인플루엔자 바이러스의 극저온 전자 단층 촬영에서 혈구응집소의 서브나노미터 분해능 구조 결정

극저온 전자 단층 촬영(cryoET)은 단백질 복합체, 바이러스, 세포 및 유기체의 스냅샷을 캡처하기 위해 지난 수십 년 동안 적용되었습니다. cryoEM(cryoEM)의 양식인 cryoET는 생물학적 샘플을 급속 동결한 다음^틸팅을 통해 다양한 방향을 통해 이미지화하는 구조 생물학 방법입니다^1,2,3. 각 방향에서 촬영된 이미지는 공통 기울기 축에 계산적으로 정렬되고 단층 촬영으로 재구성되어 3차원 보기^{를 제공합니다(4}).

X선 결정학 및 단일 입자 cryoEM은 정제되고 구조적으로 균질한 분자를 요구하는 반면, cryoET는 기본 컨텍스트 내에서 분자를 직접 이미지화할 수 있습니다⁴. 따라서 cryoET의 주요 장점 중 하나는 인플루엔자 ^5,6,7을 포함한 막 바이러스와 같은 다형성 샘플을 시각화할 수 있다는 것입니다. cryoET의 또 다른 약속은 규모를 넘어 이미징할 수 있는 능력입니다. 단층촬영은 일반적으로 5-10nm8 지나서 분해되지^않지만, 동일한 입자의 사본이 식별, 정렬 및 평균화되는 서브단층촬영 평균화의 통합은 리보솜과 같은 일부 생물학적 분자에서 원자에 가까운 분해능을 초래할 수 있습니다 ^9,10. 그러나 제한된 유형의 분자만이 이 해상도에 도달할 수 있습니다. 서브 단층 촬영 평균은 일반적으로 10-15 Å 해상도를 초과하지 않습니다. 대조적으로, 단일 입자 cryoEM은 일상적으로 분해능 회전 후 3-4 Å의 분해능을 달성합니다¹¹. cryoET 데이터 수집 및 분석 소프트웨어의 더 높은 처리량의 최근 발전으로 기본 컨텍스트 12,13,14,15,16,17,18 내에서 추가 생물학적 분자의 서브나노미터 분해능 구조 결정이 가능해졌습니다.

cryoET의 일반적인 용도 중 하나는 바이러스 형태, 조직 및 구조를 시각화하는 것입니다. 단일 입자 cryoEM 또는 X선 결정학에 비해 이 기술이 제공하는 낮은 해상도에도 불구하고 서브 단층 촬영 평균화와 결합된 cryoET는 바이러스 단백질이 기본 환경에서 어떻게 행동하는지에 대한 정보를 제공하고 비리온의 맥락에서 바이러스 단백질의 조직에 대한 중요한 세부 정보를 제공할 수 있습니다. 바이러스 cryoET의 일반적인 표적은 종종 치료제나 백신의 주요 항원 및 표적이기 때문에 숙주 세포 부착 및 융합에 일반적으로 사용되는 표면 당단백질입니다. cryoET 처리 패키지의 최근 발전으로 이러한 당단백질 ^19,20,21,22의 나노미터 이하 분해능 평균을 달성하는 것이 점점 더 실현 가능해지고 있습니다. 그러한 예 중 하나는 인플루엔자 비리온 표면의 주요 단백질인 혈구응집소(HA)입니다. 이 단백질은 수용체 결합과 막 융합을 모두 수행할 뿐만 아니라 단일 비리온에 수백에서 수천 개의 HA가 있는 믿을 수 없을 정도로 조밀한 방식으로 비리온을 덮습니다⁵. 여기에 제시된 프로토콜(그림 1)은 일반적으로 사용되는 여러 패키지를 사내 스크립트와 통합하여 인플루엔자 HA의 서브 단층 촬영 평균에 대한 전처리에서 모델 개선까지의 단계를 설명합니다.

참고: 이 프로토콜에 사용되는 샘플 데이터 세트는 이 프로토콜에 사용되는 두 세트의 틸트 시리즈를 포함하는 EMPIAR-12864에서 액세스할 수 있습니다. 틸트 시리즈는 2.09Å/픽셀의 물리적 픽셀 크기로 정제된 인플루엔자 A 바이러스의 수동 급락 그리드에서 수집되어 각 틸트 시리즈에 여러 개의 비리온이 포함될 수 있도록 충분히 넓은 시야를 보장하고 가능한 최고 해상도 재구성을 렌더링합니다. 사용자 자신의 데이터 세트의 경우 원시 틸트 동영상으로 워크플로를 시작하는 것이 좋습니다. 이러한 데이터 세트는 고성능 워크스테이션을 사용하여 처리 및 시각화되었습니다. 재료 표 에는 이 프로토콜에 사용되는 하드웨어 및 소프트웨어가 나열되어 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 소프트웨어 패키지는 오픈 소스이며 다운로드할 수 있습니다. 설치 링크 및 지침 은 재료 표에 나열되어 있습니다. cryoET 데이터 세트 처리를 위한 권장 워크스테이션에는 최소 8코어 프로세서, 6GB VRAM, 64GB RAM 및 2TB 로컬 스토리지가 있는 전용 GPU 카드가 장착되어 있어야 합니다.

1. Warp ²³ 및 IMOD ²⁴에서 틸트 동영상의 데이터 전처리 및 극저온 전자 단층 촬영의 재구성

1. 터미널에서 다음 명령을 사용하여 Warp가 설치된 conda 환경을 활성화합니다.
   conda activate warp_environment
2. 프레임 시리즈를 처리하기 위한 프레임 시리즈 설정 파일을 만듭니다. 현미경에 대한 메타데이터, 처리할 데이터의 위치, 출력 파일을 저장할 위치가 포함된 구성 파일입니다.
   WarpTools create_settings --folder_data path/to/.tif --folder_processing warp_frameseries --output warp_frameseries.settings --extension “*.tif” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07
   참고: 이 데이터는 초해상도 모드에서 수집되었습니다.
3. CTF(Contrast Transfer Function) 추정 및 동작 보정을 수행합니다.
   WarpTools fs_motion_and_ctf --settings warp_frameseries.settings --m_grid 1x1x5 --c_grid 2x2x1 --c_range_max 7 --c_defocus_max 10 --c_defocus_min 4 --c_use_sum --out_averages
   참고: m_grid 매개변수는 틸트 동영상 내의 하위 프레임 수와 일치해야 합니다 - 데이터 세트는 틸트 동영상당 5개의 하위 프레임으로 구성되었습니다.
4. WarpTools가 어떤 동영상이 어떤 틸트 시리즈에 속하는지 식별할 수 있도록 틸트 시리즈 메타데이터를 가져옵니다.
   WarpTools ts_import --mdocs path/to/.mdoc --frameseries /path/to/frameseries --tilt_exposure 3.07 --min_intensity 0.3 --output tomostar
5. tomostar 폴더를 채운 후 틸트 시리즈 처리를 위한 틸트 시리즈 설정 파일을 만듭니다
   WarpTools create_settings --folder_data tomostar --folder_processing warp_tiltseries --output warp_tiltseries.settings --extension “*.tomostar” --angpix 1.04 --gain_path gain_file.mrc --exposure 3.07 --tomo_dimensions NxNxN
6. Etomo GUI²⁴를 사용하여 IMOD의 batchruntomo 프로그램을 사용하여 틸트 스택을 작성하고 자동화된 기준 기반 틸트 시리즈 정렬을 수행합니다.
   1. 터미널에서 다음 명령을 실행합니다.
      Warptools ts_stack --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35
      참고: 틸트 시리즈는 정렬 시간과 계산 리소스를 줄이기 위해 물리적 픽셀 크기의 4배로 내보냈습니다.
   2. batchruntomo의 템플릿으로 적용하기 전에 먼저 정렬 매개변수를 설정할 샘플 데이터 세트를 선택합니다.
   3. batchruntomo를 사용하는 경우 IMOD에서 정렬 매개변수를 가져옵니다.
      WarpTools ts_import_alignments --settings warp_tiltseries.settings --alignments warp_tiltseries/tiltstack/ --alignment_angpix 8.35
      참고: 이 데이터 세트의 경우 Etomo GUI를 사용하면 WarpTools 내의 래퍼보다 더 나은 결과를 얻을 수 있습니다.
   4. 또는 WarpTools 내에서 AreTomo²⁵ 래퍼를 사용하여 자동화된 기준이 없는 틸트 시리즈 정렬을 수행합니다.
      WarpTools ts_aretomo --settings warp_tiltseries.settings --angpix 8.35 --alignz 1000 --axis_iter 3 --exe AreTomo_executive
      참고: AreTomo 래퍼는 AreTomo1.3.4로 테스트되었습니다.
7. 터미널에서 다음 명령을 실행하여 틸트 시리즈에 대한 CTF 매개변수를 추정합니다.
   WarpTools ts_ctf --settings warp_tiltseries.settings --range_high 7 --defocus_min 2 --defocus_max 10 --auto_hand 4
8. WarpTools를 사용하여 단층 촬영을 재구성합니다.
   1. 환경 변수 설정:
      export WARP_FORCE_MRC_FLOAT32=1
      참고: 이 단계는 단층 촬영이 이 프로토콜에 사용되는 다른 소프트웨어의 이미지 처리 및 시각화의 후속 단계와 호환되도록 합니다.
   2. 단층 촬영을 재구성하려면 터미널에서 다음을 실행하십시오. WarpTools ts_reconstruct --settings  warp_tiltseries.settings --input_data input file names --angpix 8.35 --dont_invert
9. 모든 데이터 세트에 대해 1.2 - 1.8.2단계를 반복합니다.

2. 단층촬영 전처리 및 입자 피킹

1. 터미널에서 IsoNet²⁶ 이 설치된 conda 환경을 활성화합니다.
   conda activate isonet_env
2. 먼저 하위 폴더를 만들고 모든 단층 촬영을 해당 폴더로 이동하여 단층 촬영 처리를 준비합니다.
   mkdir tomo_folder
mv tomograms*.mrc tomo_folder/
3. 프로젝트 폴더에 별표 파일을 생성합니다.
   isonet.py prepare_star tomo_folder --output_star tomograms.star --pixel_size 8.35
4. 텍스트 편집기를 사용하여 생성된 별 파일을 열고 각 단층 촬영의 네 번째 열(_rlnDefocus)에 0도 기울기 이미지의 대략적인 초점 디포커스 값을 입력하며, 이는 warp_tiltseries 폴더의 processed_items.json 파일에 있습니다.
   참고: 디포커스 값은 IsoNet의 옹스트롬 단위여야 합니다. Warp는 10,000의 곱셈 계수가 필요한 μm 단위의 디포커스 값을 씁니다.
5. 터미널에서 CTF deconvolve 명령을 실행합니다.
   isonet.py deconv tomograms.star --snrfalloff 0.7 --deconv_folder deconvolve
6. 디컨볼루션 후 EMAN2 GUI²⁷ 을 시작하여 입자 피킹을 위한 단층 촬영 전처리를 시작합니다.
   conda activate eman_env
e2projectmanager.py
7. 단층 촬영에서 Raw Data 옆의 화살표를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Import Tomograms 를 선택합니다.
8. Segmentation(분할) 옆에 있는 화살표를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 전처리 단층촬영을 선택합니다.
   참고: 기본 매개변수는 많은 데이터 세트에 적합할 수 있습니다. 이러한 단층 촬영의 경우 4 Å에서 저역 통과 필터를 적용하고 기울기 이미지를 정규화했습니다. 전처리 후 정보 디렉토리는 빈 .json 파일(전처리된 파일과 유사한 기본 이름 포함)이 있는 EMAN2에 의해 자동으로 생성됩니다. 파티클 피킹 전에 angpix를 json 파일에 추가해야 합니다.
9. HA 당단백질을 인식하도록 컨볼루션 신경망(CNN)을 훈련합니다.
   1. 작업 디렉토리를 CNN 훈련 및 입자 선택에 사용할 단층 촬영의 위치로 변경합니다.
      cd path/to/tomograms
   2. 터미널을 사용하여 CNN 교육 창을 엽니다.
      e2spt_boxer_convnet.py --label label_name
   3. 네 개의 창이 열려 있는지 확인합니다: 하나는 디렉토리의 CNN 매개변수 및 단층 촬영에 대한 정보를 포함하고, 다른 세 개의 창에는 좋은 참조(Positive), 잘못된 참조(Negative) 및 CNN에서 선택한 입자(Particles)의 이미지가 포함되어 있습니다.
   4. CNN GUI에서 새로 만들기 버튼을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 새 CNN을 초기화합니다. 기본 학습률을 0.0001로 설정하고 상자 크기를 8로 설정합니다.
   5. 파일 이름 열에서 대표적인 단층 촬영을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 새 창에서 엽니다.
      참고: 한 번에 하나의 단층촬영만 열 수 있습니다.
      1. 단층 촬영의 z축을 이동하려면 열려 있는 단층 촬영 위에 커서를 놓고 컴퓨터 마우스의 스크롤 휠을 눌러 새 창을 엽니다. N#이라고 표시된 슬라이더는 z축을 변경합니다.
   6. 열린 단층 촬영에서 포지티브 패널의 마우스 왼쪽 버튼을 사용하여 HA에 해당하는 10-20개의 특성을 선택합니다.
      참고: 멤브레인 위에 원통 또는 삼각형으로 나타나는 HA의 상단 및 측면 뷰를 모두 선택하여 보다 견고한 네트워크를 위한 좋은 참조로 사용합니다.
      1. 긍정적인 참조의 이미지가 긍정적 창에 나타납니다. 참조를 제거하려면 Shift 키를 누른 상태에서 참조 이미지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
   7. 네거티브 패널로 전환하고 빈 멤브레인 패치, vRNP 밀도, 기준 마커 및 파편과 같은 기능에 해당하는 10-20개의 참조를 선택합니다.
      참고: 참조가 부정 창에 나타납니다.
   8. 기본 창에서 훈련 버튼을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 CNN 훈련을 시작합니다.
      참고: 기본 창의 반복 횟수(Niter)는 CNN이 수행하는 훈련 반복 횟수를 변경합니다. 매개 변수를 50으로 설정하는 것이 좋습니다.
   9. 선택한 참조에 대해 CNN이 학습되면 적용을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 CNN을 사용하여 열린 단층 촬영에서 입자를 선택합니다.
      참고: 선택한 파티클의 이미지는 파티클 창에서 볼 수 있습니다. 선택한 입자는 단층 촬영에도 파란색 원으로 표시됩니다.
   10. 적용된 네트워크를 기반으로 포지티브 및 네거티브 참조를 계속 선택하고 저장 버튼을 통해 주기적으로 진행 상황을 저장합니다.
   11. 만족스러우면 모두 적용을 선택하여 CNN이 디렉토리의 모든 단층촬영에서 입자를 선택하고 여러 단층촬영에서 결과를 평가하도록 합니다. 필요에 따라 추가 교육을 수행합니다.
10. 각 단층 촬영에 대한 좌표를 텍스트 파일에 저장합니다.
    1. 명령을 사용하여 EMAN2 GUI를 엽니다.e2projectmanager.py
    2. Subtomogram Average 옆에 있는 화살표를 클릭하고 Manual Boxing을 클릭합니다.
    3. 단층 촬영의 이름을 입력하고 시작을 클릭합니다.
    4. 파일 > 상자 좌표 > tomogram_ha.txt 저장을 선택하여 좌표를 텍스트 파일에 저장합니다.
    5. neuralnets 하위 폴더 및 info 하위 폴더로 이동하여 nnet_save.hdf, trainouts.hdf, segouts.hdf 및 boxes3dref.hdf를 백업합니다.
11. 매트릭스(M1) 단백질층과 바이러스 리보핵단백질(vRNP) 복합체의 존재가 명백한 완전히 조립된 비리온에서만 분석이 수행되도록 하려면 M1 단백질을 인식하도록 두 번째 컨볼루션 신경망을 훈련시킵니다.
    1. 2.9단계에서 설명한 것과 동일한 프로토콜에 따라 훈련 상자 크기를 8에서 14로 변경합니다.

3. 입자 큐레이션

1. https://github.com/jqyhuang/influenza-analysis 에서 노트북을 다운로드합니다.
2. CNN_Particle_Cleaning.ipynb 노트북을 열고 필요한 모듈을 로드합니다.
   참고: 스크립트는 Open3D²⁸ 을 패키지로 사용하여 입자 좌표를 3D 포인트 클라우드로 시각화합니다.
3. HA 및 M1 좌표에 해당하는 텍스트 파일을 로드하고 Open3D 패키지를 사용하여 3D 포인트 클라우드로 봅니다.
4. Open3D에서 구현된 통계적 이상치 제거를 사용하여 HA 좌표 이상값을 필터링합니다.
   참고: HA에 대해 제안된 초기 값은 nb_neighbors = 50(좌표 주위의 인접 좌표 수) 및 std_ratio = 0.5입니다.
5. HA와 M1 포인트 클라우드 사이의 거리를 계산합니다. 그러면 M1 포인트 클라우드에서 20픽셀 이상 떨어진 모든 HA 좌표가 이상치로 식별됩니다. 이상치로 식별되지 않은 모든 파티클 좌표는 출력 .txt 파일에 저장됩니다.
   참고: 20픽셀은 픽셀 크기가 8.35Å/픽셀인 대략적인 16nm의 거리에 해당합니다. M1층에 대한 HA 삼량체의 중심은 단층촬영에서 약 15nm입니다.
6. 모든 파티클을 연결하고 pts2starfile.ipynb를 사용하여 스타파일로 저장합니다.

4. 반복적인 서브단층촬영 평균 및 분류

1. WarpTools를 사용하여 4의 비닝 계수에서 입자를 추출하고 RELION4²⁹에서 서브단층 촬영 평균화의 초기 라운드를 수행합니다.
   WarpTools ts_export_particles --settings warp_tiltseries.setting --input_star pts2star.star --coords_angpix 8.35 --output_star bin4_export.star --output_angpix 8.35 --box 48 --diameter 140 --3d
   참고: 48 x 48 x 48 픽셀의 권장 상자 크기는 7-8 HA의 어레이를 포함할 수 있을 만큼 충분히 큰 ~360 ų상자에 해당합니다.
   1. 워프 스타 파일을 RELION 4 호환 파일로 변환
      relion_convert_star --i bin4_export.star --o bin4_conv.star
   2. 파티클의 하위 집합에 대한 relion_refine_mpi를 사용하여 초기 참조를 생성합니다.
      head -n 30 bin4_conv.star >> subset.star & tail -n +31 bin4_conv.star | shuf -n 2000 >> subset.star
mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o init_ref/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i subset.star --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 300 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 14 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control init_ref/job001
   3. relion_refine_mpi 사용하여 서브단층 촬영에서 3D 자동 미세 조정을 수행합니다.
      1. 샘플 명령: mpiexec -n 3 relion_refine_mpi --o Refine3D/job001/run --auto_refine --split_random_halves --i bin4_conv.star --ref init_ref/job001/run_class001.mrc --firstiter_cc --ini_high 20 --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --particle_diameter 400 --flatten_solvent --zero_mask --oversampling 1 --healpix_order 2 --auto_local_healpix_order 4 --offset_range 16 --offset_step 4 --sym C1 --low_resol_join_halves 40 --norm --scale --j 12 --gpu 0:1 --pipeline_control Refine3D/job001
         참고: 초기 전역 및 로컬 샘플링은 7.5도 및 1.8도로 설정되었으며, 이는 healpix 차수 4 및 로컬 healpix 2에 해당합니다. 초기 개선은 대부분 멤브레인, M1 단백질 및 HA 어레이의 강력한 밀도를 활용합니다. 변환 오프셋 범위는 배열을 정렬할 때 발생할 수 있는 모든 이동을 포함하기 위해 더 클 수 있습니다.
   4. 첫 번째 미세 조정 실행이 수렴된 후 미세 조정을 반복하여 변환을 8로, 단계를 2로 변경합니다.
2. 2D 분류를 활용하여 relion_refine 사용하여 정크 입자를 폐기합니다.
   1. 샘플 명령: relion_refine --o Class2D/job003/run --grad --class_inactivity_threshold 0.1 --grad_write_iter 200 --iter 200 --i Refine3D/job002/run_data.star --dont_combine_weights_via_disc --pool 3 --pad 2 --ctf --tau2_fudge 2 --particle_diameter 300 --K 20 --flatten_solvent --zero_mask -- strict_highres_exp 14 --center_classes --oversampling 1 --norm --scale --j 24 --skip_align --pipeline_control Class2D/job002.
      참고: 계산 효율성이 더 높기 때문에 3D 분류 대신 2D 분류가 사용되었습니다. 서브단층촬영은 추가 이미지 처리 없이 2D 분류 작업에 대한 입력으로 직접 사용할 수 있습니다.
   2. relion_star_handler를 사용하여 원통형 HA, 멤브레인 및 M1 밀도를 포함하는 식별 가능한 HA 어레이를 포함하는 클래스를 결합합니다.
   3. 먼저 좋은 클래스가 포함된 별 파일을 만듭니다.
      relion_star_handler --i input_file2.star --o output_good_class.star --select rlnClassNumber --minval goodclassnumber -maxval goodclassnumber
   4. 그런 다음 다음 relion_star_handler 명령을 사용하여 개별 스타 파일을 결합합니다.
      relion_star_handler --i "output_good_class1.star output_good_class2.star … output_good_classn.star" --o bin4_keep.star --combine
3. 반복적인 로컬 세분화를 위해 bin2 및 비닝되지 않은 입자를 다시 추출합니다.
   1. bin2 미세 조정의 경우 80의 더 작은 상자 크기를 사용하여 입자를 추출하고 healpix와 로컬 healpix를 모두 4(1.8도 로컬 각도 샘플링)로 설정하여 로컬 검색을 수행합니다.
   2. 이 단계에서는 relion_star_handler를 사용하여 서로 다른 데이터 세트의 파티클 세트를 결합합니다.
      relion_star_handler --i input_file.star --o output_file.star --combine
   3. 첫 번째 정제 라운드 후 중앙 HA 플러스 멤브레인 및 M1 밀도를 포함하는 EMAN2 환경 내에서 e2filtertool.py 을 사용하여 원통형 마스크를 만듭니다.
      참고: 원통형 마스크에 사용되는 매개변수: cx=24, cy=24, outer_radius=8, zmax=40, zmin=12; 다른 모든 매개변수는 선택되지 않습니다.
   4. 마스크를 적용한 상태에서 한 번 더 다듬습니다.
   5. 중앙 HA와 정렬되지 않는 이상값 및 추가 파편을 제거하기 위해 또 다른 2D 분류를 수행합니다.
   6. 상자 크기가 120인 비닝되지 않은 입자로 프로세스를 반복하고 중앙 HA를 덮는 소프트 마스크를 만들고 참조를 C3 대칭에 정렬한 다음 이 미세 단계에서 대칭을 적용합니다.
      relion_image_handler --i bin1_ref.mrc --o bin1_c3.mrc --sym c3
      참고: RION을 사용하여 달성한 최종 분해능은 6.1 Å였습니다.
4. MTools⁹의 최종 개선
   1. 세분화 모집단을 생성합니다(워프 콘다 환경 활성화 후).
      MTools create_population --directory refine_m --name ha_final
   2. 각 데이터 세트에 대한 데이터 원본을 추가합니다.
      MTools create_source --name source_1 --population refine_m/ha_final.population --processing_settings warp_tiltseries.settings
      1. 추가 데이터 세트에 대해 이전 단계를 반복합니다.
   3. 세분화 종을 만듭니다.
      MTools create_species --population refine_m/ha_final.population --name ha_todaysdate --diameter 160 --sym c3 --temporal_samples 1 --half1 last_relion_refine/run_half1_class001_unfil.mrc --half2 last_relion_refine/run_half2_class001_unfil.mrc --particles_relion last_relion_refine/run_data.star --mask mask.mrc
   4. 다중 입자 미세화.
      1. 먼저 다음 명령을 사용하여 파티클 포즈를 다듬습니다. MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles
      2. 그런 다음 다음 명령을 사용하여 입자 포즈와 구면 수차를 모두 미세 조정합니다. MCore --population refine_m/ha_final.population --refine_particles --ctf_cs
         참고: 추가 반복으로 해상도가 향상되지 않았기 때문에 여기에서 개선이 중지되었습니다. 그러나 철저하게 테스트되지 않은 다양한 매개변수 조합은 계속해서 결과를 향상시킬 수 있습니다.

5. 모델 개선

1. ChimeraX³⁰을 사용하여 최종 맵과 HA의 원자 모델을 로드합니다.
2. 세그먼트 매핑 및 HA 엑토도메인에 해당하는 모든 세그먼트를 결합하고 세그먼트에 맞추 기 도구를 사용하여 HA 모델에 도킹합니다.
   1. 변환된 모형 좌표를 저장합니다.
3. Phenix GUI³¹을 열고 Real Space Refinement 도구를 사용합니다.
   1. 파일을 추가하라는 메시지가 표시되면 변환된 HA 모델과 맵을 추가하고 최종 재구성의 해상도를 채웁니다.
   2. 전역 최소화, 로컬 로타머 피팅, 점유율 개선 및 그룹 ADP 개선의 5라운드를 수행합니다.
4. ChimeraX를 사용하여 최종 재구성 및 모델을 시각화합니다.

이 처리 프로토콜(그림 1)의 활용을 입증하기 위해 이전에 설명한 워크플로를 H1N1 인플루엔자 A 바이러스 균주(A/푸에르토리코/8/1934)에서 얻은 25개의 단층 촬영으로 구성된 두 개의 데이터 세트에 적용했습니다. 데이터 수집 매개변수는 표 1에 요약되어 있습니다. 그림 2 는 다형성 인플루엔자 비리온의 대표적인 단층 촬영 및 확대 보기를 보여줍니다. 이 단층 촬영에서는 비리온이 구형에서 타원형/길쭉한 모양에 이르기까지 다양한 형태를 포착합니다. 대부분의 인플루엔자 입자는 잘 조직된 M1 및 vRNP 어셈블리를 포함하지만 일부 비리온은 더 무질서하고 중요한 구조 구성 요소가 부족한 것으로 보입니다.

이 데이터 세트에서 입자 피킹 및 큐레이션 후 bin4(8.35 Å/pix) 재구성에 40,995개의 서브 단층 촬영으로 구성된 초기 세트가 사용되었습니다. 두 데이터 세트는 처음에 C1 대칭과 전체 HA 어레이를 포함하는 넓은 구형 마스크를 사용하여 RELION4 독립적으로 처리되었습니다. 이러한 서브 단층 촬영에 대해 3번의 미세 주기가 수행된 후 2D 분류가 수행되었습니다. 분류 후 제대로 분해되지 않은 서브 단층 촬영과 정크 입자는 폐기되었습니다. 나머지 서브 단층 촬영은 bin2(4.17 Å/pix)에서 추출되었고 두 데이터 세트가 결합되었습니다. Bin2 서브 단층 촬영은 먼저 서브 단층 촬영 평균화에서 함께 정렬된 다음 중앙 HA 주위에 원통형 마스크를 적용하여 초점 정렬을 했습니다. 이 단계에서 HA 재구성을 위해 삼량체 대칭을 명확하게 시각화할 수 있습니다. 추가 개선 라운드는 bin2 및 2.8 Å/pix에서 수행되었습니다. 2D 분류의 마지막 라운드는 정렬된 서브 단층 촬영으로 중앙 HA 삼량체만 덮는 작은 마스크로 수행되었습니다. 나머지 서브 단층 촬영의 ~94%로 구성된 주요 클래스는 비닝되지 않은 입자로 추출되고 C3 대칭이 적용된 3D 미세 조정을 거쳤습니다. 마지막으로, 이러한 서브 단층 촬영은 입자 포즈 및 구면 수차 미세 주기가 수행된 M으로 내보내졌습니다(보충 그림 1).

15,970개의 HA 입자로 구성된 최종 서브단층촬영 평균(그림 3A)은 6.0 Å의 전체 분해능과 5-7 Å의 국소 분해능 범위에 도달했습니다(그림 4). PR8 HA 모델은 밀도로 유연하게 다듬어졌습니다. FSC=0.5 및 FSC=0.143에서 맵-모델 해상도는 각각 8.1 Å 및 6.6 Å였습니다. HA 재구성의 아키텍처는 이전의 cryoEM 및 cryoET 맵과 매우 유사했습니다. 이 해상도에서 알파 나선과 베타 시트를 구별할 수 있습니다(그림 3B). 또한, 글리칸은 HA 헤드와 줄기의 4개의 글리코실화 부위에서 식별되기 시작할 수 있습니다(그림 3C).

우리의 결과는 천연 인플루엔자 비리온에서 HA를 재구성하는 cryoET의 적합성을 보여줍니다. 프로토콜을 통해 원통형 당단백질에 대한 명확한 밀도가 바이러스 막에 수직으로 관찰되었고 각 단계를 통해 분해능이 향상되었습니다. 자체 데이터의 경우 서브단층 촬영 평균화는 구간화된 입자 스택에서 시작해야 하며 각 정제 주기에서 결과를 면밀히 모니터링해야 한다고 제안합니다. 당단백질 밀도가 초기 단계부터 명확하지 않은 경우 서브 단층 촬영 위치를 단층 촬영에 다시 매핑하여 정확한 위치를 확인하는 것이 좋습니다. 그렇지 않으면 정렬 매개변수를 조정하거나 추가 분류 단계를 구현하여 최적의 결과를 얻을 수 있습니다.

그림 1: 인플루엔자 바이러스의 cryoET에서 HA의 서브단층 촬영 평균을 위한 전체 파이프라인. 상단 패널은 프로토콜을 시연하는 데 사용되는 두 데이터 세트에 대한 요약 워크플로를 나타냅니다. 두 번째 패널은 프로토콜의 섹션 1에 해당하고, 세 번째 패널은 섹션 2-3에 해당하며, 네 번째 패널은 섹션 4-5에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: PR8 인플루엔자 바이러스의 대표적인 단층촬영 . (A) 재구성된 단층촬영을 슬라이스합니다. 스케일 바는 100nm입니다. (B-D) (B) 구형, (C) 원통형, (D) M1-less PR8 비리온의 관점을 확대했습니다. BD의 모든 스케일 바는 50nm에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: PR8 HA의 서브단층 촬영 평균. (A) PR8 HA 단일 입자 cryoEM 구조로 유연하게 장착된 두 개의 윤곽 수준에서 HA 재구성의 상단 및 측면도. (B) HA 재구성을 통한 잘린 보기. 색상 화살표는 색상 상자에 해당합니다. (C) 글리칸 밀도를 드러내기 위해 낮은 윤곽선에서 표시된 HA 재구성. cryoET 맵에서 스틱 표현의 글리칸을 클로즈업한 모습도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: HA 서브 단층 촬영 평균의 해상도 추정치. (A) 재구성에 매핑된 HA 서브 단층 촬영 평균의 로컬 해상도 추정치. 색상 막대는 파란색-흰색-빨간색 팔레트에 5-7 Å를 나타냅니다. (B) 절반 맵 및 맵-모델 해상도의 FSC 곡선. 파란색 곡선은 마스킹되지 않은 재구성이고 빨간색 곡선은 마스킹된 곡선입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: PR8 인플루엔자 바이러스의 cryoET 데이터 세트에 대한 데이터 수집 매개변수.

보충 그림 1: HA에 대한 서브단층촬영 평균화 워크플로우. 반복적인 정렬, 평균 및 분류는 점진적인 비닝 해제를 통해 HA 서브단층촬영에 대해 수행됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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