 ± 1%의 24 ± 2°C의 온도와 12시간의 밝은/어두운 주기로 통제된 환경을 유지합니다.
  3. 쥐가 산성화된 물과 표준 설치류 식단에 자유롭게 접근할 수 있도록 하십시오.

2. 동물 모델 구축 및 개입

  1. 먹이 센터에서 2주 동안 쥐를 적응시키십시오. 생후 6주에 쥐를 대조군, PTOA 그룹 및 FD 그룹의 세 그룹으로 무작위로 할당하고 각 그룹에 3마리의 쥐를 배치합니다.
  2. 표준 조건에서 대조군을 유지합니다.
  3. 이소플루란으로 PTOA 그룹을 마취합니다(유도의 경우 4%, 유지의 경우 1%-2%).
  4. 내측 슬개골주위 접근법을 사용하여 세로 피부 절개를 통해 양측 무릎 관절을 외과적으로 노출시킵니다.
  5. 메스를 사용하여 ACLT를 수행하고 양성 전방 서랍 테스트를 수행하여 완전한 절단을 확인합니다.
    참고: 모델 일관성을 보장하고 개인차를 줄이기 위해 양측 ACL 절개를 수행했습니다. 분석을 위해 동물당 하나의 값을 얻기 위해 양쪽 무릎의 데이터를 평균화했습니다.
  6. FD 그룹의 쥐를 동일한 시설에 위치한 온도 조절 챔버로 주기적으로 옮깁니다. 이 쥐에게 고지방 식단을 제공하십시오.
    참고: 고지방 식단에는 자당 20%, 라드 15%, 콜레스테롤 1.2%, 콜산나트륨 0.2%, 카제인 10%, 인산수소칼슘 0.6%, 석회석 분말 0.4%, 프리믹스 0.4%, 기초 사료 52.2%가 함유되어 있습니다. 대조군 사료의 영양 프로필은 단백질 19%, 지방 31%, 탄수화물 50%, 칼로리 비율은 단백질 17%, 지방 37%, 탄수화물 46%였습니다.
  7. 기후 챔버 내의 환경 조건을 24 ± 2 °C의 온도, 90 ± 4%의 습도 수준, 12시간의 일일 조명 주기로 유지합니다.
    알림: 이러한 고온 다습 환경에서는 박테리아 성장 위험이 증가하므로 식수와 식품을 소독하고 매일 보충하여 오염을 최소화하십시오. 실험적 개입의 총 기간은 12주였습니다.

3. 보행 분석(발자국)

  1. 이전에 설명한 방법을 사용하여 모델 쥐에서 치료 시작 후 12주 후에 발자국 분석을 수행합니다10.
  2. 쥐의 뒷발의 복부 표면에 빨간색 잉크를 바르고 흰 종이로 덮인 길이 100cm, 너비 8cm의 길을 따라 걸을 수 있었습니다.
  3. 쥐가 움직이도록 장려하려면 길 끝에 어두운 방을 배치하여 앞으로 움직이도록 장려하십시오.
  4. 불규칙성을 평가하는 데 사용된 보폭과 보폭을 포함하여 각 매개변수에 대한 평균값을 얻기 위해 세 번의 순차적 측정을 수행합니다.
  5. 두 개의 연속적인 단계 사이에서 동일한 뒷발이 이동한 거리를 측정하여 보폭(cm)을 결정합니다.
  6. 보폭(cm)을 왼쪽 뒷발과 오른쪽 뒷발 사이의 수평 거리로 정의합니다.
  7. 발 각도(°)를 수평선11을 기준으로 두 번째 발가락과 종골 사이의 각도로 측정합니다.
  8. 내장된 거리 및 각도 측정 도구를 활용하여 Image-Pro Plus 소프트웨어(버전 6.0)를 사용하여 스캔한 발자국 이미지에서 직접 보폭, 보폭 및 발 각도를 측정합니다.
    참고: 이러한 보행 매개변수는 골관절염의 초기 단계에서 미묘한 기능 장애를 식별하는 데 중요합니다. 환자는 통증이 있는 관절을 보호하기 위해 보폭과 보폭이 감소할 수 있으며, 통증으로 인한 관절 불안정성에 대한 보상 반응으로 발가락 각도 증가와 보행 비대칭이 종종 발생합니다.

4. 조인트 직경 측정

  1. 각 그룹에서 모델링한 후 보정된 나선형 마이크로미터(mm)를 사용하여 관절 직경을 측정합니다.
    참고: 골관절염이 진행됨에 따라 환자는 일반적으로 관절 부종과 통증을 나타냅니다. 부기 정도가 높을수록 질병의 더 심각한 단계를 나타낼 수 있습니다.

5. 악력 측정

  1. 견인 그리드가 장착된 디지털 악력 측정기, 견인 그리드가 장착된 근력 측정기(90mm × 90mm)를 사용하여 뒷다리 악력을 측정합니다.
    1. 쥐의 꼬리와 목 뒤쪽 피부를 부드럽게 잡습니다.
    2. 뒷다리가 그리드를 단단히 잡을 때까지 동물을 내린 다음 그립을 놓을 때까지 힘 센서의 축을 따라 동물을 수평으로 꾸준히 당깁니다.
    3. 동물당 테스트를 세 번 반복합니다. 가장 높은 값을 최대 악력으로 기록합니다.
      알림: 뒷다리 악력 테스트 중에 앞다리가 견인 그리드에 우발적으로 맞물리는 것을 방지하기 위해 앞다리를 판지 표면에 테이프로 붙여 고정하십시오. 악력 감소는 골관절염 진행과 관련된 근육 기능 감소 및 잠재적인 통증 관련 운동 장애를 나타냅니다.

6. 일차 연골 세포 분리 및 배양

  1. 6주 된 수컷 Sprague-Dawley 쥐로부터 일차 연골 세포를 분리합니다.
  2. 대퇴골두와 경골 고원을 해부하여 약 100-150mg의 연골 조직을 수집합니다.
  3. 1% 페니실린-스트렙토마이신을 함유한 PBS로 조직을 두 번 세척합니다.
  4. 연골을 5mL의 0.25% 트립신-EDTA에서 3°C에서 30분 동안 소화합니다.
  5. 연골을 1-2mm3 개로 자르고 0.2% 콜라게나제 II 10mL를 37°C에서 항온 셰이커에서 4시간 동안 추가로 분해합니다.
  6. 70μm 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하고 300× g 에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  7. 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  8. 5% CO2가 포함된 가습 분위기에서 3°C에서 세포를 배양합니다.

7. 세포 치료

  1. 혈구계를 사용하여 분리된 연골 세포를 계산합니다.
  2. 0.1mL의 완전 배양 배지(10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F12)에서 웰당 2 × 105 세포의 밀도로 연골 세포를 6웰 플레이트에 시딩합니다.
  3. 접착을 허용하기 위해 5% CO₂ 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
  4. 시험관 내 염증성 PTOA 모델을 확립하기 위해 세포 합류가 약 80%에 도달하면 48시간 동안 IL-1β(10ng/mL)로 부착 연골 세포를 처리합니다.
  5. FD 양성 대조군의 경우, 팔미트산(PA, CAS No. 57-11-4)을 클로로포름에 1:1000 희석으로 용해시켜 500μM 원액을 제조합니다.
    1. 세포 합류가 약 80%에 도달하면 배양 배지 1mL당 PA 원액 1μL를 첨가하여 최종 PA 농도 500nM에 도달합니다. 이 용액으로 연골 세포를 48시간 동안 치료합니다.
  6. PA가 없는 대조군 세포를 위해 배양 배지 1mL당 1μL의 클로로포름(비히클 대조군)을 첨가합니다.

8. 샘플 수집, 석회질 제거 및 포매 준비

  1. 개입 후 12주에 밀봉된 챔버에서 최소 5분 동안 과다 복용한 이소플루란(≥5%)을 흡입하여 동물을 안락사시키고 호흡과 심장 박동의 완전한 중단을 확인합니다.
    참고: 이 방법은 동물 윤리 위원회의 승인을 받았으며 실험 동물의 인도적 안락사에 대한 국가 지침을 준수했습니다.
  2. 조직학적 평가를 위해 그룹당 3마리의 쥐(n = 3, 총 = 6개의 무릎)로부터 양쪽 무릎 관절을 수집합니다.
  3. 4% 파라포름알데히드(PFA)에 시료를 1:20 이상의 조직 대 고정액 부피 비율로 °C에서 셰이커에서 48시간 이상 고정합니다.
  4. 흐르는 수돗물로 티슈를 1-2시간 동안 헹구어 잔류 고정액을 제거합니다.
  5. 0.5M EDTA 용액(pH 7.4, ~15%)에서 조직 대 용액 비율 1:20으로 3°C에서 21일 동안 조직을 탈회하고 3일마다 신선한 용액으로 교체합니다.
  6. 연화를 위해 바늘로 뼈를 조사하여 석회질 제거 완료를 평가합니다.
  7. 흐르는 수돗물로 석회질이 제거된 조직을 2시간 동안 세척한 후 포매 카세트에 넣습니다.
  8. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 통해 샘플을 탈수합니다: 75% 에탄올을 2시간(또는 하룻밤), 80% 에탄올을 2시간 동안 2시간, 95% 에탄올을 0.5시간 동안 및 무수 에탄올을 60분 동안 두 번 사용합니다. 그런 다음 1:1 자일렌:에탄올에 20분 동안 담급니다.
  9. 자일렌에서 조직을 두 번(10분 및 60분) 제거합니다.
  10. 자일렌:파라핀(1:1)을 15분 동안 사용하고, 연질 파라핀을 52-5°C에서 1시간(2회) 동안 투여한 다음 경질 파라핀을 56-5°C에서 30분 동안 침투시킵니다.
  11. 파라핀 포매 시스템(예: 라이카, 6°C로 설정)을 사용하여 조직을 포매하고 블록을 -2°C 냉각판에 2시간 동안 옮깁니다.
  12. 파라핀 절편은 마이크로톰을 사용하여 μm 두께로 시상적으로 차단합니다.
  13. 리본을 4°C 수조에 띄우고 깨끗한 유리 슬라이드에 장착합니다.
  14. 장착된 절편을 자연 건조하고 60°C 오븐에서 2시간 동안 구워 잔류 파라핀을 제거합니다.
  15. 자일렌(10분), 신선한 자일렌(10분), 무수 에탄올(5분), 신선한 무수 에탄올(5분), 90% 에탄올(5분) 및 75% 에탄올(5분)에 순차적으로 담가 절편을 탈파라핀화한 다음 염색하기 전에 수돗물로 헹구십시오.

9. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색

  1. 탈파라핀화 및 재수화된 조직 절편을 실온(RT; ~2°C)에서 3-5분 동안 0.5% 헤마트실린 염색 용액에 담근 후 흐르는 수돗물로 철저히 헹구었습니다.
  2. 헤마톡실린 분화 용액으로 절편을 2-5초 동안 간략하게 처리하고 흐르는 수돗물로 헹굽니다.
  3. 절편을 헤마트톡실린 블루잉 용액에 2-5초 동안 담근 후 헹구어 블루잉을 수행합니다.
  4. 절편을 85% 및 95% 에탄올로 각각 5분 동안 탈수한 다음 0.05% 에오신 Y(알코올)에서 5분 동안 염색합니다.
  5. 무수 에탄올에서 두 번 탈수한 다음(각각 5분) 자일렌에서 제거한 다음(5분), 신선한 자일렌(5분)에서 제거합니다.
  6. 중성 발삼으로 섹션을 장착하고 커버슬립으로 덮습니다.
    참고: 잘 보존된 연골에서 헤마톡실린은 핵을 파란색으로 염색하고 에오신은 매트릭스를 분홍색으로 염색합니다. 손상된 연골은 연골 세포 손실, 세동 및 무질서한 기질을 나타냅니다.

10. 사프라닌 O - 빠른 녹색(SOFG) 염색

  1. RT에서 1-5분 동안 2% Fast Green 용액으로 절편을 염색합니다. 연골이 무색이 될 때까지 흐르는 수돗물로 씻습니다.
  2. 10-15초 동안 1% 염산에서 절편을 간략하게 구별한 다음 흐르는 물로 철저히 헹굽니다.
  3. 0.2% 사프라닌 O 용액으로 절편을 5-10초 동안 염색한 다음 무수 에탄올의 4가지 변화(각각 3-5초)를 통해 빠르게 탈수합니다.
  4. 자일렌에서 절편을 제거한 다음(5분) 신선한 자일렌(5분).
  5. 중성 발삼으로 슬라이드를 장착하고 커버슬립으로 덮습니다.
    참고: 사프라닌 O는 연골 프로테오글리칸을 빨간색으로 염색하고 패스트 그린은 뼈/섬유 조직을 녹색으로 염색합니다. 빨간색이 손실되면 프로테오글리칸 고갈 및 퇴행을 나타냅니다.
  6. OARSI(Osteoarthritis Research Society International) 채점 시스템을 사용하여 조직학적 변화를 평가합니다. 관절 공간 너비와 연골 두께를 측정하여 구조적 변성을 평가합니다. 광학 현미경(예: ECLIPSE Ti2-E)에서 4×(스케일 바 = 50μm) 및 20x(스케일 바 = 10μm)에서 이미지를 캡처합니다.
    참고: 이미지 캡처에는 시스템의 이미징 소프트웨어를 사용하고 분석에는 ImageJ(v1.48v)를 사용하십시오. 마이크로미터로 Analyze > Set Scale 을 통해 이미지를 보정합니다. 각 관절에 대해 3명의 독립적인 관찰자에 의한 맹검 분석을 사용하여 3개의 시상 섹션에서 5개의 무작위 필드를 정량화합니다.

11. 마이크로 μ CT

  1. 개입 후 12주 후에 쥐 무릎 관절을 해부하고 조직 형태를 보존하기 위해 RT에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 즉시 고정합니다.
  2. 고정된 샘플을 PBS로 헹구고 스캔할 때까지 70% 에탄올에 보관합니다.
  3. 스캔하기 전에 각 무릎 관절 표본을 전용 샘플 홀더에 장착합니다. 모션 아티팩트를 최소화하기 위해 장축을 따라 조인트를 정렬합니다.
  4. X선 전압 70kV, 전류 100μA, 전력 7W의 스캐닝 매개변수가 있는 micro-μCT 시스템을 사용하여 micro-μCT 스캐닝을 수행합니다.
  5. 프로젝션당 4개의 프레임을 획득하고 이를 쌓아 이미지 품질을 향상시키며, 회전 스텝 크기는 0.72°로 전체 360° 회전을 완료합니다.
  6. 결과 복셀 크기(슬라이스 두께)를 15μm로 설정하여 섬유주골 분석에 적합한 고해상도 이미지를 제공합니다.
  7. 대퇴골과 경골의 연골하골에 초점을 맞춰 근위 경골 성장판과 경골 고원 사이의 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
  8. 재구성 소프트웨어를 사용하여 원시 스캔 데이터를 단면 이미지로 재구성합니다.
  9. 정량적 형태 측정 분석을 위해 재구성된 이미지 스택을 적절한 소프트웨어로 가져옵니다.
  10. 골 부피 분율(BV/TV, %), 골밀도(BMD, g/cm³) 및 섬유주 분리(Tb.Sp, mm)를 포함한 주요 매개변수를 평가합니다.
  11. 정성적 및 3차원 시각화를 위해 3D 시각화 소프트웨어를 사용하여 뼈 미세 구조의 체적 렌더링을 생성합니다.
  12. 정량적 데이터에서 관찰된 구조적 무결성 및 형태학적 변화를 확인하기 위해 시각적 평가를 수행합니다.
    참고: 모든 이미지 처리 및 분석은 편견 없는 결과를 보장하기 위해 맹검 작업자가 수행했습니다.

12. 엘리사

  1. 개입 후 12주 후에 쥐를 마취합니다. 복부 대동맥을 조심스럽게 노출시키고 해부하여 혈액 샘플을 채취합니다.
  2. 채취한 혈액을 RT에서 30분 동안 응고시킨 다음 755 × g (로터 반경 7.5cm의 원심분리기를 사용하여 3000rpm에 해당)에서 °C에서 15분 동안 원심분리합니다.
  3. 시중에서 판매되는 ELISA 키트를 사용하여 PGE₂ 수치를 후속 측정하기 위해 혈청을 분리하여 보관합니다.
  4. 동시에, 1차 연골 세포를 시드하고 24시간 동안 배양한 후 확립된 세포 처리 프로토콜에 따라 48시간 동안 IL-1β 및 PA로 처리합니다. 개입 후 동일한 ELISA 키트를 사용하여 PGE₂ 농도에 대한 배양 상청액을 수집하고 분석합니다.

13. 정량적 RT-PCR

  1. 상업용 RNA 추출 시약(TRIzol)을 사용하여 세포 샘플에서 총 RNA를 추출합니다.
  2. 역전사 키트(gDNA 제거제 포함)를 사용하여 cDNA를 합성하고 후속 분석을 위해 생성된 cDNA를 -8°C에서 보관합니다.
  3. SYBR Green을 사용하여 정량적 PCR을 수행하고 2-ΔΔCt 방법을 사용하여 상대 발현 수준을 계산합니다.
    참고: 사용된 프라이머 서열은 다음과 같습니다: β-액틴 포워드: ACAACCTTCTTGCAGCTCCTC; β-액틴 역방향: CTGACCCATACCCACACAC; EP4 앞으로: GGCACATTGTTGGTAAGCCC; EP4 앞으로: GGCTGTAGAAGTAGGCGTGG; COX-2 포워드: GATGACGAGCGACTGTTCCA; COX-2 역방향: TGGTAACCGCTCAGGTGTTG.

14. 웨스턴 블로팅 분석

  1. 얼음 위에 RIPA 완충액으로 세포를 30분 동안 용해합니다.
  2. SDS-PAGE로 단백질 샘플을 90분 동안 분리한 다음 2시간 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮깁니다.
  3. 5% BSA로 멤브레인을 차단하고 인산염 완충액으로 세척합니다.
  4. 특정 항체를 사용하여 면역블로팅을 수행합니다.
    참고: 항체 및 각각의 희석액은 다음과 같습니다: 항-MMP9 (1:1000), 항-콜라겐 II (1:1000), 항-COX2 (1:1000), 항-CaMKII (1:1000), 항-p-CaMKII (1:1000), 항-IP3R (1:1000), 항-Cyt-C (1:1000) 및 항-β-액틴 (1:2000).
  5. 1차 항체와 하룻밤 배양한 후, 막을 TBST로 세척하고 2차 항체(마우스-HRP(1:2000) 또는 토끼-HRP(1:2000))와 함께 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. TBST로 다시 세척한 후 향상된 화학발광 키트를 사용하여 단백질 검출을 수행합니다.
  7. ImageJ 소프트웨어(버전 1.48v)로 데이터를 분석합니다.

15. 면역형광염색

  1. 연골세포가 80% 합류에 도달할 때까지 12웰 플레이트의 커버슬립에서 연골세포를 배양합니다.
  2. IL-1β 및 PA로 48시간 동안 처리하거나 대조군으로 처리하지 않은 후, RT에서 15분 동안 PBS에서 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정합니다.
  3. 0.2% Triton X-100을 함유한 PBS로 세포를 15분 동안 투과화합니다.
  4. 세포를 PBS로 3회(각각 5분) 세척한 다음 1차 항체(항-IP3R, 1:200 희석액)와 함께 °C에서 밤새 배양합니다.
  5. 세포를 플루오레세인 이소티오시아네이트 표지 염소 항토끼 IgG 2차 항체의 1:500 희석액에 1시간 동안 노출시킵니다.
  6. 5μg/mL DAPI 용액으로 세포를 10분 동안 대조염색합니다.
    참고: 형광 이미지는 40x 대물 렌즈(스케일 바 = 2μm)를 사용하여 획득되었습니다. 모든 이미지는 ZEN 소프트웨어로 처리되고 일관된 보정 절차에 따라 ImageJ(버전 1.48v)로 정량화되었습니다.

16. 통계 분석

  1. GraphPad Prism(버전 8.0.2)을 사용하여 통계 분석을 수행합니다.
  2. 파라메트릭 검정을 적용하기 전에 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 정규 분포에 대한 데이터를 평가하고 Brown-Forsythe 및 Bartlett 검정을 사용하여 분산의 동질성에 대해 데이터를 평가합니다.
  3. 여러 그룹 간의 비교를 위해 일원 분산 분석과 Tukey의 사후 검정을 사용하고 두 그룹 비교를 위해 양측 짝이 없는 스튜던트 t-검정을 적용합니다.
  4. 0.05 미만의 P-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.
  5. 모든 데이터를 최소 3개의 독립적인 실험에서 평균 ± 표준 편차(SD)로 제시합니다.

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결과

ACLT 유발 PTOA는 FD 유발 만성 KOA에 비해 조기 연골 파괴 및 행동 결함을 나타냅니다(그림 2 및 그림 3)
관절 공간 협착과 연골 변성은 골관절염의 주요 결과입니다. 이전 연구에서는 과체중 및 환경 요인(예: 습한 기후)이 OA 발병의 잠재적 원인으로 확인되었으며12,13, 이는 노화와 직접적인 관련이 있고 노년기에 OA 발병으로 이어질 수 있습니다. 본 연구에서는 스포츠 관련 외상이 골관절염 진행을 가속화할 수 있는지 알아보기 위해 ACLT 유발 외상군을 PTOA 모델로, FD 모델을 만성 골관절염에 대한 양성 대조군으로 설정하였다. 쥐의 관절 표면 형태, 조직병리학적 변화 및 연골하 뼈 미세 구조를 검사하여...

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토론

환경 및 식이 요인에 의해 유발된 만성 OA에 비해 ACLT 유발 관절 외상은 질병의 더 빠른 진행으로 이어집니다. 관절 부종, 뒷다리 악력, 보행 분석을 포함한 행동 평가를 기반으로 한 결과, 환경 및 식이 요인에 의해 유발된 대조군, PTOA 그룹 및 양성 대조군 간에 유의미한 차이가 나타났습니다. 개입 12주 후, PTOA군에서 뒷다리 악력의 현저한 감소와 불안정한 보행을 동반한 과도한 관절 부종이 관찰되어 검체 채취에 적합한 시점을 나타냈다. 두 개입 모델에서 OA 진행에 대한 추가 평가는 H&E 염색, SOFG 염색 및 마이크로 μCT 분석을 통해 수행되었습니다. 조직학적 검사 결과 PTOA 그룹은 관절 공간 협착과 연골 얇아짐이 더 뚜렷한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, FD 그룹의 OA 병리는 초기 행동 변화에 비해 이 단계에서 덜 분명했습니다. 또한 조직학적 소견과의 상관관계를 강화하기 위해 micro-μCT 분석을 수행한 결과, 거의 모든 측정된 매개...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학재단(No. 82205147; 62472046번); 광동성 체육국 과학연구프로젝트(GDSS2024N038); 광저우 중의과대학(GZYFT2024G08)의 대학-병원 공동 기금 프로젝트.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.2% 콜라게나제 IISigma-Aldrich, 미국CAS 번호: 9001-12-1일차 연골 세포 분리 및 배양
0.2% 트리톤 X-100Beyotime, 중국ST795면역형광
0.25% 트립신-EDTA우한 보스터 생물학적 기술 Co., Ltd.AR1071석회질 제거
0.25% 트립신-EDTAGibco, 미국25200072일차 연골 세포 분리 및 배양
4% 파라포름알데히드 고정액Biyuntian, 중국P0099-3L조직 고정
항-CaMKII 항체Huabio, 중국ET1608-47웨스턴 블롯(1:1000)
항-콜라겐 II 항체Abcam, 영국AB34712웨스턴 블롯(1:1000)
항-COX2 항체Abcam, 영국AB179800웨스턴 블롯(1:1000)
항-Cyt-C 항체Selleck, 중국F2534웨스턴 블롯(1:1000)
항-IP3R 항체 (B-2)미국 산타크루즈SC-377518웨스턴 블롯(1:1000)
항-MMP9 항체Abcam, 영국AB76003웨스턴 블롯(1:1000)
항-p-CaMKII 항체Selleck, 중국F0342웨스턴 블롯(1:1000)
항-&-액틴 항체미국 세포 신호 전달 기술(CST)8시간 10일 10일웨스턴 블롯 (1:2000)
BSA 차단 솔루션시그마 알드리치, 미국해당 사항 없음웨스턴 블롯 차단을 위한 5% BSA
원심분리기(5424 R)Eppendorf, 독일해당 사항 없음755 &회; g 원심분리 속도
클로로포름시그마 알드리치, 미국해당 사항 없음PA용 용매
온도 조절 챔버(RXZ-158A)국내 제조업체, 중국해당 사항 없음습한 환경 모델
컬러 역전사 키트Invitrogen, 쑤저우, 중국해당 사항 없음cDNA 합성
CTAn 소프트웨어 브루커버전 1.9 및 4.1정량적 형태 측정 분석용
CTVol 소프트웨어 브루커버전 2.0정성적 및 3차원 시각화를 위해
DAPI 염색 솔루션Beyotime, 중국해당 사항 없음핵 염색(5 & micro; g/mL)
디지털 악력 측정기푸신 악기해당 사항 없음뒷다리 악력 측정
DMEM/F12 미디엄코닝, 미국해당 사항 없음세포 배양 배지
EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)알라딘해당 사항 없음뼈 조직의 석회질 제거
PGE2용 ELISA 키트Elabscience, 우한, 중국PGE2E-EL-0034ELISA 검출
강화된 화학발광 키트Millipore, 미국WBKLS0500웨스턴 블롯 검출
에탄올광동 광시 시약 기술 유한 회사CAS: 64-17-5조직 탈수
태아 소 혈청(FBS)코닝, 미국해당 사항 없음배양용 농도 10%
FITC 표지 염소 항토끼 IgGBeyotime, 중국P0179 키트면역형광(1:500)
그래프패드 프리즘GraphPad 소프트웨어, 미국버전 8.0.2데이터 분석
헤마톡실린 및 에오신(H& E) 염색 키트Servicebio, 우한지1005조직학
IL-1&베타;PeproTech, 미국400-01BPTOA 세포 모델의 경우 10 ng/mL
이미지J미국 NIH버전 1.48v이미지 분석
Image-Pro Plus 소프트웨어미디어 사이버네틱스버전 6.0스캔한 발자국에서 정량적 보행 분석
이소플루란상하이 야지 생물학YS1412C동물 수술용 마취
라이카 임베딩 센터라이카 마이크로시스템즈EG1160파라핀 포베딩
라이카 마이크로톰라이카 마이크로시스템즈2235 링깃파라핀 포매 조직 절편
라이카 워터 배스라이카 마이크로시스템즈하이1210플로팅 파라핀 섹션
광학 현미경(ECLIPSE Ti2-E)Nikon, 일본해당 사항 없음조직학적 관찰
마이크로 CT 스캐너(ZKKS-MCT-Sharp)국내 제조업체, 중국해당 사항 없음뼈 영상
마우스-HRP 2차 항체미국 세포 신호 전달 기술(CST)70761:2000 희석
NIS-Elements 이미징 소프트웨어니콘해당 사항 없음현미경 이미지 캡처 및 분석
NRecon 소프트웨어Bruker, 독일버전 1.6CT 재구성
팔미트산(PA)시그마 알드리치, 미국P0500500 & 마이크로; FD 셀 모델용 M 재고
절편용 파라핀 왁스, 병리학 등급, 녹는점 52-54 &g; C광동 광시 시약 기술 유한 회사Y258797-500g조직 처리 중 파라핀 포매에 사용
절편용 파라핀 왁스, 병리학 등급, 녹는점 56-58 &g; C광동 광시 시약 기술 유한 회사Y258799-500g조직 절편에서 최종 하드 왁스 포매에 사용됩니다.
PBS(인산염 완충 식염수)Gibco / 써모 피셔C10010500BT세포 세척 및 조직 헹굼
페니실린-스트렙토마이신코닝, 미국해당 사항 없음세포 배양용 1%
PVDF 멤브레인(0.45 & micro; m)Millipore, 미국IPVH00010웨스턴 블롯 멤브레인
Rabbit-HRP 2차 항체미국 세포 신호 전달 기술(CST)70741:2000 희석
빨간색 잉크영웅영웅 204보행 분석의 발자국 추적
RIPA 용해 완충액Keygen, 중국해당 사항 없음단백질 추출
사프라닌 O– 빠른 녹색 염색 키트Servicebio, 우한지1053조직학적 염색
나선형 마이크로미터(버니어 캘리퍼스)황산, 중국해당 사항 없음관절 폭 측정
연골하 뼈 분석 소프트웨어(CTAn)Bruker, 독일버전 1.9 및 4.1형태 측정 분석
SYBR 그린 PCR 마스터 믹스AG Scientific, 중국해당 사항 없음qPCR 분석
웨스턴 블롯 시약(RIPA 완충액, SDS-PAGE 겔 성분, 로딩 완충액, TBST 등)비요타임 바이오테크놀로지(중국)N/A(그룹 항목으로 사용)웨스턴 블로팅 절차에 사용되는 모든 일상적인 시약
자일렌광동 광시 시약 기술 유한 회사CAS: 1330-20-7조직 청소

참고문헌

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PGE2 EP4 신호전달연골 퇴행연골세포 기능칼슘 신호전달CaMKII 경로EP4 수용체연골 항상성IP3R 발현인터루킨-1 베타

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