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방법 논문

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

755 조회수

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DOI:

10.3791/68617

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2025년 10월 7일

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1Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

초록

기존의 프로브 기반 ISH(in situ hybridization) 이미징 검출 방법을 사용할 때 microRNA(miRNA)는 19에서 25 뉴클레오티드 범위의 크기로 인해 캡처하기 어렵습니다. 그러나 miRNA는 정상적인 생리학과 수많은 병리학적 상태에 기여하는 핵심 후성유전학적 조절인자이기 때문에 miRNA의 시공간적 거동을 이해하는 것은 세포 및 세포 이하 수준에서 miRNA의 기능을 밝히는 데 중요합니다. 이로 인해 적절한 감지 및 시각화 기술이 분명히 필요합니다. 따라서 우리는 다중 면역형광 염색을 활용하여 개발 및 최적화된 MARLIN(Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN)과 miRNA를 표적으로 하는 고정 핵산(LNA) 프로브를 통한 MicroRNA 증폭 및 인식을 만들었습니다. 이 방법은 다중화된 단백질 발현으로 miRNA를 정량화할 수 있으며, 이를 통해 종양 미세환경(TME) 내에서 높은 감도와 재현성으로 세포내 및 세포외 miRNA를 정량화할 수 있습니다. miRNA 검출과 단백질 포획 분석을 함께 사용하면 해당 TME 내의 세포 기능과 조절 메커니즘에 대한 포괄적인 이해를 제공할 수도 있습니다.

서론

마이크로RNA
마이크로RNA(miRNA)는 길이가 19-25뉴클레오티드로 매우 작지만, 이러한 단일 가닥 RNA 분자는 유전자 발현의 강력한 조절자로서 서열 특이적 상호작용을 통해 전사 후 메신저 RNA(mRNA)를 조절합니다1. 본질적으로 miRNA는 상보성 정도에 따라 표적 mRNA에 결합하여 번역을 방지하거나 mRNA 절단을 통한 분해를 촉진함으로써 음성 조절자 역할을 하며, 이는 궁극적으로 표적 유전자의 단백질 출력 감소로 이어집니다. miRNA는 기본적으로 비코딩 RNA이지만 모든 miRNA의 약 40%는 여전히 단백질 코딩 유전자의 인트론 또는 엑손 내에서 발견됩니다2. miRNA의 기능적 목적에는 세포 증식, 혈관신생, 세포사멸 등과 같은 몇 가지 주요 생물학적 과정이 포함됩니다. 특히, 특정 miRNA의 비정상적인 발현 및 miRNA 매개 유전자 조절이 여러 암 유형에서 발암성 형질전환과 관련이 있기 때문에 miRNA의 조절 장애는 종양 형성과 관련이 있습니다3.

miRNA는 발견 이후 조직 특이적 발현 및 조절 기능으로 인해 다양한 질병에서 광범위하게 연구되어 왔으며, 조절 장애는 신경퇴행성 질환, 자가면역 질환 및 다양한 암을 포함한 많은 질병과 관련이 있습니다 4,5,6. miRNA의 발현 패턴은 암 유형, 병기 및 임상 변수와 상관관계가 있을 수 있으므로 miRNA 프로파일링은 암 진단 및 예후를 위한 귀중한 도구가 됩니다 4,5,6,7. 새로운 miRNA의 발견은 또한 고처리량 시퀀싱 기술의 발전으로 가속화되어 다양한 생물학적 과정에 miRNA 관여에 대한 이해를 향상시켰습니다8. miRNA의 중요성은 전사 후 조절에서 miRNA의 기능을 발견한 공로로 Victor Ambros와 Gary Ruvkun에게 수여된 2024년 노벨 의학상에서 강조되었습니다9.

질병 진단 및 예후를 위한 귀중한 바이오마커로서 miRNA의 치료 잠재력이 탐구되어 miRNA 표적 약물 개발로 이어졌습니다. 암 치료에서 miRNA의 치료 잠재력은 유전자 모듈을 조화롭게 조절하여 잠재적으로 정상적인 세포 기능을 회복시키는 능력에 있습니다10. 이전에는 miRNA 기반 항암 치료법이 치료 반응을 강화하고 완치율을 높이기 위해 단일 요법 또는 기존 표적 요법과 병용하여 개발되었습니다11. miRNA의 동적 스펙트럼은 miRNA를 혁신적인 암 치료 전략을 위한 필수 자원으로 자리매김했습니다. 치료 내성의 맥락에서 miRNA를 표적으로 삼는 것은 전통적인 암 치료에 대한 재발과 내성을 감소시키는 데 가능성을 보여주었고 암세포를 표적으로 삼아 잠재적으로 환자 생존율을 향상시킬 수 있는 가능성을 보여주었습니다12. 종양 미세환경(TME)에서 다양한 세포 유형의 활동을 조절하는 miRNA의 역할을 탐구함으로써 독특하고 임상적으로 관련된 암 치료법을 잠재적으로 발견할 수 있습니다.

miRNA 검출을 위한 사용 가능한 분석
현재 miRNA 측정을 위한 가장 일반적인 방법은 정량적 실시간 PCR(q-RT-PCR) 또는 차세대 시퀀싱(NGS)을 위해 추출된 RNA에 의존하여 공간적 맥락을 잃습니다. cDNA 합성을 위해 표적 특이적 줄기 루프 프라이머를 사용하는 TaqMan microRNA 분석과 범용 cDNA 합성을 갖춘 SYBR Green 염료 기반 화학 물질을 제공하는 회사가 있습니다. 이러한 분석은 높은 감도와 특이성을 제공할 수 있으며 다양한 q-RT-PCR 기기에서 실행할 수 있습니다. 안타깝게도 TaqMan 분석은 절대적인 정량화를 제공할 수 없으므로 위양성 및 결과의 변동성과 같은 문제가 발생할 수 있습니다13. 또한 높은 감도에도 불구하고 다양한 시료 유형에 이러한 분석을 적용하는 것은 광범위한 시료 준비의 필요성과 시료의 다른 성분으로부터의 잠재적 간섭으로 인해 제한될 수 있습니다.

차세대 시퀀싱(NGS): miRNA-seq는 생체액의 전체 miRNome에 걸친 차등 발현 분석에 점점 더 인기를 얻고 있습니다. miRNA-seq와 같은 NGS 기술의 이점은 miRNA의 게놈 전체 발현에 대한 대규모 병렬 분석을 허용하여 개별 miRNA의 정량화, 서열 변이 식별 및 새로운 miRNA의 발견을 가능하게 한다는 것입니다14. IlluminaTruSeq Small RNA Sample Preparation Kit와 같은 시퀀싱 기반 방법의 실질적인 단점은 miRNA의 상동성과 더 작은 판독 길이로 인해 정량적 편향이 유도되어 차등 발현 분석의 정확도에 영향을 미친다는 것입니다14. 뿐만 아니라 isomiRs(표준 miRNA 서열과 서열 또는 길이가 다른 변이체) 및 기술적 인공물의 존재는 데이터 해석을 복잡하게 만들어 잠재적으로 바이오마커 분석에서 오탐지 및 교란 요인으로 이어질 수 있습니다14. 또한 sRNAbench 및 miRDeep2와 같은 miRNA-seq 데이터 분석을 위한 다양한 도구는 다양한 결과를 산출할 수 있으며, 이는 새로운 miRNA 발견의 일관성과 신뢰성에 영향을 미칠 수 있습니다15,16. 마이크로어레이 기술과 같은 것조차도 대부분의 경우 충분하지 않을 수 있습니다. miRNA 또는 유전자 발현 수준을 검출하기 위한 강력하고 처리량이 많은 플랫폼을 제공하여 게놈 전체 연구에 적합하지만 이 기술은 여전히 이전에 확인된 miRNA의 수에 의해 제한되고 miRNA-표적 상호 작용을 직접 확인할 수 없으므로 기능 연구에서의 유용성이 제한됩니다17.

이러한 사용 가능한 모든 옵션을 비교할 때 여기서 강조할 수 있는 가장 중요한 요소는 공간적 맥락이 부족하다는 것입니다. 그들은 세포 내의 조직 형태 또는 시공간 분포와 관련된 어떠한 맥락도 제공하지 않습니다. miRNA의 시공간적 거동을 시각화하는 것은 세포 및 세포 이하 수준에서 miRNA의 기능을 밝히는 데 필요합니다. 현재 miRNAscope in situ Hybridization(ISH) 분석은 일반적으로 발색 검출 방법을 활용하여 접근할 수 있습니다. 이러한 분석을 통해 단일 세포 분해능으로 miRNA를 시각화할 수 있지만 결과는 품질이 부족하여 miRNA 발현과 샘플의 배경을 구별하기 어렵습니다. 일반적으로 이들 중 다수는 신뢰할 수 없고 일반적으로 수동 정량화가 필요한 저품질 분석을 생성합니다.

따라서 우리는 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 내에서 다중 면역형광 염색(Opal 단백질 염색에 의해) 및 miRNA를 표적으로 하는 고정 핵산(LNA) 프로브를 사용하여 MARLIN(Locked-nucleic-acid in situ hybridizatioN)을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식을 개발했습니다. 우리는 항디곡시게닌(DIG) 양 고추냉이 과산화효소(HRP) 접합체 항체에 의해 활성화되는 티라미드 신호 증폭(TSA) 시스템을 구현하여 이를 달성했습니다. HRP는 TSA의 촉매 역할을 하는 반면 Anti-DIG는 LNA 프로브에 부착됩니다. 이 분석은 단백질 및 잠재적으로 다른 RNA를 동시에 사용한 전사체 변형 후 miR의 본질적인 특성을 이해하는 데 특히 유용합니다. 또한 miRNA와 단백질 발현을 모두 정량화할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 분석이 없기 때문에 MARLIN은 FFPE 샘플 내에서 miR과 단백질의 현장 관계를 이해하는 효과적인 방법을 제공합니다.

MARLIN을 사용한 miR-181c-3p 정량화의 초기 결과는 인간 난소 FFPE 조직의 기본 공간적 맥락 내에서 miRNA 및 단백질의 병렬 분석의 타당성을 입증했습니다. 이 예 외에도 MARLIN의 구성 요소를 기반으로 이론적으로 Alexa Fluor와 같은 상업용 형광 다중화 형광단 또는 기타 소분자 염료를 사용하여 최대 4개의 단백질로 확장하는 것이 가능합니다18.

또한, 이 방법론은 표준 조직학 방법의 변형을 사용하기 때문에 적절한 프로브 및 항체 선택이 주어지면 다른 포유류 FFPE 조직과 호환되어야 합니다. 이 방법론은 공간 구조를 보존하고 세포 및 세포 내 miRNA 및 단백질 공국소화의 정량화를 허용합니다. 이 접근 방식은 miRNA-단백질 공동 발현 패턴 및 공간 분포를 매핑하여 공간 생물학의 중요한 격차를 해결하며, 이는 천연 조직 구조 내에서 직접 맥락화될 수 있습니다. 여기에서는 그림 1의 자세한 그래픽 개요와 함께 MARLIN을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 miR-181c-3p에 최적화되어 있지만 적절한 프로브 설계가 주어지면 다른 miR을 연구할 수 있습니다. 이 방법의 중요한 매개변수에는 조직 품질 평가 및 프로브 농도 최적화가 포함됩니다. 두 개의 10μm 절편을 활용하고 모든 RNA 단편 크기를 보존하는 프로토콜을 사용하여 RNA를 추출하여 DV200 메트릭을 사용하여 조직 블록의 RNA 무결성을 평가하는 것이 좋습니다. DV200 점수가 50 이상이고 프로토콜 농도가 높은 샘플은 체계적으로 테스트해야 합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 HGSC 환자의 인간 난소 종양 조직 절편의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직을 사용합니다. 이 샘플은 난소암에 대한 일차 세포감소 수술을 받는 이전에 치료받지 않은 환자로부터 수집되었습니다. 모든 샘플과 임상 데이터는 텍사스 대학교 MD 앤더슨의 기관 검토 위원회가 승인한 프로토콜에 따라 부인과 종양학 및 생식 의학과의 난소암 저장소에서 얻었습니다. 프론트 데스크 직원은 환자로부터 서면 동의서를 얻었고 공인된 윤리 지침에 따라 연구를 수행했습니다.

1. 조직 준비

  1. 모든 FFPE 샘플을 60°C에서 밤새 굽고 RNAse가 없는 물로 각 장비와 도구를 세척합니다. 섹션의 두께가 약 5μm인지 확인하십시오.
    참고: 이 프로토콜은 난소 종양에 최적화되었지만 추가 테스트 후 잠재적으로 다른 조직 유형과 함께 사용할 수 있습니다.
  2. 각 라운드당 5분 동안 자일렌을 3회 투여하고 각 라운드당 3분 동안 10회 재수화(100% 에탄올(EtOH) 2x, 95% EtOH 2x, 70% EtOH 2x, 50% EtOH 2x, 30% EtOH 2x)로 탈파라핀화를 수행합니다. 1x 트리스 완충 식염수(TBS)로 2분 동안 한 번 세척합니다.
    참고: 이 탈랍 단계는 권장되지만 선택 사항이며 조직 유형에 따라 다릅니다.
  3. 탈파라핀화 및 재수화 후 3% 과산화수소(H2O2) 용액을 10분 동안 도포합니다. 1x TBS, 2x로 2분 동안 세척합니다. 그런 다음 3.7% 파라포름알데히드(PFA) 용액을 10분 동안 도포합니다. 1x TBS, 2x로 2분 동안 세척합니다.
    참고: 이 단계는 선택 사항이며 지방 조직 또는 박리되기 쉬운 샘플에 대해서만 고려해야 합니다.
  4. 항원 검색의 첫 번째 라운드를 진행합니다. 이 프로토콜은 EZ-Retriever IR 시스템을 사용합니다. 시스템의 지침에 따라 샘플을 95°C에서 15분 동안 신선한 EZ-AR1 완충액에 담근 상태에서 전자레인지에 돌립니다. 20분 동안 식히십시오.
  5. 1x TBS로 2분 동안 세척합니다. 그런 다음 1x TBS-T(1x TBS, 0.1% Tween)로 2분 동안 2x.

2. 단백질 적용

  1. 소수성 장벽 펜으로 각 조직 섹션 주위에 장벽을 그립니다.
  2. 항체 차단 용액 1개(전체 조직 영역을 덮을 수 있을 만큼)를 첨가하고 습도 챔버(주변 및 제어되지 않는 습도)에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 그 후, 첫 번째 1차 항체를 동일한 차단 용액으로 희석하고 전체 조직 영역을 덮을 만큼 충분히 도포한 다음 습도 챔버에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
    참고: 이 프로토콜을 개발하는 동안 Anti-CD8은 1:75의 희석액으로 사용되었습니다.
  4. 1x TBS-T, 3x에서 2분 동안 세척합니다. 그런 다음 Anti-Ms + Rb HRP를 첨가하고 샘플을 습도 챔버(주변 및 제어되지 않은 습도)에서 실온에서 10분 동안 배양하도록 둡니다.
  5. 1x TBS-T, 3x에서 2분 동안 세척합니다. 첫 번째 형광단을 증폭 희석제로 1:100으로 희석하고 습도 챔버에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 이 프로토콜을 개발하는 동안 690nm 방출 형광단이 사용되었습니다. 이 시점부터 첫 번째 형광단을 적용한 후 나머지 절차에는 최소한의 조명을 사용하는 것이 좋습니다.
  6. 1x TBS-T, 3x에서 2분 동안 세척합니다. 마이크로파에서 항원 회수의 두 번째 라운드로 항체 염색의 두 번째 라운드를 시작하고, 샘플을 95°C에서 15분 동안 신선한 EZ-AR1 완충액에 다시 담근 다음 20분 동안 냉각합니다.
  7. 1x TBS로 2분 동안 세척합니다. 그런 다음 1x TBS-T, 2x로 2분 동안 세척합니다.
  8. 1x 항체 차단 용액을 실온(주변 및 제어되지 않은 습도)의 습도 챔버에서 30분 동안 다시 도포합니다.
  9. 두 번째 1차 항체를 동일한 차단 용액으로 희석하고 전체 조직 영역을 덮을 만큼 충분히 도포한 다음 습도 챔버에서 최소 16시간 동안 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    참고: 이 프로토콜을 개발하는 동안 Anti-EpCAM은 1:200의 희석으로 사용되었습니다.
  10. 다음날 TBS-T 1개, 3개로 2분 동안 세척하여 시작합니다. 그런 다음 Anti-Ms + Rb HRP를 추가하고 샘플을 습도 챔버(주변 및 제어되지 않은 습도)에서 실온에서 10분 동안 배양하도록 둡니다.
  11. 1x TBS-T, 3x에서 2분 동안 세척합니다. 두 번째 형광단을 증폭 희석제로 1:100으로 희석하고 습도 챔버에서 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 이 프로토콜을 개발하는 동안 620nm 방출 형광단이 사용되었습니다.

3. 프로브 적용

  1. 1x TBS-T, 3x에서 2분 동안 세척합니다.
  2. EZ-AR1 Elegance를 사용하여 전자레인지에서 107°C에서 15분 동안 세 번째이자 마지막 항원 회수를 시작합니다. 20분 동안 식히십시오. 1x TBS로 3분 동안 세척합니다.
  3. RNAscope Protease Plus(전체 조직 영역을 덮을 수 있을 만큼)를 바르고 40°C에서 30분 동안 유지합니다. 오븐을 사용하십시오. 1x TBS, 2x로 5분 동안 세척합니다.
  4. miRNA LNA 프로브를 90°C에서 4분 동안 변성시켜 프로브 준비를 수행합니다. 그런 다음 miRNA-ISH 완충액을 사용하여 프로브를 즉시 희석합니다. 프로브 용액을 소용돌이치고 회전시킵니다.
    참고: 이 프로토콜을 개발하는 동안 miR-181c-3p 표적 프로브를 1:250의 희석으로 사용했습니다.
  5. 프로브(전체 조직 영역을 덮을 수 있을 만큼)를 적용하고 60°C에서 1시간 동안 오븐에 다시 넣습니다. 5x 식염수 구연산나트륨(SSC) 완충액에서 5분 동안 세척합니다.
  6. 60°C에서 예열된 SSC에서 다음 순서로 5회 엄격한 세척을 수행하고 각 라운드당 5분 동안 희석합니다: 5x SSC 1회, 1x SSC 2회, 0.2x SSC 2회.
  7. 실온에서 0.2x SSC로 5분 동안 세척합니다. 가습 챔버에서 실온에서 30분 동안 차단 완충액과 함께 배양합니다. 1x TBS와 0.5% 차단 시약 분말을 조합하여 사용하고 적용하기 전에 차단 용액을 소용돌이치고 회전시키십시오.
  8. 항-디곡시게닌(마우스) HRP 접합체(이 샘플의 경우 1:500의 희석액 사용)를 적용하고 가습 챔버에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  9. 1x TBS-T, 3x에서 5분 동안 세척합니다. Tyramide Signal Amplification Plus Cyanine 3(TSA+Cy3) 형광단의 권장 희석액을 1:50의 권장 희석액을 실온(주변 및 조절되지 않는 습도)의 습도 챔버에서 10분 동안 도포합니다. 적용하기 전에 TSA+Cy3 용액을 소용돌이치고 회전시키십시오.
  10. 1x TBS-T, 3x로 5분 동안 세척합니다.

4. 핵 염색 및 장착

  1. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI) 작업 용액(전체 조직 영역을 덮을 수 있을 만큼)을 가습 챔버(주변 및 조절되지 않는 습도)에서 실온에서 5분 동안 도포합니다.
    참고: 이 프로토콜의 경우 1:1000의 희석액을 사용했으며 작업 DAPI 스톡을 TBS로 희석했습니다.)
  2. 1x TBS-T, 3x로 5분 동안 세척합니다. 완료되면 마운팅 매체를 사용하여 커버슬립을 적용하고 슬라이드를 10분 동안 건조시킵니다. 슬라이드는 이미징 전 24-72시간 사이와 최대 3개월 후 어둠 속에서 4°C에 보관하십시오.

5. 이미징 및 분석

  1. 이미징을 위해 40배 배율의 슬라이드 스캐닝 현미경(선호)을 사용하십시오.
  2. 세포 분할 및 표현형 분석을 위해 DAPI 및 단백질 대계염색을 활용하여 점점을 열거하기 위해 후속 정량 분석을 수행합니다.
    참고: 이 프로토콜 동안 Phenoimager HT를 사용한 이미징을 활용했습니다. 전체 슬라이드 스캔은 존재하는 형광단에 대한 적절한 필터를 사용하여 40배 배율로 캡처된 다음 다중화된 이미지를 OME-TIFF 파일로 내보냈습니다. 그런 다음 스캔한 이미지를 정량 분석을 위해 Visiopharm 이미지 분석 소프트웨어에 업로드했습니다.

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결과

이 프로토콜을 테스트할 때 정확성과 비교를 위해 동일한 대표 샘플의 두 개의 연속 섹션을 갖는 것이 중요합니다. 이 경우 HGSC(High-Grade Ovarian Cancer) 샘플을 사용하여 결과를 비교했습니다. miRNA 염색만 거치는 대조군 슬라이드(그림 2A-B)와 단백질 및 miRNA 염색을 모두 거치는 테스트 슬라이드(그림 2C-J)를 사용하였다.

대조군 슬라이드와 테스트 슬라이드 모두 일관된 miRNA(miR-181c-3p) 발현을 보였으며 종양 세포에서 더 높은 발현이 나타났습니다(그림...

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토론

miRNA의 중요성이 인식되고 이해되고 있지만 정상적인 발달과 질병 상태 모두에 대한 관찰은 현재 표준 방법을 사용하여 miRNA를 연구하는 데 어려움이 있기 때문에 방해를 받고 있습니다. 현장 방법의 부족으로 인해 MARLIN(miRNA FISH 분석)이 개발되었습니다. miRNA의 상동성과 짧은 길이를 감안할 때 miRNA의 위치와 전사체 후 조절에 미치는 영향을 시각화하는 것이 어려워집니다. 이 프로토콜 개발은 LNA(Locked Nucleic Acid Probes)를 활용합니다. LNA는 리보스가 메틸렌 브리지로 잠겨 산소 원자를 탄소 원자에 연결하는 변형된 RNA 염기입니다. 이 추가 브리지는 일반적으로 링과 관련된 유연성을 제한하여 본질적으로 분자 구조를 단단한 형태로 고정합니다19. LNA는 더 짧은 프로브와 더 높은 담금질 효율을 가능하게 하여 더 낮은 배경 신호를 위한 분석 설계를 지원하고 분석...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

분석이 개발되는 동안 Basant의 논문 위원회의 일원이었던 Chi Lam Au Yeung과 Manjunath Nimmakayalu에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 또한 사용된 샘플을 절편화하고 제공한 Samuel Mok. 마지막으로, Visiopharm 소프트웨어의 분석 및 사용 과정에서 광범위한 지원을 제공한 Johan Doré와 Dan Winkowski에게 감사드립니다. 이 연구는 난소암 연구 연합(OCRA 811621 및 891490), Sie 재단 및 Stephanie C. Stelter 기부 기금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 M. D. Anderson의 암 센터 지원 보조금 P30 CA016672 및 Jared Burks의 NCI의 연구 전문가 1 R50 CA243707-01A1을 통해 국립 보건원의 부분적으로 지원되는 유세포 분석 및 세포 이미징 핵심 시설과 공동으로 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10배 TRIS 완충 식염수(TBS) pH 7.6 & nbsp;써모피셔 사이언티브그리고 nbsp; J62662  K7단계 사이에 간헐적으로 세척이 일어나는 경우에
1x 오팔 항체 희석제/차단  아코야 바이오사이언스ARD1001EA단백질 차단 용액
1x 플러스 자동화 증폭 희석제아코야 바이오사이언스 FP1609오팔 형광포를 희석하는 데 사용됩니다
20배 농축액   식염수 시트산나트륨(SSC) 버퍼(SSC)시그마-올드리치S6639-1L프로브 하이브리다이제이션 후 miRNA 워시에 대해
4',6-디아미디노-2-페닐린돌 (DAPI) 써모 피셔 사이언티픽/인비트로젠EN62248 / 62248핵 염색을 위해
ACD HybEZ II 하이브리드화 시스템ACD 바이오테크네321711miRNAscope 프로토콜 중 온도를 조절하는 오븐
항-CD8 (D8A8Y), 토끼 mAb세포 신호 전달 기술85336S이 프로토콜 최적화를 위해 사용된 1차 항체 예시
항디곡시제닌(마우스) HRP 접합액리비티 헬스 사이언스 주식회사NEF832001EAmiRNA 검출에 사용되는 2차 시약
항-EpCAM (E6V8Y), 래빗 mAb세포 신호 전달 기술93790이 프로토콜 최적화를 위해 사용된 1차 항체 예시
차단 시약 분말아코야 바이오사이언스 FP1012miRNA 차단 솔루션
에틸 알코올 100% (200도)파르코111000200탈파라핀화를 위해
EZ-AR1 버퍼바이오제네XHK521-XAK단백질 단계에서 FFPE 조직 절편의 항원 회취에 사용됩니다
EZ-AR1 이레그건스 버퍼바이오제네XHK546-XAKmiRNA 프로브 단계에서 FFPE 조직 절편의 항원 회수에 사용됨
EZ-리트리버 IR 시스템바이오제네XMW015-IRFFPE 조직 절편의 항원 회취에 사용되는 마이크로파
과산화수소 용액 30%  시그마-올드리치  HX0640-5 조직 준비를 위해서요. 내인성 과산화효소 활성을 차단하고 고색 제품을 생산하는 데 도움을 줍니다
miR-181c-3p miRNA 프로브치아겐339112이 프로토콜을 최적화하기 위해 사용된 miRNA 프로브 예시
miRCURY LNA miRNA ISH 버퍼 세트 (FFPE)치아겐339450 miRNA 프로브를 희석하는 데 사용됩니다
오팔 620아코야 바이오사이언스 FP1495001KT1차 항체 식별을 위한 형광체
오팔 690 아코야 바이오사이언스 FP1497001KT1차 항체 식별을 위한 형광체
오팔 안티-Ms + Rb HRP아코야 바이오사이언스ARH1001EA검출제로 사용되는 2차 항체
피어스 16% 포르말데히드 (w/v), 메탄올 무첨가써모피셔 사이언티브28908조직 준비를 위한 3.7% PFA를 만드는 방법
프로롱 다이아몬드 안티페이드써모피셔 사이언티브P36970매체 장착
RNAscope 프로테아제 플러스ACD 바이오테크네322331조직 절편을 투과시키기 위해; 단백질을 부분적으로 소화하여 표적 miRNA 분자를 노출시킨다
RNAse 없는 물과 nbsp;코닝 46-000-CM 모든 장비를 청소하고 준비하며, 필요할 때 희석제로 사용하고, nbsp; 그리고 nbsp;
트윈 20세시그마-올드리치P1379-25MLTBS-T를 만들기 위해
티라마이드 신호 증폭과 시아닌 3아코야 바이오사이언스 NEL744001KTmiRNA를 식별하기 위한 형광체
U6 및 스크램블 miRNA 프로브치아겐339459선택적 제어 프로브
자일렌 조직학 등급써모피셔 사이언티브UN1307탈파라핀화를 위해

참고문헌

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