이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.
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방법 논문
새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식
이 논문에서
요약
초록
기존의 프로브 기반 ISH(in situ hybridization) 이미징 검출 방법을 사용할 때 microRNA(miRNA)는 19에서 25 뉴클레오티드 범위의 크기로 인해 캡처하기 어렵습니다. 그러나 miRNA는 정상적인 생리학과 수많은 병리학적 상태에 기여하는 핵심 후성유전학적 조절인자이기 때문에 miRNA의 시공간적 거동을 이해하는 것은 세포 및 세포 이하 수준에서 miRNA의 기능을 밝히는 데 중요합니다. 이로 인해 적절한 감지 및 시각화 기술이 분명히 필요합니다. 따라서 우리는 다중 면역형광 염색을 활용하여 개발 및 최적화된 MARLIN(Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN)과 miRNA를 표적으로 하는 고정 핵산(LNA) 프로브를 통한 MicroRNA 증폭 및 인식을 만들었습니다. 이 방법은 다중화된 단백질 발현으로 miRNA를 정량화할 수 있으며, 이를 통해 종양 미세환경(TME) 내에서 높은 감도와 재현성으로 세포내 및 세포외 miRNA를 정량화할 수 있습니다. miRNA 검출과 단백질 포획 분석을 함께 사용하면 해당 TME 내의 세포 기능과 조절 메커니즘에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수도 있습니다.
서론
마이크로RNA
마이크로RNA(miRNA)는 길이가 19-25뉴클레오티드로 매우 작지만, 이러한 단일 가닥 RNA 분자는 유전자 발현의 강력한 조절자로서 서열 특이적 상호작용을 통해 전사 후 메신저 RNA(mRNA)를 조절합니다1. 본질적으로 miRNA는 상보성 정도에 따라 표적 mRNA에 결합하여 번역을 방지하거나 mRNA 절단을 통한 분해를 촉진함으로써 음성 조절자 역할을 하며, 이는 궁극적으로 표적 유전자의 단백질 출력 감소로 이어집니다. miRNA는 기본적으로 비코딩 RNA이지만 모든 miRNA의 약 40%는 여전히 단백질 코딩 유전자의 인트론 또는 엑손 내에서 발견됩니다2. miRNA의 기능적 목적에는 세포 증식, 혈관신생, 세포사멸 등과 같은 몇 가지 주요 생물학적 과정이 포함됩니다. 특히, 특정 miRNA의 비정상적인 발현 및 miRNA 매개 유전자 조절이 여러 암 유형에서 발암성 형질전환과 관련이 있기 때문에 miRNA의 조절 장애는 종양 형성과 관련이 있습니다3.
miRNA는 발견 이후 조직 특이적 발현 및....
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프로토콜
이 프로토콜은 HGSC 환자의 인간 난소 종양 조직 절편의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직을 사용합니다. 이 샘플은 난소암에 대한 일차 세포감소 수술을 받는 이전에 치료받지 않은 환자로부터 수집되었습니다. 모든 샘플과 임상 데이터는 텍사스 대학교 MD 앤더슨의 기관 검토 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 부인과 종양학 및 생식 의학과의 난소암 저장소에서 얻었습니다. 프론트 데스크 직원은 환자로부터 서면 동의서를 얻었고 공인된 윤리 지침에 따라 연구를 수행했습니다.
1. 조직 준비
- 모든 FFPE 샘플을 60°C에서 밤새 굽고 RNAse가 없는 물로 각 장비와 도구를 세척합니다. 섹션의 두께가 약 5μm인지 확인하십시오.
참고: 이 프로토콜은 난소 종양에 최적화되었지만 추가 테스트 후 잠재적으로 다른 조직 유형과 함께 사용할 수 있습니다. - 각 라운드당 5분 동안 자일렌을 3회 투여하고 각 라운드당 3분 동안 10회 재수화(100% 에탄올(EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x)로 탈파라핀화를 수행합니다. 1x 트리스 완충 식염수(TBS....
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결과
이 프로토콜을 테스트할 때 정확성과 비교를 위해 동일한 대표 샘플의 두 개의 연속 섹션을 갖는 것이 중요합니다. 이 경우 HGSC(High-Grade Ovarian Cancer) 샘플을 사용하여 결과를 비교했습니다. miRNA 염색만 거치는 대조군 슬라이드(그림 2A-B)와 단백질 및 miRNA 염색을 모두 거치는 테스트 슬라이드(그림 2C-J)를 사용하였다.
대조군 슬라이드와 테스트 슬라이드 모두 일관된 miRNA(miR-181c-3p) 발현을 보였으며 종양 세포에서 더 높은 발현이 나타났습니다(그림.......
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토론
miRNA의 중요성이 인식되고 이해되고 있지만 정상적인 발달과 질병 상태 모두에 대한 관찰은 현재 표준 방법을 사용하여 miRNA를 연구하는 데 어려움이 있기 때문에 방해를 받고 있습니다. 현장 방법의 부족으로 인해 MARLIN(miRNA FISH 분석)이 개발되었습니다. miRNA의 상동성과 짧은 길이를 감안할 때 miRNA의 위치와 전사체 후 조절에 미치는 영향을 시각화하는 것이 어려워집니다. 이 프로토콜 개발은 LNA(Locked Nucleic Acid Probes)를 활용합니다. LNA는 리보스가 메틸렌 브리지로 잠겨 산소 원자를 탄소 원자에 연결하는 변형된 RNA 염기입니다. 이 추가 브리지는 일반적으로 링과 관련된 유연성을 제한하여 본질적으로 분자 구조를 단단한 형태로 고정합니다19. LNA는 더 짧은 프로브와 더 높은 담금질 효율을 가능하게 하여 더 낮은 배경 신호를 위한 분석 설계를 지원하고 분석.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
분석이 개발되는 동안 Basant의 논문 위원회의 일원이었던 Chi Lam Au Yeung과 Manjunath Nimmakayalu에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 또한 사용된 샘플을 절편화하고 제공한 Samuel Mok. 마지막으로, Visiopharm 소프트웨어의 분석 및 사용 과정에서 광범위한 지원을 제공한 Johan Doré와 Dan Winkowski에게 감사드립니다. 이 연구는 난소암 연구 연합(OCRA 811621 및 891490), Sie 재단 및 Stephanie C. Stelter 기부 기금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 M. D. Anderson의 암 센터 지원 보조금 P30 CA016672 및 Jared Burks의 NCI의 연구 전문가 1 R50 CA243707-01A1을 통해 국립 보건원의 부분적으로 지원되는 유세포 분석 및 세포 이미징 핵심 시설과 공동으로 수행되었습니다.
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참고문헌
- Smolarz, B., Nowak, A. Z., Romanowicz, H. Breast cancer-epidemiology, classification, pathogenesis and treatment (review of literature). Cancers. 14 (10), 2569(2022).
- Davis-Dusenbery, B. N., Hata, A. Microrna in cancer: The involvem....
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