방법 논문

치료 전달을 위한 설치류 척수의 경막하 공간에 접근

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DOI:

10.3791/68620

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2025년 8월 8일

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1School of Pharmacy, University of Auckland, 2Neurosurgical Department, Auckland City Hospital

이 논문에서

요약

이 수술 프로토콜은 표적 치료를 제공하기 위해 설치류의 척추 경막하 공간에 척수강내 카테터를 삽입하는 단계별 가이드입니다.

초록

척수 질환이나 부상을 치료하는 것은 부분적으로 척수에 직접 적용할 수 있는 효과적인 치료법을 개발하는 데 어려움이 있기 때문에 어렵습니다. 예를 들어, 척수 손상(SCI)에 대한 현재 치료법은 주로 경막외 마취입니다. 그러나 경막외 요법은 척수와의 직접적인 상호 작용을 허용하지 않아 잠재적인 치료 효과가 감소합니다. 여기에서는 주어진 치료의 보다 직접적인 효과를 위해 설치류 모델에서 경막하 공간에 접근하는 방법이 제안됩니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 척수 기록/자극을 위한 생체 전자 장치의 성공적인 경막하 이식과 뉴로트로핀-3 로드 하이드로겔의 안전한 삽입이 수행되었습니다. 두 응용 프로그램 모두에서 이 프로토콜에 노출된 동물은 시술 후 뒷다리 또는 앞다리 기능에 변화가 없었고 시술 후 최대 12주 동안 기능 장애가 발생하지 않았습니다. 여기에 제시된 예는 매우 구체적이지만, 제안된 프로토콜은 척수의 신경학적 장애에 대한 보다 효과적인 국소 치료를 허용하기 위해 다양한 응용 분야에서 사용될 수 있습니다.

서론

척수의 질병과 부상은 전 세계 수백만 명에게 치명적인 영향을 미칠 수 있으며, 그 결과 상당한 사회적, 경제적, 의료 부담이 발생할 수 있습니다1,2. 척수 손상 및 신경퇴행성 질환은 만성 운동, 감각 및 자율신경 기능 장애를 유발하여 영향을 받은 개인의 삶의 질과 독립성을 저하시킬 수 있습니다. 외과적 개입 및 약물 요법과 같은 현재 치료법은 초기 외상 완화 및 이차 합병증 관리에 중점을 둡니다3. 그러나 이러한 접근 방식은 실질적인 신경 재생이나 기능 회복을 거의 달성하지 못하므로 기본 메커니즘을 표적으로 하는 보다 효과적인 개입이 시급히 필요합니다.

현재 치료 전략의 주요 관심사는 원하는 치료의 위치와 전달입니다. 신경 조절 또는 약물 개입과 같은 치료는 신경 활동에 영향을 미치고 기능 회복을 촉진하며 잠재적으로 손상된 척추 회로의 연결을 재확립하는 능력이 있습니다4. 척수 자극은 운동 조절을 개선하고 통증을 감소시킬 수 있습니다5. 그러나 이러한 전략은 현재 척수의 경막 장벽을 고려하지 않고 경막외 공간에 초점을 맞춘 손상된 조직으로의 간접 전달로 제한됩니다 6,7,8. 경막외 치료는 임상적 이점을 보여주었지만 표적 신경 집단에 대한 간접적인 접근으로 인해 제한되어 잠재적으로 치료제의 효과가 감소합니다.

우리 그룹은 경막외 중심 전략과 관련된 이러한 한계를 극복하고 척수 손상(SCI) 모델에서 직접적인 경막하 치료 전달 가능성을 탐구하기 위해 노력해 왔습니다. 경막하 공간에 카테터를 삽입하면 척수에 직접 치료를 적용할 수 있어 영향을 받은 신경 조직과의 상호 작용이 향상됩니다 9,10. 경막하 투여는 또한 경막의 장벽 효과를 감소시켜 전기 자극 및 표적 약물 전달 시스템의 효능을 향상시킵니다11,12. 이 방법은 치료의 정확성과 효과를 향상시켜 잠재적으로 기능 회복에서 더 나은 결과를 가져올 수 있습니다.

이 기사에서는 설치류 척수의 경막하 공간에 안전하게 접근하기 위한 단계별 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 절차는 척추의 흉부 부위(T10-T12)에 초점을 맞추지만 필요에 따라 탯줄의 다른 위치에서 시행할 수 있습니다. 해부학적 랜드마크가 지정되어 영역 식별이 가능하며 추궁 절제술, 경막 절개술 및 경막 침투에 대한 자세한 지침이 제시됩니다. 전기 자극 장치의 이식 및 하이드로겔 약물 전달 시스템의 전달을 포함하여 이 프로토콜의 두 가지 응용 프로그램도 제시됩니다(그림 1). 설명된 단계는 설치류 수술 경험이 있는 연구자가 쉽게 재현할 수 있습니다. 이 프로토콜은 SCI의 타박상 모델의 맥락에서 작성되었습니다. 그러나 원하는 실험 결과에 따라 특정 손상 모델을 수정할 수 있습니다. 여기에 설명된 기술은 척수손상 치료 발전에 대한 가능성을 가질 뿐만 아니라 정확하고 국소적인 개입을 통해 척수 복구 및 재생에 대한 향후 연구를 위한 플랫폼을 제공할 수도 있습니다.

프로토콜

모든 절차는 오클랜드 대학의 윤리 지침에 따라 수행되었으며 기관의 동물 윤리 위원회(AEC) 및 대학 동물 복지 담당관(AWO)의 승인을 받았습니다. 체중이 240-260g인 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하고 그룹 수용(21°C; 12시간:12시간, 밝음: 어두운 주기)하고 수술 전후에 표준 설치류 식단에 자유롭게 접근할 수 있도록 했습니다. 설치류 척수의 경막하 공간에 대한 안전한 접근을 제공하기 위한 의도이므로 손상 모델이 없는 경우 먼저 이 프로토콜을 시도하는 것이 좋습니다. 이는 부상을 일으키지 않고 프로토콜을 적용할 수 있음을 입증하는 중요한 첫 번째 단계로, 원하는 부상 모델을 보다 정확하게 검사할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구 그룹에서 사용하는 다양한 부상 모델과 결합하기에 적합합니다. 따라서 프로토콜은 응용 프로그램에 따라 다르기 때문에 특정 부상 전달 단계를 설명하지 않습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나와 있습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 모든 기구(보충 그림 1) 및 관련 소모품을 멸균합니다.
  2. 다음날 수술을 받을 쥐의 무게를 잰다.
  3. 투여할 약물의 적절한 용량을 계산합니다. 부피바카인(진통제) @ 2 mg/kg, 용량 - 0.08 mL/100 g; 멜록시캄(진통제) @ 2 mg/kg, 용량 - 0.04 mL/100 g; 부프레노르핀(진통제) @ 0.03 mg/kg, 용량 - 0.1 mL/100 g; 엔로플록사신(항생제) @ 10 mg/kg, 용량 - 0.08 mL/100 g12,13.
    참고: 부피바카인은 초기 절개 전에 수술 부위를 따라 3-4개 부위에 피하 투여되었습니다.

2. 수술 준비

  1. 마취 시스템이 올바르게 설정되었는지 확인합니다(산소 및 마취 시스템과 관련된 모든 튜브가 올바르게 설정되었는지 확인).
  2. 쥐의 체중에 따라 필요한 주사를 준비하고 시작 전에 투여할 식염수 3mL를 주사합니다.
  3. 히트 패드(유지 온도 37°C), 램프, 현미경 및 면도기가 모두 설정되고 작동하는지 확인하십시오.
    알림: 해부 현미경의 특정 배율은 절차 중 사용자 선호도와 가시성에 따라 달라지므로 필요하지 않습니다.
    주의 : 시술 중 동물의 체온이 35°C 이하로 떨어지거나 40°C를 초과하지 않도록 하십시오

3. 동물 준비

  1. 마취 시스템 및 산소 탱크와 관련된 모든 튜브가 연결되어 있는지 확인하십시오. 본 연구에 사용된 마취 시스템을 사용하는 경우( 재료 표 참조), 이소플루란 유도를 3%로 설정하고 동물의 체중을 마취 시스템에 입력하여 유지 마취를 위한 산소 유량을 설정합니다(보충 그림 1A).
    알림: 마취를 각 개별 동물에 적합한 유지 수준으로 유지하십시오. 이는 동물에 따라 1.3%-2% 사이에서 달라질 수 있습니다.
  2. 쥐가 스스로 바로잡을 수 없을 때까지 유도실에 넣고 원하는 이소플루란 유지 수준으로 전환한 다음 쥐를 노즈콘으로 옮깁니다.
  3. 면도 전에 식염수 3mL와 필요한 약물 주사를 피하 투여합니다.
    참고: 식염수 주사 및 면도 후 부피바카인을 의도한 절개 부위를 따라 여러 지점에 주입합니다
  4. 동물의 마취 수준을 모니터링하면서 수술 부위의 모든 기구(현미경, 도구, 멸균 드레이프)를 준비합니다. 원하는 부위에 도구용 멸균 드레이프를 놓고 드레이프 위에 도구를 정리하여 멸균 영역을 유지합니다.
  5. 목 밑부분부터 엉덩이 위쪽까지 동물의 등을 따라 털을 면도합니다.
  6. 클로르헥스 스크럽으로 해당 부위를 소독한 후 클로르헥스 팅크로 면도 부위 중앙에서 원을 그리며 움직이며(3회) 눈에 윤활제를 발라 건조를 방지합니다.
  7. 쥐를 현미경 아래 가열 패드로 옮기고 면도한 부위에 프레스와 씰 드레이프를 놓고 수술 부위가 노출될 만큼 크지만 면도하지 않은 털이 노출될 정도로 크지는 않은 구멍을 자릅니다.
  8. 직장 온도 프로브를 배치하여 동물의 체온을 모니터링하고 가열 패드로 ~37°C를 유지합니다. 5-10분마다 동물 복지 점검을 실시합니다.
  9. 페달 반사를 시행하여 마취의 수술 평면을 확인하고 시술을 시작합니다.

4. 척추 조직 해부

  1. 메스 칼날을 사용하여 목 기저부 아래에서 시작하여 흉부 혹 위로 확장하여 T9-T13 척추뼈를 노출시키는 주둥이에서 꼬리 방향(그림 2A)으로 선형 절개(~6-8cm)를 만듭니다.
  2. 절개 부위 아래의 결합 조직을 Graefe 겸자 또는 마이크로 스프링 가위로 부드럽게 짝을 이루어 척추의 근육 조직을 직접 노출시킵니다.
  3. 절개 부위의 꼬리 절반 근처에 두 개의 흰색 V자형 힘줄을 위치시켜 T13 돌기를 식별합니다. 동물의 꼬리 쪽에서 V에 직접 주둥이가 있는 극돌기는 T13입니다(그림 2B).
  4. T13에서 시작하여 T9까지 이동하면서 각 과정 사이의 결합 조직을 작은 절개하여 근육을 제거하기 전에 분리하여 절차가 진행됨에 따라 위치를 유지하는 데 도움이 됩니다(그림 2C). 그런 다음 마이크로스크리퍼를 사용하여 극돌기의 양쪽과 평행하게 이어지는 근육의 채널을 자릅니다. 척추의 양쪽에서 이 작업을 수행하여 각 척추 분절의 박판을 노출시킵니다(그림 2D).
  5. 척추에 대한 열린 시야를 유지하기 위해 근육벽의 양쪽에 세레미세 클램프를 부착합니다. T13의 측면에 한 쌍, T11/T12 경계에 다른 한 쌍, T11/T10에 다른 한 쌍을 부착합니다(그림 2E).
  6. 명확한 채널이 형성되면 미세가위 또는 롱저를 사용하여 각 과정 사이의 결합 조직을 잘라냅니다(그림 2F).
  7. T13의 부분에서 T9의 꼬리 부분까지 각 판에서 결합 조직과 근육이 깨끗하게 해부될 때까지 채널을 비우고 추궁 절제술 절차를 위해 T10-12 분절을 노출시킵니다. 성공적인 완료는 프로세스의 양쪽에 명확하게 보이는 층으로 표시됩니다.
    참고: 4단계에는 현미경이 필요하지 않지만 적극 권장됩니다.

5. 추궁 절제술

  1. T13의 부분과 겹치는 T12 박판의 꼬리 부분을 찾고, 롱저의 끝을 아래에 배치하고, 표준 JoVE 프로토콜14,15(그림 2G)에서 권장하는 대로 박판 조각 제거를 부드럽게 시작합니다.
    참고: 집게를 사용하여 각 박판의 극돌기를 잡고 안정성을 유지하고 롱저로 절단할 때마다 플레이트를 부드럽게 "들어 올립니다"(그림 2G). 롱저의 끝을 박판 아래로 밀어 넣을 때 잠재적인 손상을 최소화하기 위해 척수에서 바깥쪽으로 압력을 유지하십시오.
    주의 : 절단할 때 경막 및/또는 척수 자체를 손상시킬 수 있으므로 롱저를 너무 아래로 밀지 않도록 주의하십시오.
  2. 한쪽에서 다른 쪽으로 이동하면서 절단을 과정의 정중선으로 확장할 수 있는 충분한 공간이 생겨 약 5mm 너비의 구멍이 있는 척수를 노출시킬 때까지 T12 박판에서 뼈 조각을 계속 잘라냅니다(그림 2H).
    참고: 척추에서 뼈를 제거하면 출혈이 발생하여 시술 중 가시성이 저하될 수 있습니다. 면봉이나 보푸라기가 없는 물티슈(보충 그림 1B)를 사용하여 추궁 절제술을 수행하는 동안 이를 관리하십시오.
  3. 양쪽의 판 아래에 있는 롱저를 작업한 다음 T12의 두개골 부분으로 가는 균일한 채널을 청소합니다(그림 2I).
    참고: 각 척추 분절에 대해 층판 조각이 제거되면 척수가 보이게 됩니다.
  4. 5.1-5.3단계를 반복하여 T11과 T10을 모두 제거합니다.
  5. 추궁 절제술을 계속하면서 양쪽의 균일한 절단을 유지하고 T9까지 주둥이쪽으로 이동합니다(그림 2J).
    참고: 타박상 SCI 절차(대표 결과 섹션 참조)의 경우, 원하는 척수 분절 위의 박판은 타박상 손상 장치를 사용할 수 있을 만큼 충분히 넓게 제거되어야 합니다( 그림 2K 중간에 있는 넓어진 영역 참조). 약물 전달의 경우 추궁 절제술은 원하는 화합물의 적용을 시각화할 수 있을 만큼 충분히 넓을 수 있습니다.
  6. 후궁 절제술이 완료되고 T10-T12의 충분한 영역이 제거되면 두막낭을 식염수로 부드럽게 씻어내고 경막 절개술을 위해 원하는 부위를 준비합니다(그림 2K).
    참고: 이 절차는 척추 분절(T10-T12)에 접근하는 데 특정하지만 이러한 방법은 척추를 따라 다양한 분절에서 추궁 절제술을 수행하는 데 사용할 수 있습니다.

6. 치료 적용을 위한 듀로절개술

  1. 척수의 경막하 공간에 접근하기 위해 해부 스코프를 사용하여 경막 절개술(경막 절개)을 수행합니다(그림 3A).
    알림: 경막의 가시성에 대한 외과의의 선호도에 따라 스코프의 배율을 조정하십시오.
  2. 베벨이 위를 향하도록 27G 바늘을 90도 각도로 구부립니다(그림 3B).
    알림: 구부릴 때 한 쌍의 바늘 드라이버나 지혈제를 사용하여 바늘을 잡으십시오.
  3. 척수의 원하는 진입점에서 바늘 끝으로 경막을 부드럽게 뚫습니다(그림 3B).
    주의 : 밑에 있는 척수나 정중 혈관이 손상되지 않도록 주의하십시오.
  4. 경막에 구멍이 뚫리면 바늘을 등쪽으로 부드럽게 들어 올려 정중선 혈관 양쪽에 있는 경막에 2mm 이하의 원형 구멍을 뚫습니다. 성공적인 경막절개술은 양쪽 구멍에서 소량의 뇌척수액(CSF) 누출로 표시됩니다.
    알림: 경막하 공간에 더 쉽게 접근할 수 있도록 추궁 절제술 끝에서 최소 몇 mm의 거리를 유지하십시오. 필요한 경우 바늘 끝을 초기 구멍에 조심스럽게 다시 삽입하여 크기를 늘리십시오.
  5. 경막절개술 절개를 위해 선택한 위치와 바로 앞 위치에 정중선 혈관에서 분지된 혈관이 없는지 확인하십시오.
    주의: 정중선 혈관을 손상시키면 과도한 출혈이 발생하여 시술 완료를 방해할 수 있으므로 손상되지 마십시오.
  6. 경막에 뚫린 구멍을 사용하여 원하는 치료를 제공하거나 경막하 공간에 장치를 이식합니다. 이 프로토콜의 경우, 척수강내 카테터는 자극 장치를 제자리로 안내하거나 하이드로겔을 주입하기 위한 치료 전달에 사용됩니다(그림 3C).
    알림: 듀로절개술 후 혈액 및/또는 CSF를 지속적으로 제거하여 명확한 시야를 유지하십시오.
  7. 척수로 진행하기 전에 카테터 끝이 경막 아래에 보이는지 확인하십시오. 성공적인 적용은 경막 아래에 있는 작은 척수 혈관을 가로질러 부드럽게 움직이는 카테터로 표시됩니다.
  8. 원하는 치료가 전달된 후(그림 3D,E), 지혈, 상처 치유 및 척추 구조 유지를 돕기 위해 추궁 절제술에 의해 생성된 공간에 멸균 수술용 젤폼 조각을 놓습니다.
  9. 젤 폼을 배치한 후 4-0 폴리디옥사논 흡수성 봉합사를 사용하여 척추 위의 근육과 피부층을 봉합합니다.

7. 수술 후 관리

  1. 매일 동물을 확인하고 필요한 수술 후 약물(부프레노르핀 2일, 엔로플록사신 및 멜록시캄 최대 5일)을 투여합니다. 필요에 따라 식염수 1-3mL를 피하 투여합니다(수술 후 기간 동안 <10% 체중의 물을 24시간 동안 섭취하는 경우).
  2. 절차에 따라 방광 기능, 운동 기능, 찡그린 얼굴 척도 및 기타 동물 복지 징후를 모니터링합니다.
  3. 수술 후 약 10-14일 후에 피부 봉합사를 제거합니다.

결과

제안된 프로토콜은 두 가지 다른 실험 설정에 적용되었습니다. 표시된 데이터는 절차에 설명된 경막하 조작(부상 모델이 없는 경우)이 기능을 손상시키지 않는다는 것을 입증하려는 의도였기 때문에 부상을 입지 않은 그룹을 대표합니다. 생체전자 장치를 이식하거나(그림 1A) 하이드로겔을 6-8주 된 Sprague-Dawley 쥐에게 전달했습니다(그림 1B). 이들 동물의 운동 기능은 BBB 운동 기능 척도를 사용하여 경막하 시술 없이 가짜 수술을 받은 대조군 동물의 운동 기능과 비교되었습니다. 여기에는 여러 그룹의 동물이 표시되어 각 절차의 실행 가능성과 안전성을 보여줍니다. 각 절차 후, 모든 동물은 시술 후 7일 동안 그룹 간 BBB 점수의 차이 없이 정상적인 운동 기능을 유지했으며, 이는 설명된 프로토콜의 안전한 구현을 나타냅니다. 또한, 후지 운동 기능 장애를 나타내는 동물 그룹(그림 4C)을 경막하 시술군과 비교하기 위해 표현하여 실험군에서 부작용이 발견되지 않았음을 추가로 입증합니다. 이 그룹은 이전 문헌12,13에 설명된 바와 같이 175kdyn 충격 장치의 힘으로 타박상 SCI 시술을 받았습니다.

생체전자 임플란트
장치 이식을 위해 프로토콜에는 경막 아래에서 가이드 카테터의 이동과 장치의 제어된 배치를 용이하게 하기 위해 두 개의 경막 절개 부위(하나는 카테터 진입용, 다른 하나는 출구용)를 만드는 것이 포함됩니다. 생체 전자 장치는 생체 적합성 하우징으로 캡슐화된 PCB 인터페이스에 부착된 두 개의 분기 암으로 구성되었습니다. 팔은 임플란트의 위치 지정을 돕기 위해 7-0 실크 봉합사 를 통해 작은 척수강내 카테터에 임시로 연결됩니다. 카테터는 경막 절개 구멍을 통해 천천히 당겨지고 경막 아래로 미끄러지며 출구 경막 절개 구멍을 통해 치료 위치로 이동합니다. 그런 다음 부착된 임플란트 암을 당겨 척수의 각 반쪽 부분에 배치했습니다. 임플란트의 꼬리 끝은 T13 돌기에 부착된 근육에 봉합됩니다. 하우징은 추궁 절제술에 대한 승모근/광배근 주둥이에 봉합됩니다. 그런 다음 외부 접근을 제공하기 위해 하우징 유닛의 바닥 주위에 스킨이 닫힙니다.

하이드로겔 처리
하이드로겔 전달의 경우 진입점만 필요합니다. 하이드로겔은 자극 장치와 동일한 위치에 위치한 유사한 척수강내 카테터를 통해 전달되었습니다. 카테터에 10μL의 폴록사머 하이드로겔(12 )을 로드하고 장치 이식 단계와 동일한 방식으로 경막하 공간에 삽입했습니다. 일단 제자리에 놓이면 카테터를 천천히 수축시키는 동안 하이드로겔은 경막 아래(그림1B)에서 각 반끈으로 지속적으로 방출되었습니다. 각 절차 후 적절한 회복을 보장하기 위해 동물을 7일 동안 모니터링했습니다.

운동 기능 평가에는 21점 BBB(Basso-Beattie-Bresnahan) 척도가 사용되었습니다16. 두 그룹의 동물은 시술 전(기준선)과 수술 후 1일, 3일 및 7일에 평가되었습니다. 오픈 필드 행동은 직접 및 맹검 비디오 녹화 를 통해 평가되었습니다. 각 그룹의 왼쪽 및 오른쪽 뒷다리에 대한 운동 기능 점수를 수술하지 않은 대조군 및 별도의 SCI 그룹과 비교하여 수술의 부작용 정도를 결정했습니다. 임플란트 또는 하이드로겔 그룹의 동물은 수술하지 않은 대조군이나 손상된 SCI 동물과 비교할 때 두 절차 중 하나 후에 운동 기능의 결핍을 나타내지 않았습니다. 참고로 척수 손상이 없음을 확인하는 조직학적 분석은 이미 이전 연구에서 발표되었습니다. 이 연구는 이 방법을 사용하여 장치를 이식해도 시술 후 최대 7일까지 추가 척수 외상이 발생하지 않음을 입증했습니다11. 성상세포(GFAP) 및 미세아교세포/대식세포(Iba1) 활성의 최소한의 변화는 대조군 동물과 비교하여 장치 이식 후 나타났습니다. 임플란트 바로 아래 관상 척수 절편의 표면적과 진원도도 검사한 결과 형태에 변화가 없는 것으로 나타났다.

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그림 1: 경막하 치료 전략. (A) 하이드로겔 주입에 사용되는 임플란트 장치 및 (B) 카테터/주사기의 예. (C) 쥐의 척수에 임플란트와 하이드로겔 삽입의 대표적인 모델. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 수술 부위를 나타내는 추궁 절제술의 이미지. (A) 그림 2 및 그림 3의 수술 이미지에 대한 동물의 방향. (B) 근육 해부의 시작을 안내하기 위한 과정 T13의 위치에 대한 근육 힘줄 랜드마크. (C) 추궁 절제술 을 통해 제거할 각 과정을 식별하기 위한 수직 절단. (D) 근육 채널은 제거를 위해 골판에 접근할 수 있도록 척추 돌기와 평행하게 절단됩니다. (E) 적절한 수술 공간을 제공하기 위해 척추 양쪽의 근육/피부를 고정하는 데 사용되는 불독 세레파인 클립. (F) 추궁 절제술 시작 전에 각 과정을 상호 연결하는 흰색 힘줄 제거. (G) 추궁 절제술 시작 시 Rongeurs가 T12 플레이트 아래로 미끄러져 뼈를 절단하기 시작할 때 수술 부위. (H) 척수를 노출시키고 외과의가 주둥이로 움직이고 나머지 돌기를 제거하기 시작할 수 있는 적절한 공간을 허용하기 위해 T12 과정의 전반부를 제거했습니다(T11/T10). (I) 분절을 완전히 제거하여 T12의 두개골 부분을 제거합니다. (J) 예를 들어 타박상 SCI를 적용하기 위해 더 넓은 절개를 사용하여 T11에서 반쯤 완료된 추궁 절제술. (K) 척수의 등쪽 표면을 완전히 노출시키는 T10-T12 분절을 제거한 후 완전한 추궁 절제술. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 경막절개술을 수행하고 표적 치료를 적용하는 단계. (A) 척수 경막의 구멍 위치에 대한 개략도. (B) 경막 절개술을 만들기 위해 경막을 관통하는 27G 바늘을 보여주는 수술 영역; 이것은 (A)에서 볼 수 있듯이 중앙 혈관의 양쪽에서 수행됩니다. (C) 치료 적용에 사용되는 카테터의 초기 삽입. (D) 척수에 전기 자극 장치가 있습니다. (E) 척수 표면에 주사하기 위해 하이드로겔이 적재된 카테터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 수술 후 상태 및 운동 기능. (A) 장치 이식 및 하이드로겔 전달 후 동물의 대표 이미지. (B) 경막하 시술(임플란트 또는 하이드로겔)을 받은 동물 또는 조작이 없는 대조군 동물과 비교한 척추 타박상 손상이 있는 동물의 대표적인 BBB 점수. 대조군(비수술), SCI 및 임플란트 그룹 표본 크기는 n = 5이고 하이드로겔 그룹 표본 크기는 n = 3이었습니다. 오차 막대는 표준 오차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 1: 수술 도구. 사용된 수술 도구의 사진. (1) #10 칼날 메스. (2) Vannas 마이크로 가위. (3) 그레이프 집게. (4) 세레파인 불독 클립. (5) 롱저. (6) 경막절개술용 바늘 27G. (7) 미세한 집게. (8) 필요에 따라 식염수 적용을 위한 1mL 주사기. (9) 해부 가위. (10) 봉합용 지혈제. (11) 뾰족한 면봉. (12) 멸균된 면봉. (13) 보푸라기가 없는 물티슈. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 2: 경막하 대 경막외 공간. 척추와 척수의 개략적인 표현, 경막외 대 경막외 마취를 보여줍니다. 경막하 공간. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

여기에 제시된 방법론은 척추 경막하 공간에 접근하기 위한 단계별 지침을 제공하고 척수의 흉부 부위에 대한 치료 전달의 두 가지 예를 통해 안전성과 타당성을 보여줍니다11,12. 수많은 연구 그룹이 전기적 또는 화학적 개입을 통해 척수 손상(SCI)을 치료하려는 접근 방식을 개발했습니다. 광유전학(17) 또는 전기 자극(18)을 위한 이식형 장치와 하이드로겔(19,20)을 활용하는 약물 요법을 포함한 현재 전략은 회복 및 재활을 촉진하는 데 다양한 수준의 성공을 입증했습니다. 그러나 현재 대부분의 치료법이 경막하 공간 외부에서 전달되기 때문에 정확한 표적화는 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다. 여기에 설명된 기술은 경막하 공간에 대한 장기적인 접근 수단(보충 그림 2)을 포함하여 척수에 직접 개입을 전달하기 위한 유망한 접근 방식을 제공하여 SCI 및 신경퇴행성 질환에 대한 치료제의 지속적이고 표적 전달을 지원합니다. 이는 척수 장애에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 데 있어 주요 과제인 혈액-척수 장벽을 우회하는 데 중요한 의미를 갖습니다.

추궁 절제술
설치류의 추궁 절제술 절차가 널리 사용되지만 17,21,22, 주목해야 할 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다. 위 프로토콜에서 사용된 해부학적 랜드마크(단계 4.3; 그림 2A) 척수의 하부 흉부 부위에 접근할 수 있으며 우리 그룹의 작업에 따라 다릅니다. 절차를 다른 척추 부위에 적용하려는 경우 초기 척추뼈에 대한 또는 꼬리 세그먼트를 계산하여 위치를 결정할 수 있습니다. 또 다른 중요한 고려 사항은 박판 제거 정도입니다. 시술 중 척수에 원치 않는 손상이 발생할 위험을 최소화하려면 적어도 두 개의 인접한 수준을 제거해야 합니다. 그렇게 하면 경막절개술을 위한 충분한 공간이 제공되고 적절한 시각화가 보장됩니다. 이 예방 조치는 카테터 삽입 중 작은 혈관을 손상시킬 위험을 줄여줍니다. 수술 후 척추의 불필요한 출혈이나 불안정성을 방지하기 위해 척추 측벽에서 과도한 뼈 제거도 피해야 합니다. 적절한 접근과 중단 최소화 사이의 균형을 유지함으로써 이 절차는 보다 안전하고 정확한 치료 전달을 보장합니다.

듀로절개술 및 카테터 삽입
경막절개술을 시행하려면 척수를 관통하지 않도록 정밀도가 필요합니다. 부적절하게 삽입하면 척수나 경막하 혈관에 멍이나 열상이 발생할 수 있습니다. 경막에 생성된 개구부는 막의 무결성을 손상시키지 않으면서 원하는 치료 전략(이 경우 척수강내 카테터의 직경)을 수용할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 듀오절개술을 시행할 때 경막에 구멍이 뚫리면 뇌척수액이 누출될 수 있습니다. 그러나 수량은 최소입니다. 경막의 큰 파열은 합병증을 유발할 수 있지만, 이전 문헌에서는 설명된 프로토콜(단계 6.4)에 사용된 것과 같은 작은 천자가 콜라겐 침착/혈관 형성을 통해 자가 치유될 수 있다고 제안합니다.23, 시술 후 측정 가능한 부작용이 없습니다. 카테터를 배치할 때 직접적인 힘으로 인한 부상 위험을 최소화하기 위해 가능한 한 척수와 평행하게 삽입해야 합니다. 구부러지거나 압착되는 것을 방지하여 원활한 삽입과 적절한 위치 지정을 보장하려면 주의 깊은 취급이 필요합니다.

수술 후 관리
설치류가 일반적으로 표준 조건에서 집단 수용된다는 점을 감안할 때 시술 후 수술 후 관리는 중요한 고려 사항입니다. 이 절차 후 공격적인 행동이나 사회적 상호 작용은 적용되는 치료 유형에 따라 실험 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜은 동물의 등을 따라 6-8cm 길이의 피부 봉합사 라인을 만듭니다. 상처 치유를 허용하고 케이지 동료에 의한 봉합사 제거 가능성을 방지하기 위해 수술 후 7-10일 동안 단독집 동물을 보관하는 것이 좋습니다. 약물 전달 적용의 경우 절개 부위가 치유되면 절차와 관련된 명백하게 공격적인 행동이나 합병증 없이 이전 그룹에 다시 배치할 수 있습니다. 이식형 장치의 경우 동물은 2마리씩만 수용해야 합니다. 우리는 동물을 3마리 이상의 그룹으로 수용하면 치료 결과와 함께 공격성 관련 합병증이 발생할 수 있음을 발견했습니다.

치료 응용
여기에 설명된 절차는 흉부 척수와 두 가지 특정 치료 전략에 초점을 맞추고 있지만 척추의 다른 영역 및 추가 치료 적용에 적용할 수 있습니다. 유사한 추궁 절제술 절차가 설치류 모델의 다양한 척추 수준에서 성공적으로 수행되었습니다. 그러나 설치류의 경막하 공간이 작기 때문에 치료 전달 중 오류가 발생할 여지를 최소화하는 문제가 됩니다. 추궁 절제술 및 경막 절개술 단계는 설치류 수술 경험이 있는 사람들이 쉽게 수행할 수 있지만, 부상을 입히지 않고 경막 아래에 장치나 약물을 정확하게 배치하려면 추가 훈련 시간이 필요할 수 있습니다. 외과 훈련 외에도 치료 적용에 도움이 될 수 있는 몇 가지 요소가 있습니다. 치료를 받는 동안 선명한 시야를 유지하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 설명한 대로 척수강내 카테터를 사용할 때 카테터를 경막 아래에 삽입하기 전에 카테터에 들쭉날쭉하거나 거친 반점이 없는지 확인하십시오. 위에서 언급했듯이 경막절개술 위치는 매우 중요합니다. 카테터 진입점이 나머지 주둥이판에서 멀어질수록 삽입 중에 카테터가 일렬로 정렬되고 척수와 평행을 유지하기가 더 쉽습니다. 부상과 관련된 치료 전략의 시기도 고려해야 합니다. 향후 작업에는 만성 부상을 해결하기 위한 치료법을 평가할 수 있도록 부상 후 다양한 시점에서 동물에서 이러한 절차를 확립하는 것이 포함될 것입니다. 이 프로토콜은 척수의 신경계 질환에 대한 치료 적용의 상당한 발전을 나타내며 척수 조직에 직접 치료법을 전달하는 다양하고 정확한 접근 방식을 제공합니다.

공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 CatWalk 척수 손상 신탁과 HRC 찰스 허커스 경 연구 펠로우십(BH)의 자금 지원을 받습니다. 이 작업은 또한 국방부가 승인한 국방부 보건부 차관보의 지원을 받았으며 수상 번호에 따라 척수 손상 연구 프로그램을 통해 미화 534,258달러의 금액을 지원했습니다. HT9425-23-1-0492입니다. 그림 2A 와 그림 3A 의 회로도는 Biorender.com 를 사용하여 생성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 mL와 3 mL 주사기암텍
1ml 결핵 주사기BD302100
그라페 겸자 2개FST11051-10
약물 투여용 25G 주사니프로SH811
경막 절개용 27G 바늘니프로SH816
티슈 불독 클램프 6개FST18051-28
에탄올 70%
베이트릴 5 mg/kg엘랑코KV04UHU
바이오젤 서전스 라텍스 장갑몰리크822775-01
부피비카인 2 mg/kg애스펀 뉴질랜드2023-02
부프레노르핀 0.05 mg/kg세바 (베터지식)9000320
클로르헥스와 에탄올 팅크페리고K076A
클로르헥스 스크럽슐케LBL11258
곡선 롱저FST16021-14
듀몽 #4 겸자FST11294-00
젤폼, 멸균 흡수성 젤라틴 스펀지겔폼09-0342-04-015
해밀턴 주사기해밀턴80314
온열 패드 (37oC)켄트 사이언티픽SF-01
지혈기FST13004-14
인피니트 호라이즌 임팩터와 소프트웨어정밀 시스템 및 계측(PSI)IH-0400
이소플루란메드소스알 수 없음
메타캠 2 mg/kg보링거 잉겔하임D02818
비흡수성 봉합선 (에틸론 4-0, P-3)에티콘1603G
O<잠수>2 탱크
Omax 외과용 현미경제이콥스 디지털W43DPT
드레이핑을 위한 플라스틱 랩 프레스 앤 씰다행이네요해당 없음
메스 손잡이파인 사이언스 툴스(FST)10004-13
사이즈 10 메스 칼날암텍 메디컬SH070
Somnoflow 유도 스위트켄트 사이언티픽SF-01저유동 마취 시스템
멸균 흡수 패드와 솜스위스퍼스해당 없음
멸균 면봉 (표준 + 뾰족)help@hand해당 없음
멸균 식염수 0.9%실험실에서 제작 및 오토클레이븐해당 없음
말린 김 와이프의 멸균 부위킴텍 사이언스34155
온도 프로브켄트 사이언티픽SF-01
바나스 스프링 가위FST15903-08
수성 윤활유
체중계어떤 것이든해당 없음

참고문헌

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