방법 논문

RNA In situ 하이브리드화와 순차적 단백질 면역형광 in 탠덤 분석

DOI:

10.3791/68615

⸱

2025년 10월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hematopoietic Biology & Malignancy, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Melanoma Medical Oncology Research, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 5Department of Veterinary Medicine & Surgery, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 표적 세포 수준 공간 다중 오믹스를 특성화하기 위해 자동화된 플랫폼에서 조직에서 순차적 단백질 면역형광과 RNA in situ 혼성화를 자세히 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

숙주 내 세포의 기능은 고립된 신호에 의존하지 않습니다. 대신 가장 작은 RNA 분자부터 가장 큰 단백질에 이르기까지 모든 구성 요소가 인체 내에서 조화롭고 조정되어 작동해야 합니다. 따라서 여러 오믹스에 걸쳐 세포 수준의 공간 조사를 통합하는 접근 방식의 중요성은 세포-세포 상호 작용 및 질병의 진행을 이해하는 데 가장 중요합니다. 동일한 공간 분석에서 프로테옴과 전사체를 해부하면 세포가 수행하도록 지시되는 것(RNA)뿐만 아니라 세포가 발견하는 미세 환경 틈새(단백질)의 맥락에서 이러한 명령을 실행하는 방법을 이해하는 데 도움이 됩니다. 이 원고는 공간적 맥락에서 고처리량 단백질 및 RNA 조사를 위한 조직 내 미세유체공학 구동 시스템(seqRNA-ISH+seqIF)과 순차적 면역형광(SeqIF)을 통합하는 데 중점을 두고 있으며, 단일 실행에서 최대 12개의 RNA 및 24개의 단백질 표적을 허용하고 추가 단백질 표적을 추가할 수 있습니다. 순차적 실행. 이 방법은 형광단 호환성을 고려하지 않고 더 높은 플렉싱을 위한 광범위한 최적화를 고려할 필요가 없는 순차적 표적 멀티오믹스 플랫폼을 제공합니다. 이를 통해 세포가 어떤 메시지를 프라이밍하거나 미세 환경으로 보내고 있는지 이해할 수 있습니다. 이 표적 접근 방식은 RNA와 단백질 간의 상호 작용을 보다 정확한 방식으로 검사하면서 전체 전사체 방법을 검증하는 데 도움이 됩니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

인체 내 세포의 복잡한 기능은 작은 RNA 분자에서 큰 단백질에 이르기까지 신호의 복잡한 상호 작용에 의존하며, 모두 조정되어 작동합니다1. 이 상호 작용은 다양한 오믹스 층 2,3에서 세포 수준의 공간 상호 작용을 조사하는 통합 접근 방식의 중요성을 강조합니다. 이러한 방법론은 세포-세포 상호 작용과 질병 진행의 복잡성을 이해하는 데 필수적입니다. 유세포 분석법4 및 단일 세포 시퀀싱5과 같은 많은 전통적인 방법, 세포 분리주는 특정 샘플 내에 존재하는 표현형의 대량 비율을 식별하기 위해 분해된 샘플을 조사하는 데 사용됩니다. 그러나 분석을 위해 세포를 분리하면 활성화 또는 표현형 변화를 유도할 수 있으며, 이는 세포의 천연 생물학 및 제자리 기능을 정확하게 반영하지 않을 수 있습니다 6. 공간 생물학의 고급 방법은 여러 분자 유형에 걸쳐 조직 구조의 맥락 및 인접 세포와의 공간적 관계를 손상시키지 않으면서 세포와 미세 환경을 연구하는 새로운 전략을 제공합니다 2,7.

개별 세포를 분리하지 않고 동일한 공간 분석 내에서 전사체 및 프로테옴 분석을 통합하면 세포 기능에 대한 포괄적인 관점을 얻을 수 있습니다8. 이 방법은 단일 분자 RNA 형광 제자리 혼성화(FISH) 방법을 기반으로 하지만 순차적인 단백질 조사를 복잡하게 만드는 프로테이나제 분해를 포함하지 않습니다8. 단일 섹션에 사용되는 접근 방식의 유연성은 공간적으로 더 높은 해상도와 섹션을 통합하고 정렬하기 위한 이미지 처리를 줄입니다. 이 접근 방식은 세포(RNA)가 받는 명령과 특정 미세 환경 틈새 시장 내에서 실행(단백질) 모두에 대한 통찰력을 제공합니다. 이러한 정보 계층을 결합함으로써 연구자들은 세포 행동과 의사소통에 대한 더 깊은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

수동 방법이 존재하지만 최근 공간 오믹스 기술의 발전으로 수동 멀티플렉싱을 사용하여 검사되는 더 많은 수의 단백질체학 마커로 더 복잡한 분석이 가능해졌습니다9. 이러한 접근법에는 단백질 및 RNA-ISH 분석(10,11,12,13,14) 및 시스템 특이적 접합 항체 15,16,17, 이미징 질량 세포 분석(IMC)18,19,20을 필요로 하는 자동화된 방법론의 발전이 포함되었습니다 및 기성품 1차 및 2차 항체제를 활용하는 기타 자동화된 형광 순차 단백질체 방법론 2,21,22. 이러한 기술은 단백질체학 또는 표적 접근법을 사용하여 결합된 전사체학과 단백질체학을 촉진했으며 일반적으로 프로브를 통한 RNA와 유사한 접합체를 기반으로 하는 항체를 통한 단백질을 시각화하여 동일한 방법론 또는 기기를 사용하여 동시 또는 순차적인 RNA와 단백질을 공동 검출할 수 있습니다. 세포 활동에 대한 포괄적인 관점을 제공함으로써 이러한 유형의 접근 방식은 세포와 미세 환경 간의 세포 통신에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다. 이는 세포 상호 작용의 복잡성을 해독하는 데 유용한 도구를 제공하여 잠재적으로 정상적인 생리적 과정과 질병 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 밝혀줍니다.

이 프로토콜은 조직 내 미세유체 구동 시스템과 순차적 면역형광(SeqIF)을 통합하기 위한 지침을 제공합니다. 이는 기본 공간 컨텍스트 내에서 RNA 및 단백질을 조사하기 위한 고처리량 도구를 제공합니다. 이 방법(seqRNA-ISH+seqIF)은 단일 실행으로 최대 12개의 RNA 및 24개의 단백질 표적을 허용하며, 순차적 실행을 통해 추가 단백질 표적을 추가할 수 있습니다. 이 프로토콜은 하나의 특정 미세유체 시스템에 초점을 맞추지만 제공된 조직 처리, RNA 품질 보증, 항체 선택 및 적정 지침은 다른 방법론에 적용될 수 있습니다. 그러나 이 방법은 효율적이고 프로테아제가 없는 에피토프 회수를 위해 pH 9.0 항원 회수를 사용하여 프로테아제가 있는 pH 6.0의 기존 RNA-ISH와 달리 일부 표적 전사체학을 제공하는 동시에 프로테옴학 안정성을 개선하여 RNA 프로브 접근성을 증가시키지만 프로테옴8을 보존하지 못합니다. seqRNA-ISH+seqIF 방법은 그림 1에 시각적으로 설명되어 있으며, 1차 및 2차 항체의 부드러운 화학적 제거를 활용하는 1차-2차 항체 페어링 방법을 활용하기 전에 RNA FISH 증폭 후 절단을 보여줍니다. seqIF 및 검출의 순차적 특성은 순차적 방법론을 활용하여 형광단 호환성과 관련된 많은 한계를 극복합니다23. 이는 스펙트럼 중첩에 대한 보상이 필요한 고복합 방법론에서 동시 염색에 필요한 광범위한 최적화의 필요성을 줄입니다23.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 1차 세포감소 수술을 받은 치료 경험이 없는 고급 장액성 난소암 환자로부터 수집한 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편을 사용합니다. 모든 임상 데이터는 텍사스 대학교 MD 앤더슨의 임상시험검토위원회(Institutional Review Board)가 승인한 프로토콜에 따라 부인과 종양학 및 생식의학과의 난소암 저장소에서 얻었습니다. 프론트 데스크 직원은 환자로부터 서면 동의서를 얻었고 공인된 윤리 지침에 따라 연구를 수행했습니다.

참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 시약은 뉴클레아제가 없는 탈이온수로 희석됩니다.

1. 샘플 수정 및 삽입

참고: 고정제 및 고정 기간의 선택은 분석 성능에 큰 영향을 미치며, 일반적으로 공간 분석은 병리학적 구조를 보존하기 때문에 FFPE로 가장 자주 수행됩니다. 이 프로토콜은 FFPE 조직의 사용을 간략하게 설명하며, FFPE 조직 샘플에 대해 다음 프로토콜이 제안됩니다. 그러나 RNA 품질은 단백질 에피토프와 마찬가지로 고정 과정의 영향을 받지만 그 정도는 적습니다. 이러한 고정 방법, 불완전한 고정 및 샘플 분해는 항체 기반 단백질체학에서 비특이적 결합을 증가시킬 수 있습니다. 셋째, 구성 형광은 일반적으로 FFPE 처리 중에 소멸되지만 일부 형광단은 적당히 지속되며 소멸되었는지 확인하기 위해 테스트가 필요합니다.

  1. 균일한 고정을 보장하고 지방으로 인한 확산 장벽을 방지하기 위해 조직을 ≤ 5mm 두께로 절편합니다. RNA와 단백질24를 최적화하기 위해 10% 인산염 완충 포르말린(pH 7.0)에 절편을 4°C에서 24시간 동안 즉시 고정합니다.
  2. 조직 프로세서에서 고정 조직을 처리하거나 다음 단계를 사용하여 수동으로 처리합니다.
    1. (각각 1시간 동안 70%, 75%, 95% 2x, 100% 3x)에서 뉴클레아제가 없는 물에서 분자 등급 에탄올로 조직 절편을 탈수합니다.
    2. 그런 다음 실온(~23°C)에서 조직을 자일렌에 각각 1시간 동안 2회 담급니다.
  3. 파라핀 왁스를 60°C로 예열합니다. 티슈 상자를 파라핀 왁스에 2회 1시간 동안 담그십시오.
  4. 팽창된 티슈를 놓고 티슈를 몰드에 넣고 신선한 파라핀 왁스를 채우고 4°C로 빠르게 식힙니다25.
    참고: RNA에 대한 최상의 결과는 48시간 이내에 모든 단계를 완료함으로써 얻을 수 있습니다.

2. RNA 품질 평가

  1. 세 개의 직렬 섹션을 사용하여 세 개의 슬라이드를 모두 병렬로 실행하거나 대상 패널 앞에서 제어 슬라이드를 실행하여 차단이 충분한지 확인합니다. 쌍을 이룬 양성 대조군 프로브는 하우스키핑 유전자를 표적으로 삼아 조직 전체의 조직 품질과 공간적 무결성을 평가하며, 이는 인내 차이의 영향을 받을 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 대조군에는 UBC(고발현 유전자), PPIB(중등도 발현) 및 POLR2A(저발현)26이 포함됩니다. 각 검출 채널에서 Dab1(토양 박테리아 RNA)과 같은 음성 대조군 프로브 세트를 활용합니다. 선택적으로 표적 프로브와 함께 동일한 샘플에 모든 양성 및 음성 대조군 프로브를 포함합니다. 이 설정에서는 Dab1 음성 대조군을 채널 T2-T4에 배치하고, 양성 대조군을 가장 낮은 발현에서 가장 높은 발현으로 T1, T5 및 T9에 할당하고, 표적 프로브가 나머지 채널을 차지하도록 합니다.
    선택 사항: 또한 RNA 품질을 알 수 없는 샘플의 경우 분포 값 200(DV200 점수)을 결정하는 것이 유용할 수 있습니다. 30점 이상의 DV200 점수가 적극 권장되며, 50점 이상의 고품질 샘플이27점을 선호합니다. 이 점수는 RNA의 품질을 나타내는 지표이며, 샘플 품질이 높을수록 RNA-ISH가 효과적으로 작동할 가능성이 높아집니다27.

3. RNA 주의 사항 및 준비

참고: RNase 영역을 오염을 제거하고 닦은 다음 RNase가 없는 영역을 사용하는 것 외에도 처리 전에 작업 영역에 70% 에탄올을 뿌리는 것이 가장 좋습니다. RNase가 없는 물과 소모품만 사용하고 공급 백에 손을 대지 마십시오. 이러한 예방 조치는 물론 조직/슬라이드를 시원하고 건조하게 유지하는 것은 실험 중에 RNA 무결성을 유지하는 데 필수적입니다.

  1. 마이크로톰으로 양전하를 띤 유리 슬라이드에 절편을 자르고 이미징 영역과 조정되는 슬라이드 중앙에 관심 영역을 배치합니다(시스템에 따라 다름, 여기서는 약 12.5mm x 12.5mm).
    참고: 각 섹션의 이상적인 두께는 FFPE 조직의 경우 4-6μm 사이입니다.
  2. FFPE 슬라이드를 건조한 RNAse 프리 오븐에서 조직이 위를 향하도록 60°C에서 최소 1시간 동안 굽고 그렇지 않으면 분리되기 쉬운 지방 조직 또는 조직의 경우 최대 하룻밤 동안 굽습니다.
  3. 선택적 전처리
    참고: 전처리는 선택 사항이지만 아래에 설명된 대로 특정 단계는 추가로 선택 사항입니다.
    1. 3% 과산화수소 준비: 50mL 원추형 튜브에 5mL의 30% 과산화수소를 45mL의 1x PBS에 첨가합니다. 남은 과산화수소는 실온(~23°C)에서 파라필름으로 뚜껑을 고정하여 최대 3개월 동안 보관합니다.
      참고: 과산화수소는 강력한 산화제입니다. 가연성 물질, 열원 및 금속에서 멀리 보관하십시오. 개인 보호 장비(PPE, 예: 고글, 장갑 및 실험실 가운)가 있는 화학 연기 후드 구역에서 사용하십시오. 피부, 눈, 흡입에 닿지 않도록 하십시오. 노출된 경우 15분 동안 물로 피부를 씻어냅니다. 섭취하거나 흡입한 경우 의사의 도움을 받으십시오. 농도가 높으면 심각한 화상을 입을 수 있으며 유기 물질이나 특정 금속으로 발화하거나 폭발할 수 있습니다. 격렬한 반응을 피하기 위해 항상 물에 과산화수소를 첨가하십시오.
    2. 3.7% 포름알데히드 준비: 화학 흄 후드에 1x PBS 3.3mL당 16% 포름알데히드 1mL를 첨가합니다. 파라필름으로 싸서 포름알데히드를 최대 3개월 동안 보관하십시오.
      알림: 포름알데히드는 심각한 눈 손상, 호흡기 자극을 유발할 수 있으며 암을 유발할 수 있습니다. 장기간 또는 반복적으로 노출되면 피부 감작 및 알레르기 반응이 발생할 수 있습니다. 화학 연기 후드에서만 사용하고 적절한 PPE(장갑, 고글/안면 보호대, 마스크, 실험실 가운 등)를 착용하십시오. 피부 접촉, 눈 접촉 및 흡입을 피하십시오. 열원과 화기에서 멀리 보관하십시오. 파라포름알데히드 및 오염된 물질은 유해 폐기물로 폐기하고, 가능하면 즉시 사용할 수 있도록 필요한 양만 준비하십시오.
    3. 다음을 포함하는 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 조직 슬라이드를 세척하여 탈파라핀화합니다: 자일렌(40mL)을 화학 연기에서 각각 5분씩 3회 세척합니다.
      선택 사항: 자일렌 대신 비자일렌 염기 조직학적 정화제를 사용할 수 있지만 잠재적으로 파라핀의 잔류물을 남기고 이미지 품질에 영향을 미칩니다. 여기에는 다음을 포함하는 50mL 원뿔형 튜브에 슬라이스를 넣는 것이 포함됩니다: 비자일렌 염기 조직학적 투명제(40mL)를 각각 15분에 2회 세척합니다. 밀랍으로 만든 블록의 섹션은 비자일렌으로 탈랍하기 어려울 수 있습니다. 알려지지 않은 왁스/파라핀 혼합물의 경우 올바른 안전 예방 조치와 함께 자일렌을 사용하는 것이 좋습니다. 자일렌은 유해하고 가연성 물질이며 장기간 노출되면 중추신경계, 간, 신장에 손상을 줄 수 있습니다. 화학 연기 후드에서만 사용하고 PPE(예: 장갑, 마스크 및 실험실 가운)를 착용하십시오. 자일렌 및 오염된 물질은 유해 폐기물로 폐기하십시오. 노출된 경우 즉시 의사의 진료를 받으십시오.
    4. 다음을 포함하는 50mL 원뿔형 튜브에 넣어 조직 슬라이드를 세척하여 재수화합니다: 100% 에탄올(40mL)을 각각 3분 동안 2회 세척합니다. 95% 에탄올(40mL)을 각각 3분씩 2회 세척합니다. 70% 에탄올(40mL)을 각각 3분씩 2회 세척합니다. 50% 에탄올(40mL), 각각 3분씩 2회 세척; 30% 에탄올(40mL)을 각각 3분씩 2회 세척합니다. 1x PBS 세척(40mL)을 2분에 1회 세척합니다.
    5. 실온(~23°C)의 습도 챔버에 넣고 약 100-200μL의 3% 과산화수소로 조직을 덮고 10분에 1회 세척한 다음 1x PBS 세척(40mL)으로 조직을 세척하여 조직을 각각 2분씩 2회 세척합니다.
      참고: 과산화효소 차단은 선택 사항이며 조직에 잔류 과산화효소를 소멸시켜 비특이적 염색을 줄이고 조직 자가형광을 감소시킬 수 있습니다. 이는 골수, 신장, 간, 폐, 장 및 뇌와 같이 강한 배경 신호가 TRITC 및 FITC 방출 대역 28,29,30,31,32의 이미징을 방해할 수 있는 높은 자가형광을 가진 조직에 특히 중요합니다.
    6. 실온의 습도 챔버에 조직을 넣고 약 100-200μL의 3.7% 포름알데히드로 조직을 덮고 10분에 1회 세척한 다음 1x PBS 세척(40mL)으로 조직을 세척하여 각각 2분에 2회 세척하여 포름알데히드 고정을 수행합니다.
      참고: 이 단계는 선택 사항이지만 고지방 조직 또는 유리 슬라이드에 부착하는 데 문제가 있는 기타 조직에 권장됩니다.

4. 항원 회수

참고: 여기에 권장되고 설명된 탈랍 및 항원 회수 방법은 대용량 제어 열 항원 회수 장치를 사용하는 제조업체에서 seqRNA-ISH+seqIF에 권장하는 방법과 다릅니다.

  1. 마이크로파를 이용한 HEIR(Heat Induced Antigen Retrieval)
    1. 온도 모니터링 전자레인지를 사용하여 해당되는 경우 온도계 아래 슬라이드 홀더의 슬라이드를 덮을 수 있도록 상업적으로 이용 가능한 pH 9.0 HEIR 완충 용액(약 250mL)을 충분히 추가합니다.
      참고: RNA에 대한 항원 회수는 일반적으로 pH 6.0에서 수행되지만 다음 방법론은 항체 결합의 더 높은 효율성을 위해 pH 9.0에 대한 것입니다.
  2. 완충 용액에 슬라이드를 전자레인지에 삽입하고 해당되는 경우 이중 증류수로 빈 챔버의 균형을 맞춥니다. 107°C에서 15분 동안 전자레인지에서 가열 슬라이드합니다(HEIR 완충액이 온도에 도달하는 데 총 시간은 일반적으로 30분).
  3. 슬라이드를 실온의 화학 연기 후드 아래에 약 20분 동안 놓아 식힙니다.
  4. 50mL 원뿔형 튜브(40mL)에 1x PBS로 슬라이드를 세척하여 2분 동안 1회 세척합니다.
  5. 슬라이드를 스크류캡 슬라이드 메일러 또는 1x PBS(또는 상용 다중 염색 완충액)로 채워진 50mL 원추형 튜브에 보관하고 즉시 진행하거나 4°C에서 최대 7일 동안 보관하되 seqRNA-ISH+seqIF를 진행하기 전에 이상적으로는 72시간 미만으로 보관합니다.

5. 원액 준비

  1. 40x RNA 이미징 완충액 준비
    1. 400mg의 분말 RNA 이미징 완충액과 25mL의 뉴클레아제가 없는 탈이온수를 결합하여 40x RNA 이미징 완충액을 준비합니다.
    2. 생성된 용액을 완전히 용해될 때까지 소용돌이치고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브(튜브당 1mL)에 분취합니다.
    3. 동결-해동 주기를 피하면서 최대 3개월 동안 -20°C에서 냉동 및 보관하십시오.
  2. 20x 식염수-구연산나트륨 완충액(SSC)을 준비합니다.
    1. 염화나트륨(NaCl) 157.3g과 구연산나트륨(Na3C6H5O7) 88.2g을 뉴클레아제가 없는 탈이온수 800mL에 녹입니다.
    2. pH를 측정하고 1M 염산(HCl)으로 pH 7.0으로 적정합니다.
    3. 멸균을 위해 오토클레이브.
      참고: 멸균 20x SSC는 다른 회사에서도 구입할 수 있습니다. 개봉 후에는 4°C까지 실온에서 보관하십시오.
    4. 20x SSC 스톡 1mL와 Nuclease Free 탈이온수 4mL를 결합하여 4x SSC 완충액을 준비합니다.

6. 순차적 RNA-ISH + 순차적 면역형광

참고: 본원에 설명된 모든 단계는 대부분의 시약이 시스템 호환, 상업, 시약으로 식별되기 때문에 재료 표에 설명된 seqRNA-ISH+seqIF에 대한 제조업체 프로토콜에서 채택되었습니다. 이러한 시약은 제조업체에서 식별 및/또는 제공하며 시스템과 호환되도록 설계되었습니다. 수정이 가능하며 논의에 설명되어 있지만 축적을 방지하기 위해 추가 테스트 및 유체 세척이 필요할 수 있습니다. 소프트웨어는 패널과 프로토콜이 설계되고 입력된 후 필요한 시약의 총 부피를 계산합니다. 그러나 권장되는 수정 사항이 제공됩니다. 총 볼륨은 프로토콜당 사용되는 주기 및 대상 수에 따라 항상 달라집니다. 그러나 항체 및 RNA-ISH 희석액은 각 개별 조합이 데이터베이스에 고유한 항목으로 입력되지 않는 한 시스템에서 계산되지 않습니다. 이 프로토콜의 경우 샘플 슬라이드당 400uL의 항체 칵테일이 필요합니다.

  1. 시스템 준비
    1. seqRNA-ISH+seqIF 전에 모든 미세유체를 뉴클레아제가 없는 물로 철저히 세척하십시오.
    2. RNAse 오염 제거 용액을 시스템 외부에 뿌린 다음 70% 에탄올을 뿌립니다.
  2. 일반 시약 준비
    1. 세척 완충액: 20x 시스템 호환, 상업용, 다중 염색 완충액 50mL + 뉴클레아제가 없는 탈이온수 950mL
    2. 물: 뉴클레아제가 없는 탈이온수 100mL.
    3. 에탄올: 70% 에탄올 100mL.
    4. 이미징 완충액: 10x 시스템 호환, 상업용, 이미징 용액 16mL + 뉴클레아제가 없는 탈이온수 140mL + 시스템 호환, 상업용, 이미징 스톡 4mL.
    5. 용출 완충액: 시스템 호환, 상업용, 용출 용액 1 + 시스템 호환, 상업용, 용출 용액 2의 8
    6. 담금질 완충액: 뉴클레아제가 없는 탈이온수 130mL + 시스템 호환, 상업용, 담금질 용액 14mL + 시스템 호환, 상업용, 담금질 용액 16mL 2.
  3. RNA-ISH 프로토콜을 위한 염색 시약 준비
    참고: 이 단계는 전날 밤에 완료하여 어둠 속에서 4°C에서 보관할 수 있습니다. 제조업체 권장 사항에는 풀링된 프로브를 최대 1년 동안 사용할 수 있다고 명시되어 있지만 오염 우려로 인해 일주일 이상 미리 프로브를 풀링하는 것은 권장하지 않습니다. 프로브의 경우 사용하기 전에 두드리거나 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 부드럽게 원심분리하여 회전시키는 것이 가장 좋습니다.
    1. 시스템 호환 미세 원심분리기 튜브에 슬라이드당 500 μL의 시스템 호환, 상업적, 프로테이나제 프리 투과화 용액을 로드합니다.
    2. 시스템 호환 미세 원심분리기 튜브에서 다음 각각에 대해 슬라이드당 총 500μL에 대한 사이클(표 1)을 기반으로 하는 RNA-ISH 증폭기 풀링: i) 꼬리 T1 내지 T4용 ZZ 테일 트리, ii) 테일 T5 내지 T8용 ZZ 테일 트리, iii) 테일 T9 내지 T 12용 ZZ 테일 트리.
    3. 시스템 호환 마이크로 원심분리기 튜브에서 다음 각각에 따라 슬라이드당 총 500μL에 대한 풀 꼬리 트리 특이적, 증폭기 매칭, 형광단: i) 트리 T1 내지 T4에 대한 형광단, ii) 트리 T5 내지 T8에 대한 형광단, iii) T9 내지 T 12에 대한 형광단.
      알림: 이 단계는 빛에 민감합니다
    4. 슬라이드당 뉴클레아제가 없는 탈이온수로 만든 상업용 다중 염색 완충액에 상업용 DAPI(1mg/mL의 스톡 농도)의 1:200 희석액 1mL를 준비합니다.
      참고: 절차는 표준 시약의 일부로 DAPI를 포함하는 제조업체에 따라 수행되었습니다. N,N-디메틸포름아미드(DMF)로 희석된 DAPI의 맞춤형 제형을 사용하는 경우 희석액이 다를 수 있으며 적정 테스트를 수행해야 합니다. 그러나 1mg/mL 스톡 농도의 약 1:1000-1:2000 농도를 사용하는 것이 좋습니다. 일반적으로 이것은 여러 차례의 이미징 및 스트리핑을 거쳐야 하기 때문에 수동 염색 프로토콜보다 정상보다 높은 농도입니다. DMF의 DAPI 신선 제형은 상업적으로 이용 가능한 DAPI 제형보다 더 밝은 경향이 있습니다. DAPI와 같은 포름아미드가 포함된 시약은 화학 흄 후드 아래에 할당되어야 합니다. 포름아마이드는 생식 독성 및 장기 손상을 일으킬 수 있으며 발암성이 의심됩니다. 적절한 PPE(예: 장갑 및 실험실 가운)를 활용하십시오.
    5. 12.125 뉴클레아제가 없는 탈이온수, 1.5mL의 10x 이미징 완충액 스톡 B 및 275μL의 40x 이미징 완충액 스톡 A(해동 또는 갓 만든 것)와 함께 사용하기 직전에 RNA-ISH 이미징 완충액을 준비합니다.
    6. 시스템 호환 미세 원심분리기 튜브에서 슬라이드당 총 400μL에 대해 상업용 다중 염색 완충액에서 적정 테스트 희석액에 따라 seqIF를 위해 최대 10쌍의 1차 항체(1차 단백질 항체는 표 2에 설명되어 있음)를 준비합니다. seqIF의 각 주기에는 숙주 종당 하나의 1차 항체만 포함되어 있는지 확인하십시오.
    7. 적정 테스트 희석액에 따라 seqIF를 위해 단계 6.3.7의 1차 항체 조합에 따라 2차 형광단(표 3)과 DAPI를 준비합니다. 최소 1mL의 데드 부피가 있는 50mL 원뿔형 튜브에서 사이클당 총 400μL의 다중 염색 완충액에 희석합니다. 2차 Alexa Fluor 항체 및 DAPI의 농도 예는 다음과 같습니다: Alexa Fluor 555의 경우 1:200 희석, Alexa Fluor 647의 경우 1:400 희석, DAPI의 경우 1:1800 희석(DMF의 1 mg/mL DAPI에서)
      알림: 이 단계는 빛에 민감합니다. 2차에 DAPI를 추가하는 것은 실행 후 이미지를 정렬하는 데 도움이 되는 seqIF의 여러 주기에 걸쳐 DAPI 표현을 유지하는 데 도움이 될 수 있으므로 제조업체의 프로토콜에 따르지 않습니다. 이 시스템에 포함된 것과 같은 대부분의 이미지 처리 소프트웨어는 DAPI 신호를 사용하여 형광 공동 국소화를 위한 주기적 이미징의 정렬을 확인합니다.
  4. 시스템 초기화
    1. 6.3단계의 각 시약을 시스템에서 지정한 순서대로 로드합니다. 일반적으로 순서는 위와 같지만 항상 시약이 로드되는 위치와 일치하는지 확인하십시오
    2. 항원을 회수한 슬라이드를 홀더에 로드하고 슬라이드 이미징 창이 이미징 공간 중앙에 정렬되었는지 확인한 후 시스템 호환 미세유체 칩을 위에 놓고 제자리에 고정합니다.
      참고: 미세유체 칩은 개스킷이 손상되지 않은 한 최대 1회 더 세척하고 적절하게 보관하면 seqIF 적정 테스트에 재사용할 수 있습니다. 미세유체 칩은 잠재적인 오염으로 인해 RNA 패널을 실행하는 경우 재사용할 수 없습니다.
    3. 1.35mL의 4x SSC와 150mL의 상업용 10x 절단 용액을 혼합하여 절단 용액을 준비합니다.
      참고: 10x Cleaving Solution은 빠르게 산화되어 seqRNA-ISH+seqIF 실험 실행에서 사용하기 직전에만 깨야 하는 유리 앰플에 보관됩니다.

7. 시스템 실행

  1. 제조업체 지침에 따라 시스템을 실행하고, 20-plex 단백질 seqIF가 있는 12-plex seqRNA-ISH에서 두 개의 슬라이드에 대한 대략적인 실행 시간은 12.5cm x 12.5cm 이미징 창에 대해 48시간입니다.
  2. seqRNA-ISH+seqIF 실행이 완료된 후 슬라이드를 제거하여 1x PBS에 저장하거나 추가 seqIF(최대 40개 단백질)에 즉시 활용할 수 있습니다.
    참고: 오염 가능성을 줄이기 위해 각 실행 전후에 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 시스템 미세유체를 세척하고 세척하는 것이 중요합니다.

8. 선택 사항: 이미지 및 통계 분석

  1. 이미지 분석 또는 병리 분석 도구를 통해 이미지 및 통계 분석을 진행합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법의 예로, 인간 고급 장액성 난소 암종의 두 슬라이드에서 다음 seqRNA-ISH(표 1) + SeqIF(표 2 및 표 3)를 실행했습니다.

그림 2는 난소 종양 조직 샘플에 대한 seqRNA-ISH+seqIF의 오버레이를 보여줍니다. 콜라겐 1과 같은 구조 단백질 마커는 종양 영역을 식별하는 데 활용되며, CD33, CD8 및 그랜자임 B(GZMB)와 같은 표현형 및 기능 마커는 종양 면역 미세 환경을 이해하는 데 필수적인 특정 면역 세포를 구별하는 데 도움이 됩니다. RNA는 ApoE 및 PDL1과 같은 표적 분자를 표적으로 탐색하여 추가 통찰력을 제공하고 RNA 전사와 단백질 번역 간의 비교를 용이하게 하며, GZMB의 경우 동일한 조직에 단백질과 RNA를 모두 제시하므로 암 진행에 상당한 영향을 미칠 수 있는 번역 조절을 ...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

샘플을 준비하고 처리하는 가장 중요한 단계는 RNAse 오염을 줄이는 것입니다. 이는 마스크를 사용하여 호흡으로 인한 오염을 방지하고 RNase 오염 제거 용액과 뉴클레아제가 없는 물로 만든 70% 에탄올로 작업 표면을 닦음으로써 달성할 수 있습니다. FFPE 슬라이드의 경우 seqRNA-ISH+seqIF용 FFPE 블록에서 인접한 여러 슬라이드를 절단하여 건조제와 함께 4°C에서 보관하는 것이 가장 좋습니다. 품질 관리를 위해 조직 블록의 DV200을 테스트하는 것 외에도 조직의 인접 부분에서 RNA 양성 대조군 슬라이드(UBC, PPIB, POLR2A) 및 음성 대조군 슬라이드(DapB)를 실행하는 것이 좋습니다. 샘플과 슬라이드를 4°C에서 보관하면 온도에 따라 증가하는 RNA의 분해를 방지하는 데 도움이 되며, 건조제는 수용성 단백질의 분해를 줄이는 데 도움이 됩니다. 4°C의 건조제는 정기적으로 교체해야 합니다. 지방 조직이나 슬라이드에 부착하기 어려운 조직의...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 난소암 연구 연합(OCRA 811621 및 891490), Sie 재단 및 Stephanie C. Stelter 기부 기금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 M. D. Anderson의 암 센터 지원 보조금 P30 CA016672 및 Jared Burks의 NCI의 연구 전문가 1 R50 CA243707-01A1을 통해 국립 보건원의 부분적으로 지원되는 유세포 분석 및 세포 이미징 핵심 시설과 공동으로 수행되었습니다.

또한 기술 지원과 교육을 해준 Lunaphore의 Emily Martersteck에게도 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.

저자(들)는 Bio-Techne의 조기 액세스 프로그램의 일환으로 할인된 가격으로 RNAScope 표적 및 제어 프로브 세트를 받았으며 일부 시약은 이 연구에 사용하기 위해 무료로 제공되었습니다. 제조업체는 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 원고 준비에 아무런 역할도 하지 않았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)Thermo Fisher Scientific/InvitrogenEN62248 / 62248핵 염색의 경우(본 연구에서 사용된 제품, 62247은 단종됨)
50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리기 튜브써모 피셔 사이언티픽339652분취량에 사용 & 혼합 2차 솔루션
70% 멸균 이소프로판올 알코올텍스와이프TX3270 시리즈표면 오염 제거용
항 체다양한다양한기본 대상에 사용되며 사용된 채널에 따라 다릅니다.
APOE - 호스트: 마우스, 클론: 960318R& DMAB41443-100(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
aSMA - 호스트: 마우스, 클론: 1A4중부 표준시69319평방(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
자동 절단 마이크로톰라이카14051956472조직 절편
CD10 - 호스트: 토끼, 클론: E5P7S중부 표준시65534S(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD11c - 호스트: 토끼, 클론: D3V1E중부 표준시93233평방 피트(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD163 - 숙주: 토끼, 클론: D6U1J중부 표준시93498S(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD163 - 숙주: 토끼, 클론: ja51-30인비트로젠MA5-32684(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD20 - 호스트: 마우스, 클론: L26베틸A500-017ACF(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD31 - 호스트: 마우스, 클론: 3F8E2프로틴테크66065-2-IG(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD33 - 호스트: 토끼, 클론: BLR061G베틸A700-061CF(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD4 - 호스트: 토끼, 클론: EPR6855아브캠AB181724(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD45 - 숙주: 토끼, 클론: BL-178-12C7베틸A700-012(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD45RO - 호스트: 마우스, 클론: UCHL1베틸A500-020ACF(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD56 - 호스트: 토끼, 클론: BLR152J베틸99746(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD66b - 숙주: 토끼, 클론: BLR111H인비트로젠MA5-44413(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD68 - 숙주: 마우스, 클론: KP-1바이오레전드916104(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD8 - 호스트: 마우스, 클론: C8/144B바이오레전드372902(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
CD86 - 호스트: 토끼, 클론: E2G8P중부 표준시76755평방피트(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
Col 1A1 - 호스트: 마우스, 클론: E3E1X중부 표준시66948S(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
DNA LoBind 튜브 2mL에펜도르프22431048혼합 RNA 프로브 용액에 사용
건조제를 나타내는 드라이어라이트 21005콜-팔머21005건조기용 건조제
Edge-Rite 마이크로톰 블레이드Thermo Fisher Scientific / Invitrogen4280엘라조직학 - 샘플을 절편화할 때 사용
에틸 알코올 100% (200 프루프)팜코111000200탈파라핀용
EZ-AR2 엘레강스 버퍼바이오유네엑스HK547-XAKFFPE 조직 절편의 항원 회수에 사용
FOXP3 - 숙주: 토끼, 클론: 다클론베틸A700-034CF(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
염소 항마우스 IgG(H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/InvitrogenA-21425(참고: 본 연구에 특정한) F(ab')2-염소 항-마우스 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 555
염소 항-마우스 IgG(H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/InvitrogenA-48289/A-21237(참고: 본 연구에 특정한) F(ab')2-염소 항-마우스 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 플러스 647
염소 항토끼 IgG(H+L) Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific/InvitrogenA-21430(참고: 본 연구에 특정한) F(ab')2-염소 항토끼 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 555
염소 항토끼 IgG(H+L) Alexa Fluor 647Thermo Fisher Scientific/InvitrogenA-21246(참고: 본 연구에 특정한) F(ab')2-염소 항토끼 IgG(H+L) 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor™ 647
GZMB - 숙주: 토끼, 클론: 다클론프로틴테크13588-1-AP(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
Hs-폴 2A-T1ACD 바이오테크네310457-T1인간 저발현 프로브
Hs-PPIB-T5ACD 바이오테크네313907-T5인간 중간 발현 프로브 제어
HS-UBC-T9ACD 바이오테크네310047-T9인간의 높은 발현 제어
과산화수소 용액 30%시그마-알드리치HX0640-5조직 준비용. 내인성 과산화효소 활성을 차단하고 착색이 풍부한 제품을 생성하는 데 도움이 됩니다. 3% 과산화수소 용액을 만들려면
Ker8/18 - 숙주: 마우스, 클론: 다클론프로틴테크66187-1-PBS(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
LRP5 - 호스트: 토끼, 클론: HPA030505시그마HPA030505-100UL(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
Lunaphore 20x 멀티염색 완충액바이오테크네BU06희석제 및 COMET의 세척에 사용됩니다.
Lunaphore COMET 칩바이오테크네MK03COMET 기기용 mcirofluidics 칩
루나포어 혜성바이오테크네CM10-SSeq-IF 자동 염색기
Lunaphore 용출 완충액 키트바이오테크네BU07-L솔루션 1 & COMET의 용출 단계에 대한 솔루션 2
Lunaphore 이미징 버퍼 키트바이오테크네BU09용질 & COMET 실행 중 이미징에 사용되는 용매
Lunaphore 담금질 완충기바이오테크네BU08-L솔루션 1 & COMET의 담금질 단계에 대한 솔루션 2
마이크로피펫다양한해당 사항 없음시약 준비용
페리오스틴 - 숙주: 마우스, 클론: 1A11A3프로틴테크66491-1-PBS(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
피어스 16% 포름알데히드(w/v), 메탄올 프리써모 피셔 사이언티픽28908조직 준비를 위해 3.7% PFA를 만들기 위해
프로브 320102 입력(T2 채널)ACD 바이오테크네300040T2의 음성 대조군 DapB
프로브 320102 입력(T3 채널)ACD 바이오테크네300040T3의 음성 대조군 DapB
프로브 320102 입력(T4 채널)ACD 바이오테크네300040T4의 음성 대조군 DapB
RNAscope HiPlex 절단 원액바이오테크네P/N 324399RNAScope 분석 중 절단용 시약
RNAscope HiPlex Pro for COMET 12-plex, 20-슬라이드 키트바이오테크네322075시약 & RNAScope용 완충액
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-APOE-T2ACD 바이오테크네433093-T2(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-APOE-T2
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-ARG1-T4ACD 바이오테크네401581-T4(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-ARG1-T4
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-CD274-T1ACD 바이오테크네600863-T1(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-CD274-T1
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-CD40-T6ACD 바이오테크네445973-T6(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-CD40-T6
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-CXCL1-01-T12ACD 바이오테크네1256473-T12(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-CXCL1-01-T12
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-GZMB-T7ACD 바이오테크네468453-T7(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-GZMB-T7
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-IFNG-T3ACD 바이오테크네310503-T3(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-IFNG-T3
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-IL23a-T8ACD 바이오테크네562853-T8(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-IL23a-T8
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-IL6-T9ACD 바이오테크네400883-T9(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-IL6-T9
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-TNFa-T11ACD 바이오테크네310423-T11(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-TNFa-T11
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-VEGFa-T5ACD 바이오테크네423163-T5(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - Hs-VEGFa-T5
RNAscope HiPlex 프로브 - Hs-VISTA-T10ACD 바이오테크네491513-T10(참고: 본 연구에 특정한) 얼리 액세스 RNAscope™ HiPlex CS 프로브 - HS-VISTA-T10
RNAscope HiPlex12 CS 음성 대조군 프로브ACD 바이오테크네324347제조업체에서 권장하는 Full 12 plex 네거티브 컨트롤 패널. T1-T12의 DapB.
RNAscope HiPlex12 CS 양성 대조군 프로브-HsACD 바이오테크네324317제조업체에서 권장하는 Full 12 plex Human 포지티브 컨트롤 패널. 채널 T1에서 T12까지의 다음 하우스키핑 유전자에 대한 Hs -RTU : Polr2a, PPIB, UBC, HPRT1, TUBB, RPL28, RPL5, B2M, ACTB, LDHA-O1, RPLP0-X-RPLP0P2, GAPDH.
RNAse가 없는 물코 닝46-000-CM모든 장비를 청소 및 준비하고 필요한 경우 희석제로 사용
RNaseZap RNase 오염 제거 용액써모 피셔 사이언티픽AM9782RNase를 파괴하는 표면 오염 제거 용액
RNeasy FFPE 키트키아겐73504 & 19093RNA 추출 및 DV200 측정
슬라이드 메일러임포트 사이언티픽M9504MA액체 완충액에 슬라이드를 저장합니다.
외과 설계 범용 산업용 면도날Thermo Fisher Scientific / Invitrogen13-812-236조직학 - 샘플을 절편화할 때 사용
TOX 1/2 - 호스트: 토끼, 클론: E613Q중부 표준시62886평방피트(참고: 본 연구에 특정한) 1차 단백질 항체
자일렌 조직학적 등급써모 피셔 사이언티픽UN1307탈파라핀용

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Levine, E., Hwa, T. Small RNAs establish gene expression thresholds. Curr Opin Microbiol. 11 (6), 574-579 (2008).
  2. Ferri-Borgogno, S., et al. metabolic, and subcellular mapping of the tumor immune microenvironment via 3D targeted and non-targeted multiplex multi-omics analyses. Cancers (Basel). 16 (5), 846(2024).
  3. Carstens, J. L., et al. Spatial multiplexing and omics. Nat Rev Methods Primers. 4 (1), 1-12 (2024).
  4. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eur J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
  5. Macosko, Z. E., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  6. Nichols, A. E. C., et al. Impact of isolation method on cellular activation and presence of specific tendon cell subpopulations during in vitro culture. FASEB J. 35 (7), e21733(2021).
  7. Grünwald, D., Singer, R. H., Czaplinski, K. Methods Enzymol. , Elsevier. London. (2008).
  8. Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH. Biotechniques. 59 (4), 209-221 (2015).
  9. Shih, J. D., Waks, Z., Kedersha, N., Silver, P. A. Visualization of single mRNAs reveals temporal association of proteins with microRNA-regulated mRNA. Nucleic Acids Res. 39 (17), 7740-7749 (2011).
  10. Wang, F., et al. RNAscope. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  11. Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries. Nat Protoc. 8 (11), 2158-2179 (2013).
  12. Meyer, C., Garzia, A., Tuschl, T. Simultaneous detection of the subcellular localization of RNAs and proteins in cultured cells by combined multicolor RNA-FISH and IF. Methods. 118-119, 101-110 (2017).
  13. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  14. Pemberton, J., Kala, S., Dikshit, A., Hupple, C. Regular and young investigator award abstracts. Thorax. 72 (Suppl 3), A1654(2017).
  15. Goltsev, Y., et al. Deep profiling of mouse splenic architecture with CODEX multiplexed imaging. Cell. 174 (4), 968-981.e15 (2018).
  16. Cheng, Y., Burrack, R. K., Li, Q. Spatially resolved and highly multiplexed protein and RNA in situ detection by combining CODEX with RNAscope in situ hybridization. J Histochem Cytochem. 70 (8), 571-581 (2022).
  17. Pourmaleki, M., et al. Tumor MHC class I expression associates with intralesional IL-2 response in melanoma. Cancer Immunol Res. 10 (3), 303-313 (2022).
  18. Johnstone, R. W., Andrew, S. M., Hogarth, M. P., Pietersz, G. A., McKenzie, I. F. C. The effect of temperature on the binding kinetics and equilibrium constants of monoclonal antibodies to cell surface antigens. Mol Immunol. 27 (4), 327-333 (1990).
  19. Porichis, F., et al. High-throughput detection of miRNAs and gene-specific mRNA at the single-cell level by flow cytometry. Nat Commun. 5 (1), 5641(2014).
  20. Hu, K., Harman, A., Baharlou, H. Imaging mass cytometry for in situ immune profiling. Methods Mol Biol. 2779, 407-423 (2024).
  21. Rivest, F., et al. Fully automated sequential immunofluorescence (seqIF) for hyperplex spatial proteomics. Sci Rep. 13 (1), 1-10 (2023).
  22. Sans, M., et al. Spatial transcriptomics of intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas identifies NKX6-2 as a driver of gastric differentiation and indolent biological potential. Cancer Discov. 13 (8), 1844-1861 (2023).
  23. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 1-12 (2021).
  24. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  25. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. Am J Pathol. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  26. Bingham, V., et al. RNAscope in situ hybridization confirms mRNA integrity in formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue samples. Oncotarget. 8 (55), 93392-93403 (2017).
  27. Matsubara, T., et al. DV200 index for assessing RNA integrity in next-generation sequencing. Biomed Res Int. 2020 (1), 1-6 (2020).
  28. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  29. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and nonspecific immunofluorescent labeling in frozen bovine intestinal tissue sections: solutions for multicolor immunofluorescence experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), 531-541 (2017).
  30. Walters, D. K., Jelinek, D. F. Multiplex immunofluorescence of bone marrow core biopsies: visualizing the bone marrow immune contexture. J Histochem Cytochem. 68 (2), 99-112 (2020).
  31. Zoppolato, E., et al. Optimized immunofluorescence for liver structure analysis: enhancing 3D resolution and minimizing tissue autofluorescence. Biol Methods Protoc. 10 (1), 1-12 (2025).
  32. Zhang, Y., et al. Spectral characteristics of autofluorescence in renal tissue and methods for reducing fluorescence background in confocal laser scanning microscopy. J Fluoresc. 28 (2), 561-572 (2018).
  33. Suresh, S., O'Donnell, K. A. Translational control of immune evasion in cancer. Trends Cancer. 7 (7), 580-582 (2021).
  34. Ferri-Borgogno, S., et al. Spatial transcriptomics depict ligand-receptor cross-talk heterogeneity at the tumor-stroma interface in long-term ovarian cancer survivors. Cancer Res. 83 (9), 1503-1516 (2023).
  35. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: a tool for biomedical research and diagnosis. Eur J Histochem. 58 (4), 1-12 (2014).
  36. Croce, A. C., Bottiroli, G. New light in flavin autofluorescence. Eur J Histochem. 59 (4), 1-10 (2015).
  37. Dubois, L., Andersson, K., Asplund, A., Björkelund, H. Evaluating real-time immunohistochemistry on multiple tissue samples, multiple targets and multiple antibody labeling methods. BMC Res Notes. 6 (1), 542(2013).
  38. Chen, A. K., Cheng, Z., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Assessing the sensitivity of commercially available fluorophores to the intracellular environment. Anal Chem. 80 (19), 7437-7444 (2008).
  39. Krenacs, L., Krenacs, T., Stelkovics, E., Raffeld, M. Methods Mol Biol. , Humana Press. New York. (2010).
  40. Weber, J., Peng, H., Rader, C. From rabbit antibody repertoires to rabbit monoclonal antibodies. Exp Mol Med. 49 (3), e305(2017).
  41. Marlin, M. C., et al. A novel process for H&E, immunofluorescence, and imaging mass cytometry on a single slide with a concise analytics pipeline. Cytometry A. 103 (12), 1010-1018 (2023).
  42. Duncan, J. S., Elliott, K. L., Kersigo, J., Gray, B., Fritzsch, B. situ hybridization methods. , Springer. New York, NY. (2015).
  43. Kersigo, J., et al. An RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA. Cell Tissue Res. 374 (2), 251-262 (2018).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNA

관련 논문