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방법 논문

Stereo-seq 를 통한 종에 구애받지 않는 전사체의 포괄적인 공간 프로파일링

1.4K 조회수

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DOI:

10.3791/68619

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2025년 10월 31일

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1Department of Hematopoietic Biology and Malignancies, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 2Department of Gynecologic Oncology and Reproductive Medicine, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, 3Department of Veterinary Medicine & Surgery, University of Texas MD Anderson Cancer Center, 4Department of Genetics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 기사에서는 조직 구조를 보존하면서 다양한 전사체의 고해상도 매핑을 가능하게 하는 Stereo-seq를 사용하여 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 절편에서 숙주, 바이러스, 진균 및 마이크로바이옴 RNA의 포괄적인 공간 전사체 프로파일링을 수행하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

숙주 내 세포의 공간적 구성과 조직 내 박테리아 또는 바이러스 부하는 세포 유형 특이적 과정을 통해 세포를 구동하는 세포 유형 및 분석물의 상호 작용에 영향을 미칠 수 있습니다. FFPE 조직용 스테레오 시퀀스는 A'tailing을 사용하여 메신저 RNA(mRNA)를 캡처하거나 프로브 기반을 사용하여 종 특이적 전사체를 캡처하는 표준 공간 전사체학 방법과 다른 공간 바코드에 대한 무작위 프라이밍을 사용합니다. 이러한 방법은 긴 비코딩 RNA, 미토콘드리아 RNA, 마이크로RNA 또는 미생물, 바이러스 및 진균과 같은 다른 종의 RNA에서 다른 유형의 RNA의 영향과 중요성에 대한 최신 지식을 수용하지 않습니다. 여기에 설명된 것은 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직과 호환되는 랜덤 프로브 방법론을 사용하여 RNA 검출을 통한 공간 종에 구애받지 않는 스테레오 시퀀스 적용을 위한 라이브러리 준비를 통한 조직 절편화에서 단계별 절차입니다. 이 Stereo-seq 방법은 0.5μm마다 어레이에서 재발생하는 0.22μm 크기의 랜덤 캡처 비드를 가지므로 시퀀싱 기반 기술에서 세포내 분해능을 얻을 수 있습니다. 이 방법은 숙주 및 비숙주 RNA를 모두 검출하기 때문에 프로토콜은 수집, 보존, 절단 및 검출 과정(즉, 환경 및 취급 오염 물질) 동안 조직 내부에 무엇이 있는지 결정할 수 있도록 특정 고려 사항이 필요합니다. 마지막으로, 이 프로토콜을 사용하면 공간적 맥락 내에서 다중 RNA 종의 높은(단일 세포) 수준의 분해능을 가질 수 있어 세포 유형 및 병리학적 종의 액토 내 및 상호 작용에 대한 통찰력을 제공합니다.

서론

공간 오믹스 기술은 여러 표적, DNA(유전체학), RNA(전사체학), 대사산물(대사체학) 또는 단백질(단백질체학)1의 동시 정량화를 가능하게 함으로써 조직 세포 이질성 연구에 혁명을 일으켰습니다. 이러한 다양한 분석의 분해능은 종종 다양하며, 단일 세포 2,3 또는 기본 공간 컨텍스트4를 측정할 때 희소성이 증가하여 분석물을 측정할 때 다른 제한을 제공합니다. 대조적으로, RNA 시퀀싱과 같은 벌크 방법은 전체 샘플에 걸쳐 평균 유전자 발현만 제공하고 세포 이질성을 모호하게 하거나2 단일 세포 시퀀싱을 위해 조직 해리가 필요한 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)2,3은 종종 필터링이 필요합니다. 따라서 이러한 방법은 큰 세포와 응집체를 배제하는 반면, 생물정보학적 방법은 편향을 유발하는 단편과 이중항을 제거하려고 시도합니다 5,6,7. 공간 전사체학은 조직 구조를 유지하여 세포 조직 및 상호 작용에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 대부분의 비표적 공간 시퀀싱 방법은 단일 세포 분해능을 갖지 않으므로 10 내지 100개의 세포를 포함하는 공간 캡처 영역의 디콘볼루션이 필요하다 8,9,10. 그러나 지난 10년 동안 공간 전사체학은 실험 전략 또는 새로운 기술을 사용하여 해상도의 발전, 더 넓은 캡처 영역 및 다중 오믹스 접근 방식의 통합이 있었기 때문에 이러한 방법에 대한 요구를 능가했습니다 1,11,12.

Stereo-seq(Spatial Enhanced Resolution Omics-sequencing)는 나노 스케일 해상도(500nm)와 센티미터 스케일 캡처 영역을 제공하며, 종에 구애받지 않는 전체 전사체 캡처를 통해 코딩, 비코딩 및 비숙주 RNA13을 캡처할 수 있습니다. 이 방법은 현재 공간 전사체학에 대한 가장 높은 해상도이며 가장 큰 시야를 제공할 수 있는 옵션이 있습니다. 그러나 이 방법에는 시퀀싱 준비 라이브러리를 완성하는 데 4일에 걸친 약 15시간의 실습 시간의 시간 및 노동력 요구 사항을 포함하여 몇 가지 주목할만한 제한 사항이 있습니다. 이에 비해 프로브 기반 공간 전사체학, polyA-capture 어레이 기반 공간 전사체학, Slide-seq 및 공간 오믹스 시퀀싱을 위한 조직의 결정론적 바코드(DBiT-seq)와 같은 다른 시퀀싱 기반 공간 전사체학 기술은 일반적으로 2-3일에 걸쳐 5-8시간의 실습 시간이 필요합니다(표 1). 많은 연구자들에게 이러한 발전은 기술적 과제보다 더 중요하며 특히 다른 기술과 계층화된 경우 세포 및 세포 내 수준에서 질병 진행을 연구하기 위해 전체 전사체학 공간 아틀라스를 구성하는 데 이상적입니다1.

Stereo-seq 프로토콜은 폴리아데닐화된 mRNA 전사체를 포착하기 위해 폴리-T 프로브에 의존하는 전통적인 mRNA 전사체학을 뛰어넘는 가능성을 가지고 있습니다. 이러한 방법은 공간 발현 분석을 위해 신선한 조직(14 ) 또는 표적 사전 정의된 유전자 세트(15 )에 대한 종-특이적 프로브에 폴리아데닐화를 추가함으로써 수정될 수 있다. 대신, Stereo-seq는 무작위 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 미생물 RNA, 진균 RNA, 바이러스 RNA 및 인핸서 RNA, 원형 RNA 및 긴 비코딩 RNA(lncRNA)와 같은 비폴리아데닐화 RNA를 포함하여 종에 관계없이 다양한 RNA를 선택합니다16. 이론적으로, 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로RNA(miRNA) 및 트랜스포존과 같은 더 작은 RNA 또는 복구 요소를 포획하는 것이 가능합니다17. 그러나 현재 이러한 RNA의 생물정보학 및 매핑은 여전히 까다롭고 일반적으로 30bp 컷오프를 사용하는 초기 정렬 중에 필터링되는 경우가 많습니다.

여기에 요약된 것은 그림 1에 표시된 Stereo-seq 프로토콜에 대한 더 나은 이해와 처리를 보장하기 위해 DNA 나노볼(DNB) 칩에 대한 제조업체의 무작위 뉴클레오티드 캡처에 대한 수정과 함께 세부 프로토콜입니다. 이 프로토콜에는 분자 생물학자가 무작위 뉴클레오티드 캡처를 사용하여 Stereo-seq에서 새로운 FFPE 조직을 테스트하여 품질이 낮은 보관된 샘플 및 지방 조직에서 보다 일관되고 더 높은 수율을 생성하기 위한 전략이 포함되어 있습니다. 설명된 프로토콜은 원산지 종에 관계없이 대부분의 장기에서 추출한 FFPE 샘플에 최적화되어 있습니다. 그러나 이 프로토콜에는 석회질 제거가 필요한 골수와 같은 어려운 조직을 처리하는 데 필요한 현재 수정이 포함되어 있지 않습니다.

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프로토콜

이 방법 논문에는 치료 경험이 없는 고급 장액성 난소암 환자 표본에 대한 임상 데이터가 제공되지 않습니다. 그러나 관련 임상 데이터는 서면 동의서를 제공한 참가자로부터 텍사스 대학교 MD 앤더슨 암 센터, 부인과 종양학 및 생식 의학과의 IRB(Institutional Review Board)에서 승인한 프로토콜에 따라 수집되었습니다.

참고: RNase 오염을 방지하기 위해 프로토콜 전체에서 수술용 마스크와 장갑을 착용하는 것이 좋습니다. 머리가 긴 연구원은 머리를 뒤로 당기거나 머리망을 착용하는 것이 좋습니다. 수율을 극대화하려면 항상 멸균 뉴클레아제가 없는 물(NFW)과 뉴클레아제가 없는 저결합 DNA/RNA 튜브를 사용하십시오. 식물 조직과 같은 비포유류 조직은 폴리-L-라이신(PLL) 및 세포벽으로 인한 투과화 시간 연장을 포함하는 접착 최적화가 필요할 수 있습니다. 분자 포획은 이론적으로 실현 가능하지만 현재 워크플로에서 식물 조직이 테스트되지 않은 상태로 남아 있기 때문에 실험적 검증이 필요합니다.

1. RNA 품질 및 RNA 단편 분포 값 평가 200점

  1. 200bp보다 큰 RNA의 백분율을 측정하는 RNA 단편 분포 값 200(DV200)을 사용하여 RNA 품질을 평가합니다.
  2. Stereo-seq 처리를 위해 동일한 조직 블록에서 두 개의 10μm 절편을 활용합니다.
    참고: 즉각적인 처리가 최적이지만 샘플은 4°C에서 최대 1주일, -20°C에서 4주 동안 또는 -80°C에서 6개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. Patel et al.18 에 의해 설명된 대로 비크기 선택적 RNA 추출 프로토콜을 사용하여 RNA를 추출하여 RNA 단편 크기의 분포를 정확하게 평가할 수 있습니다.
  4. 단편 분석기를 사용하여 다음 중 하나로 RNA 품질을 평가하여 DV200 점수 또는 200bp보다 긴 RNA 단편을 나타내는 곡선 아래 면적의 백분율을 결정합니다. 이상적으로 조직은 DV200 점수(> 50%)와 농도(> 10ng/μL)를 가져야 합니다.

2. 작업 공간 청소

  1. 30% 표백제로 모든 표면을 청소하십시오. 표백제와 에탄올의 조합으로 클로로포름이 형성되는 것을 방지하기 위해 표면을 최소 30분 동안 건조시키십시오.
  2. DNA 오염 제거 물티슈(DDW)로 표면을 닦습니다. RNase 오염 제거 용액(RDS)을 모든 표면에 뿌린 다음 NFW로 준비한 70% 에탄올을 뿌립니다.
    알림: 표백제나 다른 알코올을 혼합하지 마십시오. 이 조합은 독성이 강하고 낮은 노출에서도 의식 상실, 장기 손상 또는 사망을 유발할 수 있는 클로로포름을 생성했습니다.

3. Stereo-seq 랜덤 올리고뉴클레오티드 캡처 칩(N-chip) 준비

  1. 이 단계에서 사용된 모든 시스템을 포함하여 2.1 및 2.2단계에 설명된 대로 작업 영역을 정리합니다.
  2. 포장에서 Stereo-seq N-칩을 꺼내고 칩 ID를 기록한 다음 칩을 건드리지 않고 100% 에탄올로 Stereo-seq N-칩과 유리 슬라이드의 가장자리를 청소합니다. 완전히 자연 건조시키십시오.
  3. 칩을 슬라이드에 고정하기 위한 수지 도포(자일렌을 사용하는 사용자의 경우 옵션).
    참고: 비자일렌 투명제는 종종 상업 공급업체에서 권장하지만 비자일렌 투명제는 파라핀 혼합물에 따라 덜 효과적일 수 있는 것으로 관찰되었습니다. 이는 특정 플라스틱, 합성 수지 또는 밀랍 포매 조직과 호환되지 않는 경우가 많으며 가교가 심하거나 융점이 높은 파라핀을 효율적으로 제거하지 못합니다. 샘플 포획에 사용되는 파라핀 조성이 확실하지 않은 경우 최적의 제거를 위해 자일렌을 사용하는 것이 좋습니다. 또한 자일렌은 유방, 난소, 난자 또는 뇌 조직과 같은 지방 조직을 더 잘 제거할 수 있습니다.
    1. 수지가 균일하게 하얗도록 잘 흔들거나 섞습니다. 마이크로피펫을 사용하여 Stereo-seq N-칩의 가장자리 주위에 10μL의 UV 경화성 세라믹 수지를 조심스럽게 도포합니다(그림 2A).
      참고: 레진은 피부와 눈에 자극을 줄 수 있으며 반복적으로 노출되면 알레르기 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 이 레진을 피펫팅하거나 취급할 때는 항상 니트릴 장갑, 보안경, 실험실 가운을 착용하십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고, 대량으로 사용하거나 용액을 가열할 때는 마스크를 착용하고 피부나 눈에 직접 닿지 않도록 하십시오.
    2. 밀봉된 폼 면봉을 사용하여 여분의 레진을 제거하고 칩 가장자리 주위에 가는 선만 남깁니다. 슬라이드를 UV 경화 장치에 넣고 칩 표면에 닿지 않도록 합니다.
    3. 레진 도포 칩을 405nm UV 광원의 불투명 마스크 위에 올려 슬라이드 뒷면을 비추고 5분 동안 경화시킵니다. 이는 그림 2B에 설명되어 있습니다.
      알림: Stereo-seq N-칩을 UV 광선에 과도하게 노출시키거나 칩 표면의 수지를 만지지 마십시오.
    4. 경화 후 다음 각각에 적신 밀봉된 폼 면봉을 사용하십시오: 100% 분자 등급 에탄올; 70% 에탄올; 마지막으로 NFW는 수지가 놓인 가장자리 주변을 청소합니다. 흰색 반점이 벗겨지면 가장자리를 다시 청소하십시오. 칩 표면을 만지지 마십시오(그림 2C).
    5. 슬라이드를 완전히 자연 건조시키십시오. 검사 후 필요한 경우 건조제와 함께 칩을 4°C에서 밤새 보관합니다. 그러나 가능하면 즉시 칩 준비 및 절편을 계속하는 것이 좋습니다.
      알림: 자외선을 다룰 때는 항상 자외선 차단 안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. 에탄올과 수지는 통풍이 잘 되는 곳, 바람직하게는 흄 후드에서 다루십시오. 기관 지침에 따라 폐기물을 처리하십시오.
  4. Poly-L-lysine을 사용한 칩 준비(지방 조직 또는 접착 문제가 있는 조직의 경우 선택 사항)
    1. 이 단계에서 사용된 모든 시스템을 포함하여 2.1 및 2.2단계에 설명된 대로 작업 영역을 정리합니다.
      알림: PCR 기계에 직접 화학 물질을 분사하지 마십시오. 모든 사전 PCR 단계의 경우 가능하면 PCR 후드에서 작업하여 cDNA의 이전 증폭을 포함한 오염을 방지하십시오.
    2. 50mL 원추형 튜브를 사용하여 칩을 신선한 NFW에 세 번 담급니다.
    3. 칩 표면에서 약 5cm 떨어진 곳에서 칩 표면을 가로질러 대각선(45°)으로 약 60°에서 80° 각도로 압축 공기의 전체 힘을 사용하여 압축 공기를 사용하여 칩을 건조합니다(그림 2E). 표면이 흐려지면 새 NFW로 세척을 반복하고 다시 건조시킵니다(구름 표면은 일반적으로 이전 단계에서 세라믹이 충분히 씻겨 나오거나 경화되지 않았음을 의미합니다).
    4. 150μL의 PLL 용액을 도포하여 전체 칩 표면을 덮습니다. 실온(22°C에서 25°C)에서 10분 동안 배양합니다. 이는 그림 2D에 설명되어 있습니다.
    5. PLL 용액을 제거하고 칩을 뉴클레아제가 없는 물로 10-15초 동안 두 번 세척합니다.
    6. 두 번째 세척 후 슬라이드의 가장자리를 조심스럽게 건조시킵니다(칩을 만지지 않고).
    7. 칩 표면에서 약 5cm 떨어진 곳에서 칩 표면을 대각선으로 가로질러 약 60°에서 45° 각도로 압축 공기의 최대 힘을 사용하여 압축 공기를 사용하여 칩을 단단히 건조시킵니다(그림 2E).
      알림: 칩은 30초 이내에 완전히 건조되어야 합니다. 이보다 오래 걸리면 DNB가 방해되어 캡처에 아티팩트가 발생합니다.
    8. 1시간 이내에 장착을 진행하고 칩을 건조하게 유지하십시오.
      알림: 건조 후 칩 표면이 흐려지면 새 NFW로 세척하고 건조 과정을 반복하십시오. 건조 후 칩 표면에 아티팩트가 있으면 해당 영역에서 캡처 문제가 발생할 수 있습니다. 조직에 필요하지 않은 경우 PLL을 사용하여 부착하지 마십시오. 칩을 만지면 cDNA 방출 전 캡처 영역의 긁힘 및 손실이 발생하거나 방출 후 캡처가 고르지 않을 수 있습니다. 칩 표면의 수지는 캡처 영역의 얼룩덜룩한 손실로 이어집니다. 칩을 압축 공기 노즐에 너무 가깝게 배치하면 칩 표면에 결정이 생성되고 손상된 DBN 자국이 스프레이될 수 있습니다. 그러나 이것은 드물며 일반적으로 노즐이 칩에 거의 닿고 압축 공기 병이 너무 차가운 경우에만 발생합니다. 이 단계는 기술적으로 어렵기 때문에 평가 칩을 사용하여 이 절차를 여러 번 연습하는 것이 좋습니다.

4. 조직 절편 및 장착

  1. 2.1 및 2.2단계에 설명된 대로 작업 영역이 깨끗한지 확인합니다. 조직 절편 및 장착 중에 모든 수조와 얼음에 새 블레이드와 NFW가 활용되는지 확인하십시오. 칩을 직접 만지지 말고 칩의 80%만 티슈로 덮으십시오.
    참고: 표준 조직의 경우 5μm, 고지방 조직의 경우 4μm의 두께를 사용하는 것이 좋습니다. 해당되는 경우 시리얼 섹션의 리본을 사용하여 샘플 전체의 양식을 일치시킵니다.
  2. 뚜껑을 연 상태에서 오븐 또는 PCR 기계에서 42°C에서 3시간 동안 슬라이드를 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 옮기거나 오븐 또는 PCR 기계의 온도를 37°C로 변경하고 밤새 12-48시간 동안 굽습니다. 약 18시간 동안 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 선택적 중지 지점: 건조 후 슬라이드를 4°C에서 건조제로 알루미늄 백에 밀봉한 후 최대 1주일 동안 진행합니다.
    참고: 건조 시간이 길어지면 RNA 무결성이 저하될 수 있습니다. 건조가 너무 짧으면 슬라이드에 대한 조직 접착력이 낮아집니다. 더 높은 온도에서 굽는 것은 RNA 무결성을 감소시킬 수 있습니다. 슬라이드는 외부 처리(예: 호스트 분석)를 위해 배송될 수 있습니다. 그러나 운송 중 잠재적 오염이 증가하기 때문에 마이크로바이옴 분석을 위한 배송은 권장되지 않습니다.

5. 슬라이드 탈파라핀

  1. 2.1 및 2.2단계에 설명된 대로 작업 영역이 깨끗한지 확인합니다.
  2. 탈파라핀화 및 Stereo-seq 프로토콜을 위한 시약을 준비합니다.
    1. 필요한 시약을 분취합니다: 50mL 원추형 튜브에 30mL 자일렌 2개, 50mL 원추형 튜브에 30mL 100% 에탄올 2개.
    2. NFW로 다음과 같은 희석 시약을 준비합니다: 칩당 96% 에탄올(원뿔형 2개 또는 1mL 필요), 칩당 90% 에탄올, 칩당 80% 에탄올, 칩당 70% 에탄올, 칩당 50% 에탄올, 칩당 30% 에탄올, 20x 용액에서 5x 식염수-구연산나트륨(SSC) 2.5mL, 0.01N HCl 5mL(NFW로 pH 2로 0.1N HCl 희석). 에탄올 희석의 경우 실리콘 개스킷을 사용하는 경우 50mL 원뿔형 튜브에 30mL 용액 1개를 준비하거나 1.5mL 튜브에 500μL 용액을 준비합니다.
    3. 다음 용액을 준비하여 얼음 위에 보관합니다: i) 5x 용액에서 0.1x SSC 32.5mL(원뿔형 튜브에 용액 30mL를 보관하고 나중에 사용할 수 있도록 나머지 2.5mL를 5mL 튜브에 넣음), ii) 5% RI가 포함된 0.1x SSC 400μL를 얼음 위에 보관합니다.
    4. 0.1N HCl로 다음 희석 시약을 준비합니다.
      1. 시중에서 판매되는 동결건조 시약에 0.1N HCl 1mL를 첨가하여 10x 투과화 시약(PR) 용액을 준비합니다.
        참고: 얼음 위에 1시간 동안만 보관하고 나중에 사용할 수 있도록 분취한 다음 -20°C에서 얼리십시오.
      2. 500μL의 1x PR 용액을 준비합니다(10x PR 용액 분취량을 0.01N HCl로 희석하고 최대 6시간 동안 얼음 위에 보관함).
        참고: 펩신 기반 효소는 pH 2에서 최적으로 작동하므로 0.01N HCl의 pH가 pH 2.0의 10% 이내인 것이 중요합니다.
  3. 슬라이드를 자일렌(권장)에 담가 각각 20분씩 2회 동안 슬라이드를 탈파라핀화합니다.
  4. 즉시 샘플을 에탄올로 재수화합니다(100%, 96%, 2라운드, 각각 5분, 90%, 70%, 50%, 30%를 1라운드, 2분). 마지막으로 NFW로 1분 동안 수분을 보충합니다. 에탄올 희석의 경우, 마이크로바이옴 연구를 위한 샘플을 준비하는 경우 각 슬라이드에 대해 50mL 원뿔형 튜브에 30mL의 용액을 사용하고, 비마이크로바이옴 샘플을 준비하는 경우 슬라이드 2개마다 30mL를 사용합니다. 이후의 모든 희석의 경우 50mL 원추형 튜브에 30mL의 용액을 준비하거나, 실리콘 개스킷을 사용하는 경우 칩 영역을 완전히 덮기 위해 1cm2 칩당 500μL의 용액을 사용합니다.
    선택 사항: 그림 2F-H와 같이 100% 에탄올 단계 후에 밀봉을 생성하기 위해 칩 주위에 3챔버 제거 슬라이드에서 실리콘 챔버를 배치하는 것이 좋습니다. 이를 통해 더 적은 양의 시약을 사용할 수 있으며 칩 손상 위험을 줄일 수 있습니다. 또는 50mL 원추형 튜브를 사용하여 절차 전반에 걸쳐 Stereo-seq 슬라이드를 완전히 잠길 수 있습니다.

6. (선택 사항) 핵 이미징 및 ssDNA 염색

참고: 6.1에서 사용하기 전에 FFPE 탈교차 시약이 실온(~25°C)에 도달하도록 하십시오. 다른 염색 용액도 가능하지만 현재 전사체 데이터의 단일 세포 분할 및 세포 비닝에는 형광 핵 염색이 필요합니다.

  1. 단일 가닥 DNA(ssDNA) 염료를 사용한 형광 염색
    1. Qubit ssDNA 시약을 5x SSC 완충액으로 1-2 칩당 1:1 희석으로 희석하여 SSC 완충액에 2 μL의 ssDNA 염색 용액을 준비합니다.
      참고: ssDNA 희석은 이미징 시 사용되는 현미경에 따라 변경될 수 있습니다.  따라서 새로운 현미경은 평가 칩과 테스트 조직을 사용하여 ssDNA 염료 희석액으로 테스트하여 최상의 동적 범위를 결정해야 합니다.
    2. RNase 억제제(RI)의 1:20 희석, ssDNA 희석액의 1:200 희석 및 나머지 5x SSC를 사용하여 염색 용액의 마스터 믹스(칩당 200μL)를 생성합니다.
    3. 염색 용액(칩당 150μL)을 첨가하고 실온에서 5분 동안 어두운 곳에서 배양합니다. 피펫을 사용하여 칩 모서리에서 염색액을 부드럽게 제거합니다.
      참고: 탈착식 실리콘 챔버를 사용하는 경우 ssDNA 염료 혼합물로 칩을 염색하기 전에 제거하십시오.
    4. 0.1x SSC(매번 칩당 150μL)로 10-15초 동안 칩을 두 번 세척합니다. 두 번째 세척 후 슬라이드의 가장자리를 렌즈 용지로 조심스럽게 말립니다(칩을 만지지 않고).
    5. ~3-5 μL의 글리세롤을 추가하고(도립 현미경의 경우 적게 사용) cloverslip을 장착합니다(기포에 주의하십시오).
      참고: 슬라이드 영역에 올바른 양의 글리세롤이 도포되었는지 확인하십시오(일반적으로 1cm2 칩의 경우 약 4μL). 글리세롤을 너무 많이 사용하면 슬라이드를 수직으로 잡았을 때 커버슬립이 이동할 수 있습니다. 글리세롤을 너무 적게 사용하면 커버슬립을 제거할 때 조직 손상 위험이 증가하고 기포가 발생하여 이미징 및 단일 세포 분할 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
    6. 커버슬립을 약 1cm 높이에서 칩 위로 떨어뜨립니다. 개입된 현미경을 사용하는 경우 커버슬립이 수직으로 잡았을 때 미끄러지지 않도록 하십시오. 글리세롤을 더 추가하지 않고 다시 장착되는 경우.
    7. 이미지 타일 사이에 10% 겹치는 광시야 현미경으로 ssDNA 염색 조직의 형광 이미지를 캡처합니다.
      알림: 10x 대물렌즈를 사용하여 광시야 현미경으로 9-13개 포인트의 수동 초점 맵을 수행하는 것이 좋습니다. 공초점 현미경을 사용할 수 있지만 조직과 칩 전체의 초점 변화에 훨씬 더 민감합니다.
    8. ImageJ와 같은 이미지 처리 소프트웨어에서 이론적 중첩을 활용하여 각 타일의 대략적인 위치를 생성한 후 픽셀 일치 계산 중첩을 수행하여 이미지 타일링을 미세 조정합니다.
    9. StereoMap 소프트웨어에서 이미지를 처리하고 계속하기 전에 이미지 QC를 통과하는지 확인하십시오.
    10. 커버슬립이 분리될 때까지 Stereo-seq 슬라이드를 30mL의 0.1x SSC에 담급니다.

7. 탈교차 과정

알림: 이 단계에서 칩을 만지거나 기울이지 말고 부드럽게 피펫팅하십시오.

  1. FFPE 탈가교 시약이 따뜻한 실온(~25°C)에 있는지 확인하고 용액을 흐리게 만드는 입자가 없는지 검사합니다. 입자가 보이면 55°C로 가열하고 30°C로 식힌 후 사용하십시오.
  2. 다음 설정으로 열순환기를 켭니다: 평형을 위한 30°C(85°C의 가열된 뚜껑); 30분 배양 동안 95°C; 4°C 무한 유지 시간.
  3. 카세트 개스킷을 조립한 다음 Stereo-seq 칩 슬라이드를 카세트에 넣습니다.
  4. FFPE 탈교차 시약(칩당 400μL)을 칩이 들어 있는 카세트의 웰에 추가합니다. 카세트에 밀봉 테이프를 붙이고 단단히 밀봉되었는지 확인하십시오.
  5. 7.2단계부터 95°C에서 30분 배양을 시작합니다. 10분이 지나면 10mL의 메탄올을 15mL 용기(슬라이드당 약 1mL가 필요함)에 넣어 -20°C 냉동실에 넣습니다.
  6. 열순환기에서 칩을 조심스럽게 제거하고 카세트를 벤치로 옮긴 다음 밀봉 테이프를 떼어냅니다.
  7. 피펫을 사용하여 FFPE 탈교차 시약을 제거하고 폐기합니다. 모든 탈교차 시약을 제거한 후 카세트와 개스킷을 분리하고 폐기합니다.
  8. Stereo-seq 슬라이드를 실온 ~23°C로 평형을 맞춥니다. 멸균 연기 후드 아래에서 슬라이드 가장자리를 건조시키고 새 실리콘 챔버(해당되는 경우)를 적용합니다. -20°C 냉동고에서 냉각된 메탄올 500μL를 넣고 전체 섹션이 20분 동안 완전히 잠기도록 합니다.
    참고: 또는 전체 Stereo-seq 슬라이드를 30mL의 냉각된 메탄올로 채워진 50mL 원추형 튜브에 담글 수 있습니다.
  9. 메탄올 고정이 끝나기 약 5분 전에 사용하기 전에 37°C 건조 블록에서 10분 동안 1x PR 용액을 예열합니다(단계 7.8).
  10. 고정이 완료되면 슬라이드를 멸균 흄 후드로 옮깁니다. 슬라이드에서 여분의 메탄올을 닦아내고 칩에 남아 있는 메탄올이 증발할 때까지 기다립니다(~5분). 새 카세트와 개스킷을 조립합니다. 메탄올이 완전히 증발하면 Stereo-seq 칩 슬라이드를 카세트에 넣습니다.

8. 투과화 및 역전사

알림: 8.1-8.11단계의 경우 천천히 피펫팅하고 칩을 만지지 마십시오. 과도한 압력은 DNB에 확산이나 자국을 유발합니다.

  1. 칩에 투과화 시약 200μL를 첨가합니다. Stereo-seq 슬라이드 카세트에 밀봉 테이프를 붙이고 단단히 밀봉되었는지 확인합니다.
  2. 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
  3. 각 슬라이드에 380μL의 0.1x SSC와 20μL의 RI(RNA 억제제)를 첨가하여 세척 완충액을 준비합니다. 슬라이드당 400μL를 만들고 사용할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
  4. FFPE 역전사(FFPE RT)용 시약을 꺼낸 다음 다음 모든 시약을 스핀다운하고 효소 혼합물, 올리고 및 이량체를 얼음 위에 보관합니다. FFPE RT 완충액을 실온(~23°C)으로 예열합니다.
  5. 투과화가 끝나기 5분 전에 FFPE RT 혼합물 칩당 200μL를 준비합니다. FFPE RT 완충액(158μL), FFPE RT 효소 혼합물(30μL), FFPE RT 올리고(10μL) 및 FFPE 이량체(2μL)를 첨가합니다. 이것을 부드럽게 섞어 얼음 위에 보관하십시오.
  6. 칩을 열순환기에 보관한 상태에서 배양 온도를 실온(~23°C)으로 변경합니다. 씰을 제거하고 1x PR 용액을 조심스럽게 버립니다.
  7. 1cm2 칩당 200μL의 0.1x SSC(5% RI 포함)로 칩을 매우 부드럽게 세척합니다.
  8. 칩 모서리에서 0.1x SSC(5% RI 포함) 세척액을 제거합니다.
  9. 칩 모서리에 200μL의 FFPE RT 용액을 추가합니다.
  10. Stereo-seq 슬라이드 카세트에 밀봉 테이프를 붙이고 단단히 밀봉되었는지 확인하십시오. 그렇지 않으면 증발로 인해 수율이 감소합니다.
  11. 프로토콜 FFPE RT 배양 등온 반응을 42°C에서 45°C 가열 뚜껑으로 (5 내지 24시간) 시작합니다.
    참고: 12-16시간 동안 배양하고 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 것이 좋습니다.

9. cDNA 방출 및 정제

알림: 9.6-9.7단계의 경우 천천히 피펫팅하고 칩을 만지지 마십시오. 과도한 압력은 DNB에 확산이나 자국을 유발합니다.

  1. 형성되었을 수 있는 침전물을 용해하기 위해 cDNA 방출 완충액을 55°C에서 데워 400μL의 cDNA 방출 완충액을 준비합니다.
  2. cDNA 방출 완충액을 따뜻한 실온(25°C)으로 평형화합니다. 얼음 위에 올려 놓지 마십시오.
  3. 사용하기 전에 탁상용 원심분리기에서 cDNA 방출 완충액과 cDNA 방출 효소를 100 x g 으로 회전시킵니다.
  4. 380μL의 cDNA 방출 완충액에 20μL의 방출 효소를 첨가하여 cDNA 완충액을 준비합니다.
  5. 칩을 열순환기에 보관한 상태에서 배양 온도를 실온(~23°C)으로 변경합니다. 씰을 제거하고 FFPE RT 용액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
  6. 칩당 0.1x SSC(200μL)로 칩을 한 번 매우 부드럽게 세척합니다.
  7. 칩 모서리에서 0.1x SSC를 제거하고 매우 조심스럽게 피펫팅합니다.
  8. 준비된 cDNA 방출 용액 400μL를 각 칩에 첨가합니다.
  9. Stereo-seqs 슬라이드 카세트에 밀봉 테이프(또는 PCR 커버)를 부착하여 밀봉합니다. 증발, 누출 또는 오염을 방지하기 위해 카세트가 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
  10. 뚜껑을 덮고 60°C로 가열한 상태에서 55°C에서 ≥ 5시간(최소 5시간에서 최대 24시간) 동안 배양합니다.
    참고: 5-7시간 동안 배양하거나 2시간으로 실험 전반에 걸쳐 일관성을 유지하는 것이 좋습니다.

10. cDNA 방출 혼합물 수집

  1. NFW를 37°C로 예열합니다(1cm2의 칩당 최소 500μL).
  2. 씰을 제거하고 티슈 위의 칩의 각 모서리와 중앙에서 세게 피펫을 사용하되 티슈를 긁거나 만지지 마십시오. 칩에서 모든 cDNA 방출 혼합물을 수집하고 1.5 또는 2.0 mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 각 튜브에 칩 식별(칩 ID) 번호를 기록합니다.
  3. 350μL의 예열된 NFW를 칩 표면에 직접 추가합니다. 그리고 다시 한 번 더 작은 피펫(P100 또는 P200)으로 세게 피펫팅하고 팁을 기울여 더 많은 전단력을 가하되 조직을 만지거나 칩을 긁지 마십시오.
  4. 10.3단계(350μL)의 세척액을 10.2단계(400μL)의 cDNA Release Mix와 결합합니다. 단일 칩의 샘플만 결합해야 합니다.
  5. 칩에 NFW 100μL를 놓고 Stereo-seq 칩 슬라이드를 카세트에 밀봉한 다음 프로토콜이 끝날 때까지 냉장고에 보관합니다.
    참고: 수율이 낮은 경우 cDNA를 다시 방출하는 것이 좋습니다. 칩에 DNA의 존재는 ssDNA 염료를 사용하고 커버슬립 유무에 관계없이 재이미징을 사용하여 평가할 수 있습니다.

11. cDNA 비드 정리 수집

  1. 10.4단계의 cDNA를 동일한 부피의 SPRI(Solid Phase Reversible Immobilization) 비드로 재현탁합니다. 비드가 용액 전체에 고르게 분포될 때까지 혼합하여 ~100 bp 이상의 DNA 단편을 선택합니다.
  2. 27°C에서 37°C(30°C 권장)의 온도에서 10분 동안 배양합니다.
    1. 부화 중. 처리된 칩 2개당 NFW에 80% 신선한 에탄올 5mL를 준비합니다.
  3. 배양된 비드 혼합물이 담긴 튜브를 가져다가 탁상용 원심분리기에서 100 x g 으로 잠시 회전시킵니다.
  4. 튜브를 마그네틱 분리 랙에 놓고 최소 5분 동안 배양합니다(액체가 투명해질 때까지).
  5. 구슬을 방해하지 않고 상청액을 조심스럽게 제거하고 깨끗한 라벨이 붙은 튜브에 보관합니다. cDNA 방출에 칩 ID 및 날짜를 표시합니다.
  6. 비드를 방해하지 않고 튜브에 80% 에탄올 1.5mL를 첨가하고 에탄올을 제거하기 전에 30초 동안 배양합니다.
  7. 11.6단계를 한 번 더 반복하여 이번에는 비드를 방해하지 않고 작은 피펫 팁을 사용하여 가능한 한 많은 에탄올을 제거합니다.
  8. 더 이상 반사되지 않을 때까지 튜브의 비드를 자연 건조시킵니다. 시간은 다양하므로 정기적으로 점검하여 수확량이 낮아지는 과도한 건조(균열)를 방지하십시오.
    알림: 방의 습도와 온도를 측정하십시오. 고온(27°C) 및 낮은 습도(20% 미만)에서 비드는 매우 빠르게 건조됩니다(3-5분). 저온(23°C) 및 높은 습도(40% 이상)에서는 비드가 훨씬 더 느리게 건조됩니다(7-15분).
  9. 자석 선반에서 비드 튜브를 제거하고 22μL의 NFW를 추가한 다음 와류로 혼합합니다.
  10. 27°C의 건식 수조 또는 PCR 기계에서 5-15분 동안 배양합니다.
  11. 잠시 원심분리하고 액체가 투명해질 때까지 튜브를 마그네틱 분리 랙에 다시 놓습니다(2-5분).
  12. cDNA를 함유한 상청액 21μL를 비드를 방해하지 않고 샘플 표지된 0.2mL PCR 튜브로 옮깁니다.
  13. 각 튜브에 대해 11.9 - 11.12단계를 반복하여 총 42μL의 cDNA를 수집합니다. cDNA의 증폭을 직접 계속합니다(단계 12.1 - 12.8).
    참고: 증폭 시작이 지연되면 수율이 감소하고 짧은 판독이 증가하며 단일 가닥 DNA 주형이 분해됩니다.

12. cDNA 증폭

  1. 냉동실에서 cDNA 증폭 믹스와 FFPE cDNA 프라이머를 꺼내 젖은 얼음 위에 올려 해동합니다.
  2. cDNA 증폭 혼합물과 FFPE cDNA 프라이머를 탁상용 원심분리기에서 ~100 x g로 스핀다운합니다.
  3. (단계 11.13)에서 42 μL에서 각 cDNA 튜브에 50 μL의 cDNA 증폭 용액과 8 μL의 FFPE cDNA 프라이머를 추가하고 튜브 변형을 방지하기 위해 플랫 캡 어댑터가 있는 열순환기에 넣습니다.
  4. cDNA 증폭을 위해 열순환기 프로그램을 실행합니다: 초기 변성: 95°C에서 5분; 사이클링: [98°C에서 20초, 58°C에서 20초, 72°C에서 3분] × 15사이클; 최종 확장: 72°C에서 5분; 유지 온도: 12°C(즉시 처리하는 경우) / 4°C(하룻밤 동안 보관하는 경우).
  5. 비드 정화 전후 1μL cDNA의 DNA 농도를 측정합니다.
    참고: 정화 전 cDNA 산물의 양은 1cm² 칩당 1μg을 초과하도록 계산해야 합니다. 세척 후 농도는 최소 10ng/μL여야 합니다. 낮은 수율은 일반적으로 라이브러리 다양성 감소와 관련이 있습니다. 이 단계에서 상당한 샘플 손실은 DV200 점수와 상관관계가 있습니다. 그러나 DV200은 결과를 완벽하게 예측하는 것이 아닙니다.
  6. 12.4단계의 PCR 산물을 사용하여 11단계(비드 클린업)에서 cDNA 비드 클린업을 반복하고, 세 가지 수정을 거칩니다: 더 작은 PCR 마그네틱 랙 사용, 11.6단계에서 200μL의 80% 에탄올만 추가, 11.9단계에서 22μL의 Tris-EDTA(TE) 완충액(pH 8)에 재현탁합니다.
  7. 샘플 이름, 바코드, 날짜 및 칩 ID가 표시된 20μL의 NFW가 담긴 튜브에 비드를 보관합니다.
  8. 단편 분석기를 사용하여 cDNA 단편 분포를 측정합니다. 단편 크기 범위는 250-400bp 사이여야 합니다. 조각이 너무 작으면 비드 세척을 반복하되 27°C 대신 실온(~25°C)을 사용하십시오.
    선택적 중지 지점: cDNA를 측정한 후 -20°C에서 최대 1개월, -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 비드는 4°C에서 1주일 동안 NFW에 보관할 수 있습니다. 구슬을 얼리지 마십시오.

13. 도서관 준비(4일차)

  1. 증폭 반응 혼합물 준비
    1. 라이브러리 PCR 증폭 용액, 라이브러리 바코드 세트, cDNA 제품 및 NFW를 제거합니다. 실온에서 얼음과 물에 cDNA와 시약을 해동하고 100 x g 에서 10초 동안 회전시킵니다.
  2. 각 25μL의 PCR 바코드 프라이머 믹스에 대한 라이브러리 바코드 전략을 결정합니다.
    알림: 이 시퀀서의 경우 모든 염기는 바코드 세트의 각 위치에서 동일하게 표시되어야 합니다. 따라서 이와 호환되는 대부분의 상용 키트는 사전 정의된 바코드 테트라드(4개 세트)로 설계되었습니다. 이러한 테트라드는 시퀀싱 레인을 가로질러 분할할 때 개별 샘플에 적용하거나 레인당 하나의 샘플을 시퀀싱할 때 단일 샘플에 대해 함께 풀링할 수 있습니다. 균형이 맞지 않는 바코드는 시퀀서에서 생성되는 사용 가능한 데이터의 양을 줄이기 때문에 균형 잡힌 바코드를 유지하는 것이 필수적입니다.
  3. 20ng에 대한 cDNA의 부피를 결정합니다(예: 10ng/μL에는 2μL가 필요함). 이를 사용하여 희석된 cDNA의 NFW(25μL) 용액을 만듭니다(~1ng/μL로 희석).
  4. 라이브러리 증폭 혼합물(50 μL)과 NFW(25 μL)의 희석된 cDNA 및 PCR 바코드 프라이머 혼합물(25 μL)을 0.2 mL PCR 튜브에 결합합니다.
  5. 피펫팅으로 웰을 혼합하고 100 x g 에서 10초 동안 회전시킵니다. (소용돌이치지 마십시오)
  6. 0.2mL PCR 튜브를 열순환기에 넣고 튜브가 부서지는 것을 방지하기 위해 인서트가 있는지 확인하십시오.
  7. cDNA 증폭을 위해 열순환기 프로그램을 실행합니다: 초기 변성: 95°C에서 5분; 사이클링: [98°C에서 20초, 58°C에서 20초, 72°C에서 3분] × 8사이클; 최종 확장: 72°C에서 5분; 유지 온도: 12°C(즉시 처리하는 경우) / 밤새 보관하는 경우 4°C.
    참고: 라이브러리를 준비하기 위해 다양한 양의 입력 cDNA를 사용할 수 있습니다. 그러나 사용되는 양은 증폭에 필요한 PCR 주기 수에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 공급업체는 20ng의 입력 DNA와 8주기 사용을 권장합니다. 7사이클로 40ng 또는 6사이클로 80ng를 사용하는 것도 가능합니다. 20ng 미만 또는 80ng 이상의 입력 cDNA를 사용하는 것은 권장되지 않습니다.

14. 라이브러리 증폭 비드 정리

  1. 12.5단계에서 수행한 대로 원시 라이브러리 제품을 정량화합니다.
  2. 13.7단계의 원시 라이브러리 산물을 활용하여 11단계부터 비드 클린업(비드 클린업)을 반복하여 세 가지 수정을 거칩니다: 제품에 대해 0.8:1 비율의 비드 사용, 더 작은 PCR 마그네틱 랙 사용, 11.7단계와 비교하여 80% 에탄올 200μL만 사용, 11.9단계에서 22μL의 TE 완충액(pH 8)에 재현탁합니다. 1cm2 칩당 신선한 80% 에탄올 약 1mL를 준비합니다.
  3. 선택적 정지 지점: 라이브러리를 측정한 후 -20°C에서 최대 1개월, -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다. 비드는 4°C에서 1주일 동안 NFW에 보관할 수 있습니다. 구슬을 얼리지 마십시오.

15. Stereo-Seq Random Oligonucleotide Primed DNB의 시퀀싱을 위한 DNBSEQ-T7RS 시스템

  1. DNBSEQ-T7RS 시스템에서 PE75 키트를 사용하여 주기를 읽기 1의 경우 25, 읽기 2의 경우 62(PE25+62)로 할당한 다음 10bp 인덱스를 할당합니다.
    1. 첫 번째 판독(25주기 중 1회 읽기)은 칩 기반 바코드에서 공간 칩 ID(CID) 또는 위치별 정보를 캡처합니다.
    2. 두 번째 판독(62주기 중 2개 읽기)은 위상 보정 및 바코드 오프셋 보정에 사용되는 3개의 추가 다크 사이클과 함께 유전자 삽입물에 직접 부착된 무작위 6bp 서열인 분자 식별자(MID)를 캡처합니다. 그 다음에는 알려진 게놈 또는 전사체에 매핑하여 식별되는 판독 2에서 30-59bp의 유전자 삽입이 뒤따릅니다.
      참고: 더 긴 유전자 삽입이 가능하지만 다른 쌍을 이루는 엔드 키트와 매핑 워크플로우에 대한 수정이 필요합니다.
    3. 역다중화를 위한 인덱스 주기는 13.2단계에서 풀링된 시퀀싱 바코드를 기반으로 10bps를 포함합니다.
      참고: 75 PE 플로우 셀의 경우 약 10-12시간의 일반적인 시퀀싱 시간. 시퀀싱은 DNBSEQ-T7RS 또는 유사한 시퀀싱 기기가 필요하기 때문에 대부분의 실험실에서는 사내 프로세스가 아닌 시퀀싱 코어 또는 상업 시설에서 가장 자주 수행됩니다.

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결과

아래 데이터는 SAW 파이프라인을 사용하여 단일 세포 분할을 수행하고 FFPE 섹션에서 tRNA(TRDMT1)와 같은 비폴리 아데닐화 RNA에 매핑하는 능력을 보여줍니다. Stereo-seq의 편향되지 않은 데이터를 통해 mRNA뿐만 아니라 tRNA, rRNA 및 비숙주 RNA(해당되는 경우)의 중요성을 조사할 수 있습니다. SAW 파이프라인16의 직접 출력과 그림 3A-G의 Stereo-seq 출력의 품질 평가를 위한 스테레오피를 사용하여 셀 빈(SAW 핵 이미지를 통해 생성된 단일 핵 오버레이)에서 표준 공간 개요, 유전자 발현, 클러스터링 및 QC를 생성했습니다. 검출된 전사체의 수는 조직 유형에 따라 다릅니다: 면역 밀도가 높은 조직은 일반적으로 더 낮은 전사체 ...

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토론

Stereo-seq 프로토콜은 매우 상세하며 특히 특정 예방 조치가 필요할 수 있는 마이크로바이옴 또는 비숙주 프로파일링에서 성공을 보장하기 위해 정밀도, 타이밍 및 깨끗한 환경이 필요한 몇 가지 중요한 단계를 포함합니다.

모든 단계에서 뉴클레아제가 없는 물을 사용해야 하며 캡처 칩은 샘플과 시약 이외의 다른 것으로 만져서는 안 됩니다. 카세트 어셈블리를 사용할 때는 연습용 칩을 활용하는 데 시간을 할애하여 각별히 주의하십시오. 조직 영역의 스크래치는 조직 공간 해상도를 손상시키고 트랙 라인의 스크래치는 공간 해상도 또는 샘플이 자동으로 정렬되지 않을 수 있습니다. 또한, 췌장이나 간과 같은 RNase/DNase 조직이 높은 경우 절편 중 물을 교체하는 것이 좋습니다. 또한 RNA 품질을 유지하기 위해 FFPE 조직 블록을 소량의 왁스 씰과 함께 얼굴에 4°C에서 보관하고 분해를 방지하기 위해 데시케이터에 보관하는 것이...

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공개 사항

저자는 이 작업이 Complete Genomics의 자금 지원을 받지 않았음을 선언합니다. 그러나 Complete Genomics는 이 기사의 출판 비용을 지원하고 있습니다.  그들은 고급 사본이나 내용에 대한 입력을 받지 못했습니다.

감사의 글

이 연구는 난소암 연구 연합(OCRA 811621 및 891490), Sie 재단 및 Stephanie C. Stelter 기부 기금에서 부분적으로 자금을 지원했습니다. 이 연구는 M. D. Anderson의 암 센터 지원 보조금 P30 CA016672 및 Jared Burks의 NCI의 연구 전문가 1 R50 CA243707-01A1을 통해 국립 보건원의 부분적으로 지원되는 유세포 분석 및 세포 이미징 핵심 시설, 수의학 및 외과 및 고급 유전체학 기술 코어와 공동으로 수행되었습니다.

또한 Compete Genomics, 특히 기술 교육 및 문제 해결을 해준 Brandon Vanderbush와 Tanzeen Yusuff, Jia "Jackie" Zhao, Yongfu Wong 및 Erin Petrilli에게 감사의 말씀을 전하고 싶습니다. 저자는 Complete Genomics로부터 FFPE OMNI 및 시퀀싱 시약 세트와 T7 조기 액세스 프로그램에 대한 액세스를 할인된 가격으로 받았습니다. 또한 본 연구에 사용하기 위해 일부 시약이 무료로 제공되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL 원심분리관 일반 DNAse/RNAse써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠3456시약을 섞으려면(다른 밴드도 괜찮습니다) 
100% 에탄올시그마-올드리치E7023분자등급
15mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠339650알리코트와 nbsp에 사용;
20배 농축액   식염수 시트산나트륨(SSC) 버퍼(SSC)시그마-올드리치S6639-1L스테인용 SSC 5배, 세척 단계와 커버슬립 제거용 SSC 1배를 만들었어요.
2100 바이오분석기애질런트할인장비: 바이오분석기
3 웰 챔버, 분리 가능이비디80381실리콘 챔버는 재수화 및 메탄올 고정 시 부피를 줄이기 위한 것입니다.
405nm 자외선 광원다양한해당 없음UV 수지 경화를 위해
50mL 원뿔형 멸균 폴리프로필렌 원심분리관써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠339652알리코트와 탈파라핀화에 사용되며, nbsp;
멸균 이소프로판올 알코올 70%텍스와이프 TX3270표면 오염 제거를 위해...
애질런트 고감도 DNA 키트애질런트5067-4626cDNA 및 라이브러리의 바이오분석기 특성 분석
애질런트 RNA 6000 피코 키트애질런트5067-1513RNA의 바이오분석기 특성 분석
알루미늄 호일다양한해당 없음SSD 염색 시 슬라이드를 덮기 위해서요.
벡만 쿨터 SPRI셀렉트벡만 쿨터 생명과학  B23317/B23318/B23319SPRI 비즈 cDNA 및 라이브러리 정화
표백제다양한해당 없음마이크로바이옴 오염 제거 작업 공간 청소
CONSTIX 밀봉 폼 스왑콘텍19161023정밀 수지 세척을 위해
커버슬립시그마-올드리치BR470045-2000EA
건조제 팩다양한해당 없음RNase 없고 먼지 없는 건조제 팩.
일회용 마스크써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠12-888-001보호, RNAase 오염 및 및 불임성 
DNA 지우기 와이프시그마-올드리치L9060-250EA표면을 닦아내는 오염 제거(물티슈)
DNA LoBind 튜브 1.5mL에펜도르프와 nbsp;22431021cDNA 채집 및 라이브러리 포스트 증폭에 사용됩니다.
DNA LoBind 튜브 2mL에펜도르프와 nbsp;22431048증폭 전에 cDNA 수집에 사용됩니다.
DNBSEQ 원스텝 DNB 시약 제조 키트완전 유전체학940-001891-00DNA 나노볼(DNB) 제조 및 증폭을 위한 시약
DNBSEQ-T7RS 청소 시약 키트완전 유전체학940-001903-00시퀀싱 완료 후 세척용 카트리지
DNBSEQ-T7RS DNB 부하 시약 키트완전 유전체학940-001894-00DNB를 플로우셀에 적재하는 시약과 플레이트
DNBSEQ-T7RS 시퀀싱 플로우 셀완전 유전체학940-001902-001레인/플로우셀
DNBSEQ-T7RS 스테레오-시퀀스 시각화 시약 키트완전 유전체학940-001893-00시퀀싱을 위한 카트리지와 시약들.
DNBSEQ-T7RS 시스템완전 유전체학이 스테레오-시퀀스 시각화 세트는 DNBSEQ 기술을 활용합니다. 시퀀싱 작업은 DNA 앵커의 하이브리드다이제이션으로 시작되고, 조합 프로브 앵커 시퀀싱(cPAS) 화학을 사용하여 형광 프로브를 DNA 나노볼(DNB)에 부착합니다. 마지막으로, 고해상도 영상 시스템은 형광 신호를 포착합니다. 광학 신호를 디지털 처리한 후, 시퀀서는 고품질이자 정확한 시퀀싱 정보를 생성합니다.
먼지 제거 압축 공기아침 기도M-6318이 브랜드나 유사한 추진제를 사용하는 것이 중요합니다.
엣지-라이트 미크토름 블레이드써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠4280L조직학 - 샘플 절획 시 사용
방폭 냉동고다양한해당 없음메탄올 고정 단계와 그 전후에 메탄올을 냉각하는 것입니다.
조직학 브러시다양한해당 없음조직학 - 샘플 절획 시 사용
염산시그마-올드리치2104-50ML0.01 N HCl(pH 2)에서 전단계 희석하는 효소를 위해. HCl 용액의 표준 스톡 농도는 0.1 N입니다.
영상 시스템다양한해당 없음GC 스토믹스 이미저, 레시아, 에보 레볼루션
인비트로젠 RNaseZap RNase 오염 제거 솔루션써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠AM9780RNAse 오염 제거 작업 공간 청소
킴텍 섬세한 작업 와이퍼s 킴텍34155작업대, 장비, 피펫 등을 건조하는 데 사용했습니다.
실험복다양한해당 없음개인 보호 장비(PPE)
렌즈 페이퍼써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠11-997슬라이드를 머리 없이 건조하는 다양한 작품
룩아웃 DNA 지우기 물티슈시그마-올드리치L9060PCR 오염 제거 작업 공간 청소
마젠틱 분리 랙 5uL - 0.2 & nbsp;Permagen LabwareMSRLV08PCR 튜브 내 구슬 분리를 위해
매그젯 럭 12x1.5 mL써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠MR021.5 mL 튜브에서 구슬 분리를 위해
수동 회전 미세토름라이카RM2235조직학 - 샘플 절획 시 사용
메토날 & 지오; 99.9%, 면역형광 및 HPLC 적합시그마-올드리치34860고정 용도(HPLC 등급 필요)
미세 해리 겸자시그마-올드리치F4142-1EA조직학 - 샘플 절획 시 사용
마이크로피펫다양한해당 없음
분자급 무핵효소수 비-DPEC 처리수다양한해당 없음구슬의 희석과 용출
니트릴 장갑다양한해당 없음개인 보호 장비
오븐다양한해당 없음감자튀김 구우기 위해
캡이 부착된 PCR 0.2 mL 튜브다양한해당 없음PCR 응용
PCR 표지 및 nbsp;다양한해당 없음제공된 커버의 접착제가 약하면 교체
PCR 후드 & 워크스테이션미스테어MY-PCR24-010사전 PCR(RNA에서 cDNA) 단계에 대해
pH 측정기다양한해당 없음HCl pH를 확인하기 위해 pH 미터.
폴리-L-라이신 용액시그마-올드리치A005-C칩에 대한 조직 접착을 높이기 위해 선택 사항입니다
큐비트 4 형광도계써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠Q33226소술; DNA 양 측정
큐비트 dsDNA 정량 분석 키트써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠Q32851cDNA 및 라이브러리 정량 측정을 위해
큐비트 ssDNA 분석키트써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠Q10212ssDNA 염색 (유일한 염료 사용)
RNAse 없는 아이스 블록다양한해당 없음조직학 - 샘플 절획 시 블록 수화를 위해 사용됨
RNaseZap RNase 오염 제거 용액써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠AM9782RNAs를 파괴하는 표면 오염 제거 용액
RNeasy FFPE 키트치아겐73504 & 19093RNA 추출 및 사용 DV200 측정값 & nbsp;
스컬프트 울트라 화이트 레진시라야 테크해당 없음고온 저항성 자외선 경화 수지
스테레오-세이크 16 바코드 라이브러리 준비 키트STOmics / 완전 유전체학111KL160스테레오-시퀀스 OMNI FFPE 라이브러리 구축을 위해
스테레오-시퀀스 FFPE 액세서리 키트STOmics / 완전 유전체학310AK002211SN114 키트의 공간 OMNI 액세서리 부품
스테레오 시퀀스 N-칩 슬라이드 (1cm x 1cm)STOmics / 완전 유전체학210CN114211SN114 키트의 공간 OMNI 칩 부품
스테레오-시퀀스 PCR 어댑터  STOmics / 완전 유전체학301AUX001PCR 하이브리다이제이션 단계는 PCRmax와 유사한 세 가지 용도로 수정되었습니다.
스테레오-시퀀스 전사체학 N 키트STOmics / 완전 유전체학211KN114211SN114 키트의 공간 OMNI 리젠트 부품
외과 설계 범용 산업용 면도날써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠13-812-236조직학 - 샘플 절획 시 사용
TE 완충액 pH 8.0시그마-올드리치8890cDNA 용출과 라이브러리
열 사이클러바이오래드 / 기타1861096 /12015392 / 여러 가지수동 뚜껑 또는 딥웰 옵션(T100 열 사이클러 / PTC 템포, 딥웰 서멀 사이클러 등) 있는 PCR 머신
Thermo Scientific Orion 올인원 pH 버퍼 키트써모피셔 사이언티픽 / 인비트로젠13-624-500
조직 부상 목욕 - 디지털 XH-1003초연NC0779538조직학 - 샘플 절획 시 사용
자외선 차단 안경다양한해당 없음UV 경화 시 안전을 위해
자일렌시그마-올드리치247642탈파라핀화를 위해

참고문헌

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