방법 논문

RNA In Situ Hybridization Assay를 사용한 쥐 뇌의 인슐린 수용체 A 및 B의 정확한 시각화

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DOI:

10.3791/68677

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2025년 7월 15일

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Section/Laboratory of Clinical Investigation, National Institute on Aging, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

우리는 쥐 맥락막신경총에서 인슐린 수용체 이성질체 IR-A 및 IR-B를 매핑하기 위해 Duplex in situ hybridization assay를 구축하여 기존 방법의 한계를 극복했습니다. 이 고해상도 접근법은 동형(isoform) 특이적 발현을 밝혀 뇌 인슐린 신호전달에 대한 새로운 통찰력과 신경 장애에 대한 잠재적인 동형(isoform) 표적 치료에 대한 새로운 통찰력을 제공합니다.

초록

인슐린 수용체(IR)는 모든 조직과 모든 세포 유형에 걸쳐 널리 발현됩니다. 그것은 기능적으로 구별되는 두 개의 이성질체(IR-A와 IR-B)에 존재하며, 선택적 엑손 11 접합으로 인해 12개의 아미노산이 다릅니다. 이러한 동형은 조직 및 세포 특이적 발현 패턴을 나타내며, 상대적 풍부도는 발달, 노화 및 질병에 따라 다양합니다. 염기서열 유사성이 높기 때문에 기존의 면역학적 방법을 사용하여 IR-A와 IR-B를 구별하는 것은 어려운 일이었습니다. 여기에서는 조직 내 IR-A 및 IR-B 발현을 시각화할 수 있는 새로운 ISH(Duplex in situ hybridization) 분석에 대해 설명합니다. 이 접근법을 사용하여 두 동형이 모두 쥐 맥락막신경총에서 발현되는 반면 IR-A가 우세하다는 것을 처음으로 입증했습니다. 이 방법은 서로 다른 조직에 걸쳐 인슐린 수용체 동형 의 공간 분포를 조사하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. Real-Time qPCR은 단세포 체외 배양에서 IR-A 및 IR-B 전사체를 검출할 수 있지만 복잡한 조직 내에서 공간적 위치를 파악하는 능력이 부족하여 듀플렉스 ISH 기술의 필요성과 유용성을 강조합니다.

서론

인슐린 수용체(IR)는 인슐린의 다양한 생리학적 효과를 매개하는 단일 통과 막관통 효소 수용체입니다. 이질체 단백질로 기능하며, 각 단량체는 이황화 결합으로 연결된 두 개의 펩티드 사슬로 구성됩니다 : 리간드 결합 도메인을 포함하는 세포 외 α-subunit과 세포 내 서열이 고유 티로신 키나아제 활성을 갖는 막관통 β-subunit1. 엑손 11의 선택적 스플라이싱을 통해 IR 유전자의 전사는 두 개의 IR mRNA 변이체를 발생시킵니다. IR-A에는 엑손 11이 없지만 IR-B에는 엑손 11이 있습니다. 결과적으로, IR-A와 IR-B는 α-subunit의 C-말단 근처에서 12개의 아미노산 서열에 의해 다르며, 그 결과 성숙한 인슐린 외에 성장 인자의 뚜렷한 결합과 다양한 다운스트림 신호 전달 특성이 발생합니다. 두 변이 모두 인슐린에 대해 유사한 친화력을 나타내지만, IR-A는 IR-B에 비해 인슐린 유사 성장 인자-II(IGF-II) 및 프로인슐린에 대한 친화력이 더 높습니다. IR-A 및 IR-B의 발현 패턴은 조직 및 세포 유형, 질병 상태2에 따라 다릅니다.

조직과 질병에서의 차별적 발현은 생리학과 병리학에 대한 그들의 독특한 기여를 강조합니다. 맥락막신경총(CP)은 뇌척수액(CSF)을 생성하고 혈액-CSF 장벽의 일부를 형성하는 특수 구조로, 특히 염증이 발생하는 동안 영양분 운반, 노폐물 제거 및 신경 보호에 중요한 역할을 합니다. 두 IR 이성질체는 모두 CP에서 발현되며, 여기서 CSF 부피 및 조성을 조절할 가능성이 높습니다. IR-A는, IGF-II에 의하여 그것의 높 친화력 연결을 통해, 확률이 높습니다 CP 상피에 있는 세포질 증식 그리고 조직 수선을 승진시킵니다. 반면에 IR-B는 혈액-CSF 장벽을 통한 인슐린 수송에 관여하여 성상세포, 뉴런, 신경교세포, 포도당 항상성을 위한 뇌의 인슐린 가용성을 지원합니다 3,4.

당뇨병 전단계 IR 수치는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)에 대한 유전적 위험이 있는 무증상 환자의 CSF 타우 증가와 관련이 있으며5, IR-A/IR-B 비율의 변화는 인슐린 저항성, 노화, 암 및 기타 병리학에 기여할 수 있는 증식 활동 인자 증가와 관련이 있습니다6. IR-A 및 IR-B의 동형 특이적 발현 패턴을 규명하는 것은 복잡한 중추신경계 장애에 대한 새로운 치료 전략을 개발하기 위한 중요한 단계를 나타냅니다. 그러나 면역염색 및 qPCR과 같은 현재의 접근법은 제한적입니다: 검증된 항체가 없기 때문에 모든 단백질이 신뢰할 수 있는 면역 표지를 할 수 있는 것은 아니며, qPCR은 특이성이 높지만 공간 분해능이 부족합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 RNAscope 플랫폼 BaseScope를 기반으로 하는 고급 RNA 검출 기술인 ISH(Duplex in situ hybridization)를 활용했습니다. 이 분석은 표적 RNA에 탠덤 결합이 필요한 고유한 double-Z 프로브 설계를 사용하여 저농도 전사체에 대해서도 높은 특이성과 감도를 가능하게 합니다. 형광 또는 발색 신호는 여러 프로브 결합 이벤트를 통해 증폭되어 검출을 향상시키고 배경7을 줄입니다. 표준 RNAscope와 달리 이 분석은 짧은 RNA 염기서열(50-300 염기)을 검출하도록 최적화되어 있어 뇌와 같은 복잡한 조직에서 선택적 스플라이싱 이벤트, 단일 뉴클레오티드 변이체 및 희귀 전사체를 식별하는 데 특히 적합합니다8.

이 분석은 명시야에서 뚜렷한 녹색(C1) 및 빨간색(C2) 발색 신호로 표적을 동시에 시각화합니다. 4% 파라포름알데히드(PFA) 또는 10% 중성 완충 포르말린(NBF)으로 고정되고 저농도에서 고농도 RNA를 포함하는 5μm-15μm(동결/FFPE)로 절단된 조직을 사용하여 성공을 보장합니다. RNA 분해, 과잉 고정 및 프로브 오류에 대한 민감성으로 인해 특이성을 극대화하고 배경을 최소화하기 위해 전처리, 프로브 설계 및 제어를 최적화해야 합니다. 여기에서는 이 Duplex ISH 분석을 적용하여 쥐 CP에서 IR-A 및 IR-B의 발현 패턴을 특성화하여 IR 동형의 공간 생물학과 뇌 건강 및 질병에 대한 가능한 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 미국 실험실 동물 관리 인증 협회(AAALAC)의 인증을 받은 NIA (National Institute on Aging)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 NIA 교내 연구 프로그램(IRP/NIA)의 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토하고 승인했습니다. 생쥐는 12시간의 라이트/다크 사이클 하에 온도 조절 시설에 보관되었으며, 달리 명시되지 않는 한 물과 표준 차우에 대한 임시로 접근할 수 있었습니다. C57BL/6J 수컷 마우스는 Jackson Laboratory에서 얻어 생후 3-4개월에 실험에 사용했습니다.

1. 고정 냉동 시료 준비

  1. 4x PBS에 갓 준비한 4% PFA를 마우스에 관류하고 4°C에서 17-24시간 동안 갓 준비된 4% PFA에 뇌 전체를 넣습니다.
    참고: 조직을 4% PFA(각 뇌당 10mL)에 24시간 이상 배치하지 마십시오.
  2. 조직이 용기 바닥으로 가라앉을 때까지 4°C에서 1x PBS의 10%(10mL) 자당에 조직을 담그십시오. 그런 다음 조직을 순차적으로 20% 자당으로 옮기고 마지막으로 30% 자당으로 옮겨 각 단계에서 가라앉도록 합니다.
    참고: 조직이 가라앉는 데 필요한 시간은 조직 유형과 크기에 따라 다릅니다. 뇌 조직의 경우 약 18시간이 걸립니다.
  3. OCT 임베딩 배지에서 조직을 동결하고 조직 블록을 -80°C의 밀폐 용기에 보관합니다.
  4. 포름알데히드로 고정된 코로나 절편은 얼어붙은 뇌 조직을 10μm 조각으로 만들고 사용할 때까지 -80°C에서 보관합니다.
    알림: 양전하를 띤 현미경 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 다른 슬라이드 유형은 조직 손실을 초래할 수 있습니다. 슬라이드를 즉시 사용하지 않을 경우 -80°C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.

2. 이중 검출 분석 전에 단면도 전처리

  1. 분석 당일에는 1x PBS에서 슬라이드를 5분 동안 세척하고 슬라이드 랙을 위아래로 부드럽게 움직여 잔류 OCT를 제거합니다.
  2. 슬라이드를 60°C에서 30분 동안 굽습니다.
  3. 4°C에서 15분 동안 1x PBS에 미리 냉각된 4% PFA로 슬라이드를 사후 수정합니다.
  4. EtOH 시리즈를 통해 슬라이드를 순차적으로 전송합니다: RT에서 5분 동안 50% EtOH, RT에서 5분 동안 70% EtOH, RT에서 5분 동안 100% EtOH, RT에서 다시 5분 동안 100% EtOH.
  5. RT에서 5분 동안 슬라이드를 자연 건조합니다.
  6. 각 섹션에 과산화수소 2-4방울을 바르고 RT에서 10분 동안 배양합니다. 증류수로 한 번 헹굽니다.
  7. 비커에 700mL의 새로운 1x Target Retrieval 용액을 준비합니다. 호일로 덮고 일정한 끓임(99–100 °C)이 됩니다.
    알림: 사용하기 전에 30분 이상 끓이지 마십시오. 한편, 오븐( 재료 표 참조)을 40°C로 예열합니다.
  8. 슬라이드 랙을 끓는 Target Retrieval 용액에 조심스럽게 담그고 5분 동안 배양합니다. 온도를 98–102 °C 사이로 유지하고 면밀히 모니터링하십시오.
    알림: 조직 유형에 따라 끓는 시간을 조정해야 할 수도 있습니다(5-15분).
  9. 즉시 핫 슬라이드 랙을 증류수가 담긴 접시에 옮기고 랙을 위아래로 3-5배 움직입니다. 신선한 증류수로 반복하십시오.
  10. 신선한 100% EtOH로 슬라이드를 헹구고 위아래로 3-5배 움직입니다. 자연 건조합니다.
  11. 소수성 장벽 펜을 사용하여 각 조직 섹션 주위를 2-3번 그립니다. RT에서 장벽이 완전히 건조되도록 합니다.
  12. 슬라이드를 배치 슬라이드 트레이에 놓습니다. 각 섹션에 Protease( 재료 표 참조)를 추가하여 조직이 완전히 덮이도록 합니다. 40°C의 오븐에서 15분 동안 배양합니다.
    참고: 프로테아제 배양 시간은 조직 유형 및 표적 유전자에 따라 조정이 필요할 수 있습니다.
  13. 오븐에서 슬라이드 트레이를 제거하고 증류수에 넣습니다. 슬라이드를 2분 동안 위아래로 움직여 부드럽게 세척하고 새 증류수로 이 단계를 2번 반복합니다.

3. 이중 검출 분석

  1. 프로브
    1. 포지티브 및 네거티브 대조군 프로브를 위한 두 개의 추가 섹션을 준비합니다.
    2. 대상 프로브와 동일한 수의 ZZ 쌍을 가진 제어 프로브를 선택합니다. 1 ZZ 쌍의 경우 포지티브 컨트롤과 네거티브 컨트롤을 사용합니다( 재료 표 참조).
    3. 사용하기 전에 40°C에서 10분 동안 프로브를 평형화하고 AMP1-12 시약을 RT로 가져옵니다.
  2. 프로브 하이브리드화
    1. C2 프로브를 잠시 돌리고 C1 프로브와 1:50 비율로 혼합합니다. 각 섹션을 완전히 덮을 수 있도록 충분한 프로브(100–200 μL) 혼합물을 추가하고 40 °C의 오븐에서 2시간 동안 슬라이드를 배양합니다. RT에서 1x Wash buffer에서 2 x 2분 동안 슬라이드를 세척합니다.
    2. 기본 범위 듀플렉스 AMP1 응용 프로그램
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP1(100–200 μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    3. 기본 스코프 듀플렉스 AMP2 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP2(100–200μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    4. 기본 스코프 듀플렉스 AMP3 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP3(100–200μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
        알림: 배양 시간을 15분을 초과하지 마십시오.
    5. 기본 스코프 듀플렉스 AMP4 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP4(100–200μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    6. 기본 범위 듀플렉스 AMP5 응용 프로그램
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP5(100–200 μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    7. 베이스 스코프 듀플렉스 AMP6 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP6(100–200μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
        알림: AMP3의 경우 배양 15분을 초과하지 마십시오.
    8. 베이스 스코프 듀플렉스 AMP7 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP7(100–200μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮고 실온 에서 30분 동안 배양합니다.
        1. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
          참고: AMP7을 사용하여 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.
    9. 기본 범위 듀플렉스 AMP8 응용 프로그램
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP8(100–200μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮고 실온 에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
        참고 : RT에서 15 분 동안 AMP8 배양으로 배양하십시오.
    10. 적색 신호 감지(C2)
      1. Fast Red-B를 잠시 스핀다운하고 Fast Red-A와 1:60 비율로 믹싱합니다.
      2. 각 섹션(100–200 μL)에 적용하고 트레이를 덮은 다음 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 배양합니다.
      3. 1x 세척 버퍼에서 2x 세척.
        알림: 5분 이내에 혼합 패스트 레드 용액을 사용하십시오. 빛(햇빛 또는 UV)으로부터 보호하십시오.
    11. 베이스 스코프 듀플렉스 AMP9 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP9(100–200 μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    12. 기본 범위 듀플렉스 AMP10 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP10(100–200 μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. 오븐으로 돌아가 40°C에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
    13. 기본 스코프 듀플렉스 AMP11 애플리케이션
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP11(100–200 μL)을 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. RT 에서 30분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
        참고 : RT에서 AMP11로 30 분 동안 배양하십시오.
    14. 기본 스코프 듀플렉스 AMP12 적용 사례
      1. 슬라이드에서 과도한 세척 버퍼를 제거하고 AMP12(100–200 μL)를 추가하여 각 섹션을 완전히 덮습니다. RT 에서 15분 동안 배양합니다.
      2. 2x 세척 버퍼에서 2 x 1분 세척.
        알림: 배양 시간을 15분을 초과하지 마십시오.
    15. 녹색 신호 감지(C1)
      1. Fast Green-B 튜브를 잠시 돌리고 Fast Green-A와 1:50 비율로 혼합합니다.
      2. 각 섹션(100–200 μL)에 GREEN 용액을 바르고 트레이를 덮은 다음 RT에서 10분 동안 배양합니다.
      3. 5x Wash Buffer에서 1분 동안 세척하고 증류수로 짧게 헹굽니다.
        알림: 5분 이내에 혼합된 패스트 그린 용액을 사용하십시오. 빛으로부터 보호하십시오. 녹색 B 대 A 비율은 1:50입니다. RED 및 GREEN 기질은 모두 알코올에 민감합니다. 알코올이 함유된 시약을 사용하지 마십시오.

4. 카운터 스테인

  1. 단면이 보라색으로 나타날 때까지 RT에서 1분 동안 50% Hematoxylin 염색 용액에 슬라이드를 담급니다.
  2. 위아래로 움직여 수돗물로 3-5회 헹굽니다. 배경이 깨끗해질 때까지 깨끗한 수돗물로 반복하지만 섹션은 자주색으로 유지됩니다.
  3. 섹션이 파란색으로 바뀔 때까지 0.02% 암모니아 물을 위아래로 3번 딥합니다.
  4. 수돗물로 3-5회 다시 헹굽니다.

5. 장착

  1. 60°C 건조 오븐에서 ~15분 동안 슬라이드를 완전히 건조시킵니다.
  2. 신선한 자일렌에 슬라이드를 담그십시오.
    참고: 장착 매체는 점성이 매우 높기 때문에 장착하기 전에 자일렌을 잠시 담그면 조직 섹션을 가로질러 매체가 더 부드럽게 퍼지고 커버슬립 아래에 기포 형성이 줄어듭니다.
  3. 기포를 피하면서 슬라이드와 커버슬립에 장착 매체( 재료 표 참조)를 적용합니다.
  4. 최소 5분 동안 자연 건조 슬라이드를 만듭니다.

6. 샘플 평가

  1. 표준 명시야 현미경으로 20x 또는 40x 배율로 단면을 이미지화합니다. (그림 1).
    참고: 양수 컨트롤은 셀에 구두점 점을 표시해야 합니다. 네거티브 컨트롤은 20배 배율에서 20개 셀당 1개 이하의 점이 있는 경우 허용됩니다.

7. 점수 매기기(선택 사항)

  1. 이미지 분석 소프트웨어(예: Halo 또는 QuPath)를 사용하여 세포당 RNA 도트를 정량화합니다.

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결과

인슐린 수용체(IR)는 2개의 세포외 α-서브유닛과 2개의 막관통 β-서브유닛으로 구성되어 기능적 이질체를 형성하는 막관통 티로신 키나아제 수용체입니다. α-subunit은 인슐린 결합을 매개하는 반면, β-subunit은 다운스트림 신호를 시작하는 고유한 tyrosine kinase 활성을 가지고 있습니다. 엑손 11의 IR mRNA 대체 스플라이싱은 IR, IR-A 및 IR-B의 두 가지 동형을 생성합니다. 이와 같이, IR-B는 α-subunit의 C-말단 영역 내에 엑손 11에 의해 인코딩된 12-아미노산 세그먼트를 포함하는 반면, IR-A는 이 세그먼트가 없습니다.

뇌 조직에서 이러한 동형을 구별하기 위해 우리는 두 가지 특정 프로브를 사용했습니다: 엑손 10-12 접합(엑손 11 건너뛰기)을 표적으로 하는 IR-A 프로브와 엑손 11-12 접합을 표적으...

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토론

뇌 내에서 인슐린 수용체(IR)의 발현은 이질적이며, 후각구(olfactory bulb), 시상하부(hypothalamus), 해마(hippocampus), 맥락막신경총(choroid plexus10)과 같은 영역에서 높은 밀도가 관찰됩니다. 특정 뇌 영역과 세포 유형에서 변이 발현 패턴을 포괄적으로 규명하는 것은 중요한 정보를 제공하여 시냅스 가소성, 학습 및 기억에서 인슐린과 IGF-II 신호의 특정 역할을 연구하고 이해할 수 있도록 합니다12. 또한 이것은 복잡한 신경 장애와 관련된 병리학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 것입니다. 뇌에서 IR-A 및 IR-B 발현의 조절 장애는 이미 알츠하이머병, 우울증, 자폐증, 정신분열증을 포함한 다양한 신경 및 신경 정신 장애와 관련이 있습니다6. 동형체 특이적 발현 패턴의 규명은 이러한 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)/국립 노화 연구소(National Institute on Aging)/미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
암모늄수전자현미경과학 26754-4A
BaseScope Dulplex 검출 시약 키트ACD 바이오323810
BaseScope Dulplex 듀플렉스 양성 대조군 프로브 - 마우스(mm)-C1-PPIB-1ZZ/C2-Polr2A-1ZZACD 바이오700121
BaseScope Dulplex 듀플렉스 양성 대조 프로브-C1-DapB-1ZZ/C2-DapB-1ZZACD 바이오700141
길의 헤마톡실린 I시그마-알드리치GHS132-1L
염소 항토끼 IgG(H+L) 고교차흡착 2차 항체, Alexa Fluor Plus 488인비트로젠A32731
HybEZ 오븐, 트레이, 랙 및 세척 트레이ACD 바이오321721, 310012, 321716, 321717
ImmEdge 소수성 배리어 펜벡터 연구소H-4000
INSR 이소형 A 및 B 프로브: BA-Mm-Insr-tv1-E10E11, BA-Mm-Insr-tv2-E11E12-C2ACD 바이오717411, 717421-C2
인슐린 수용체 항체세포 신호 전달 23413
RNAscope 10x 표적 검색ACD 바이오322000
RNAscope 과산화수소, 프로테아제 플러스ACD 바이오322381
식염수-구연산나트륨(SSC) 20x피셔 사이언티픽BP1325-1
SuperFrost Plus 슬라이드피셔 사이언티픽12-550-18
VectaMount 영구 마운팅 매체벡터 연구소H-5000

참고문헌

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  8. BaseScope assays. , Advanced Cell Diagnostics, Inc. https://acdbio.com/basescope-duplex-assay (2025).
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