폐암의 동계 동소 마우스 모델을 생성하기 위한 최소 침습적 방법

요약

폐암에 대한 새로운 치료법 개발의 주요 과제에는 국소 질환이 전이성 질환으로 진행됨에 따라 종양 미세 환경을 모델링하는 것이 포함됩니다. 여기에서는 시간이 지남에 따라 질병의 생체 내 추적을 가능하게 하는 폐암의 동소 동계 모델을 확립하는 간단한 방법을 설명합니다.

초록

비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계적으로 여성과 남성 모두에게 암 관련 사망의 가장 큰 원인입니다. 보다 효과적인 치료 방식을 개발하려면 암세포, 면역 체계, 각 종양 내의 미세 환경 및 숙주 조직 간의 상호 작용을 이해하기 위해 더 많은 정보를 수집해야 합니다. 여기에 보고된 것은 마우스 폐 내에서 암을 유도하는 간단하고 반복 가능한 방법으로, 초기 단계에서 후기 단계의 질병까지 종양 성장을 모니터링할 수 있습니다. 수술 절차에는 피부의 작은 표면 절개와 늑간근을 통해 폐로 암세포를 주입하는 것이 포함됩니다. 루시페라아제를 발현하도록 조작된 세포와 결합된 생체 내 이미징 시스템(IVIS)은 연구 과정 동안 종양 성장 및 질병 진행을 평가하는 편리한 방법을 제공합니다. 이 기술은 다양한 폐암 모델에 쉽게 적용할 수 있으며 자연 종양 미세 환경을 모방하는 폐암의 전임상 모델에서 새로운 치료법의 타당성과 효능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 실험적 치료법과 함께 외과적 절제, 방사선 및 면역 요법을 포함한 표준 치료 치료를 사용하는 효능 및 안전성/독성 연구의 관련성을 확대합니다.

서론

폐암은 계속해서 가장 많이 진단되는 암 중 하나이며 전 세계적으로 남성과 여성의 암 관련 사망 원인 1위입니다 ^1,2,3. 비소세포폐암(NSCLC)은 미국 전체 폐암 사례의 거의 90%를 차지하며, 지난 몇 년 동안 치료 환경이 크게 개선되었지만 결과를 개선하는 새로운 치료법 개발에 대한 관심이 계속 높아지고 있습니다⁴. 특정 동인 돌연변이에 대한 표적 치료법과 반응성 NSCLC 아형에 대한 면역 요법 개발에는 많은 진전이 있었지만 전체 5년 생존율은 폐암의 모든 단계에서 약 20%로 계속 낮습니다 2,5,6,7. 또한, 면역요법이 진행성 질환의 생존율을 향상시키는 데 큰 진전을 이루었지만 이러한 개선은 5년 전체 생존율이 6.8%에서 10.7%로 바늘을 옮겼고 생존 기간을 7개월에서 8개월로 늘렸을 뿐입니다⁸. 질병의 작용 메커니즘을 이해하고 현재의 표준 치료 요법과 시너지 효과를 발휘하는 새로운 치료법을 개발해야 할 필요성이 여전히 큽니다. NSCLC의 자연적인 진행과 새로운 치료법에 대한 반응의 작용 메커니즘을 이해하려면 안정적으로 재현 가능하고 유도하기 쉬우며 암이 발생하는 종양 미세 환경을 캡슐화하는 전임상 모델이 필요합니다.

지난 수십 년 동안 설치류에서 폐암의 동소 모델을 평가하기 위해 다양한 절차가 개발되었습니다. 절차는 매우 침습적이며 흉강을 여는 폐내 이식 또는 이식 절차와 같이 높은 수준의 전문 지식이 필요합니다 9,10,11,12,13; 기관내 및 구강기관 시술과 같은 중등도 침습성 14,15,16,17; 경피적 주사, 꼬리 정맥 또는 비강내 유도와 같은 최소 침습적 절차 18,19,20,21. 모든 절차는 더 정확하지만 잠재적으로 더 높은 마모율을 허용하는 더 침습적인 기술과 더 낮은 침습적 기술을 통해 더 나은 생존율을 제공하지만 종양 이식 부위의 가변성이 더 큰 등 서로 다른 위험과 이점을 제공합니다. 이러한 다양한 프로토콜 중 일부는 생체 내에서 종양 성장을 추적하지 않고 생체 외 종양 평가만 완료하기로 선택합니다 9,11,12,16. 시간 경과에 따른 종양 성장을 추적하는 프로토콜 중 초기 프로토콜은 컴퓨터 단층촬영(CT)^14,19, 위치 방출 단층촬영(PET)¹⁸ 및 자기공명영상(MRI)¹⁷과 같은 시스템에 더 많이 의존하는 반면, 후기 프로토콜은 생물발광영상(BLI) 시스템과 유전자 변형 세포를 보다 쉽게 사용할 수 있게 된 후 BLI²⁰을 사용하여 시간 경과에 따른 종양 성장을 추적하는 것을 선택합니다^{. 21}.

이 프로토콜을 개발하는 목적은 이러한 다른 절차에서 교훈을 얻고 종양이 폐에 국한된 초기 질병에서 시작하여 NSCLC의 진행을 연구하기 위해 고립성 폐 종양을 유도하는 간단하면서도 신뢰할 수 있는 방법을 만드는 것이었습니다. 이 논문의 전반적인 목표는 생체 내 이미징을 사용하여 모니터링할 수 있고 연구자가 질병이 발생하는 장기에서 폐암을 연구할 수 있도록 할 수 있는 신뢰할 수 있고 최소 침습적인 동계 동소 마우스 모델을 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 이 방법은 온전한 면역체계를 가진 마우스에서 인간 폐암 세포주를 이용한 이종이식 동소소 마우스 모델과 마우스 폐암 세포주를 이용한 동계 동소소 마우스 모델을 모두 생성하는 데 효과적이며, 인간 암 유형과 면역 체계와 NSCLC의 복잡한 상호 작용을 모두 연구하는 방법에 다양성을 부여합니다.

우리는 면역 능력이 있는 NSCLC 마우스 모델인 Lewis Lung Carcinoma(LLC)에서 이 프로토콜을 최적화하는 데 중점을 두었는데, 이 모델을 통해 연구자는 화학 요법, 방사선 요법, 면역 요법 및 기타 표적 요법과 같은 현재 요법 유무에 관계없이 면역 체계 반응을 더 잘 이해할 수 있습니다 22,23,24,25. 이 프로토콜은 접종 시 초기 단계 질병(폐 실질의 종양) 및 종양이 종종 폐 실질을 능가하고 다른 조직에 씨앗을 뿌리기 때문에 연구가 끝날 무렵의 전이를 대표하는 모델을 생성합니다.

동소 모델 연구의 중요한 측면은 동물에 대한 스트레스를 최소화하면서 종양 성장을 반복적으로 추적하고 신속하게 추적하여 연구의 각 동물을 단일 시점에서 평가할 수 있는 능력입니다. MRI 또는 CT와 같은 이미징 기술을 사용하면 종양의 해상도를 향상시킬 수 있지만, 이러한 이미징 기법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되며 마우스와 같은 소동물 모델에서 초기 종양 성장을 추적하는 데 어려움이 있습니다 26,27,28,29,30,31. 따라서 우리는 루시페라아제로 조작된 암세포를 사용하여 생물발광을 통해 종양 성장을 모니터링하기로 결정했습니다. 이 프로토콜에서 우리는 반딧불이 루시페라아제(LLC-luc)로 조작된 25,000-50,000개의 LLC 세포를 주입하고 BLI에 의해 빠르면 다음날 종양을 검출했습니다. 루시페린-루시페라제 반응은 스펙트럼 이미징 장비를 사용하여 생체 내 종양 성장을 추적하는 데 유용한 도구입니다. 빛의 광자를 추적하는 이러한 이미징 시스템의 민감성으로 인해, 루시페라아제를 발현하는 암세포는 종종 MRI 또는 CT에 의해 마우스 모델에서 종양이 검출되기 전에, 그리고 종종 생체 내에서 조기에 추적될 수 있으며, 자주26,32,33,34.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 아이오와 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 검토 및 승인을 받습니다. C57BL6/N 마우스(4-6주령)를 구입하여 수술 전 최소 1주일 동안 적응시킵니다. 모든 동물은 12시간의 빛/암흑 주기에 있습니다. 동물은 우리당 4마리를 수용하며 마취 시간까지 음식과 물을 완전히 이용할 수 있습니다.

1. 주사용 세포의 선택 및 성장

1. ³⁵에 기재된 바와 같이 세포주를 선택하기 위해 루시페라아제 분석을 수행한다.
   1. 10% 소 태아 혈청(FBS), L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)에서 고습도의 37°C에서 LLC-luc 세포를 성장시킵니다. 세포가 50%-100% 합류할 때 분석을 수행합니다.
   2. 분석을 수행하기 전에 세포를 1x PBS로 세척합니다.
   3. 6웰 플레이트에 200μL의 용해 완충액/웰(25mM Tris/phosphate, 4mM EGTA, 1% Triton X-100, 10% 글리세롤)을 추가합니다. 웰에서 세포를 긁어내어 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 16,000 × g 에서 세포를 회전시킵니다. 튜브 바닥에 조밀한 세포 펠릿이 형성되는지 확인하고 상청액을 새로운 미세 원심분리기 튜브에 수집합니다.
   4. 세포 추출물의 절반을 새로운 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 단백질 정량화를 위해 저장합니다. 나머지 절반에 2mM 디티오스레이톨을 넣고 잘 섞는다.
   5. 2 mM 디티오트레이톨을 함유한 8 μL의 세포 추출물을 42 μL의 분석 완충액(25 mM Tris/phosphate, 20 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 2 mM ATP, 1 mM dithiothreitol)과 결합합니다. 0.5-1mM 루시페린 50μL를 첨가합니다.
   6. 상대 빛 단위(RLU)로 보고된 피크 발광을 측정하고 선호하는 단백질 정량 방법으로 단백질 함량을 평가하여 발광을 단백질 mg당 RLU(RLU/mg)로 보고합니다.
2. 발광이 8,000-15,000 RLU/mg인 세포주를 선택합니다.
   참고: 더 높은 루시페라아제 발현(>15,000 RLU/mg)을 선택하면 BLI 기기가 포화될 수 있으므로 피하십시오.

2. 세포 준비

1. 10% FBS, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM에서 37°C의 높은 습도에서 최소 1주일 동안 5% CO₂ 인큐베이터에서 LLC-luc 세포를 성장시킵니다.
   참고: 성장을 모니터링하여 컨플루언션을 70%-80%로 제한하고 필요에 따라 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 분할하여 앞서 설명한 바와 같이 원하는 주입량에 도달합니다³⁶.

3. 수술 전 준비

1. 털이 있는 쥐의 경우 수술 1일 전에 면도하십시오.
2. 마우스를 유도 챔버에 넣어 이소플루란을 사용하여 마취합니다. 산소 유량을 2.0L/min으로 설정하고 기화기를 2% 이소플루란으로 설정합니다. 유도되는 마우스의 크기에 따라 조정하십시오.
3. 마우스의 호흡을 모니터링하고 페달 철회 반사를 사용하여 적절한 마취를 확인합니다.
4. 마우스를 IACUC 승인 보온 장치의 엎드린 자세로 노즈콘에 놓습니다. 계속하기 전에 페달 철수 반사를 사용하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오.
5. 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
6. 마우스가 적절하게 마취되면 전기 클리퍼를 사용하여 마우스의 왼쪽 등쪽 부분에 있는 큰 직사각형 영역(2cm x 3cm)을 제거합니다. 척추는 내측으로, 테이블은 털이 보이지 않을 때까지 옆으로, 마지막 갈비뼈(13번째)는 아래쪽으로, 견갑골의 위쪽 가장자리는 머리를 향해 면도합니다.
7. IACUC 승인 온난화 장치의 빈 케이지에 마우스를 넣고 마우스가 깨어 깨어 깨어 있을 때까지 마우스의 호흡을 관찰합니다. 이때 수술이 끝날 때까지 마우스를 홈 케이지로 되돌려 놓으십시오.

4. 주사용 세포 현탁액의 제조

1. 세포 수확 당일(단계 2.2), 수집 3-4시간 전에 겐타마이신 50mg/mL와 함께 신선한 배지를 추가하여 죽은 세포와 분리된 세포를 제거합니다.
2. 배지를 흡인하고 세포를 1x PBS로 세척합니다. 트립신-EDTA를 첨가하고 37°C에서 1-2분 동안 배양합니다.
3. 세포를 분산시키고 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다.
4. 실온에서 1,200 × g 에서 3분 동안 회전시킵니다. 튜브 바닥에 조밀한 세포 펠릿이 형성되는지 확인하고 상청액을 흡인한 다음 펠릿을 1x PBS로 세척합니다. 이 단계를 3회 반복합니다.
5. 계수를 위해 세포 펠릿을 약 1-2백만 세포/mL의 1x PBS에 재현탁합니다. 계수하기 전에 40μm 세포 여과기를 통해 여과합니다.
6. 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루를 결합하고 혈구계를 사용하여 계수합니다. 세포 현탁액을 2배 만들고 둘 다 계산하여 세포 수를 확인합니다. 총 세포 수와 생존력을 계산합니다.
7. 최종 주입 부피에 재현탁하기 위해 실온에서 3분 동안 세포를 1,200× g 으로 스핀다운합니다. PBS를 흡인합니다.
8. 세포를 1x PBS의 0.5 mg/mL 마트리겔에 50 μL의 부피로 주입당 원하는 세포 수로 재현탁합니다. 응고를 방지하기 위해 절차 내내 최종 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하십시오.
   참고: 이 프로토콜은 LLC-luc 셀을 사용합니다. 마우스당 50μL의 부피에 25,000-50,000개의 세포를 주입합니다.

5. 수술 준비

1. 무균 시술을 위해 IACUC 승인 수술실에서 시술을 수행합니다. 수의사가 승인한 소독제로 수술대를 청소하십시오.
2. 수술 부위에 소독된 IACUC 승인 가열 패드를 놓습니다. 가열 패드 위에 멸균 수술용 드레이프를 놓습니다.

6. 외과적 마취

1. 마우스를 유도 챔버에 넣어 이소플루란을 사용하여 마취합니다. 산소 유량을 2.0L/min으로 설정하고 기화기를 2% 이소플루란으로 설정합니다.
   알림: 이소플루란 농도는 마우스의 크기에 따라 조정할 수 있습니다.
2. 마우스의 호흡을 모니터링하고 페달 철수 반사를 사용하여 적절한 마취를 확인합니다.
3. 멸균 수술용 드레이프의 오른쪽 측면 누운 자세로 노즈콘에 마우스를 놓습니다. 계속하기 전에 페달 철수 반사를 사용하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오.
4. 수술 전 진통제, 멜록시캄(2mg/kg 중량) 피하, 안과용 연고를 양쪽 눈에 투여합니다.

7. 동소폐주사

1. 멸균 거즈를 사용하여 70% 에탄올과 베타딘을 번갈아 가며 수술 부위를 3회 청소합니다. 3cm x 4cm 구멍이 있는 멸균된 천공 수술용 드레이프를 마우스에 놓습니다. 수술용 드레이프 위에 고압멸균된 멸균 기구를 놓습니다.
2. 겸자를 사용하여 견갑골의 두개골 가장자리와 흉곽의 꼬리 가장자리를 찾아 절개할 위치를 결정합니다. 외과 의사의 엄지와 검지를 사용하여 피부가 팽팽한지 확인하고 크기 10 칼날로 견갑골 바로 아래 피부만 통해 표면적으로 5mm 절개를 합니다.
   알림: 외과의는 멸균 장갑을 착용해야 합니다.
3. 115mm 직선 가위를 사용하여 갈비뼈와 늑간근의 피하 지방을 무딘 듯이 해부합니다. 늑간근을 자르지 마십시오.
   알림: 견갑골 근처에 위치한 흉배동맥과 경횡동맥의 심부 가지가 손상되지 않도록 주의하십시오. 피부 내의 모세혈관과 피하 지방을 절단하여 가벼운 출혈이 발생할 수 있습니다. 멸균된 면봉 어플리케이터로 가벼운 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다.
4. Micro-Adson 겸자를 사용하여 절개 부위를 열어 둡니다. 일곱 번째 진정한 갈비뼈부터 시작하여 구부러진 중간 포인트 겸자를 사용하여 위쪽으로 세어 갈비뼈 4와 5를 식별합니다. 주입을 위해 이 영역을 기록하십시오.
5. 세포 현탁액을 부드럽게 3-4배 반전시켜 혼합합니다. 주입 직전에 멸균 300μL 31G 8mm 인슐린 주사기를 사용하여 50μL의 세포 현탁액을 흡입하고 기포가 없는지 확인합니다.
6. 멸균된 4mm 두께의 금속 테이프 스트립을 바늘에 추가하고 주사기와 같은 높이로 마개 역할을 합니다. 이렇게 하면 바늘이 폐 깊숙이 4mm 깊이만 들어갑니다.
7. 50μL 세포 현탁액을 폐에 수직인 90° 각도로 갈비뼈 4와 5 사이의 늑간 공간에 있는 네 번째 갈비뼈 바로 아래에 주입합니다. 세포 현탁액을 주입한 후 바늘을 2-3초 동안 제자리에 고정하여 마트리겔이 경화되고 세포가 주사 부위를 빠져나가는 것을 방지합니다.
8. 같은 각도로 바늘을 천천히 제거하고 날카로운 용기에 버립니다.
9. 2-3바늘을 사용하여 피부를 봉합하고 사각형 매듭으로 봉합하고 수의학 수술용 접착제를 추가하여 상처가 충분히 봉합되도록 합니다.

8. 수술 후 절차

1. IACUC 승인 가열 장치의 빈 케이지에 마우스를 놓습니다. 마취에서 완전히 회복될 때까지 마우스를 모니터링하며, 이는 1-2분이 소요됩니다.
2. 마우스가 깨어 움직이면 새 침구가 있는 케이지에 넣으십시오. 처음 24시간 이내에 마우스를 자주 관찰하여 통증이나 감염의 징후가 있는지 확인하십시오.
3. 수술 후 2일 동안 NSAID 진통제인 멜록시캄(2mg/kg 중량)을 피하 주사로 투여합니다.

9. 생체 내 BLI에 의한 종양 성장 모니터링

1. BLI를 사용하여 수술 다음 날부터 하루에 한 번 자주 폐의 종양 성장을 모니터링합니다.
2. 생체 내 이미징 시스템(IVIS)을 사용하여 생체 내 이미징을 수행합니다.
   1. 마그네슘이나 칼슘이 없는 1x PBS에 15mg/mL로 루시페린을 구성합니다. 20g 마우스의 경우, 이는 15mg/mL 루시페린 용액 200μL를 주입하는 것과 같습니다.
      알림: 준비된 루시페린 용액은 빛에 민감하므로 사용하지 않을 때는 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오.
   2. 소프트웨어를 열고 생물 발광 이미징에 대한 매개변수를 설정합니다. 노출 시간(Exposure Time)을 자동으로 설정합니다. 구간 계수를 4로 설정합니다.
   3. 마우스에게 체중 kg당 150mg의 루시페린을 복강 주사합니다.
   4. 새로운 암세포 모델을 처음으로 이미징할 때 동전기 곡선을 수행하여 최적의 루시페린 흡수 시간을 식별하며, 이는 발광이 정체되기 전에 최고조에 달하는 시점으로 표시됩니다.
      1. 쥐에게 루시페린을 주사합니다. 루시페린이 흡수될 때까지 3분 정도 기다립니다.
      2. 60분 동안 5-10분마다 마우스를 이미지화합니다.
         참고: 다양한 세포주에 대한 최적의 흡수 시간은 일반적으로 5-15분입니다.
   5. 이후의 모든 이미징 세션에서는 최적의 루시페린 흡수 시간을 사용하십시오. 이 시간 동안 이미징을 준비하기 위해 마우스를 마취합니다. 마우스를 2.0 L/min의 유속으로 2% 이소플루란의 유도 챔버에 넣습니다.
   6. 캡처가 완료되면 획득을 선택하여 두 개의 이미지를 촬영합니다.
      1. 첫 번째 이미지는 오른쪽 측면 누운 자세로 누워 있는 마우스입니다. 이를 통해 카메라는 마우스의 왼쪽 측면 부분에 위치한 주사 부위를 캡처할 수 있습니다. 이 보기를 사용하여 종양 성장을 정량화합니다. 이 위치에서 캡처된 이미지는 여기서부터 왼쪽 측면 보기로 표시됩니다.
      2. 첫 번째 이미지가 완성된 직후 누운 자세에서 마우스의 두 번째 이미지를 찍습니다. 이를 통해 카메라는 흉강의 종양에서 방출되는 광자를 복부 보기에서 캡처할 수 있습니다. 이 보기(여기서는 복부 보기로 표시됨)를 사용하여 흉강 내 암의 위치를 추정합니다.
3. 이미지를 분석하려면 단위를 개수 에서 광도로 변경합니다.
4. 도구 구개를 엽니다. 이미지 조정으로 이동하여 수동을 선택합니다. 촬영한 이미지에 가장 적합한 색상 막대의 최소값과 최대값을 선택합니다.
5. ROI 도구를 엽니다. 원 드롭다운을 선택하여 이미지에 관심 영역(ROI) 원을 추가합니다. 왼쪽 측면 보기의 경우 절개 부위 위로, 복부 보기의 경우 가슴 중앙 위로 원을 이동합니다.
6. ROI 측정을 선택합니다.

10. 포함 및 제외 기준 평가

1. 먼저 왼쪽 측면 영상을 관찰하여 폐에 종양 발광의 존재를 확인합니다.
2. 다음으로, 복부 보기 이미지에서 왼쪽 흉강에 종양 발광의 존재를 확인합니다. 그런 다음 복부 보기 이미지에서 발광 부위가 단 하나만 있는지 확인합니다.
3. 이 두 기준(10.1, 10.2단계)이 충족되면 발광이 복부 보기 이미지에서 흉강의 정중선을 교차하지 않는지 확인하여 제외 기준을 평가합니다. 수술 후 4일 동안 2회 연속 IVIS 이미지 후 왼쪽 측면 영상에서 발광이 감지되지 않으면 암세포가 취하지 않았을 가능성이 있으므로 이 마우스를 추가 연구에서 제외합니다.

11. 연구 종료 시 종양 평가

1. 종양 발광의 총 플럭스가 1 × 10⁸ 광자/s(p/s) 이상에 도달하면 종점 평가를 위해 마우스를 수확합니다.
2. 앞서 설명한 바와 같이 폐의 마취 및 관류를 위해 다음 단계를 수행하여 육안적 해부학적 분석 또는 조직학을 위해 종양을 수집합니다³⁷.
   1. 마우스를 유도 챔버에 넣어 이소플루란을 사용하여 마취합니다. 산소 유량을 2.0L/min으로 설정하고 기화기를 2% 이소플루란으로 설정합니다. 마우스의 호흡을 모니터링하고 페달 철수 반사를 사용하여 적절한 마취를 확인합니다.
      알림: 이소플루란 농도는 마우스의 크기에 따라 조정할 수 있습니다.
   2. 누운 자세로 마우스를 노즈 콘에 놓습니다. 계속하기 전에 페달 철수 반사를 사용하여 마우스가 적절하게 마취되었는지 확인하십시오.
   3. 마우스의 흉강을 열어 횡격막 뒤의 폐와 심장을 시각화합니다.
   4. 마우스의 정중선을 따라 아래쪽으로 긴 수직 절단을 만듭니다. 장을 움직여 왼쪽 신장 동맥을 시각화합니다.
   5. 횡격막을 절단하여 심장을 시각화합니다.
   6. 왼쪽 신장 동맥을 절단합니다.
   7. 약 5mL/min의 속도로 심장의 우심실을 통해 약 5-10mL의 1x PBS를 주입합니다.
   8. 목을 따라 절개를 합니다. 기관 위에 있는 피하 지방을 제거합니다. 기관이 절단되지 않도록 주의하십시오.
   9. 바늘로 기관을 평행하게 관통하여 10% 포르말린을 기관에 직접 주입하여 폐를 팽창시키고 고정합니다.
   10. 폐 정점 위의 기관을 절단하여 흉강에서 폐를 확보하고 폐를 흉강에 부착하는 흉막과 인대를 절단합니다.
   11. 10% 포르말린을 넣어 고정합니다.

결과

이 연구에서 C57BL6/N 마우스는 제시된 프로토콜에 따라 주입되었습니다(그림 1). 루시페라아제(LLC-luc)를 발현하도록 유전자 조작된 LLC 세포를 사용했습니다. 또한 가짜 마우스에게 암세포가 없는 Matrigel을 주사했습니다. IVIS의 BLI는 수술 후 1일 이내에 시작할 수 있습니다. 이 LLC-luc 연구는 초기 폐암을 평가하기 위해 BLI에 최적화되었습니다. 이 논문에 사용된 BLI 시스템은 제조업체의 기술 사양에 따라 10광자∙^s-1∙^cm-2∙sr-1의 최소 검출 가능 방사도(MDR)와 50μm의 최소 이미지 픽셀 해상도를 가지고 있습니다.

토론

이 프로토콜은 빠른 회복 시간과 거의 즉각적인 종양 모니터링을 가능하게 하는 최적화된 최소 침습 절차를 설명하며, 이는 이전에 설명한 보다 외과적으로 집중적인 방법과 다릅니다 10,11,20,38,39,40,41,42,43,44,45

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.25% 트립신-EDTA (1배)	깁코	25200-056
10% 중성 완충 포르말린	VWR	16004-112
100mm x 20mm 조직 배양 처리 접시	닷 사이언티픽 주식회사	667621
190 프루프 순수 에탄올	디콘 랩스	2801
3/10 mL 인슐린 주사기, BD 울트라 파인 바늘 31g x 5/16인치.	벡턴 딕킨슨	328438
3M 베트본드	3M	1469SB
ATP	시그마	A5394
베타딘 용액 10% 포비돈-요오드 소독제	아르비오 헬스 L.P.	67618-150-04
C57BL6/N 마우스	찰스 리버 연구소
셀 스트레이너 40um 나일론	송골매	352340
컴팩트 마취기	베타맥 마취
원적외선 워밍 패드와 컨트롤러	켄트 사이언티픽 코퍼레이션
일반 수술용 칼날 손잡이, 사이즈 3	브래드-파커	371030
곡선 중간 끝 범용 겸자	피셔브랜드	16-100-110
디티오트레이톨	리서치 프로덕츠 인터내셔널	D11000
D-루시페린 (나트륨 소금)	케이맨 케미컬	14682
드레이프, 외과용 18" x 26" 페네트레이트 없고, 불임	딜 완료	783410
둘벡코 s 개조 이글 미디엄 (1x)	깁코	11965-092
둘벡코 s 인산염 완충식염수(PBS) 1회	깁코	14190-144
EGTA	시그마	E3389
태아 소 혈청	깁코	A5670402
FL150 광섬유 현미경 광원	메이지
겐타마이신 설페이트 용액	IBI 사이언티픽	IB02030
글리세롤	리서치 프로덕츠 인터내셔널	G22025
이소플루란	프라이멀 파르마 리미티드	66794-013-25
IVIS 루미나 S5	퍼킨엘머와 nbsp;
리빙 이미지 소프트웨어	퍼킨엘머와 nbsp;
LL/2 (LLC1)	ATCC	CRL-1642	연구에 가장 적합한 암세포주를 사용하고, nbsp;
황산마그네슘	피셔 사이언티브	M63
마트리젤 저저막 매트릭스	코 닝	354234
메이요-헤가 바늘 홀더, 6인치, 톱니 모양 턱	밀텍스	8-44TC
마이크로 애드손 겸자	파인 사이언스 툴즈	10018-12
N5 도그 포 트리머 더블 블레이드	Oneisall
비멸균, 12겹 거즈 스펀지	NDC	P157112
옵틱스케어 아이 윤활제	아벤틱스	5914304
페니실린 스트렙토마이신	깁코	15140-122
퍼마핸드 실크 봉합사 6-0 1 x 18"	에티콘	K802H
인산 85%	피셔 사이언티브	A242
메스 칼날 크기 10, 스테인리스 스틸, 멸균	신시내티 서지컬	110
스크류 캡 튜브 원뿔형 50 mL	사르스테트	62.547.100
티슈 가위 4.5" Staight Premium	온성	SCT115
트리톤 X-100	시그마	T6878
트리즈마 기지	시그마	T1503
트라이판 블루 스테인 (0.4%)	깁코	15250-061
라이너가 있는 유틸리티 알루미늄 호일 테이프	IPG	ALF150L
나무 샤프트 면 팁 어플리케이터	NDC	76200