Method Article

질량 분석 이미징을 통한 포르말린 고정, 파라핀 포매 샘플에서 생체 분자의 순차적 검출

DOI:

10.3791/68618

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Texas at Austin, 2Department of Leukemia, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직 샘플에서 순차적 대사산물, N-결합 글리칸 및 트립신 펩타이드 검출을 위한 질량 분석 이미징 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조직은 장기의 기능을 수행하기 위해 서로 상호 작용하는 다양한 세포 유형과 생체 분자로 구성된 복잡한 세포 환경입니다. 전통적으로 대사산물, 글리칸, 단백질과 같은 생체분자 분석 기술은 조직의 균질화를 수반하여 모든 공간 정보를 파괴했습니다. 이러한 전통적인 방법은 복잡한 세포 내 및 세포외 분자 상호 작용에 대한 완전한 이해를 방해했습니다. 반면에 질량 분석 이미징(MSI)은 조직 내 생체 분자의 공간 정보를 보존할 뿐만 아니라 거의 단일 세포 해상도의 순차 분석을 통해 동일한 조직 절편에서 여러 종류의 분석물을 검출할 수 있습니다. 이를 통해 다양한 종류의 생체 분자 전반에 걸친 분자 상호 작용에 대한 보다 완전한 그림을 도출할 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 대사산물, N-결합 글리칸 및 트립스 펩타이드의 질량 분석 이미징을 20μm 분해능으로 동일한 조직 절편에서 순차적으로 수행하는 단계를 간략하게 설명합니다. 무결성을 보장하기 위해 절편을 신중하게 처리하는 것과 함께 분석물 클래스가 이미지화되는 순서를 성실하게 고려하면 동일한 섹션에서 여러 고품질 이미지를 수집할 수 있습니다. 이러한 데이터는 이후에 일련의 절편에서 수집된 다른 공간 오믹스 데이터(전사체학, 면역조직화학 등)와 통합될 수 있으며, 여기서 동일한 세포는 이러한 인접한 절편에서 분석될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

질량 분석 이미징(MSI)은 조직에 존재하는 정확한 분자에 대한 선험적 지식 없이도 얇은 조직 절편에서 수백에서 수천 개의 생체 분자를 검출하고 시각화할 수 있는 강력한 기술로, 바이오마커 발견을 위한 탁월한 도구입니다1. DESI(Desorption ElectroSpray Ionization)2,3, IR-MALDESI(Infrared Matrix Assisted Laser Desorption ElectroSpray Ionization)4 및 SIMS(Secondary Ion Mass Spectrometry)5를 포함하여 여러 유형의 MSI가 다양한 실험실에서 사용되지만 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization)는 여전히 가장 일반적으로 사용되고 가장 다재다능합니다. 대부분의 생체 분자 종류는 조직의 세척/전처리, 효소 분해 및 사용된 매트릭스/용매를 포함하여 샘플 준비를 맞춤화하여 MSI로 검출할 수 있습니다 6,7. MALDI MSI는 대사 산물, 지질, 글리칸, 단백질 및 단백질 분해 펩타이드의 검출에 사용되었습니다.

MSI 연구는 질병 메커니즘 8,9를 더 잘 이해하고, 암 등급 및 병기 결정10,11을 개선하고, 치료 결과12를 예측하고, 진단을 개선하고13, 분자 종양 마진을 결정하기 위해 다양한 임상 및 전임상 연구에서 사용되었습니다14. 이러한 연구의 대부분은 단일 종류의 분석물만 검출하는 데 초점을 맞췄습니다. 그러나 동일한 샘플에서 두 가지 이상의 생체 분자를 분석하는 것이 종종 흥미로울 것입니다. 전통적으로 이는 조직의 연속 절편으로 수행되었습니다. 그러나 보다 최근에는 동일한 조직 절편에서 여러 분석물 클래스를 순차적으로 분석하는 예가 나타났습니다. 예를 들어, Yagnik et al. 세포 유형 분류를 위해 동일한 섹션에서 동결 조직의 지질 이미징에 이어 MALDI 면역조직화학을 입증했습니다15. Cliftet al. N-결합 글리칸, 세포외 기질 단백질 및 일반 단백질의 이미징을 위해 포르말린 고정, 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에 PNGaseF, 콜라게나제 및 트립신을 각각 순차적으로 적용하는 것을 보여주었습니다16. Escobar et al. 동결 조직의 동일한 섹션에서 N-결합 글리칸, O-GlcNAc 및 트립신 펩타이드의 순차적 분석을 입증했습니다17. 이러한 유형의 실험은 가장 쉽게 손실되는 분석물을 먼저 분석한 다음 조직에서 더 안정적인 분석물을 분석하기 위한 신중한 실험 계획을 통해 수행됩니다. 많은 경우, 원치 않는 분자 클래스를 제거하는 데 사용되는 세척은 다른 종류의 분자를 향상시키는 데 도움이되며6, 이는 이전에 적용된 매트릭스를 제거하는 각 세척이 이미지화할 다음 종류의 분석물의 신호를 향상시키는 데 도움이 되는 특성을 활용할 수 있는 특성입니다.

최근에, 우리는 FFPE 난소암 조직의 동일한 섹션에서 대사산물, N-결합 글리칸 및 트립신 펩타이드의 순차적 분석을 위한 워크플로를 발표했습니다18. 여기에서는 동일한 조직 절편에서 이 세 가지 종류의 생체 분자를 분석하기 위한 자세한 워크플로를 제시합니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 자세히 설명되어 있습니다. 우리가 아는 한, 이것은 FFPE 조직에서 순차적 이미징을 위한 이 워크플로를 자세히 설명하는 첫 번째 프로토콜입니다. 간단히 말해서, 음성 이온 모드 대사산물 이미징을 위해 1,5-디아미노나프탈렌 매트릭스(50% 아세토니트릴에 10mg/mL)로 코팅하기 전에 조직 절편을 자일렌으로 탈랍합니다. 그런 다음 매트릭스를 제거하고 절편을 재수화하고 항원을 회수한 후 PNGase F(중탄산암모늄 중 0.1μg/μL)를 분사하여 N-결합 글리칸을 제자리에서 방출합니다. 배양 후, 절편을 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA)(70% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산에서 10mg/mL) 매트릭스로 코팅하고 포지티브 이온 모드로 이미징합니다. 그런 다음 매트릭스를 다시 제거하고 재수화 및 항원 회수를 반복한 다음 절편에 트립신(중탄산암모늄에서 0.075μg/μL)을 분사하고 배양한 후 CHCA(70% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산에 10mg/mL) 매트릭스로 다시 코팅하고 양이온 모드로 이미지화합니다. 모든 용액은 사용 직전에 신선하게 만들어야 하며, 가능하면 연속 3일에 걸쳐 실험을 수행해야 합니다. 지연이 발생하면 절편을 건조 상태에서 -80°C 냉동고에 보관해야 합니다.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 고급 장액성 난소 암종에 대한 1차 세포감소 수술을 받는 이전에 치료받지 않은 환자로부터 수집한 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직을 사용합니다. 모든 임상 데이터는 텍사스 대학교 MD 앤더슨의 임상시험검토위원회(Institutional Review Board)가 승인한 프로토콜에 따라 부인과 종양학 및 생식의학과의 난소암 저장소에서 얻었습니다. 프론트 데스크 직원은 환자로부터 서면 동의서를 얻었고 공인된 윤리 지침에 따라 연구를 수행했습니다.

1. 대사산물 이미징 샘플 준비

참고: 이 프로토콜은 임상 샘플이 일반적으로 조직기술자에 의해 임상 병리학 코어 내에서 절편화되어야 하기 때문에 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직(4μm 두께)의 절편이 이미 유리 현미경 슬라이드에 장착되었다고 가정합니다. 여기에 제시된 작업은 참조된 TOF 기기에서 수행되므로 직교 TOF 측정은 MSI 실험에서 전통적으로 사용되는 전도성 슬라이드의 필요성을 완화합니다. 표준 현미경 슬라이드를 사용하면 임상 병리학 실험실의 표준 워크플로우에 더 도움이 될 뿐만 아니라 슬라이드에 이미 보관된 조직을 사용할 수 있습니다.

  1. 다이아몬드 서기를 사용하여 슬라이드의 네 모서리에 기준 표시를 만듭니다.
  2. 조직학적 등급 자일렌에 3분 동안 담가 절편을 탈파라핀화합니다.
    알림: 자일렌은 유해하므로 화학 흄 후드에 사용해야 합니다.
  3. 절편을 신선한 자일렌에 3분 동안 담급니다.
  4. 슬라이드를 실온에서 건조시키십시오.
  5. 슬라이드를 슬라이드 어댑터 대상에 놓습니다.
  6. 평판 스캐너를 사용하여 4,800dpi 해상도의 슬라이드의 광학 이미지를 획득합니다.
  7. 15mg의 1,5-디아미노나프탈렌(DAN)을 1.5mL의 50% ACN에 녹여 MALDI 매트릭스를 만듭니다. 완전히 용해될 때까지 초음파 처리, ~ 5 분. 샘플 루프에 로드하기 전에 매트릭스 용액을 필터링합니다.
    알림: DAN은 발암이 의심되는 물질이므로 적절한 개인 보호 장비와 함께 사용해야 합니다. 매트릭스 스프레이는 화학 연기에서 수행해야 합니다.
  8. 다음 매개변수가 있는 로봇 시약 분무기를 사용하여 슬라이드에 DAN 용액을 분사합니다: 트랙 속도 - 1,200mm/s; 트랙 간격 - 3mm; 노즐 온도 - 60 °C; 노즐 높이 - 40mm; 유량 - 100 μL/min; 패스 - 4; N 2 압력 - 10psi; 패턴 - CC
  9. 메탄올에 현탁된 적린 0.5μL를 슬라이드의 알려진 위치에 도포합니다.

2. 대사산물 이미징 데이터 수집

  1. 준비된 슬라이드를 슬라이드 어댑터 II에 넣고 timsTOF fleX MALDI QTOF 질량 분석기에 로드합니다.
  2. tims OFF를 사용하여 timsControl에서 음이온 모드 데이터 수집에 적합한 방법을 로드합니다. 기기가 아직 음이온 모드에 있지 않은 경우 대사산물에 대한 다음 기기 매개변수를 사용하여 교정 및 데이터 수집 전에 평형을 위해 극성을 전환한 후 최소 25분 동안 기다립니다. 레이저 스캔 범위 - X 및 Y 모두에서 16.0 μm; 결과 필드 크기 - X 및 Y 모두에서 20.0 μm; 레이저 샷 - 150; 레이저 플루언스 - ~30%; 깔때기 1 RF - 150.0 Vpp; 깔때기 2 RF - 200.0 Vpp; 다극 RF - 200.0 Vpp; 충돌 에너지 - 10.0eV; 충돌 RF - 500.0 Vpp; 전송 시간 - 55.0 μs; PrePulse 저장 - 5.0μs(보충 그림 S1).
  3. Sample Carrier 탭에서 Target Profile(지금 생성 버튼 클릭) 및 초점 조정(지금 조정 버튼 클릭)을 수행합니다. 필요한 경우 레이저 탭에서 X 및 Y의 레이저 위치를 조정하여 레이저가 십자선과 정확하게 정렬되도록 합니다.
  4. 슬라이드의 지점에서 최소 5세트의 레이저 샷을 합산하여 적린탄 스펙트럼을 수집합니다.
  5. 캘리브레이션 탭에서 캘리브레이션 버튼을 클릭하여 캘리브레이션을 수행합니다. 강도가 매우 낮거나 ppm 오류가 높은 피크를 제거합니다.
    참고: 인 클러스터(P2 및 P4)조차도 일반적으로 매우 약한 신호를 제공합니다. 수락을 클릭하기 전에 보정 점수가 100%여야 합니다. 그렇지 않은 경우 합산 스펙트럼을 지우고 새 스펙트럼을 얻으십시오.
  6. flexImaging 소프트웨어를 실행합니다. 이미지 획득 GUI가 자동으로 시작됩니다.
  7. Choose Imaging Run 창에서 Set up a new imaging run 을 선택합니다.
  8. Select Workflow(워크플로 선택) 창에서 Classic workflow(클래식 워크플로)를 선택합니다.
  9. 데이터 스토리지 창에서 데이터에 대한 이미징 실행 이름과 결과 디렉터리를 제공합니다.
    참고: 파일 이름에 공백을 사용해서는 안 됩니다.
  10. 획득 설정 창에서 사용자 정의 측정 영역을 선택하고 래스터 폭 상자에 20을 입력합니다. 찾아보기를 클릭하여 이전에 만든 timsControl 메서드를 선택합니다.
  11. Sample Image(샘플 이미지) 창에서 Browse(찾아보기)를 클릭하여 평판 스캐너를 사용하여 획득한 광학 이미지를 선택합니다.
  12. 티치 샘플 창에서 광학 이미지와 슬라이드 사이의 3점 정렬을 수행합니다. 그런 다음 샘플 캐리어를 슬라이드의 첫 번째 에칭 된 기준 (etched fiducial) 으로 이동하고 timsControl의 십자선을 에칭의 뚜렷한 피쳐와 정렬합니다. 사진을 확대하고(100% 확대/축소 권장) 샘플 이미지를 티치 포인트 설정으로 설정한 다음 광학 사진에서 동일한 위치를 클릭합니다. 이 과정을 2회 더 반복하여 총 3개의 티치 포인트를 얻습니다. 다음을 클릭하여 교육을 완료합니다.
  13. 확인을 클릭하여 새 이미징 실행 마법사를 종료합니다.
  14. 소프트웨어에서 Position Sample Carrier 버튼을 클릭하여 티칭의 정확성을 확인하십시오. 확대하여 그림에서 네 번째(사용되지 않은) 기준점의 뚜렷한 특징을 클릭합니다. 샘플 캐리어는 timsControl 내에서 이 위치로 이동합니다. 십자선이 선택한 특성과 정렬되는지 확인합니다. 정렬되지 않으면 flexImaging에서 티칭을 지우고 티칭 프로세스를 반복하여 정확도를 높입니다.
  15. 소프트웨어에서 Add Polygon Measurement Region 도구를 선택하고 이미징할 조직의 윤곽을 그립니다. 마우스를 클릭할 때마다 앵커 포인트가 생성됩니다. 키보드의 백스페이스 버튼을 눌러 점을 하나씩 제거합니다. 영역이 그려지면 마우스를 두 번 클릭하여 다각형을 닫습니다.
  16. 조직 내의 몇 위치에서 레이저를 발사하여 신호를 확인하십시오. 티칭을 확인하기 위해 2.14단계와 같이 Position Sample Carrier 버튼을 사용하여 그림의 위치를 클릭합니다. 스펙트럼은 m/z 157 및 313 주변의 매트릭스 피크에 의해 지배됩니다. 154 및 250-300 미만의 m/z 영역을 확대하여 각각 많은 소분자 대사 산물과 지방산 피크를 보여줍니다. 최적의 신호를 위해 필요에 따라 레이저 플루언스를 조정합니다.
  17. timsControl 메서드를 저장합니다.
  18. 소프트웨어에서 AutoXecute 실행 시작 버튼을 클릭하여 이미징 수집을 시작합니다.
    참고: DAN 매트릭스를 사용하여 음이온 모드에서 이미징하면 TCA 사이클, 아미노산 및 지방산 등에서 수많은 대사 산물이 검출됩니다.

3. N-결합 글리칸 이미징을 위한 시료 준비

  1. 질량 분석기에서 샘플을 제거한 후 슬라이드를 100% 에탄올(200프루프)에 1분 동안 담가 DAN 매트릭스를 제거합니다.
  2. Coplin 병에 슬라이드를 재수화합니다: 1분 동안 신선한 100% 에탄올; 1분 동안 95% 에탄올; 1분 동안 70% 에탄올; 3분 동안 물; 3분 동안 담수.
  3. 슬라이드를 ~15분 동안 건조시킵니다.
  4. 슬라이드를 100mM Tris 완충액(6.06g의 Tris Base를 물 500mL에 용해시키고 필요에 따라 pH를 조절하여 만든), pH 9에 담그고 뚜껑이 느슨하게 놓인 Coplin 용기에 담그고 챔버에 500mL의 물이 있는 Decloaking Chamber에 넣어 항원 회수를 수행합니다. 95°C에서 20분 동안 가열합니다.
  5. Decloaking Chamber에서 Coplin Jar를 꺼내 벤치탑에 올려 20분 동안 식힙니다.
  6. 슬라이드를 5회 교체하여 물에 완충 교환합니다. 처음 세 가지는 용액의 절반을 붓고 물로 교체하십시오. 마지막 두 가지는 용액을 모두 붓고 물로 교체합니다.
  7. 슬라이드를 완전히 건조시키십시오.
  8. PNGaseF 적용 후 슬라이드 배양을 위한 습도 챔버를 만듭니다. 직경 100mm의 페트리 접시의 바닥을 덮도록 흡수성 물티슈의 원을 자릅니다. 두 개의 실험실 물티슈를 굴려 페트리 접시의 양쪽에 베개를 만듭니다(그림 2). 물 8mL를 넣어 물티슈를 포화시키고 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 37°C의 오븐에 30분 이상 넣어 예열합니다.
    알림: 접시 내부는 김이 모락모락 나는 것처럼 보여야 합니다.
  9. 100 μg의 동결건조 효소를 200 μL의 100 mM 중탄산암모늄, pH 7.8 및 와용돌이에서 혼합하여 PNGaseF를 준비합니다. 용액을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 물로 1mL로 희석합니다.
  10. 다음 매개변수와 함께 로봇 시약 분무기를 사용하여 슬라이드에 PNGaseF를 분사합니다. 저용량/저유량 응용 분야에 주사기 펌프 사용: 트랙 속도 - 1200mm/s; 트랙 간격 - 3mm; 노즐 온도 - 45 °C; 노즐 높이 - 40mm; 유량 - 25 μL/min; 패스 - 15; N 2 압력 - 10psi; 패턴 - CC
  11. 슬라이드를 예열된 페트리 접시에 티슈 면이 위로 향하게 하고 한쪽 끝이 각 실험실 물티슈 베개에 놓입니다. 슬라이드를 교체하고 페트리 접시를 접착 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 37°C 오븐에 넣고 페트리 접시 위에 40°C로 설정된 파충류 가열 패드를 놓습니다.
    알림: 이렇게 하면 뚜껑이 접시에서 가장 따뜻한 부분으로 유지되고 뚜껑에 결로가 형성되어 조직에 떨어지는 것을 방지하여 이미지에 아티팩트가 발생합니다.
  12. 소화가 진행될 수 있도록 슬라이드를 2시간 동안 배양합니다.
  13. 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 ~5분 동안 건조시킵니다.
  14. 15mg의 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA)을 1.5mL의 70% ACN, 0.1% TFA, 10mM 암모늄 인산염에 녹여 MALDI 매트릭스를 만듭니다.
    알림: TFA는 부식성이므로 적절한 개인 보호 장비가 있는 후드에 사용해야 합니다.
  15. 완전히 용해될 때까지 초음파 처리, ~ 5 분.
  16. 샘플 루프에 로드하기 전에 매트릭스 용액을 필터링합니다.
  17. 다음 매개변수와 함께 로봇 시약 분무기를 사용하여 슬라이드에 CHCA를 분사합니다. 트랙 속도 - 1,200mm/s; 트랙 간격 - 3mm; 노즐 온도 - 75 °C; 노즐 높이 - 40mm; 유량 - 120 μL/min; 패스 - 3; N 2 압력 - 10psi; 패턴 - HH
  18. 메탄올에 현탁된 적린 0.5μL를 슬라이드의 알려진 위치에 도포합니다.

4. N - 연결된 글리칸 이미징 데이터 수집

  1. 준비된 슬라이드를 슬라이드 어댑터 타겟에 놓고 MALDI QTOF 질량 분석기에 로드합니다.
  2. timsControl에서 양이온 모드 데이터 수집 을 위한 적절한 방법을 로드합니다. 기기가 아직 양이온 모드에 있지 않은 경우, 글리칸에 대한 다음 기기 매개변수를 사용하여 교정 및 데이터 수집 전에 평형화를 위해 극성을 전환한 후 최소 25분 동안 기다립니다: m/z 범위 - 700-3500; 레이저 스캔 범위 - X 및 Y 모두에서 16.0 μm; 결과 필드 크기 - X 및 Y 모두에서 20.0 μm; 레이저 샷 - 200; 레이저 플루언스 - ~25%; 깔때기 1 RF - 450.0 Vpp; 깔때기 2 RF - 500.0 Vpp; 다극 RF - 500.0 Vpp; 충돌 에너지 - 10.0eV; 충돌 RF - 2,700.0 Vpp; 전송 시간 - 140.0 μs; PrePulse 저장 - 14.0μs (보충 그림 S2).
  3. Sample Carrier 탭에서 Target Profile(지금 생성 버튼 클릭) 및 초점 조정(지금 조정 버튼 클릭)을 수행합니다. 필요한 경우 레이저 탭에서 X 및 Y의 레이저 위치를 조정하여 레이저가 십자선과 정렬되도록 합니다.
  4. 슬라이드의 지점에서 최소 5세트의 레이저 샷을 합산하여 적린탄 스펙트럼을 수집합니다.
  5. 캘리브레이션 탭에서 캘리브레이션 버튼을 클릭하여 캘리브레이션을 수행합니다. 강도가 매우 낮거나 ppm 오류가 높은 피크를 제거합니다.
    알림: 수락을 클릭하기 전에 보정 점수는 100%여야 합니다. 그렇지 않은 경우 합산 스펙트럼을 지우고 새 스펙트럼을 얻으십시오.
  6. 소프트웨어에서 이전에 대사산물 이미징에 사용된 .mis 파일을 엽니다.
  7. 글리칸 데이터임을 나타내는 새 이름으로 파일을 저장합니다.
  8. 편집 | 이미징 실행 속성에서 획득 방법을 원하는 글리칸 방법으로 변경합니다.
  9. 편집 | 티치 포인트를 지웁니다.
    알림: 슬라이드를 제거하고 슬라이드 어댑터에 다시 로드한 후 슬라이드가 정확히 같은 위치에 있지 않습니다.
  10. 편집을 사용하여 새로운 교육 수행 | 티치 포인트를 설정합니다. 원래 이미징 마법사(2.12단계)에서 수행한 대로 3점을 설정합니다.
  11. 소프트웨어에서 Position Sample Carrier 버튼을 클릭하여 티칭의 정확성을 확인하십시오. 확대하여 그림에서 네 번째(사용되지 않은) 기준점의 뚜렷한 특징을 클릭합니다. 샘플 캐리어는 timsControl 내에서 이 위치로 이동합니다. 십자선이 선택한 특성과 정렬되는지 확인합니다.
    알림: 십자선이 정렬되지 않으면 티칭을 지우고 티칭 과정을 반복하여 정확도를 높이십시오.
  12. 파일을 저장합니다.
  13. 조직 내의 몇 위치에서 레이저를 발사하여 신호를 확인하십시오. 4.11단계와 같이 Position Sample Carrier 버튼을 사용하여 이미지의 위치를 클릭하여 티칭을 확인합니다. 스펙트럼에 일반적으로 m/z 1,663 및 1,809에서 우세한 피크가 있는 풍부한 글리칸 피크가 있는지 확인합니다. 최적의 신호를 위해 필요에 따라 레이저 플루언스를 조정합니다.
  14. timsControl 메서드를 저장합니다.
  15. AutoXecute 실행 시작 버튼을 클릭하여 이미징 획득을 시작합니다.

5. 트립신 펩타이드 이미징을 위한 샘플 준비

  1. 슬라이드를 100% 에탄올(200프루프)에 ~1분 동안 담가 CHCA 매트릭스를 제거합니다.
  2. 다음과 같이 Coplin 병에 슬라이드를 재수화합니다. 1분 동안 신선한 100% 에탄올; 1분 동안 95% 에탄올; 1분 동안 70% 에탄올; 3분 동안 물; 3분 동안 담수.
  3. 슬라이드를 ~15분 동안 건조시킵니다.
  4. 슬라이드를 100mM Tris 완충액(pH 9)에 담그고 뚜껑이 느슨하게 놓인 Coplin 용기에 담그고 챔버에 500mL의 물이 있는 은폐 제거 챔버에 넣어 항원 회수를 수행합니다. 95°C에서 20분 동안 가열합니다.
    참고: 이 두 번째 항원 검색은 트립신이 절단 부위에 보다 효율적으로 접근하기 위해 단백질을 변성시키는 데 필요합니다.
  5. Decloaking Chamber에서 Coplin Jar를 꺼내 벤치탑에 올려 20분 동안 식힙니다.
  6. 슬라이드를 5회 교체하여 물에 완충 교환합니다. 처음 세 가지는 용액의 절반을 붓고 물로 교체하십시오. 마지막 두 가지는 용액을 모두 붓고 물로 교체합니다.
  7. 슬라이드를 완전히 건조시키십시오.
  8. 100mM 아세트산 200μL에 동결건조 효소 100μg을 재구성하여 트립신을 제조하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 실험에 적합한 크기(일반적으로 40μL)로 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
  9. 350μL의 100mM 중탄산암모늄, pH 7.8 및 39μL의 ACN을 첨가하여 40μL의 트립신 분취량을 준비합니다. 잘 섞는다.
    참고: 아세토니트릴(10% ACN)은 수용액에 비해 트립신의 활성을 증가시키고 스프레이를 위한 용액의 표면 장력을 감소시킵니다19.
  10. 다음 매개변수가 있는 로봇 시약 분무기를 사용하여 슬라이드에 트립신을 분사합니다. 저용량/저유량 응용 분야에 주사기 펌프 사용: 트랙 속도 - 750mm/s; 트랙 간격 - 3mm; 노즐 온도 - 30 °C; 노즐 높이 - 40mm; 유량 - 10 μL/min; 패스 - 12; N 2 압력 - 10psi; 패턴 - HH
  11. 직경 100mm의 페트리 접시 바닥에 정사각형의 흡수성 물티슈를 놓습니다. 모서리가 접시 가장자리에 닿도록 하고 물티슈 위에 물 1mL를 뿌립니다.
  12. 슬라이드를 물티슈 위에 놓고 티슈 면이 위로 향하게 하고 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 접착 밀봉 필름으로 페트리 접시를 밀봉합니다.
  13. 소화가 진행될 수 있도록 슬라이드를 37°C에서 4시간 동안 배양합니다.
  14. 페트리 접시에서 슬라이드를 제거하고 ~5분 동안 건조시킵니다.
  15. 15mg의 α-시아노-4-하이드록시신남산(CHCA)을 1.5mL의 70% ACN, 0.1% TFA, 10mM 암모늄 인산염에 녹여 MALDI 매트릭스를 만듭니다.
  16. 완전히 용해될 때까지 초음파 처리, ~ 5 분.
  17. 샘플 루프에 로드하기 전에 매트릭스 용액을 필터링합니다.
  18. 다음 매개변수가 있는 로봇 시약 분무기를 사용하여 슬라이드에 CHCA를 분사합니다. 트랙 속도 - 1200mm/s; 트랙 간격 - 3mm; 노즐 온도 - 75 °C; 노즐 높이 - 40mm; 유량 - 120 μL/min; 패스 - 4; N 2 압력 - 10psi; 패턴 - HH
  19. 메탄올에 현탁된 적린 0.5μL를 슬라이드의 알려진 위치에 도포합니다.

6. 트립신 펩타이드 이미징 데이터 수집

  1. 준비된 슬라이드를 슬라이드 어댑터에 넣고 timsTOF MALDI QTOF 질량 분석기에 로드합니다.
  2. timsControl에서 양이온 모드 데이터 수집 을 위한 적절한 방법을 로드합니다. 기기가 아직 양이온 모드에 있지 않은 경우, 펩타이드에 대해 다음 기기 매개변수를 사용하여 교정 및 데이터 수집 전에 평형을 위해 극성을 전환한 후 최소 25분을 기다립니다: m/z 범위 - 600-4500; 레이저 스캔 범위 - X 및 Y 모두에서 16.0 μm; 결과 필드 크기 - X 및 Y 모두에서 20.0 μm; 레이저 샷 - 200; 레이저 플루언스 - ~25%; 깔때기 1 RF - 450.0 Vpp; 깔때기 2 RF - 500.0 Vpp; 다극 RF - 600.0 Vpp; 충돌 에너지 - 10.0eV; 충돌 RF - 3400.0 Vpp; 전송 시간 - 180.0 μs; PrePulse 저장 - 18.0μs (보충 그림 S3).
  3. Sample Carrier 탭에서 Target Profile(지금 생성 버튼 클릭) 및 초점 조정(지금 조정 버튼 클릭)을 수행합니다. 필요한 경우 레이저 탭에서 X 및 Y의 레이저 위치를 조정하여 레이저가 십자선과 정렬되도록 합니다.
  4. 슬라이드의 지점에서 최소 5세트의 레이저 샷을 합산하여 적린탄 스펙트럼을 수집합니다.
  5. 캘리브레이션 탭에서 캘리브레이션 버튼을 클릭하여 캘리브레이션을 수행합니다. 강도가 매우 낮거나 ppm 오류가 높은 피크를 제거합니다. 수락을 클릭하기 전에 보정 점수가 100%인지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 합산 스펙트럼을 지우고 새 스펙트럼을 얻으십시오.
  6. 이전에 글리칸 이미징에 사용된 .mis 파일을 엽니다.
  7. 펩타이드 데이터임을 나타내는 새 이름으로 파일을 저장합니다.
  8. 편집 | 이미징 실행 속성에서 획득 방법을 원하는 펩타이드 분석법으로 변경합니다.
  9. 편집 | 티치 포인트를 지웁니다.
    알림: 슬라이드를 제거하고 슬라이드 어댑터에 다시 로드한 후 슬라이드가 정확히 같은 위치에 있지 않습니다.
  10. 편집을 사용하여 새로운 교육 수행 | 티치 포인트를 설정합니다. 원래 이미징 마법사(2.12단계)에서 수행한 것처럼 세 점을 설정합니다.
  11. Position Sample Carrier 버튼을 클릭하여 티칭의 정확성을 확인하십시오. 확대하여 그림에서 네 번째(사용되지 않은) 기준점의 뚜렷한 특징을 클릭합니다. 샘플 캐리어는 timsControl 내에서 이 위치로 이동합니다. 십자선이 선택한 특성과 정렬되는지 확인합니다.
    알림: 십자선이 정렬되지 않으면 티칭을 지우고 티칭 과정을 반복하여 정확도를 높이십시오.
  12. 파일을 저장합니다.
  13. 조직 내의 몇 개 위치에서 레이저를 발사하여 신호를 확인합니다. 티칭을 확인하기 위해 6.11단계와 같이 샘플 캐리어 위치 버튼을 사용하여 이미지의 위치를 클릭합니다. 스펙트럼에 일반적으로 m/z 944, 1,105 및 1,198에서 우세한 피크가 있는 풍부한 펩타이드 피크가 있는지 확인합니다. 최적의 신호를 위해 필요에 따라 레이저 플루언스를 조정합니다.
  14. timsControl 메서드를 저장합니다.
  15. AutoXecute 실행 시작 버튼을 클릭하여 이미징 획득을 시작합니다.

7. 조직학적 염색

참고: 헤마톡실린과 에오신에는 여러 가지 방법이 있습니다. 여기에 제시된 것은 이 실험실에서 자주 사용되는 수정된 Carazzi 방법입니다.

  1. 슬라이드를 100% 에탄올에 1분 동안 담가 CHCA 매트릭스를 제거합니다.
  2. 슬라이드를 다음과 같이 염색합니다: 95% 에탄올을 30초 동안 염색합니다. 30초 동안 70% 에탄올; 30초 동안 물; 2분 동안 헤마톡실린; 30초 동안 물; 30초 동안 70% 에탄올; 30초 동안 95% 에탄올; 1분 동안 에오신; 30초 동안 95% 에탄올; 30초 동안 100% 에탄올; 2.5분 동안 자일렌; 장착 매체가 있는 커버슬립.
  3. 슬라이드를 >1시간 동안 건조시킨 후 커버슬립을 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.
  4. 디지털 슬라이드 스캐너로 디지털화하세요.

8. 데이터 시각화

참고: 이 프로토콜의 범위를 벗어난 SCiLS Lab으로 수행할 수 있는 광범위한 분석이 있습니다. 여기에서는 기본 파일 생성, 데이터 시각화 및 추정 식별을 위한 데이터베이스에 대한 피크 검색에 대해 설명합니다.

  1. SCiLS Lab 2025b를 시작하고 새로 만들기를 선택합니다.
  2. 소프트웨어에 로드할 데이터 파일을 선택합니다.
    참고: SCiLS Lab Pro를 사용하면 동일한 매개변수로 수집된 여러 데이터 파일을 함께 로드하여 서로 정규화하고 동시에 시각화할 수 있습니다.
  3. 원하는 레이아웃으로 샘플을 정렬합니다. 왼쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 샘플을 이동합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 드래그하여 샘플을 회전합니다. 다음을 선택합니다.
  4. 질량 축 설정 창에서 필요한 조정을 수행합니다. 기본값은 일반적으로 timsTOF 데이터에 적합합니다. 다음을 클릭합니다.
  5. 피처 찾기 창에서 가져오는 동안 자동 피크 선택에 적절한 값을 설정합니다. 다음을 클릭합니다.
    참고: 이것은 FFPE 조직의 대사 산물 데이터에 대해 잘 작동하지 않으므로 건너뛰어야 합니다.
  6. 가져오기 설정은 가져오기 요약 창에서 시각화됩니다. 가져오기를 클릭합니다.
  7. 파일 이름과 SCiLS 파일을 저장할 위치를 제공합니다.
    참고: 파일 크기에 따라 가져오는 데 몇 분에서 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
  8. 완료되면 요약 창 이 표시됩니다. 가져온 데이터셋 열기 를 클릭하여 SCiLS 파일과 상호 작용합니다.
  9. 소프트웨어의 오른쪽 상단에서 정규화 옆의 드롭다운을 클릭하고 Root Mean Square를 선택합니다.
    참고: 이것은 가져온 중심 데이터의 희소성을 고려할 때 timsTOF 데이터에 가장 적합한 방법이며 최상의 시각화를 제공합니다.
  10. 파일 | 파일 속성에서 간격 너비를 적절한 값(일반적으로 timsTOF 데이터의 경우 10 - 15ppm)으로 설정합니다. 값이 평균 스펙트럼의 피크 너비에 걸쳐 있는지 평가하여 값이 적절한지 확인합니다.
  11. 마우스 휠을 클릭하고 드래그하거나 앞으로 굴려 소프트웨어 하단의 평균 스펙트럼을 확대합니다.
  12. 정점에 십자선을 배치하고 마우스 휠을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 시각화할 피크를 선택합니다.
  13. Control + 스페이스 바를 눌러 활성 이온 이미지 목록에 관심 있는 이온을 추가합니다.
  14. 소프트웨어 오른쪽에 있는 이온 이미지 창 하단에 있는 기능으로 저장 버튼을 클릭하여 선별된 기능 목록을 저장합니다.
  15. 파일 | MetaboScape가 동일한 네트워크에 설치 및 구성된 경우 MetaboScape를 사용하여 추정 대사 산물 또는 글리칸 ID를 검색합니다. 또는 추정 식별을 위해 SCiLS 파일을 .imzML 파일로 변환하여 METASPACE(https://metaspace2020.org/)로 가져옵니다.
    참고: SCiLS Lab의 기능에 대한 전체 설명은 도움말 메뉴 옵션의 사용 설명서에서 찾을 수 있습니다.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜을 완료하면 동일한 조직 섹션에서 3개의 강력한 MSI 데이터 세트가 생성됩니다. 대사산물 데이터의 전체 스펙트럼을 시각화할 때 스펙트럼은 m/z 157 및 315에서 매트릭스 피크에 의해 크게 지배됩니다. 이것은 FFPE 조직의 경우 정상입니다. 많은 대사 산물 및 지방산 신호는 m/z 범위 <155 및 250에서 300 사이를 확대하여 관찰됩니다. 그림 3 은 조직에서 얻은 복잡한 대사 산물 스펙트럼을 강조하는 전체 스펙트럼 및 확대 범위의 예를 보여줍니다. 전형적으로, 700 내지 900 사이의 대사산물 피크가 이 샘플 전처리를 통해 음성 모드에서 FFPE 조직 절편에서 관찰됩니다.

PNGaseF 분해는 조직에서 ~2-300개의 글리칸 피크를 검출해야 합니다. m/z 범위 1,000-2,000의 글리칸에서 발생하는 피크는 원자 구성으로 인해 십진수 질량이 0.3-0.7이어야 합니다. 이 십진수 질량은 이 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단일 조직 절편에서 순차적인 MSI 데이터를 수집하려면 세부 사항에 세심한 주의가 필요합니다. 고품질 데이터를 얻는 데 절대적으로 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 동시에 두 개 이상의 슬라이드를 준비하는 경우 주의해야 합니다. 슬라이드를 Coplin 용기에 넣거나 Coplin 용기 사이를 이동할 때 두 개의 슬라이드를 용기의 같은 위치에 놓지 않도록 주의하십시오. 이로 인해 조직 표면의 용매 노출이 부적절해지거나 한 슬라이드가 다른 슬라이드에서 조직을 긁어낼 수 있습니다. 둘째, 분석을 위해 극성을 변경할 때 기기가 최소 25분 동안 평형을 이루도록 하는 것이 중요합니다. 이 시간 동안 분자의 측정된 m/z 값은 약간 드리프트됩니다. 이는 이 평형 시간 동안 튠 믹스를 분사할 때 피크의 질량이 약간 변하기 때문에 관찰할 수 있습니다. 시스템이 평형화되기 전에 이미지를 시작하면 이미지의 첫 번째 부분에서 감지된 피크의 질량 드리프트가 발생하여 이 정착 기간 동안...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EHS와 텍사스 대학교 오스틴 질량 분석 이미징 시설은 텍사스 암 예방 및 연구소 상(RP240559)의 지원을 받습니다. 이 연구는 난소암 연구 연합(OCRA 811621 및 891490), Sie 재단 및 Stephanie C. Stelter 기부 기금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 M. D. Anderson의 암 센터 지원 보조금 P30 CA016672 및 Jared Burks의 NCI의 연구 전문가 1 R50 CA243707-01A1을 통해 국립 보건원의 부분적으로 지원되는 유세포 분석 및 세포 이미징 핵심 시설과 공동으로 수행되었습니다.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,5-디아미노나프탈렌피셔 사이언티픽D010125G대사산물 이미징을 위한 MALDI 매트릭스
아세토니트릴피셔 사이언티픽A955-4매트릭스 제조에 사용되는 LC-MS 등급 용매
& 알파;-시아노-4-하이드록시신남산시그마-알드리치70990-1G-F글리칸 및 펩타이드 이미징을 위한 MALDI 매트릭스
중탄산암모늄피셔 사이언티픽A643-500효소 완충액
암모늄 인산염시그마-알드리치467782-50G이미징 중 매트릭스 클러스터를 줄이기 위한 첨가제
은폐 해제 챔버 NxGen바이오케어 의료해당 사항 없음조직의 항원 회수에 사용
에탄올피셔 사이언티픽04-355-223매트릭스 준비 및 염색에 사용되는 LC-MS 등급 용매
M5 로봇 시약 분무기HTX 이미징해당 사항 없음효소 및 매트릭스를 조직에 적용하는 데 사용됩니다.
메탄올피셔 사이언티픽A456-4적린 현탁액 제조용 LC-MS 등급 용매
MS 등급 트립신피셔 사이언티픽PI90058단백질 소화를 위한 효소
MTP 슬라이드 어댑터 II브루커 달토닉스8235380질량 분석기에 마이크로스코프 슬라이드를 삽입하는 어댑터
NanoZoomer SQ 디지털 슬라이드 스캐너하마마츠 주식회사해당 사항 없음염색된 조직의 디지털 현미경 이미지를 생성하는 데 사용됩니다.
Perfection V600 평판 스캐너엡손해당 사항 없음MSI 데이터 수집을 위한 슬라이드의 광학 이미지를 생성하는 데 사용됩니다.
페트리 씰피셔 사이언티픽50-212-518효소 분해 중 페트리 접시 밀봉용
PNGaseF불독 바이오NZPP550LY단백질에서 N-결합 글리칸을 절단하기 위한 효소
적린시그마-알드리치04004-250G양이온 및 음이온 모드 모두에 대한 MALDI 교정제
SCiLS 연구실 (2025b)브루커 달토닉스해당 사항 없음MSI 데이터 시각화를 위한 소프트웨어
timsTOF fleX QTOF 질량분석기브루커 달토닉스해당 사항 없음질량 분석 데이터 수집에 사용
트리플루오라세트산피셔 사이언티픽85183양이온 모드 이미징을 위해 pH를 낮추는 매트릭스 첨가제
트리스 베이스피셔 사이언티픽BP152-500항원 회수를 위한 완충액
물피셔 사이언티픽W64매트릭스, 효소 및 염색에 사용되는 LC-MS 등급 용매
와이프올 X60피셔 사이언티픽19-413-113가습 효소 배양을 위한 흡수성 물티슈
자일렌피셔 사이언티픽X3P-1GAL염색용 투명제

References

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